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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CAMPUS DE JABOTICABAL

ASPECTOS DA INFECÇÃO TOXOPLÁSMICA NO

SISTEMA REPRODUTOR DE OVINOS (Ovis aries)

MACHOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS

Welber Daniel Zanetti Lopes Médico Veterinário

JABOTICABAL, SP – BRASIL - 2007

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CAMPUS DE JABOTICABAL

ASPECTOS DA INFECÇÃO TOXOPLÁSMICA NO

SISTEMA REPRODUTOR DE OVINOS (Ovis aries)

MACHOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS

Welber Daniel Zanetti Lopes

Prof. Dr. Alvimar José da Costa

Orientador

JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL

Janeiro de 2007

Dissertação apresentada à Facul- dade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária (Medicina Veterinária Preventiva).

Trabalho realizado no “Centro de

Pesquisas em Sanidade Animal-

CPPAR/FCAV/UNESP, no departamento

de Medicina Veterinária Preventiva da

FCAV-UNESP, no Instituto Adolfo Lutz e no

Laboratório de prozoologia molecular da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE TABELAS......................................................................................................... iv

LISTA DE FIGURAS......................................................................................................... vii

RESUMO.......................................................................................................................... 01

SUMMARY....................................................................................................................... 02

1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................. 03

1.1. Aspectos Gerais................................................................................................... 03

1.2 Toxoplasmose em ovinos...................................................................................... 07

2. OBJETIVOS.................................................................................................................. 15

3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................. 16

3.1. Cepas de Toxoplasma gondii............................................................................... 16

3.2 Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoítos de T. gondii.......................... 16

3.3. Obtenção de oocistos de Toxoplasma gondii...................................................... 17

3.4. Obtenção de taquizoítos de Toxoplasma gondii.................................................. 19

3.5 Confecção de lâminas com antígeno para IFI.................................................... 19

3.6. Seleção e adaptação dos ovinos reprodutores para o experimento.................... 20

3.7 Condicionamento dos reprodutores ovinos à colheita de sêmen.......................... 21

3.8 Inoculação dos ovinos reprodutores machos........................................................ 21

3.9. Exames clínicos................................................................................................... 23

3.10. Determinação de parasitemia............................................................................ 23

3.11. Resposta imune humoral (IFI)......................................................................... 24

3.12. Exames no sistema reprodutor dos ovinos infectados experimentalmente ...... 25

3.12.1. Colheita do sêmen.................................................................................... 25

3.12.2. Parâmetros espermáticos......................................................................... 25

3.12.2.1 Motilidade e vigor.................................................................................... 25

3.12.2.2 Concentração e volume.......................................................................... 25

3.12.2.3 Morfologia espermática.......................................................................... 26

3.13. Bioensaio em camundongos................................................................................... 26

3.14 Pesquisa de DNA de T. gondii pela PCR................................................................. 26

3.14.1. Extração do DNA das amostras do controle positivo e das amostras de

sêmen.......................................................................................................

27

3.14.2. Reação em cadeia da polimerase (PCR)................................................. 28

3.14.3. Eletroforese em gel de agarose para análise dos produtos amplificados

na PCR.....................................................................................................

29

3.15. Pesquisa do Toxoplasma gondii no testículo, vesícula seminal, próstata e

epidídimo dos ovinos reprodutores.........................................................................

29

3.15.1. Exames anátomo-histopatológicos nos órgãos reprodutores dos

ovinos..........................................................................................

29

3.15.2. Bioensaio em camundongos........................................................... 30

3.15.3. Imunoistoquímica em órgãos do sistema reprodutor dos ovinos.. 31

3.15.4 Pesquisa do DNA de T. gondii em tecidos pela PCR...................... 33

4. ANÁLISE ESTATÍSTICAS............................................................................................ 34

5. RESULTADOS............................................................................................................. 35

5.1. Obtenção de taquizoítos de T. gondii.................................................................. 35

5.2. Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoítos de T.gondii......................... 35

5.3. Obtenção de oocistos de T.gondii....................................................................... 35

5.4. Seleção dos ovinos reprodutores........................................................................ 36

5.5. Exames clínicos................................................................................................... 37

5.5.1 Temperatura corporal........................................................................ 37

5.5.2 Freqüência cardíaca.......................................................................... 39

5.5.3 Freqüência respiratória..................................................................... 41

5.5.4 Outros sinais clínicos........................................................................ 43

5.6 Exames nos sistema reprodutor dos ovinos infectados experimentalmente........ 45

5.6.1 Parâmetros espermáticos................................................................. 45

5.7. Determinação de Parasitemia............................................................................ 53

5.8. Resposta Imune Humoral..(RIFI)......................................................................... 55

5.9. Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos (Bioprova)..................... 58

5.10. Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos pela PCR.................... 61

5.11. Exames anátomo-histopatológicos (necropsias)................................................ 62

5.12 Exames histopatológicos.................................................................................... 62

5.13. Pesquisa do Toxoplasma gondii em tecidos dos reprodutores ovinos............... 62

5.13.1. Bioprova..................................................................................................... 62

5.13.2. Imunoistoquímica....................................................................................... 62

5.13.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).................................................. 65

6. DISCUSSÃO................................................................................................................. 66

7. CONCLUSÕES............................................................................................................. 73

6. REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 74

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1. Infecção toxoplásmica em ovinos pertencentes a diversas

regiões Mundiais...................................................................................... 09

Tabela 2. Delineamento experimental dos oito ovinos reprodutores

submetidos à infecção toxoplásmica experimental.................................. 22

Tabela 3. Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).......... 29 Tabela 4. Resultados sorológicos para Toxoplasmose, Neosporose,

Brucelose e Leptospirose dos ovinos examinados para seleção dos

grupos experimentais infectados com Toxoplasma gondii...................... 36

Tabela 5. Temperatura retal média mensurada dos ovinos

experimentais até 70 dias pós-inoculação com Toxoplasma

gondii........................................................................................................ 38

Tabela 6. Freqüência cardíaca média mensurada nos ovinos


gondii........................................................................................................ 40

Tabela 7. Freqüência respiratória média mensurada nos ovinos


gondii........................................................................................................ 42

Tabela 8. Parâmetros seminais de ovinos inoculados com oocistos de

Toxoplasma gondii................................................................................... 46

Tabela 9. Parâmetros seminais de ovinos inoculados com taquizoítos

de Toxoplasma gondii.............................................................................. 47

Tabela 10. Parâmetros seminais de ovinos pertencentes ao grupo

Controle.................................................................................................... 48

Tabela 11. Comparações múltiplas e resultados da análise de

variância dos parâmetros seminais de ovinos nos não inoculados

(controle) e inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106

taquizoítos de Toxoplasma gondii............................................................ 49

Tabela 12. Surtos parasitêmicos detectados em ovinos não infectados

(controle) e inoculados com Toxoplasma

gondii........................................................................................................ 54

Tabela 13. Recíproca dos títulos obtidos pela Reação de

Inumofluorescência Indireta (IFI) em ovinos não inoculados (controle) e

inoculados com 2,5 x 105 ou com 1,0 x 106

taquizoítos................................................................................................ 56

Tabela 14. Comparações múltiplas e resultados da análise de

variância do título sorológico de ovinos nos não inoculados (controle) e

inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106 taquizoítos de

Toxoplasma gondii................................................................................... 57

Tabela 15. Pesquisa de T. gondii em camundongos inoculados com

amostras seminais oriundas dos reprodutores ovinos não inoculados

(controle) e inoculados com oocistos ou

taquizoítos............................................................................................... 60

Tabela 16. Parasitismo tissular detectado pela técnica de

imunoistoquímica em testículos, epidídimos vesícula seminal e

próstata de ovinos inoculados com 2 x 10 5 oocistos ou 1 x 10 6

taquizoítos de Toxoplasma gondii............................................................ 63

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1. Temperaturas retais médias mensuradas nos ovinos não

inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x

105 oocistos de Toxoplasma gondii................................................................ 39

Figura 2. Freqüências cardíacas médias mensuradas nos ovinos não


105 oocistos de Toxoplasma gondii................................................................ 41

Figura 3. Freqüências respiratórias médias mensuradas nos ovinos não


105 oocistos de Toxoplasma gondii............................................................... 43

Figura 4. Apatia dos animais inoculados com oocistos de Toxoplasma

gondii no 5º DPI............................................................................................. 44

Figura 5. Apatia dos animais inoculados com oocistos de Toxoplasma

gondii no 7º DPI.............................................................................................. 44

Figura 6. Volume espermático médio (mL) em ovinos não inoculados

(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x 105

oocistos de Toxoplasma gondii..................................................................... 50

Figura 7. Motilidade espermática média (%) em ovinos não inoculados

(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x 105 oocistos

de Toxoplasma gondii.................................................................................... 50

Figura 8. Vigor espermático médio (0 a 5) em ovinos não inoculados

(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x 105 oocistos

de Toxoplasma gondii.................................................................................... 51

Figura 9. Concentração espermáticas médias (x 108) em ovinos não

inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x


Figura 10. Patologias espermáticas médias de cabeça (%) em ovinos não



Figura 11. Patologias espermáticas médias de cauda (%) em ovinos não



Figura 12. Taquizoítos fluorescentes de Toxoplasma gondii (IFI). Soro de

camundongo inoculado com amostra seminal de ovino infectado com

taquizoítos. Obj. 20x....................................................................................... 58

Figura 13. Cisto de Toxoplasma gondii em cérebro de camundongo

inoculado com sêmen de ovino infectado com oocistos. Obj. 40x................. 59

Figura 14. Eletroforese em gel de agarose 2% de produto da reação em

cadeia da polimerase (PCR), a partir de amostras seminais dos ovinos

experimentalmente infectados........................................................................ 61

Figura 15. Próstata demonstrando imunomarcação ao Toxoplasma gondii.

Ovino inoculado com oocistos de Toxoplasma gondii. Obj.

40x.................................................................................................................. 64

Figura 16. Vesícula seminal demonstrando agrupamento de taquizoítos

com imunomarcação ao Toxoplasma gondii. Ovino inoculado com

taquizoítos de Toxoplasma gondii. Obj. 40x................................................... 64

Figura 17. Eletroforese em gel de agarose 2% de produto da reação em

cadeia da polimerase (PCR), a partir do “pool” das amostras de tecidos

(testículos, vesícula seminal, próstata e epidídimos) dos ovinos

experimentalmente infectados........................................................................

65

ASPECTOS DA INFECÇÃO TOXOPLÁSMICA NO SISTEMA

REPRODUTOR DE OVINOS (Ovis aries) MACHOS

EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS

RESUMO

Oito reprodutores ovinos, isentos de Toxoplasma gondii e quaisquer outras doenças

reprodutivas, foram distribuídos em três grupos para infecção com o respectivo

protozoário: GI - três ovinos (2,0 x 105 oocistos da cepa P), GII - três ovinos (1,0 x 106

taquizoítos da cepa RH) e GIII - dois ovinos (controle). Parâmetros clínicos foram

mensurados. Avaliações parasitêmicas e sorológicas (IFI) foram efetuadas. Qualidade

espermática foi avaliada e a presença do parasito no sêmen foi investigada por meio

das técnicas da bioprova e da PCR. Parasitismo tissular foi pesquisado pela bioprova,

PCR e imunohistoquímica. Foi possível registrar alterações hipertermia e apatia nos

ovinos infectados com oocistos de Toxoplasma gondii Parasitemia foi detectada em

cinco ovinos. Todos os ovinos inoculados responderam ao estímulo antigênico,

produzindo anticorpos contra T. gondii a partir do 5º dia pós-inoculação. Nos animais

dos grupos I e II, os títulos observados foram de 1:4096 e 1:8192, respectivamente. Nos

mesmos grupos, foram ainda, pela bioprova e PCR, constatada a presença do parasito

no sêmen. Pela PCR detectou-se o DNA de T. gondii no sêmen dos animais 02 e 09 (do

GI oocistos) e 07, 48 e 52 (do GII taquizoítos). Parasitismo tissular por T. gondii

(bioprova e PCR) foi diagnosticada nos ovinos 09, 16 (oocistos) e 07 (taquizoítos).

Vesícula seminal e próstata foram os tecidos de eleição da infecção por T. gondii

(imunohistoquímica) no sistema reprodutor dos ovinos experimentalmente infectados.

Em síntese, estes resultados sugerem a viabilidade da transmissão venérea deste

coccídio.

Palavras-chave : PCR, Sêmen, Toxoplasma gondii, ovinos, sistema reprodutor

ASPECTS OF THE TOXOPLASMIC INFECTION ON

REPRODUCTIVE SYSTEM OF SHEEP (Ovis aries)

EXPERIMENTALLY INFECTED

SUMMARY

Eight sheep reproducers exempt of Toxoplasma gondii and any other reproductive

illnesses, were distributed in three groups for infection with the respective protozoan: GI

- three sheep (2.0 x 105 oocysts from P lineage), GII - three sheep (1.0 x 106 taquizoites

from RH lineage) and GIII - two sheep (control). Clinical parameters were measured.

Parasitemics and sorologicals evaluations (IFA) were effected. Spermetic quality was

evaluated and the presence of the parasite in the semen was searched through

techniques of bioassay and PCR. Tissue parasitism was researched through bioassay,

PCR and immuneistochemistry. It was possible to registered hyperthermia and apathy

alterations in sheep infected with oocysts from Toxoplasma gondii. Parasitemia was

detected in five sheep. All inoculated sheep responded to antigenic stimulation,

producing antibodies against T. gondii upon the 5th day post-inoculation. In animals from

groups I and II, the titles observed were 1:4096 and 1:8192, respectively. The animals of

group III (control), did not present antibodies against T. gondii during all experimental

period. In the same groups, it still has been evidenced, through bioassay and PCR, the

presence of the parasite in the semen. Through PCR, T. gondii DNA was detected in the

semen of animals 02, 09 of GI (oocysts) and 07, 48 and 52 of GII (taquizoites). Tissue

parasitism by T. gondii (biotest and PCR) was diagnosed in sheep 09, 16 (oocysts) and

07 (taquizoites). Seminal vesicle and prostate were the tissues elected for infection with

T. gondii (immuneistochemistry) in the experimentally infected sheep reproductive

system. In summery, these results suggests the viability of the venereal transmission for

this coccidium.

KEYWORKS : PCR, Semen, Toxoplasma gondii, Sheep, Reproductive system

1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Aspectos Gerais

Uma das tarefas básicas da pesquisa agropecuária consiste em divulgar, reunir e

conferir informações científicas que possibilitem prevenir problemas, visando resguardar

a integridade física e sanitária do rebanho.

Em relação à criação de ovinos, tendo em vista a importância econômica que

representa no contexto pecuário, a prioridade é de aumentar a segurança dos

investimentos realizados, principalmente em regiões de expressiva produtividade.

Portanto, conhecer doenças que possam vir a ser um problema em futuro próximo, é a

importância de se manter pesquisas na área animal.

O estudo do Filo Apicomplexa, o qual compreende parasitas intracelulares

obrigatórios, que são altamente adaptados e conseguem invadir e se desenvolver

dentro das células hospedeiras, torna-se de suma importância. Este grupo possui ciclos

de vida complexo, em que cada forma evolutiva interage com células específicas de um

único hospedeiro (QUEIROZ, 1998).

Um dos membros deste filo, a família Sarcocystidae, possui mais de 200

espécies reconhecidas de coccídios heteroxenos formadores de cistos tissulares nos

hospedeiros intermediários, sendo subdividida em duas sub-famílias: Sarcocystinae e

Toxoplasmatinae (RESENDES et al., 2002). Pertence ao reino protista, filo

Apicomplexa, classe Sporoazida, ordem Eucoccidiorida, família Sarcocystidae,

subfamília Toxoplasmatinae, gênero Toxoplasma, tipo-espécie Toxoplasma gondii.

A sub-família Toxoplasmatinae compreende quatro gêneros diferentes, dentro

dos quais pelo menos duas espécies, Toxoplasma gondii e Neospora caninum, são de

importância em saúde pública e veterinária, podendo causar abortamentos, natimortos

ou doença congênita nos hospedeiros.

T. gondii foi descrito pela primeira vez em coelhos por SPLENDORE (1908), em

São Paulo, Brasil, e, por NICOLLE & MANCEAUX (1908), na Tunísia, em um pequeno

roedor, o Ctenodactylus gondii, no entanto teve seus nomes genérico e específico

determinados por NICOLLE & MANCEAUX (1909).

No seu ciclo evolutivo, T. gondii se apresenta sob três formas principais: 1)

taquizoítos, de rápida multiplicação e que ocorrem na infecção aguda; 2) bradizoítos,

localizados em cistos teciduais e presentes na infecção crônica e 3) oocistos, produto

final da reprodução sexuada e que ocorre somente no trato digestivo dos felídeos, seus

hospedeiros definitivos (MILLER et al., 1972). Os oocistos são eliminados para o meio

juntamente com as fezes dos felídeos onde, após esporulação, tornam-se infectantes.

Após a ingestão, a parede do cisto ou do oocisto se rompe por ação enzimática,

liberando as formas infectantes (bradizoítos e esporozoítos, respectivamente) no trato

digestivo do hospedeiro. Penetram então nas células epiteliais do intestino parasitado

onde, após multiplicação, transformam-se em taquizoítos. A disseminação ocorre pelo

rompimento das células infectadas seguido da invasão das células vizinhas,

distribuindo-se praticamente por todo organismo via circulação sanguínea ou se

difundindo de uma célula a outra, podendo, ainda, ser disseminado por macrófagos,

linfócitos ou granulócitos, além de circular na corrente sanguínea na sua forma livre.

Os taquizoítos são encontrados somente em células nucleadas, com maior

afinidade pelos sistemas muscular e nervoso, onde se multiplicam com rapidez até

destruí-las.

Com o avanço da infecção, o hospedeiro começa a desenvolver uma resposta

imune que atua sobre a multiplicação dos taquizoítos, os quais passam a se dividir mais

lentamente, sendo então denominados bradizoítos e que se encontram confinados num

cisto no interior da célula parasitada, protegidos contra a ação do sistema imune e de

drogas. É a infecção latente ou crônica, que pode se perpetuar por vários anos

(HUTCHISON et al., 1968, 1970, 1971; WITE, PIEKARSKI, 1970; FRENKEL, 1970;

FRENKEL, 1973 e SWANGO et al., 1989).

Além deste ciclo, no hospedeiro definitivo, em especial o gato doméstico, ocorre

o ciclo entero-epitelial com esquizogonia e gametogonia, culminando com a fecundação

e produção do oocisto (FRENKEL, 1970 e WONG & REMINGTON, 1993). Os felídeos

podem se infectar pela ingestão de qualquer uma das três formas evolutivas, sendo a

ingestão de cistos com bradizoítos, por meio do carnivorismo, a via mais freqüente

(SWANGO et al., 1989; DUBEY et al., 1996 e DUBEY, 2002).

Normalmente T. gondii parasita seus hospedeiros sem a manifestação de sinais

clínicos, porém pode ser capaz de desencadear doença severa, ocorrendo graves

alterações comportamentais, como déficit de atenção e esquizofrenia (LAFFERTY,

2005) reduzindo a qualidade de vida dos indivíduos (McALLISTER, 2005). Deve-se

atentar para os fatores de risco de aquisição da infecção pré natal bem como considerar

sua patogenia e seqüelas (DUBEY, 1993; KRAVETZ, FEDERMAN, 2005;

BACHMEYER et al., 2006 e HUNG et al., 2007).

O risco de aquisição desta enfermidade na vida pós-natal, também foi

demonstrado por vários autores (DUBEY et al. 1998; GIRALDI et al. 2001 e SILVA et al.

2001).

Em humanos, a infecção é muito comum, porém a enfermidade clínica é pouco

freqüente. Estima-se que um terço, ou mais, da população possua anticorpos contra o

parasito. Somente nos EUA é provável que ocorram 1.437.500 novos casos de infecção

por T. gondii, com um custo aproximado de U$ 445 milhões por ano (TODD, 1989). No

mesmo país, segundo SAAD et al. (1996), aproximadamente 300 pessoas morrem

anualmente devido à toxoplasmose, tanto na sua forma congênita (neonatos) quanto

em indivíduos com severa imunossupressão iatrogênica (transplantados, tratamento de

neoplasias, pacientes submetidos à diálise renal) ou que sofram de enfermidades

imunossupressoras como doenças auto-imunes ou a síndrome de imunodeficiência

adquirida – AIDS (SMITH, 1993).

Em pacientes com síndrome de imunodeficiência adquirida, a toxoplasmose

manifesta-se com uma elevada freqüência, sendo considerada uma doença oportunista

(LUTF & REMINGTON, 1988; PASSOS et al., 2000) que provoca a reativação dos

cistos, principalmente os cerebrais, produzindo grave encefalite (HALONEN et al., 2001;

KHETSURIANI et al., 2002; MAMIDI et al., 2002; COLLAZOS, 2003; YADAV et al., 2004

e PRADHAN et al., 2007). POTASMAN et al. (1987) observaram uma freqüência de

encefalite por T. gondii entre seis e 10% de pacientes aidéticos nos EUA. No Brasil, em

pacientes acima de 12 anos de idade, a toxoplasmose é a terceira doença associada

mais prevalente, com 11.809 (3,72%) dos 314.582 casos notificados entre 1980 e 1996

(BRASIL, 1996).

Estudos da soroprevalência de Toxoplasma em indivíduos da cidade de

Fortaleza, Ceará, mostraram um rápido aumento na positividade, durante os primeiros

10 anos de vida, sugerindo que a maioria das infecções primárias seja adquirida

durante a infância. Fato este que pode ser associado ao contato domiciliar com gatos e

famílias numerosas, que provavelmente deixam a desejar na higiene e cuidado com as

crianças (REY & RAMALHO, 1999).

As principais vias de transmissão do T. gondii são: infecção transplacentária

(taquizoítos circulantes), sendo mais freqüente no terço final da gestação (FRENKEL,

1973; DUBEY e TOWLE 1986; MAMIDI et al., 2002); ingestão de água, como sugerem

os trabalhos de ARAMINI et al. (1998 e 1999), ou alimentos contaminados com oocistos

esporulados oriundos das fezes do gato e, ainda, ingestão de cistos teciduais em

carnes cruas e/ou mal cozidas (SILVA et al., 2000).

Menos freqüente, porém possível, a infecção pode se dar por meio de acidentes

laboratoriais (WONG & REMINGTON, 1993), transfusão sangüínea (FIGUEROA-

DAMIAN, 1998), transplante de órgãos (MUNIR et al., 2000), e ingestão de leite caprino

não pasteurizado contendo taquizoítos, já descrita em humanos por CHIARI & NEVES

(1984). Em mulheres, embora não se tenha comprovado a transmissão por meio da

amamentação, BONAMETTI et al. (1997a) descrevem um caso positivo de

toxoplasmose em uma criança, cuja dieta era constituída exclusivamente por leite

materno, e a mãe fazia parte de um grupo de 17 indivíduos que havia adquirido

toxoplasmose pela ingestão de carne ovina crua. Um inquérito sorológico na

propriedade de origem dos ovinos revelou 43% dos animais soropositivos para

protozoonose.

Outra via de transmissão recentemente reconhecida é o contato com cães,

devido ao comportamento de alguns deles de ingerir e rolar sobre fezes de gatos, talvez

atraídos pelo cheiro forte. Este comportamento foi denominado xesnomofilia e

possibilitaria a transmissão pelo contato com possíveis oocistos presentes na pelagem

de cães que vivem em áreas muito contaminadas (FRENKEL & PARKER, 1996).

1.2 Toxoplasmose em ovinos

A toxoplasmose ovina é uma doença parasitária de elevada importância

veterinária, zootécnica e de saúde pública, uma vez que acarreta prejuízos aos animais

de produção (WYSS et al., 2000; SMIELEWSKA, et al., 2001, O’ROUKE, 2002), além

de servirem de fonte direta ou indireta de infecção para o ser humano (LINDSAY et al.,

1997; GARCIA et al., 1999; WALSH et al., 1999). Na Europa, mais de 50% da carne de

ovinos e suínos, pesquisada por ACHA & SZYFRES (1986) apresentaram-se

parasitadas pelo T. gondii. A carne suína é considerada a principal fonte de transmissão

para humanos nos Estados Unidos e, provavelmente, em vários outros países

(GAMBLE, 1997). Em frangos de corte estima-se que a prevalência seja baixa, embora

KANETO et al. (1997) tenham isolado cistos viáveis de T. gondii de musculaturas

esquelética e cardíaca de animais infectados experimentalmente, e GARCIA et al.

(2000) encontraram uma soroprevalência de 10,3% em frangos de corte no estado do

Paraná.

Dentre os animais de produção, o ovino é um dos que mais comumente

apresenta-se infectado, juntamente com os suínos, caprinos e coelhos (DUBEY &

THULLIEZ, 1993).

A alta prevalência da toxoplasmose em ovinos pode estar ligada a menor

resistência desta espécie ao parasita e as próprias condições de exploração da

ovinocultura que expõe estes animais a maior probabilidade de contato com os oocistos

eliminados pelos gatos (DUBEY & HAMIR, 2002).

A toxoplasmose em ovinos foi descrita pela primeira vez por OLAFSON &

MONLUX (1942), nos Estados Unidos. Estes autores assinalaram esta enfermidade em

uma ovelha que clinicamente apresentava sintomatologia nervosa, aumento de

temperatura, rigidez muscular, entre outros. O diagnóstico para esta zoonose foi

estabelecido após necropsia e exame histopatológico do cérebro e medula espinhal do

animal.

Desordens reprodutivas, como abortos e neonatos mortos ou fracos, que

evoluem para óbito, geram perdas econômicas consideráveis em rebanhos ovinos

(PEREIRA-BUENO et al., 2004). Estudos conduzidos no Uruguai apontaram a

toxoplasmose como um problema importante nos rebanhos ovinos, promovendo

prejuízos anuais de US$ 1,4 a 4,7 milhões (FREYRE et al., 1999). MUNDAY & MASON

(1979) foram os primeiros a descreverem a toxoplasmose como importante causa de

prejuízos reprodutivos em caprino, e apesar de pouco relatada nesta espécie,

aparentemente, os danos são maiores, acometendo clinicamente tanto animais jovens,

como adultos (DUBEY, 1987). Para pequenos ruminantes, a principal via de infecção é

a ingestão de oocistos esporulados do parasito (DUBEY & BEVERLEY, 1988).

Em conseqüência disto, na Nova Zelândia e em alguns países europeus, tem

sido licenciado o uso de uma vacina (cepa atenuada “S48”) de taquizoítos, com o

objetivo de minimizar as perdas econômicas nestes sistemas de produção (MONTOYA

& LIESENFELD, 2004).

Um surto de Toxoplasmose humana foi relatado na cidade de Bandeirantes,

Estado do Paraná por BONAMETTI et al., (1997b). Os autores apresentaram 17 casos

(dentre estes, uma paciente que estava no 5º mês de gestação) com sintomatologia

aguda da doença, adquirida pela ingestão de carne crua de carneiro, servida em uma

festa. Todos apresentaram títulos séricos de anticorpos específicos (IgM) que

evidenciaram fase aguda da toxoplasmose, pela reação de Imunofluorescência Indireta

(IFI).

As taxas de infecção apontadas para rebanhos ovinos são variáveis (Tabela 1).

Esta flutuação na ocorrência deve-se principalmente ao tipo de teste sorológico

utilizado, à região e a idade dos animais estudados (Dubey, 1990).

Tabela 1: Infecção toxoplásmica em ovinos pertencentes a diversas regiões Mundiais.

Autor(es) Ano País Reação

Sorológica

Nº de

ovinos

examinados

% de

positivos

FELDMAN & MILLER 1956 Estados Unidos SF 9 100

ANGELOFF et al., 1957 Bulgária SF 138 3

ROEVER-BONNET 1957 Holanda SF 128 63

RAWAL 1959 Inglaterra SF 200 36

EYLES et al., 1959 Estados Unidos SF 29 100

COOK 1959 Austrália SF 485 6

ANGELOV et al., 1960 Bulgária FC 526 24

GUILO & DESMONTS 1960 França SF 165 72

SATO 1960 Japão SF 52 44

BERVELEY &

WASTON 1961 Inglaterra SF 200 36

JACOBS 1961 Nova Zelândia SF 18 83

MOYLE & HARTLEY 1961 Nova Zelândia SF 696 45

BERVELEY & MACKAY 1962 Inglaterra SF 77 31

BERVELY & WASTON 1962 Inglaterra SF 246 25

JACOBS et al., 1963 Nova Zelândia SF 29 100

McCULLOCH et al., 1964 Estados Unidos SF 27 81

IFI 315 55 BOCH et al., 1965 Alemanha

ELISA 315 90

ZASTERA et al., 1965 Czechoslovakia SF 127 73

BERENGO et al., 1965 Itália SF 77 43

BERGER 1966 Alemanha SF 146 99

ELIAS 1966 Romênia SF 635 53

WORK 1967 Dinamarka SF 70 61

SINGH et al., 1967 Singapura HAI 24 25

continua

continuação

JANITSCHKE et al., 1968 Alemanha SF 49 87

HARTLEY & MOYLE 1968 Austrália SF 230 88

CATAR et al., 1969 Czechoslovakia FC 429 27

ROEVER-BONNET 1969 Argentina SF 37 62

GILL & PRAKASCH 1970 Índia HAI 488 9

FRENCH et al., 1970 Kwait SF 70 70

WEILAND &

DALCHOW 1970 Turquia SF 250 38

MUNDAY &

CORBOULD 1971 Austrália IFI 1022 14

TATEYMA et al., 1971 Japão HAI 11 27

GARIN et al., 1971 Senegal IFI 83 46

WASTON &

BERVELEY 1971 Inglaterra SF 270 92

DONEV 1972 Bulgária FC 968 31

MARONPOT et al., 1972 Egito IFI 389 12

MUNDAY 1972 Austrália IFI 493 9

BERENGO et al., 1972 Itália SF 88 99

IANNUZZI & RENIERI 1973 Itália HAI 371 48

PLANT et al., 1974 Austrália SF 48 84

CAMPANA et al., 1974 França IFI 583 72

VANDERWAGEN et al., 1974 Estados Unidos HAI 68 28

FRANTI et al., 1975 Estados Unidos IFI 405 13

IFI 144 (M) 62 MUNDAY 1975 Tasmânia

IFI 160 (F) 17

KOZOJED et al., 1976 Afeganistão HAI 117 21

continua

continuação

CHHABRA &

MAHAHAN 1976 Índia HAI 189 19

ARNAUDOV 1977 Estados Unidos HAI 1579 38

HASGAWA et al., 1977 Japão SF 17 18

MAITANI 1977 Japão SF 34 44

SHARMA & GAUTAM 1977 Índia HAI 122 7

WYNNE & MARTIN 1977 Argentina HAI 105 54

PECHERE et al., 1977 Canadá HAI 26 23

ARNAUDOV et al., 1977 Czechoslovakia IFI 493 33

RIFAAT et al., 1977 Egito SF 52 27

2164 (M) 24 RIEMANN et al., 1977 Estados Unidos HAI

699 (F) 4

MICHAEL 1977 Egito SF 100 51

AMARAL et al., 1978 Brasil HAI 100 23

HAGIQARA et al., 1978 Japão SF 26 65

APARICIO et al., 1978 Espanha IFI 84 50

PERRY 1978 Colômbia HAI 1655 58

TIZARD et al., 1978 Canadá SF 273 65


CHABASSE et al., 1978 França IFI 60 15

AMARAL et al., 1978 Brasil (Bahia e

RS) SF 100 23

PERRY et al., 1979 Colômbia IFI 1655 58


FAHMY et al., 1979 Egito SF 169 68

Larsson et al., 1980 Brasil

(Uruguaiana/RS) SF 100 39

continua

continuação

Larsson et al., 1980 Brasil

(Uruguaiana/RS) SF 100 39

SHARMA 1980 Romênia IFI 502 37

PLANT et al., 1980 Austrália IFI 5724 42

PROSECK & HEIJECK 1980 Czechoslovakia SF 89 11

IFI 1092 (M) 29 RUTHERFORT 1980 Nova Zelândia

IFI 50 (F) 0

RAMISSE et al., 1981 França HAI 263 22

OKHO et al., 1981 Nigéria HAI 479 27

SILVA & COSTA 1981 Brasil

(Guaíba/RS) IFI 310 12

AGANGA et al., 1983 Nigéria IFI 200 9

GHORBANIi et al., 1983 Irã AL 203 32

UGGLA & HJORT 1984 Suécia IFI 155 62

SRIVASTAVA et al., 1984 Índia HAI 202 34

DUBEY & KIRKBRIDE 1984 Estados Unidos SF 15 100

RHYAN & DUBEY 1984 Estados Unidos SF 12 91

NISHIKAWA et al., 1984 Brasil (Rio

Grande do Sul) AL 655 8

DUBEY et al., 1985 Estados Unidos SF 78 41

DUBEY 1985 Estados Unidos SF 649 13

ALI ABBAS et al., 1986 Índia HAI 177 26

FESHASKI - HASHENI 1996 Iran IFI 3311 24,5

GONDIN et al., 1999 Brasil (Bahia) IFI 240 18,75

IFI 352 55 LANGONI et al., 1999

Brasil (Estado

de São Paulo) HAI 352 30

continua

continuação

MEIRELLES 2003 Brasil (São

Manuel/SP) ELISA 200 31

SILVA et al., 2003 Brasil

(Pernambuco) IFI 173 35,3

FIGIOULO et al., 2004 Brasil (Estado

de São Paulo) IFI 597 34

SAWADOGO et al., 2005 Moroccos ELISA 261 27,6

KLUN et al., 2006 Sérvia

Montenegro IFI 511 84,5

DUMETRE et al., 2006 França AD 257 44

LOPES et al., 2006 Brasil

(Jaboticabal/SP) IFI 134 56

SHARIF et al., 2006 Iran IFI 588 35

Convenções: SF: Reação de Sabin & Feldman; HAI: Reação de Hemoaglutinação Indireta; AL: Aglutinação em Látex; FC: Fixação de Complemento; IFI: Reação de Imunofluorêscencia Indireta; AD: aglutinação direta; ELISA: Ensaio Imunoenzimático.

SPOSITO-FILHA et al. (1992), isolaram 20 cepas de Toxoplasma a partir do

diafragma de 136 ovinos. DA SILVA & LANGONI (2001) identificaram o T. gondii do

cérebro e diafragma de 34 dos 40 ovinos sorologicamente reagentes à

imunofluorescência indireta. Estes trabalhos de isolamento de parasitos viáveis em

tecidos comestíveis, bem como no leite caprino (CHIARI & NEVES, 1984) revelam a

importância destas espécies como fonte de infecção para o homem. O isolamento do T.

gondii no sêmen de animais domésticos, foi comprovado em caprinos (DUBEY &

SHARMA, 1980), bovinos (SCARPELLI, 2001), suínos (MOURA, 2004) e caninos

(ARANTES, 2005).

Apenas três trabalhos na literatura (SPENCE et al., 1978; TEALE et al., 1982;

AGANGA et al., 1988) relatam o isolamento de T. gondii em sêmen de ovinos.

Diferentemente destes autores, no presente trabalho foram utilizadas duas

metodologias (bioprova e PCR) nas tentativas de recuperar este coccídio. Todos os

resultados relativos ao sistema reprodutor de ovinos (parâmetros espermáticos,

histopatologia, bioensaio, imunohistoquímica e PCR) são inéditos na literatura

consultada.

2. OBJETIVOS

2.1 - Avaliar a infecção experimental, em ovinos machos, em idade reprodutiva,

inoculados com oocistos e taquizoítos de T. gondii;

2.2 - Compilar dados clínicos e laboratoriais para melhor conhecimento da infecção

toxoplásmica em reprodutores ovinos;

2.3 - Avaliar a resposta imune humoral dos animais infectados por meio da Reação de

Imunofluorescência Indireta (IFI);

2.4 - Pesquisar pelas técnicas da bioprova e da PCR, a eventual presença de T. gondii

em amostras de sêmen colhidas dos ovinos infectados experimentalmente.

2.5 - Investigar a presença de T. gondii em testículos, próstata, vesícula seminal e

epidídimo dos ovinos infectados experimentalmente por meio do bioensaio (inoculação

em camundongos), da Imunoistoquímica e da PCR.

2.6 - Dos resultados obtidos, devidamente analisados, extrair inferências sobre a

importância do T. gondii no sistema reprodutor de ovinos experimentalmente infectados.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – Cepas de Toxoplasma gondii

Foram utilizadas as cepas “P” (JAMARA & VIEIRA, 1991) e ”RH” (SABIN, 1941),

mantidas no “CPPAR - Centro de Pesquisas em Sanidade Animal” da Faculdade de

Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP - Campus de Jaboticabal. A cepa “P” produz

infecções letais nos camundongos experimentalmente infectados. Os sobreviventes à

infecção normalmente apresentam razoável quantidade de cistos teciduais em cérebro.

Os oocistos desta cepa apresentam-se infectantes para camundongos (VIDOTTO et al.,

1986b) mesmo depois de mantidos durante cinco anos em temperatura de refrigeração

(4oC a 8oC).

3.2 Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoít os de T. gondii

Camundongos albinos suíços, fêmeas, com idade média de 35 dias foram

inoculados intraperitonealmente com aproximadamente 10 cistos (cepa “P”) cada, e

observados diariamente até o 42o dia pós-inoculação, quando, então, eram

eutanasiádos. Os camundongos inoculados foram medicados com sulfadiazina (500

mg) misturada à ração (100g) na dose de 3,5g/animal/dia de ração do segundo ao 11o

dia pós-inoculação de T. gondii. A maioria dos camundongos sobreviventes à infecção

apresentavam cistos cerebrais.

Para pesquisa de cistos de T. gondii os camundongos foram eutanasiádos e

posicionados em decúbito esternal. Com o auxílio de pinça e tesoura, cada cérebro foi

removido e transferido para um graal estéril e macerado com cerca de 1,0 ml de

solução fisiológica estéril. Uma alíquota de 50 µl foi examinada ao microscópio óptico,

com objetiva de 40X, para identificação e quantificação dos cistos de T. gondii

eventualmente presentes. Nos camundongos que morreram antes do 11o dia pós-

inoculação, realizou-se pesquisa de taquizoítos no exsudato peritoneal. Os taquizoítos,

assim obtidos, dependendo da concentração e viabilidade, foram também inoculados

em outros camundongos com o objetivo de se obter cistos cerebrais.

3.3 – Obtenção de oocistos de T. gondii

Foram utilizados dois gatos, SRD (sem raça definida), entre dois e três meses de

idade, todos sorologicamente negativos (IFI) para a presença de T. gondii (anticorpos e

oocistos). Cada um deles recebeu aproximadamente 3 mL de um inóculo, contendo

aproximadamente 1500 cistos de T. gondii provenientes de cérebros dos camundongos

cronicamente infectados (cepa “P”). Para a inoculação dos gatos, adotou-se a

metodologia proposta por COSTA et al. (1977), tomando-se o cuidado de realizar a

lavagem da seringa utilizada com solução fisiológica, a fim de remover os cistos que

porventura estivessem aderidos às paredes da mesma. Além do macerado cerebral, os

gatos receberam vísceras (pulmão, coração e fígado) e, ainda, a carcaça dos

camundongos positivos para cistos, com o objetivo de aumentar o inóculo administrado.

Os felinos foram mantidos, isoladamente, em gaiolas metálicas, devidamente

adaptadas para recebê-los. Os animais foram colocados em ambiente fechado, sendo a

água e a ração fornecidas “ad libitum”. A cada 24 horas, os animais foram transferidos

para gaiolas limpas e os comedouros e bebedouros trocados. Os papéis utilizados para

forrar as gaiolas foram acondicionados em sacos de papel e incinerados. As gaiolas e o

recinto (piso e paredes) ocupados pelos gatos infectados foram tratados com água

quente (80ºC).

Exames coproparasitológicos (Método de Sheather), utilizando-se do volume

total de fezes excretadas durante 24 horas pelos gatos, foram realizados, diariamente,

durante 15 dias consecutivos pós-inoculação. As fezes recentemente colhidas foram

misturadas com água até a formação de uma massa pastosa. Uma solução de

sacarose (500g de açúcar dissolvidas em 320mL de água destilada) foi adicionada na

proporção 1:1 para homogeneização do material. Em seguida, este material foi filtrado

para a remoção das partículas maiores e transferido para tubos cônicos de centrífuga

de 50mL (Falcon). Do material, assim obtido, após centrifugação (3000 a 4000 rpm por

10 minutos), foram aspiradas alíquotas do sobrenadante, com auxílio de uma pipeta

Pasteur, para a pesquisa de oocistos de T. gondii em microscópio óptico (objetiva de

40X). Em cada uma das amostras de oocistos, assim obtidos, foi adicionada soluções

de ácido sulfúrico a 2% para auxiliar na esporulação. Assim, o material colhido

diariamente, foi mantido em temperatura ambiente em frasco, parcialmente fechado e

aerado mecanicamente duas vezes ao dia, durante 10 dias até a completa esporulação

dos oocistos (DUBEY et al., 1972).

Os oocistos esporulados foram lavados em solução fisiológica, por meio de

sucessivas centrifugações, para remoção do ácido sulfúrico 2% e estocados em

temperatura de refrigeração (4oC a 8oC), imersos em solução salina a 0,85%.

A identificação dos oocistos esporulados foi realizada utilizando-se critérios

morfológicos (ZAMAN, 1970), por meio da mensuração dos oocistos (10 a 12

micrômetros) em régua micrométrica ocular calibrada para a objetiva de aumento 40X

do microscópio óptico e por meio de inoculações intraperitoneais em camundongos

(DUBEY et al., 1972). Após a identificação, foi efetuada a quantificação total dos

oocistos em cada uma das datas de emissão das fezes, para cada um dos dois felinos,

por meio de cinco contagens em câmara de Neubauer, de acordo com a técnica

adotada por COSTA et al. (1977).

Para a inoculação nos ovinos, procedeu-se uma mistura de todas as amostras

fecais positivas, nos respectivos dias em que foram colhidas, para cada um dos felinos,

resultando assim em duas soluções (oriundas dos dois felinos). Posteriormente estas

soluções foram novamente examinadas, sendo o tamanho do inóculo definido mediante

contagem de oocistos em câmara de Neubauer.

3.4 – Obtenção de taquizoítos de T. gondii

Para a obtenção dos taquizoítos e padronização dos inóculos que posteriormente

foram administrados aos ovinos procedeu-se da seguinte forma: camundongos albinos

suíços fêmeas, com idade de 35 dias, receberam por via subcutânea exsudato

(contendo T. gondii) colhidos de outros camundongos previamente inoculados com

taquizoítos de T. gondii (cepa RH). Freqüentemente, alguns destes camundongos eram

eutanasiádos e posicionados em decúbito dorsal. Após o acesso à cavidade abdominal,

era feito um lavado intraperitoneal com injeção de 1,0 mL de solução fisiológica estéril e

posterior aspiração deste conteúdo.

Com o auxílio de microscopia óptica (objetiva de 40X), a concentração,

viabilidade e morfologia dos taquizoítos foram avaliadas para obtenção dos inóculos. A

padronização desta metodologia permite a obtenção de taquizoítos, em concentrações

variadas, presentes no exsudato intraperitoneal dos camundongos previamente

infectados por T. gondii (COSTA, 1979).

3.5 - Confecção de lâminas com antígeno para IFI

Para a realização da IFI foi utilizado, como antígeno, taquizoítos da cepa RH de

T. gondii, mantidos em solução salina estéril acrescida de heparina (25µl de heparina

em 50 mL de solução salina), obtidos de camundongos no segundo dia pós-infecção, e

inativados por formol a 0,5%, em estufa a 37oC por 30 minutos. Após centrifugação (um

minuto a 500 rpm), para sedimentar impurezas, o sobrenadante recolhido foi novamente

centrifugado (10 minutos a 1500 rpm), sendo descartado o novo sobrenadante. O

sedimento foi então ressuspenso em PBS e centrifugado mais uma vez. Após nova

ressuspensão do sedimento, o mesmo foi avaliado (microscopia óptica, objetiva de 40X)

quanto à quantidade de taquizoítos e então diluído em PBS até obter-se uma média de

20 a 30 taquizoítos por campo. Dez microlitros desta suspensão de taquizoítos foram

colocados em “poços” (impressos em lâminas de microscopia pela técnica de “Silk

Screen”). As lâminas contendo o antígeno foram mantidas à temperatura ambiente

(“overnight”), cobertas para evitar contaminação por poeira, para secarem. Em seguida,

as mesmas foram envoltas em papel alumínio e estocadas a –20oC até a utilização.

3.6 - Seleção e adaptação dos reprodutores ovinos p ara o experimento

Oito ovinos machos sorologicamente negativos para toxoplasmose, neosporose,

brucelose e leptospirose, clinicamente saudáveis, em idade reprodutiva, foram

selecionados de um total de 74 animais examinados, oriundos de propriedades rurais

dos municípios paulistas de Viradouro, Pitanguerias, Morro Agudo e Jaboticabal.

Amostras de sangue dos animais foram colhidas por venopunção jugular, em

tubos de vacutainer, sem anticoagulante. O material foi centrifugado a 2000 rpm, por 10

minutos, e os soros obtidos foram estocados a -20ºC, até o processamento. A técnica

sorológica empregada para detecção de anticorpos contra T. gondii foi a IFI - Reação

de Imunofluorescência Indireta (CAMARGO, 1964), utilizando-se de conjugado anti-IgG

específico para ovinos, marcado com isotiocianato de fluoresceína, sendo utilizadas as

diluições de 1:16 e 1:64. Foram consideradas como amostras positivas os soros que

apresentaram títulos iguais ou superiores a 1:16 (MAINARDI et al, 2003).

Empregou-se, também, a IFI para detectar a presença de anticorpos contra

Neospora caninum (CONRAD et al. 1993) sendo os soros dos animais usados nas

diluições de 1:50 e 1:100. Os ovinos com títulos sorológicos a partir de 1:50, foram

considerados positivos (FIGLIUOLO et al., 2004) e, conseqüentemente, descartados do

experimento.

Para pesquisa de anticorpos contra brucelose foi utilizada a Técnica do Antígeno

Acidificado Tamponado, também conhecida como Teste do Rosa Bengala ou “Card

Test” (ALTON et al., 1988). Para este teste, 0,03 mL do soro foi colocado em contato

com 0,03 mL do antígeno em placa de vidro própria. Em seguida, a mistura foi

homogeneizada e a placa mantida em movimentos rotatórios durante quatro minutos,

para observar a ocorrência, ou não, de grumos de aglutinação, indicativos da

soroconversão. Testou-se somente o antígeno Brucela abortus, em decorrência da

impossibilidade de obtenção do antígeno referente a Brucela canis, não mais produzido

pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento).

Quanto à leptospirose, a técnica empregada foi a Prova de Soroaglutinação

Microscópica. Os soros foram testados contra os sorovares pomona,

icterohaemorrhagiae e canicula. O critério adotado para considerar um soro reagente foi

de 50% de aglutinação no título final de 1:100, ou seja, metade das leptospiras

aglutinadas no campo microscópico, observado no aumento de 100X. Para a realização

da técnica e interpretação do grau de aglutinação foram adotadas as recomendações

do CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS (1985).

Após a realização de todos os exames sorológicos, os animais selecionados

foram alocados em boxes individuais descontaminados, pertencentes ao “Setor de

Ovinos e Caprinos” do CPPAR - Centro de Pesquisas em Sanidade Animal da FCAV –

UNESP, Campus de Jaboticabal. Posteriormente, foram desverminados, examinados

clinicamente e submetidos a quarentena (quatro semanas) para detecção de eventuais

alterações clínicas e/ou laboratoriais que pudessem interferir nos resultados

experimentais. Durante o período de adaptação pré-experimental (40 dias) os ovinos

receberam água e ração “ad libitum”.

3.7 – Condicionamento dos reprodutores ovinos à col heita de sêmen

Durante esta fase pré-experimental, os animais foram submetidos à colheita de

sêmen pelo método artificial, com o uso de eletro-ejaculador, a cada sete dias, por um

período de quatro semanas, para obtenção de sêmen e, conseqüentemente, para que

estivessem aptos a doarem sêmen no decorrer do experimento.

3.8 – Inoculação dos ovinos reprodutores machos.

Após o período de adaptação, os animais foram identificados, sorteados e

distribuídos em grupos, conforme o delineamento experimental descrito na Tabela 2.

Tabela 2 . Delineamento experimental dos oito ovinos reprodutores submetidos à

infecção experimental por Toxoplasma gondii.

Número do

Ovino

Grupo

Oocistos de

Toxoplasma

gondii

Taquizoítos de

Toxoplasma gondii

Via de

inoculação

02 2x 105 -- Oral

09 2x 105 -- Oral

16

I

2x 105 -- Oral

07 -- 1 x 106 Subcutânea

48 -- 1 x 106 Subcutânea

52

II

-- 1 x 106 Subcutânea

43 Placebo Oral

44 III

Placebo Oral

Os oocistos foram administrados por meio de seringa acoplada a uma sonda de

metal, para deposição direta no esôfago dos animais. Em seguida a inoculação dos

oocistos, foram administrados mais 100 mL de solução fisiológica estéril em cada

animal, para lavagem das paredes da seringa e/ou sonda, onde eventualmente os

oocistos pudessem estar aderidos.

Os taquizoítos foram administrados via subcutânea (na região da paleta),

utilizando-se seringas e agulhas estéreis conforme descrito por BRESCIANI (2003).

Posteriormente, os últimos dois animais foram inoculados com 100 mL de solução

fisiológica estéril, por via oral, constituindo, assim, o grupo controle.

Todos os animais foram mantidos isolados, em baias individuais, no Setor de

Ovinos e Caprinos – CPPAR, durante todo o período experimental. Exames sorológicos

para a detecção de anticorpos contra outras doenças infecciosas que possam provocar

desordens reprodutivas, (brucelose, neosporose e leptospirose) também foram

realizados em todos os ovinos experimentais, pré e pós-inoculação.

3.9 – Exames clínicos

Os reprodutores foram submetidos a exames clínicos (Freqüência cardíaca,

respiratória e temperatura retal), desde o primeiro dia antes da infecção e a cada três

dias até o 14º dia pós-inoculação (DPI). A partir desta data, tais exames passaram a ser

realizados semanalmente até 70º DPI.

3.10 – Determinação da parasitemia

A avaliação parasitêmica em camundongos, segundo a técnica descrita por

OLIVEIRA (1997). Amostras de sangue (10 mL) dos animais inoculados e controles

foram colhidas em tubo estéril contendo EDTA, nas mesmas datas dos exames clínicos.

Após centrifugação (3000 rpm por 15 minutos), a camada leucocitária foi

cuidadosamente aspirada com auxílio de pipeta Pasteur e inoculada,

intraperitonealmente, em grupos de três camundongos. Esses camundongos foram

observados por 15 minutos após as inoculações para avaliar possíveis efeitos adversos

à inoculação. Em seguida, avaliações diárias foram efetuadas até 42 dias pós-

inoculação para verificação de manifestações da infecção toxoplásmica.

Nos animais que apresentaram aumento de volume abdominal ou que morreram

até o 10o DPI, foi pesquisada a presença de taquizoítos de T. gondii por meio da

microscopia do exsudato peritoneal e “imprint” de pulmão dos mesmos. Nos animais

que morreram a partir do 11o até o 42o DPI, realizou-se a pesquisa de anticorpos

séricos contra T. gondii (IFI) (CAMARGO, 1964).

3.11 – Resposta imune humoral

Nos soros de todos os ovinos reprodutores infectados experimentalmente e dos

controles, obtidos um dia anterior à inoculação e nos dias 3, 5, 7, 11, 14 após a infecção

e, semanalmente, até o fim do experimento foram pesquisados anticorpos contra

T.gondii por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI), segundo CAMARGO

(1964).

A colheita de sangue foi feita por meio de punção da veia jugular com agulha 40

x 12 mm. Foram colhidos aproximadamente 10 mL de sangue sem anticoagulante de

cada animal. Este material foi processado para obtenção do soro, sendo centrifugado

por 10 minutos a 3000 rpm. O soro foi retirado com auxilio de pipeta de vidro e

acondicionado em microtubos previamente autoclavados, e mantidos sob congelamento

(-20oC).

Os soros dos ovinos foram diluídos em PBS (1:16 até 1:8192). A diluição de 16

microlitros de cada diluição de cada soro, foram depositados nos poços das lâminas

contendo o antígeno. As lâminas, assim preparadas, foram acondicionadas em câmara

úmida e incubadas a 37oC por 40 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas três

vezes (em tampão PBS, 10 minutos cada vez) e colocadas para secarem (seis minutos

em estufa a 37oC). Posteriormente, adicionou-se o conjugado gamaglobulina anti-IgG

total de ovino marcado com isotiocianato de fluoresceína, e as lâminas foram

novamente incubadas em câmara úmida (37oC por 40 minutos) em estufa. Nova

lavagem por duas vezes foi procedida com tampão PBS e uma vez com água

bidestilada (10 minutos cada lavagem) para remoção do excesso de sais. Após a

secagem definitiva das lâminas, glicerina tamponada foi adicionada às mesmas,

recobertas com lamínulas e examinadas em microscópio de fluorescência (objetiva de

40X).

3.12 – Exames no sistema reprodutor dos ovinos infe ctados experimentalmente

3.12.1- Colheita do sêmen

A cada sete dias, por um período de quatro semanas, os oito ovinos foram

submetidos ao “condicionamento” para a colheita de sêmen, com o uso de eletro-

ejaculador. Dos oito ovinos experimentais foram obtidos ejaculados um dia antes da

inoculação, prosseguindo, no período de 3, 5, 7, 11, 14 e, semanalmente, até o 70º DPI.

Os ejaculados foram recolhidos em tubos graduados acoplados à funis plásticos

previamente esterilizados. Estes foram mantidos a 37ºC e, no momento da colheita,

acoplados a um recipiente aquecido para evitar o choque térmico, que poderia

ocasionar mortalidade dos espermatozóides e alterações morfológicas.

Imediatamente após o término da ejaculação, o tubo contendo o sêmen foi

colocado em banho-maria (37ºC) para garantir a integridade espermática.

3.12.2 Parâmetros espermáticos

3.12.2.1 Motilidade e Vigor

Para avaliação da motilidade (expressa em % de espermatozóides que se

movimentam em trajetória retilínea e para frente) e do vigor (intensidade com que esta

motilidade é exercida), imediatamente após a colheita, uma alíquota do sêmen

(aproximadamente 10µL) foi colocada sobre lâmina e recoberta por lamínula

(previamente aquecidas a 37ºC) e observada ao microscópio óptico (aumentos de 10 e

40X). Os dados foram expressos em porcentagem (motilidade), numa escala de 0 a 5

(vigor), e anotados em fichas próprias para posterior análise.

3.12.2.2 Concentração e volume

Para análise da concentração espermática foram obtidas alíquotas de 5µl,

diluídas em 4.995µl de solução salina formol. A concentração foi estimada por meio da

contagem em câmara de Neubauer, conforme MAIA (1998). O volume seminal

mensurado por meio da observação direta dos tubos graduados.

3.12.2.3 Morfologia espermática

Para a análise da morfologia espermática foram obtidas alíquotas de 50µl,

diluídas em 1 mL de solução salina formol (0,9%). A morfologia seminal, para evidenciar

possíveis patologias espermáticas, foi realizada de acordo com critérios padronizados

por BLOM (1973), utilizando-se de microscopia de contraste de fase, conforme o

Manual de Exame Andrológico e Avaliação de Sêmen Animal do COLÉGIO

BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL (1998).

3.13 – Bioensaio em Camundongos

Para o isolamento de T. gondii das amostras de sêmen (todas as frações)

colhidas, foi utilizada a metodologia proposta por TEALE et al. (1982), modificada.

Foram separadas duas amostras de sêmen (0,5mL cada amostra) de cada animal. Em

0,5 mL da amostra seminal, foi acrescido 0,5mL da solução tampão (PBS), com pH 7,2,

autoclavado e antibiótico (ampicilina, 1 mg/mL). Cinco camundongos foram inoculados,

via intraperitoneal, com 1mL da alíquota espermática diluída. Os camundongos foram

observados e examinados conforme metodologia adotada por OLIVEIRA (1997) e

BRESCIANI (1999).

3.14 – Pesquisa do DNA de T. gondii pela PCR

Alíquotas de 1mL de sêmen (não diluído) de cada animal infectado, foram

devidamente armazenadas para posterior processamento da técnica de PCR (BURG et

al. 1989 e FUENTS et al. 1996).

Escalas de diluição de taquizoítos de T. gondii (cepa RH) foram realizadas,

usando como diluente tampão PBS ou sêmen. Após obtenção dos taquizoítos por

lavagem intraperitoneal dos camundongos, previamente inoculados, a concentração foi

aferida em câmara de Neubauer e o volume final ajustado para 1,0 x 107 taquizoítos/mL

(de PBS ou sêmen ou tecido). A partir desta diluição inicial, 500µL da mesma foram

diluídos em 9,5 mL de água de MiliQ estéril e assim sucessivamente, obtendo-se as

diluições de 107, 106 , 105, 104 , 103 , 102 , 101 e 100 parasitos por mL. O material assim

obtido foi mantido congelado (-20oC) até a extração do DNA.

3.14.1 - Extração do DNA das amostras do controle p ositivo e das amostras de

sêmen e tecidos

Todas as amostras de sêmen (positivas para a presença de T. gondii em

camundongos inoculados) obtidas ao longo do experimento foram avaliadas quanto à

presença do T. gondii pela técnica de PCR.

O DNA de T. gondii das escalas de diluição (controle positivo) e das amostras de

sêmen para a detecção do DNA de T. gondii foi extraído segundo metodologia

preconizada por SAMBROOK & RUSSELL (2001).

Uma alíquota de 100µL (sêmen e tecido) previamente preparado para a extração

de DNA, foi transferida para um microtubo de 1500 µL. A esta, foram acrescidos 900 µL

de tampão PBS, pH 7,2, previamente autoclavado. Após homogeneização, o material

foi então centrifugado (8000 rpm por 6 min) para lavagem, sendo o sobrenadante

removido por inversão. Ao sedimento, foram acrescentados 100 µL de PBS e 400 µL da

solução de lise (2% β-mercaptoetanol, 10 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5%

SDS e 100 mM de NaCl). Após agitação em vortex, a amostra foi incubada em banho

Maria (37oC) por 30 minutos. Foram então adicionados 5µL de Proteinase K (200µg/mL)

e nova incubação em banho Maria (37oC por 12 a 16 horas). Na seqüência, foram

realizadas duas extrações de DNA com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Em

seguida, foram acrescentados 10% do volume de uma solução de Acetato de Sódio

para precipitação do DNA. Na seqüência, foi adicionado etanol 100%, gelado (duas

vezes o volume). O material foi então agitado levemente com movimentos manuais até

a formação da “medusa” de DNA. Em seguida, o material foi centrifugado (12000-16000

rpm por 20 min), o sobrenadante descartado por inversão e 900µL de etanol 70% foram

acrescidos. O DNA precipitado foi submetido à agitação (vortex) para se desprender o

pellet. Nova centrifugação (12000-16000 rpm por 20 min) e o sobrenadante foi

desprezado por inversão e o tubo contendo o DNA foi deixado a secar de boca para

baixo em papel absorvente. O DNA foi ressuspendido em 50 µL de água miliQ

autoclavada e mantido em temperatura ambiente “overnight” para, em seguida, ser

estocado sob temperatura de congelamento (-20oC) até realização da PCR.

A quantificação do DNA foi realizada por meio de espectrofotometria em

absorbância de 260nm e corrida eletroforética, em gel de agarose 0,8% corado com

brometo de etídio, de 5µL do DNA previamente extraído. Foi utilizado o padrão de peso

molecular λ (50ng/10µL) e, por comparação visual, a quantidade de DNA foi estimada.

3.14.2 – Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Para a detecção do DNA de T. gondii nas amostras de sêmen e tecidos

analisadas, foi amplificado um fragmento do gene B1 de T. gondii de 194 pares de

bases (bp) utilizando-se os “primers” 5’–GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3’ (B11) e

5’TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC –3’ (B12), descritos por BURG et al. (1989) e

FUENTES et al. (1996). A reação de polimerização em Cadeia (Polimerase Chain

Reaction) SAIKI et al. (1988) foi feita pela adição de 500ng de DNA molde em um meio

de reação contendo MgCl2 2mM, KCl 50mM, Tris-HCl 10mM pH 9, Triton X-100 0,01%,

dNTPs 0,2mM, 10pmoles de iniciador e 5,0 unidades de TaqDNA polimerase.

Tabela 3 . Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):

PASSO TEMPO TEMPERATURA (ºC)

1 2 minutos 95

2 1 minuto 95

3 30 segundos 55

4 1 minuto 72

5 35 vezes (passo 2 a 4) -

6 7 minutos 72

7 - 4

As reações foram realizadas em termociclador modelo Mastercycler gradient®

(Eppendorf).

3.14.3 – Eletroforese em gel de agarose para anális e dos produtos amplificados

na PCR

A análise dos produtos amplificados foi feita por eletroforese em gel de agarose

2% preparado em tampão de TAE 1X (Tris-Acetato 40 mM, EDTA 0,1 mM). As

eletroforeses foram realizadas neste mesmo tampão à temperatura ambiente. Géis de

agarose contendo fragmentos de restrição separados por eletroforese foram corados

em solução de Brometo de Etídeo 0,5 µg/mL em água por 20 minutos e observados em

trans-iluminados UV.

3.15 - Pesquisa do Toxoplasma gondii em testículos, epidídimos, vesícula seminal

e próstata dos ovinos reprodutores

3.15.1 – Exames anátomo-histopatológicos nos órgãos reprodutores dos ovinos

Os animais foram necropsiados para realização de exames anátomo-

histopatológicos dos ovinos, inclusive os do grupo controle. Amostras dos seguintes

tecidos foram colhidas para exames histopatológicos e para isolamento de T. gondii por

meio da técnica da bioprova, Imunoistoquímica e PCR: testículos, epidídimos, vesícula

seminal e próstata. Para exames histopatológicos e imunoistoquímica, o material

colhido foi fixado em formol tamponado a 10%, por um período de 24 horas, sendo

então transferido para uma solução de álcool 70%. Em seguida o material foi

emblocado em parafina histológica e armazenado desta forma até a realização dos

exames.

3.15.2 - Bioensaio em camundongos

O bioensaio de amostras de testículos, epidídimos, vesícula seminal e próstata

colhidas, inclusive do grupo controle, foi realizado de acordo com o protocolo descrito

por DUBEY (1998). Os tecidos foram primeiramente cortados em pequenos pedaços,

sendo removidos o tecido conectivo e a gordura. A vesícula seminal e a próstata foram

utilizadas integralmente, enquanto que o testículo e epidídimo foram utilizados para

completar 100g de tecidos. O “pool” de tecidos foi homogeneizado com cinco volumes

de NaCl 0,15M (salina) sendo usado um homogenizador de uso doméstico.

Ao material homogeneizado adicionou-se o mesmo volume de uma solução de

pepsina ácida, pH 1,1 – 1,2 (pepsina, 2,6g; HCl, 7,0mL; água destilada suficiente para

500mL de solução), recém preparada e aquecida em banho-maria a 37ºC. A mistura foi

incubada em estufa a 37ºC por uma hora sobre agitador magnético.

Após a incubação, a suspensão foi coada por meio de duas camadas de gaze, o

coado transferido para cinco tubos cônicos de 50mL e centrifugado a 1.200 giros por 10

minutos. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento de cada tubo foi então

neutralizado pela adição gradual de bicarbonato de sódio a 1,2%, pH 8,3, recém-

preparado (ao redor de 5,0mL por tubo). A neutralização foi percebida visualmente pela

mudança de cor do sedimento. Após homogeneização, o material foi transferido para

um vidro único tubo cônico, completando-se o volume para 50mL com salina, e

centrifugado a 1.200 giros por 10 minutos. Novamente, o sobrenadante foi desprezado

e o sedimento homogeneizado com salina (v/v) contendo 2000U de penicilina e 200ug

de estreptomicina por mililitro.

Imediatamente a amostra foi inoculada em grupo de 15 camundongos.

Esses camundongos inoculados (1mL/camundongo) foram observados

diariamente, por seis semanas (COSTA et al., 1977), para a avaliação da presença de

sinais clínicos da toxoplasmose. Naqueles que apresentaram pêlos eriçados e/ou

aumento de volume abdominal durante este período, foi pesquisada a presença de

taquizoítos de T. gondii no exsudato peritoneal e “imprint” de pulmão. Os sobreviventes

foram exsanguinados para pesquisa de anticorpos (IFI - CAMARGO, 1964) e cistos

cerebrais de T. gondii, em amostras de soros e cérebros dos camundongos

respectivamente.

3.15.3 – Imunoistoquímica em órgãos do sistema repr odutor dos ovinos

Fragmentos de testículos, epidídimos, vesícula seminal e próstata dos ovinos

reprodutores (controle e inoculados), colhidos e processados conforme item 3.15.1,

foram analisados pela Imunoistoquímica para pesquisa de possíveis antígenos de T.

gondii. Para tanto, foi utilizado o método imuno-enzimático de amplificação com o

complexo estrepto-avidina com peroxidase-biotina (Kit LSAB/HRP, Dako, USA)

conforme GUESDON et al. (1979).

Os tecidos incluídos em parafina foram submetidos à microtomia para obtenção

de secções histológicas de 3µm de espessura, estendidas em lâminas silanizadas e

incubadas em estufa a 55oC por seis horas para fixação dos cortes. Os cortes

histológicos foram submetidos a desparafinização em xilol, seguida de banhos em

álcoois gradualmente hidratados (álcool absoluto, álcool a 95%, álcool a 80%) e em

água destilada.

Foi empregado anticorpo policlonal contra T. gondii produzido por MINEO (2002

– comunicação pessoal), cuja diluição otimizada para o ensaio imunoistoquímico foi de

1:5000.

Após desparafinização e hidratação, os cortes foram submetidos a dois banhos

(10 min) em peróxido de hidrogênio a 6%, para bloqueio da peroxidase endógena,

seguidos de lavagens em água destilada e solução tampão (PBS – pH 7,2).

O anticorpo foi diluído a 1:5000 em solução de soroalbumina bovina (BSA) a 1%

em PBS contendo 0,1% de azida sódica. O BSA foi utilizado para o bloqueio de

possíveis ligações inespecíficas entre outras proteínas presentes na solução de

anticorpos e os tecidos em estudo, evitando-se, desta forma, reações espúrias (“de

fundo”).

O anticorpo diluído foi, então, aplicado aos cortes e estes incubados em câmara

úmida a 37oC por 30 minutos e, em seguida, a 4oC por 18 horas. Após este

procedimento, foram realizadas três lavagens em PBS, de 5 minutos cada, seguindo-se

nova incubação com anticorpo biotinilado (solução de anticorpos biotinilados contra

imunoglobulinas de coelho/camundongo/cabra), em câmara úmida a 37oC por 30

minutos. Em seguida, foram realizadas três lavagens em PBS (5 min cada) e o material

foi então incubado com estrepto-avidina-biotina-peroxidase, em câmara úmida a 37oC

por 30 min.

Após nova etapa de lavagens em PBS (3 banhos de 30 min cada), as amostras

foram reveladas por meio de um banho em solução contendo substrato (peróxido de

hidrogênio a 0,1%) e cromógeno (diaminobenzidina 60 mg%, Sigma D5637, USA) em

PBS. Na seqüência, o material foi lavado em água corrente e em água destilada e

submetido a contracoloração com hematoxilina de Harris. Finalizando o procedimento, o

material foi desidratado em álcoois, diafanizado em xilol e montado entre lâmina e

lamínula empregando resina sintética (Entellan, Merck, Germany).

A reação foi acompanhada de controles positivo e negativo, sendo este último

submetido a todas as etapas do procedimento técnico, suprimindo-se, entretanto, a

aplicação do anticorpo primário contra T. gondii. A presença do antígeno foi revelada

pela coloração acastanhada assumida pelo parasita presente no tecido.

3.15.4 Pesquisa do DNA de T. gondii em tecidos pela PCR

Um pool dos respectivos tecidos (testículos, epidídimos, vesícula seminal e

próstata) dos ovinos reprodutores (inoculados e controle) foi realizado conforme item

3.15.2, e devidamente armazenados para posterior processamento da técnica de PCR

conforme item 3.14.2.

4 – ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os parâmetros pré e pós-inoculação foram avaliados por meio de um

delineamento em parcela subdividida no tempo (“Split Plot in Time”), considerando-se

os inoculados e controle. Testes de F, para efeitos dos tratamentos, e de Tukey, para

as comparações entre os tratamentos, foram aplicados. Todas as análises estatísticas

foram realizadas com auxílio do programa SAS, (2001).

5. RESULTADOS

5.1 Obtenção de taquizoítos de T. gondii

Após padronização da técnica para manutenção da cepa “RH” de T.gondii em

camundongos, foi possível obter lavados peritoneais ricos em taquizoítos. Após

avaliação, os mesmos eram inoculados via subcutânea em novos camundongos,

procedendo assim, a cada dois dias a fim de se manter a cepa em condições de uso.

Para obtenção dos inóculos, contendo taquizoítos, destinados aos ovinos

experimentais, camundongos foram eutanasiádos, os taquizoítos recuperados de

lavados peritoneais, padronizados e imediatamente inoculados nos reprodutores.

5.2 Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoít os de T.gondii

Camundongos inoculados intraperitonealmente com a cepa “P” foram medicados

com sulfadiazina, durante 10 dias, para obtenção de maiores quantidades de cistos de

T. gondii. Decorridos 30 dias pós-inoculação, 20 camundongos foram eutanasiádos,

sendo removidos os respectivos encéfalos. A padronização e a quantificação de cistos,

para serem inoculados nos gatos, obedeceram os critérios já descritos anteriormente

nas etapas experimentais executadas.

5.3 Obtenção de oocistos de T.gondii

Do primeiro gato inoculado, via oral, com 1500 cistos cerebrais de T.gondii, foi

possível recolher de suas fezes aproximadamente 1,0 x 106 oocistos esporulados após

somatória dos valores diários, encontrados do quarto até o nono dia pós-inoculação. O

pico de eliminação ocorreu no quarto dia, obtendo-se aproximadamente 485000

oocistos esporulados.

Do segundo gato, inoculado com 885 cistos de T. gondii, foi possível recolher

612500 oocistos esporulados eliminados em três dias (5º, 6º e 7º DPI), ocorrendo o pico

de liberação no sexto dia pós-inoculação .

Os oocistos produzidos foram identificados como de T. gondii por meio de

critérios morfológicos (ZAMAN, 1970) e pela sua infectividade, avaliada por inoculação

intraperitoneal em camundongos (2500 oocistos por animal, totalizando 15

camundongos). Tais camundongos vieram a óbito entre o 10º e o 12º dia pós-

inoculação. No lavado peritoneal de 80,0% dos camundongos que vieram a óbito, foram

encontrados taquizoítos viáveis em quantidades variadas. Os camundongos

sobreviventes, após seis semanas de inoculação, apresentaram cistos cerebrais de T.

gondii.

5.4 Seleção dos ovinos reprodutores

Os resultados dos exames sorológicos realizados em 74 ovinos machos,

relativos à presença de anticorpos contra Toxoplasma gondii, Neospora caninum,

Brucela abortus e Leptospira sorovares pomona, icterohaemorrhagiae e canicula, foi

possível selecionar oito ovinos negativos para as quatro enfermidades supracitadas.

Estes resultados sorológicos encontram-se sumariados na Tabela 4.

Tabela 4 . Resultados sorológicos para Toxoplasmose, Neosporose, Brucelose e

Leptospirose dos ovinos examinados para seleção dos grupos experimentais infectados com Toxoplasma gondii.

Enfermidade avaliada/ nº de ovinos

Resultado da Sorologia Toxoplasmose Neosporose Brucelose Leptospirose

Positiva 39 06 20 13

Negativa 35 68 54 61

Total 74 74 74 74

5.5 Exames clínicos

Durante as quatro semanas que antecederam a inoculação (período de

treinamento para as colheitas de sêmen) não foram observadas quaisquer alterações

clínicas nos ovinos, com relação aos parâmetros de temperatura corporal, freqüências

respiratória e cardíaca, avaliados semanalmente durante esta fase.

Nas Tabelas 5, 6 e 7 e Figuras 1, 2 e 3 estão registrados os dados clínicos

(temperatura corporal, freqüências cardíaca e respiratória, respectivamente) dos

animais, obtidos um dia antes da inoculação e nos dias 1, 3, 5, 7 e, semanalmente, até

o 70º DPI.

5.5.1 Temperatura corporal

A temperatura corporal (retal) média dos ovinos do grupo controle (média

aritmética), nas condições climáticas verificadas durante o experimento, foi de 38ºC.

Considerando que a temperatura normal de ovinos oscila entre 37,5°C e 39,5°C,

adotou-se essa faixa como sinal de normotermia. Analisando-se a média de cada um

dos grupos experimentais, observamos a ocorrência de hipertermia nos ovinos

inoculados com taquizoítos no 3°, 5° e 7° DPI. Nos animais inoculados com oocistos de

T. gondii, o aumento da temperatura corporal foi assinalado, de forma similar, no 5º e 7º

DPI. A Tabela 5 e Figura 1 permitem uma melhor visualização destes resultados.

Tabela 5: Temperaturas retais médias mensuradas nos ovinos experimentais até 70 dias pós- inoculação com T. gondii .

43 38,7 38,3 38,2 38 37,9 38,2 38,3 39,2 38,3 38,5 39,8 38,6 37,9 38,9

44 38,1 38,7 38,4 38 37,8 37,4 37,7 39,1 37,5 38,3 39,1 38,3 37,5 38,5

Média 38,40 38,50 38,30 38,00 37,85 37,80 38,00 39,15 37,90 38,40 39,45 38,45 37,70 38,70

7 39 40 40,7 41 39 38,6 39,2 39,1 38,7 39,2 38,3 39,2 38,3 39

48 39,1 41 40,9 38,7 38,7 39,3 39,3 38,9 39,5 39,1 38,9 38,1 38,1 38,6

52 39,3 39,6 40,3 39,7 39 38,4 38,9 39,3 39 39,4 39,1 39 37,9 38,8

Média 39,13 40,20 40,63 39,80 38,90 38,77 39,13 39,10 39,07 39,23 38,77 38,77 38,10 38,80

2 38,2 37,7 41,9 39,2 38,5 37,9 38,8 39,1 39,6 38,6 39 38,3 38,8 38,5

9 39,3 39,6 41,9 40,6 39,3 38,8 38,9 39,2 38,9 38,8 39 38,9 39,1 38,9

16 39,3 39,3 41,9 40,5 38,8 38,4 38,5 39,2 39,1 39 39,5 38,7 38,8 38,4

Média 38,93 38,87 41,90 40,10 38,87 38,37 38,73 39,17 39,20 38,80 39,17 38,63 38,90 38,60

Taq

uizo

ítos

InóculoOvino

Nº 497 14 7028 35 42

Ooc

isto

s

Temperatura °C/Dias pós inoculação

Con

trol

e

-1 3 5 11 21 56 63

35,0

36,0

37,0

38,0

39,0

40,0

41,0

42,0

43,0

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70

Dias pós-inoculação

Tem

pera

turt

a re

tal (

ºC)

Controle (GI) Taquizoíto (GII) Oocisto (GIII)

Figura 1 . Temperaturas retais médias mensuradas nos ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.

5.5.2 Freqüência cardíaca

Com base na variação das freqüências cardíacas médias obtidas dos ovinos do

grupo controle, de forma análoga à temperatura corporal, estabeleceu-se, como

parâmetro de freqüência cardíaca, o valor de 84 a 137 batimentos por minuto como

padrão da normalidade.

Para os animais inoculados com taquizoítos, bradicardia pôde ser observada no

56o DPI, sendo que os dias restantes mantiveram-se dentro dos parâmetros de

normalidade. Nos ovinos que receberam oocistos, taquicardia foi registrada no 63o DPI.

Estes resultados também estão registrados na Tabela 6 e Figura 2.

Tabela 6: Freqüências cardíacas médias mensuradas n os ovinos experimentais até 70 dias pós- inoculação com T. gondii.

43 134 174 124 88 100 120 120 80 104 120 120 108 96 160

44 84 100 140 80 100 88 96 108 98 140 96 84 100 108

Média 109,00 137,00 132,00 84,00 100,00 104,00 108,00 94,00 101,00 130,00 108,00 96,00 98,00 134,00

7 76 108 112 90 80 100 100 100 80 152 108 60 100 104

48 152 160 152 120 124 88 116 100 124 128 72 56 80 92

52 124 120 100 148 132 116 96 120 128 120 112 68 88 128

Média 117,33 129,33 121,33 119,33 112,00 101,33 104,00 106,67 110,67 133,33 97,33 61,33 89,33 108,00

2 72 88 62 85 120 96 96 108 106 128 80 104 120 150

9 108 100 152 88 120 92 100 104 112 160 148 136 190 120

16 84 84 156 120 100 92 96 156 124 160 116 148 120 120

Média 88,00 90,67 123,33 97,67 113,33 93,33 97,33 122,67 114,00 149,33 114,67 129,33 143,33 130,00

Ovino Nº

Inóculo42 4914 21 285 7 11

Taq

uizo

ítos

Ooc

isto

s

Frequência cardíaca (bpm)/Dias pós inoculação

-1 353 7056 63

Con

trol

e

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70


Fre

qüên

cia

card

íaca

(bp

m)


Figura 2 . Freqüências cardíacas médias mensuradas nos ovinos não inoculados

(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.

5.5.3 Freqüência respiratória

A média da freqüência respiratória detectada nos ovinos do grupo controle foi de

16 a 32 movimentos respiratórios por minuto, sendo esta amplitude indicativa de

normopnéia. Com base nestes dados, taquipnéia foi observada naqueles animais

inoculados com taquizoítos no 3o dia pós-infecção. Nos ovinos que receberam oocistos,

aumento dos movimentos respiratórios ocorreu no 5o dia pós-inoculação. Tais

resultados estão registrados na Tabela 7 e Figura 3.

Tabela 7: Freqüências respiratórias médias mensurad as nos ovinos experimentais até 70 dias pós- inocul ação com T. gondii .

43 28 28 28 28 24 24 28 32 12 24 20 24 28 24

44 20 20 20 24 31 24 24 32 20 16 20 20 24 20

Média 24 24 24 26 27,5 24 26 32 16 20 20 22 26 22

7 20 36 24 20 28 24 24 28 20 28 20 20 28 24

48 36 40 36 28 32 24 32 28 28 28 32 24 32 32

52 20 24 32 24 20 32 24 24 28 16 24 24 28 28

Média 25,33 33,33 30,67 24,00 26,67 26,67 26,67 26,67 25,33 24,00 25,33 22,67 29,33 28,00

2 20 16 20 20 20 24 28 24 20 20 20 20 24 20

9 36 40 40 20 28 24 32 24 28 24 36 32 28

16 24 32 44 24 27 24 24 24 20 24 32 28 28 20

Média 26,67 29,33 34,67 22,00 22,33 25,33 25,33 26,67 21,33 24,00 25,33 28,00 28,00 22,67

6314 21 28 35

Frequencias respiratórias (mpm)/Dias pós inoculação

-1 3 5 7 11 7042 49 56

Con

trol

eT

aqui

zoíto

sO

ocis

tos

Ovino Nº

Inóculo

0

5

10

15

20

25

30

35

40

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70


Fre

qüên

cia

resp

irató

ria (

mpm

)


Figura 3 . Freqüências respiratórias médias mensuradas nos ovinos não inoculados

(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.

5.5.4 Outros sinais clínicos

Sinais clínicos, além dos parâmetros vitais (temperatura corporal, freqüências

cardíaca e respiratória), também puderam ser observados durante o experimento. Os

três ovinos inoculados com oocistos apresentaram fezes pastosas, inapetência e apatia

no 5º e 7° DPI, coincidindo com o quadro de hiperte rmia (Figuras 4, e 5).

Figura 4 . Apatia dos animais inoculados com oocistos de Toxoplasma gondii no 5º DPI.

Figura 5 . Apatia dos animais inoculados com oocistos de Toxoplasma gondii no 7º DPI.

5.6 Exames do sistema reprodutor dos ovinos infecta dos experimentalmente

5.6.1 Parâmetros espermáticos

Conforme a literatura consultada, o volume de ejaculado considerado normal

para ovinos a partir de dez meses de idade é de, no mínimo, 1,0 mL. No entanto,

considerou-se a média do volume ejaculado dos ovinos do grupo controle,

aproximadamente 1,1 mL, como valor de normalidade. A motilidade espermática, pelos

mesmos critérios, não deve ficar aquém dos 70% dos espermatozóides de um

reprodutor normal e o vigor, determinado por MAIA, (1998), teve seu limite fixado entre

0 e 5.

Diminuição do volume do ejaculado pôde ser observada nos ovinos inoculados

com taquizoítos no 42º DPI e somente no 63o DPI, naqueles que receberam oocistos.

Para os animais inoculados com taquizoítos, diminuição da motilidade

espermática (<70%) foi observada nos 3o, 7o, 11o, 21o, 35o, 42o, 49o, 56o, 63o e 70o DPI

(P>0,05). De forma semelhante, o mesmo ocorreu com o sêmen dos ovinos do grupo

inoculado com oocistos nos dias 3, 5, 7, 35, 42, 49, 63 e 70 pós-inoculação (P>0,05).

No 49º DPI observou-se uma diminuição (P<0,05) na avaliação do vigor dos

espermatozóides nos animais inoculados com taquizoítos, em relação ao grupo

controle. Também foi verificada (no 21º DPI), diferença estatística (P<0,05) no volume

seminal dos animais de ambos grupos inoculados (oocistos e taquizoítos) quando

comparados com aqueles pertencentes do grupo controle.

Os resultados acima descritos podem ser visualizados nas Tabelas 8, 9, 10 e 11

e Figuras 6, 7, 8, 9 e 10.

Tabela 8. Parâmetros seminais e patologias espermát icas de ovinos inoculados com oocistos

Cabeça Cauda

2 4 75 2 117 0 3 Positivo

9 1 40 2 17,6 0 2 Positivo

16 3,5 75 4 15,9 1 2 PositivoMédia 2,83 63,33 2,67 50,17 0,33 2,33

2 1,5 0 0 6 1 2 Positivo

9 1,1 90 5 70 1 1 Negativo

16 3,8 0 0 59,25 0 0 NegativoMédia 2,13 30,00 1,67 45,08 0,67 1,00

2 1,8 20 1 143,4 0 2 Negativo

9 2,4 80 4 226,5 0 3 Positivo

16 2,1 5 0 113,5 0 1 PositivoMédia 2,10 35,00 1,67 161,13 0,00 2,00

2 1,6 40 2 55,5 0 1 Negativo

9 1,7 80 4 103 2 3 Positivo

16 1,5 60 4 125 1 1 NegativoMédia 1,60 60,00 3,33 94,33 1,00 1,67

2 1,5 80 4 202 1 1 Negativo

9 1,5 80 , 4 176 1 1 Positivo

16 0,8 75 4 37,5 4 2 NegativoMédia 1,27 78,33 4,00 138,50 2,00 1,33

2 1,3 80 4 12 0 3 Positivo

9 2 70 3 23 0 2 Positivo

16 1,5 90 5 46 1 2 PositivoMédia 1,60 80,00 4,00 27,00 0,33 2,33

2 1 50 3 35 1 7 Negativo

9 1 80 4 59 0 2 Positivo

16 1 95 5 29 1 1 NegativoMédia 1,00 75,00 4,00 41,00 0,67 3,33

2 2,2 80 4 12,5 0 6 Positivo

9 1 70 4 36,5 0 4 Positivo

16 1,1 90 5 73 0 1 NegativoMédia 1,43 80,00 4,33 40,67 0,00 3,67

2 1 50 2 36 0 10 Positivo

9 1 30 1 27 0 5 Positivo

16 2 90 5 132 0 4 NegativoMédia 1,33 56,67 2,67 65,00 0,00 6,33

2 1,8 10 0 16 1 5 Negativo

9 1 10 0 53 1 2 Negativo

16 1 90 5 24 1 2 NegativoMédia 1,27 36,67 1,67 31,00 1,00 3,00

2 1,7 90 4 216 0 6 Negativo

9 1 80 3 36 1 3 Positivo

16 1 90 4 55 0 1 NegativoMédia 1,23 86,67 3,67 102,33 0,33 3,33

2 1,5 80 4 44 1 4 Negativo

9 1 60 2 56 1 5 Positivo

16 1,2 90 4 18 0 4 NegativoMédia 1,23 76,67 3,33 39,33 0,67 4,33

2 1 70 3 13 1 7 Positivo

9 1 25 3 21 0 4 Positivo

16 0,9 80 4 39,50 0 1 NegativoMédia 0,97 58,33 4,00 24,50 0,33 4,00

2 0,8 50 2 47,7 0 5 Positivo

9 1,2 35 1 18,5 0 4 Positivo

16 1 5 1 40 0 1 NegativoMédia 1,00 30,00 1,33 35,40 0,00 3,33

Parâmetros Seminais

Vigor (0-5)Concentração

(x106 sptz/mL)Celularidade

Patologias (%)

7

11

Volume (mL)

Motilidade (%)

63

70

28

35

42

49

de Toxoplasma gondii .

* Dias pós-inoculação

DPI*Número do

ovino

5

14

21

-1

3

56

Tabela 9. Parâmetros seminais e patologias espermát icas de ovinos inoculados com taquizoítos

Cabeça Cauda7 1 90 4 16,5 1 5 Positivo

48 1,3 75 3 15,25 2 4 Positivo

52 1 85 4 135,5 2 5 PositivoMédia 1,10 83,33 3,67 55,75 1,67 4,67

7 0,4 70 3 20,7 2 4 Negativo

48 1,5 30 2 30 2 1 Positivo

52 1,5 80 3 52 1 1 NegativoMédia 1,13 60,00 2,67 34,10 1,67 2,00

7 1,5 80 3 78,5 1 5 Positivo

48 1 60 3 54,25 0 4 Negativo

52 1 80 3 55,00 0 2 NegativoMédia 1,17 73,33 3,00 62,58 0,33 3,67

7 1,7 60 3 41 0 3 Positivo

48 0,8 5 0 38 0 1 Negativo

52 1,8 80 4 68 0 3 NegativoMédia 1,43 48,33 2,33 49,00 0,00 2,33

7 1,8 85 4 185 2 3 Positivo

48 1 20 , 1 78,5 1 4 Positivo

52 1,4 75 4 150,5 0 2 NegativoMédia 1,40 60,00 3,00 138,00 1,00 3,00

7 1 90 4 91,5 1 2 Negativo

48 1,5 90 5 34 1 1 Positivo

52 1,6 70 4 46,5 1 2 PositivoMédia 1,37 83,33 4,33 57,33 1,00 1,67

7 1,2 85 4 145 1 1 Negativo

48 2 80 4 57 0 3 Positivo

52 1 10 1 5 0 1 PositivoMédia 1,40 58,33 3,00 69,00 0,33 1,67

7 1,4 90 5 23 0 5 Positivo

48 0,8 90 5 54 0 2 Positivo

52 2 90 4 36 0 2 PositivoMédia 1,40 90,00 4,67 37,67 0,00 3,00

7 1,4 10 2 93 0 4 Negativo

48 1,2 90 5 60 0 5 Negativo

52 1,5 40 2 35 1 1 NegativoMédia 1,37 46,67 3,00 62,67 0,33 3,33

7 1 60 3 44 0 2 Positivo

48 0,8 50 2 70 2 4 Positivo

52 0,5 50 0 33 1 2 PositivoMédia 0,77 53,33 1,67 49,00 1,00 2,67

7 0,8 5 1 54 0 2 Positivo

48 1,3 70 3 66 0 4 Positivo

52 2,8 20 2 33,2 0 4 PositivoMédia 1,63 31,67 2,00 51,07 0,00 3,33

7 1,5 90 5 39 1 3 Negativo

48 1 25 1 43 1 2 Negativo

52 2,5 45 3 75,5 1 2 PositivoMédia 1,67 53,33 3,00 52,50 1,00 2,33

7 1 90 5 138 2 4 Negativo

48 1 70 1 25 0 5 Negativo

52 1 35 0 19,40 1 1 NegativoMédia 1,00 65,00 4,00 60,80 1,00 3,33

7 1,3 60 3 45,5 1 5 Negativo

48 0,8 12 0 12 1 4 Negativo

52 1,2 0 0 36 0 1 PositivoMédia 1,10 24,00 1,00 31,17 0,67 3,33


CelularidadeMotilidade (%) Vigor (0-5)Concentração (x10 6

sptz/mL)

Volume (mL)

Patologias (%)

3

-1

14

21

56

35

42

28

de Toxoplasma gondii .

* Dias pós-inoculação

DPI*Número do ovino

63

70

11

5

7

49

Tabela 10. Parâmetros seminais e patologias espermá tica de ovinos pertencentes ao grupo controle.

Cabeça Cauda

43 0,3 20 2 14,85 0 0 Negativo

44 1,5 60 2 24,08 1 0 Positivo

Média 0,90 40,00 2,00 19,47 0,50 0,00

43 0,3 60 3 25,85 0 3 Negativo

44 1,8 30 1 11,10 0 1 Negativo

Média 1,05 45,00 2,00 18,48 0,00 2,00

43 0,3 70 3 56,56 1 4 Positivo

44 1 60 2 57,00 0 3 Negativo

Média 0,65 65,00 2,50 56,78 0,50 3,50

43 0,8 40 2 22,5 0 3 Positivo

44 1 90 4 43,50 0 3 Negativo

Média 0,90 65,00 3,00 33,00 0,00 3,00

43 1,4 75 , 4 17,5 1 4 Negativo

44 1,4 65 3 54 2 1 Negativo

Média 1,40 70,00 3,50 35,75 1,50 2,50

43 1 50 3 12,6 2 1 Positivo

44 1 90 5 25,5 1 1 Positivo

Média 1,00 70,00 4,00 19,05 1,50 1,00

43 3 80 4 22,5 3 2 Positivo

44 2 90 4 95 1 1 Positivo

Média 2,50 85,00 4,00 58,75 2,00 1,50

43 0,1 70 3 5 1 2 Positivo

44 1,3 1 0 13,5 1 1 Positivo

Média 0,70 35,50 1,50 9,25 1,00 1,50

43 0,5 50 1 15 0 20 Positivo

44 1,2 40 1 45 0 1 Negativo

Média 0,85 45,00 1,00 30,00 0,00 10,50

43 1 60 2 30 2 4 Positivo

44 1,47 80 4 64 2 4 Positivo

Média 1,24 70,00 3,00 47,00 2,00 4,00

43 0,5 40 5 25 1 4 Positivo

44 0,5 90 4 55 1 1 Positivo

Média 0,50 65,00 4,50 40,00 1,00 2,50

43 0,8 10 2 19 0 2 Negativo

44 1,5 90 4 52 0 2 Positivo

Média 1,15 50,00 3,00 35,50 0,00 2,00

43 0,8 10 0 22 0 3 Positivo

44 1 3 0 67 0 2 Negativo

Média 0,90 6,50 4,00 44,50 0,00 2,50

43 0,9 10 1 35 1 2 Positivo

44 1,2 90 5 46 1 1 Positivo

Média 1,05 50,00 3,00 40,50 1,00 1,50* Dias pós-início do experimento

49

56

21


35

42

-1

3

Motilidade (%)

7

63

70

CelularidadeConcentração (x10 6

sptz/mL)Vigor (0-5)

Patologias (%)

28

5

Volume (mL)

11

14

DPI*Número do ovino

Tabela 11. Comparações multiplas e resultados da análise de variância dos parâmetros seminais e patologias espermáticas de ovinos

nos não inoculados (controle) e inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106 taquizoítos de Toxoplasma gondii.

B A B A A A A A A A A A A A A A A A A A Ab a a a a a ab a a a a a b ab a b ab a a a a

B A AB A A A A A A A A A A A A A A A A A Aab ab a a a a ab a a a a a b b a b ab a a a a

B A AB A A A A A A A A A A A A A A A A A Ab ab a a a a ab a a a a a b ab a b b ab a a a

A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Ab ab a a a a ab a a a a a b ab a a a a a a a

A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Aab b a a a a ab a a a a a b ab a b ab a a a a

A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Ab ab a a a a a a a a a a b ab a b ab a a a a

A B B A A A A A A A A A A A A A A A A A Aa b a a a a a a a a a a b ab a b a a a a a

A A A A A A B A A A A A A A A A A A A A Ab ab a a a a ab a a a a a b ab a b ab a a a a

A A A A A A A A A A A A A B B A A A A A Ab b a a a a ab a a a a a a a a b ab a a a a

A A A A A A A A A A A A A A A A B A A B A ab b a a a a ab a a a a a b ab a a a a a a a

B AB A A A A A AB B A A A A A A A A A A A Ab b a a a a a a a a a a b ab a a ab b a a a


A A A A A A B A AB A A A A A A A A A A A Ab b a a a a b a a a a a b ab a a a a a a a


3,64 NS 0,48 NS 0,27 NS 5,97 * 0,01 NS 0,01 NS 0,32 NS

1,35 NS 2,01 * 3,05 ** 3,33 ** 4,17 ** 4,98** 2,82 **

Grupos X Período 2,56 ** Grupos X Período 1,60 NSGrupos X Período 1,64 * Grupos X Período 1,39 NS

Grupos X Período 1,65 * Grupos X Período 1,56 * Grupos X Período 1,78 * *médias seguidas pela mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem entre si pelo Teste Tukey (P>0,05)

Análise de Variância

Grupos

Período

0,50 0,67 0,00

1,00 0,67 0,33

1,00 0,33 1,00

0,50 0,33 0,33

0,50 0,67 0,00

1,00 0,00 1,00

1,00 0,33 0,67

1,00 0,67 1,00

0,00 0,33 0,67

1,00 1,00 0,67

0,50 0,67 0,33

0,50 0,33 0,33

0,50 1,00 1,00

0,00 0,33 0,33

CelularidadeControle Oocistos Taquizoitos

0,90

1,07

0,67

0,90

1,40

1,00

2,50

0,70

0,87

1,23

0,50

1,17

0,90

1,07

2,83 1,10

2,13 1,13

2,10 1,17

1,60 1,43

1,27 1,40

1,60 1,37

Volume

0,97 1,00

1,00 1,10

1,23 1,63

1,23 1,67

1,33

1,67 4,33 4,67

Controle Oocistos Taquizoitos

1,00 1,40

1,43 1,40

4,00 4,00 4,33

4,00 4,00 3,00

3,00 3,33 2,33

3,67 4,00 3,00

2,67

2,67 1,67 3,00

Grupos

21

28

35

42

49

56

1,37

1,27 0,77


Val

or d

e F

e

Grupos

Período

Diapós-inoculação

Sig

nific

ânci

a

-1

3

5

7

11

14

63

70

MotilidadeControle Oocistos Taquizoitos

40,00 63,33 83,33

45,00 30,00 60,00

65,00 35,00 73,33

65,00 60,00 48,33

70,00 78,33 60,00

70,00 80,00 83,33

85,00 75,00 58,33

35,50 80,00 90,00

45,00 56,67 46,67

70,00 36,67 53,33

65,00 86,67 31,67

50,00 76,67 53,33

6,50 58,33 65,00

50,00 30,00 24,00


Período

Vigor (0 a 5)Controle Oocistos Taquizoitos

2,00 2,67 3,67

2,00 1,67

1,00 2,67 3,00

3,00 1,67 1,67

4,67 3,67 2,00

3,00 3,33 3,00


Grupos

Período

0,00 3,33 2,00

3,00 1,33 1,00

19,47 50,17 55,75

18,48 45,08 34,10

Concentração (x106 sptz/mL)Controle Oocistos Taquizoitos

56,78 161,13 62,58

33,00 94,33 49,00

35,75 138,50 138,00

19,05 27,00 57,33

58,75 41,00 69,00

9,25 40,67 37,67

30,00 65,00 62,67

47,00 31,00 49,00

40,00 102,33 51,07

35,50 39,33 52,50

44,50 24,50 60,80

40,50 35,40 31,17


Grupos

Período

Patologia de CabeçaControle Oocistos Taquizoitos

0,50 0,33 1,67

0,00 0,67 2,00

0,50 0,00 3,67

0,00 1,00 2,33

1,50 2,00 3,00

1,50 0,33 1,67

2,00 0,67 3,00

1,00 0,00 3,33

0,00 0,00 2,67

2,00 1,00 3,33

1,00 0,33 2,33

0,00 0,67 3,33

0,00 0,33 3,33

1,00 0,00 3,33


Grupos

Período

Patologia de CaudaControle Oocistos Taquizoitos

0,50 2,33 4,67

0,00 1,00 2,00

0,50 2,00 3,67

0,50 1,67 2,33

0,00 1,33 3,00

1,00 2,33 1,67

1,00 3,33 3,00

1,00 3,67 3,33

0,50 6,33 2,67

1,00 3,00 3,33

1,00 3,33 2,33

0,33


0,50 4,33 3,33

0,50 4,00 3,33

Grupos

Período

1,00 3,33

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70

Dias Pós-inoculação

Vol

ume

Esp

erm

átic

o M

édio

(m

L)

Controle Taquizoítos Oocistos

Figura 6 . Volume espermático médio (mL) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70

Dias Pós-inoculação

Mot

ilida

de E

sper

mát

ica

Méd

ia (

%)


Figura 7 . Motilidade espermática média (%) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70

Dias Pós-Inoculação

Vig

or E

sper

mát

ico

Méd

io (0

a 5

)


Figura 8 . Vigor espermático médio (0 - 5) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.

0,0

25,0

50,0

75,0

100,0

125,0

150,0

175,0

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70

Dias Pós-Inoculação

Con

cent

raçã

o E

sper

mát

ica

Méd

ia (

x10

8 )


Figura 9 . Concentração espermática média (x 106) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70


Pat

olog

ias

Esp

erm

átic

as

Cab

eça

(%)


Figura 10 . Patologias espermáticas médias de cabeça (%) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70


Pat

olog

ias

Esp

erm

átic

as

Cau

da (

%)


Figura 11 . Patologias espermáticas médias de cauda (%) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.

5.7 Determinação da Parasitemia

De cada amostra sanguínea obtida dos ovinos, três camundongos foram

inoculados intraperitonealmente com camada leucocitária conforme descrito no item

3.10. A parasitemia foi determinada de forma indireta, pela sorologia dos camundongos

inoculados, sendo considerados positivos aqueles que apresentaram títulos sorológicos

≥ 1:64. Desta forma, surtos parasitêmicos foram detectados no 7º, 11º, 35º, 56º e 63º

dis pós-inoculação (DPI) em um ovino inoculado com taquizoítos e no 7º, 21º, 35º e 63º

DPI para animais inoculados com oocistos. Na Tabela 12, estão registrados estes

achados.

Tabela 12. Surtos parasitêmicos detectados em ovino s não infectados (controle) e inoculados com Toxoplasma gondii

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Total

43 - - - - - - - - - - - - - - 0

44 - - - - - - - - - - - - - - 0

Total 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7 - - NR Positivo - - Positivo - - - - - Positivo - 3

48 - - - - - - - - Positivo - - - - - 1

52 - - - - - - - - Positivo - - - - - 1

Total 0 0 0 1 0 0 1 0 2 0 0 0 1 0 5

2 - - - - Positivo - - - Positivo - - - - - 2

9 - - - - - - - - - - - - - - 0

16 - - - Positivo - - - - - - - Positivo Positivo - 3

Total 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 5

Positivo = RIFI para T. gondii (≥ 1:64) em camundongos inoculados

– = Sorologia negativa (camundongos)

NR = Não realizado

Taq

uizo

ítos

O

ocis

tos

Nº do Ovino

InóculoBioprova/dias pós-inoculação

Con

trol

e

5.8 Resposta Imune Humoral

As recíprocas dos títulos obtidos por meio da Reação de Imunofluorêscencia

Indireta - IFI (Camargo, 1964), estão expressas na Tabela 13. Verificou-se a

soroconversão (título ≥ 1:16), a partir do 5º DPI nos ovinos inoculados com oocistos e

taquizoítos, respectivamente. Título sorológico máximo (1: 8192) foi detectado no ovino

52 inoculado com taquizoítos (28º DPI). Naqueles que receberam oocistos a recíproca

sorológica máxima foi de 1:4096, foi diagnosticada nos três ovinos no 49º e 56º DPI.

Embora tenham ocorrido alterações nos títulos de anticorpos no decorrer do

experimento, decréscimos acentuados destes títulos foram observados a partir do 63º

DPI nos ovinos do grupo I (oocistos) e II (taquizoítos).

Diferenças estatísticas (P<0,05) foram verificadas nas recíprocas de títulos de

anticorpos contra T. gondii (Tabela 14), em algumas datas pós-inoculação, entre os dois

grupos inoculados (taquizoítos e oocistos).

Os animais do grupo controle não apresentaram anticorpos contra T. gondii ao

longo de todo experimento.

Tabela 13: Recíproca dos títulos sorológicos obtidos pela Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI) em

ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 2,5 x105 oocistos ou com 1,0 x 106 taquizoítos.

2 9 16 7 48 52 43 44

-1 - - - - - - - -

3 - - - - - - - -

5 16 - 16 - - 16 - -

7 32 - 32 32 32 - - -

11 32 - 32 256 64 64 - -

14 64 32 64 4096 256 256 - -

21 4096 1024 4096 1024 256 256 - -

28 1024 256 256 528 256 8192 - -

35 1024 256 528 528 256 528 - -

42 4096 1024 1024 4096 1024 1024 - -

49 4096 4096 4096 4096 528 4096 - -

56 4096 4096 4096 4096 4096 4096 - -

63 256 256 256 256 528 528 - -

70 256 528 256 528 256 1024 - -

Recíproca dos títulos sorológicosDia pós-inoculação

NR = Não realizado

– = Sorologia negativa

Nº ovino/ oocistos Nº ovino/ taquizoítos Nº ovino/ controle

Tabela 14. Comparações múltiplas e resultados da análise de variância do título sorológico de ovinos

não inoculados (controle) e inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106

taquizoítos de Toxoplasma gondii.

A A Aa f eA A Aa f deB A ABa ef d B A A a e c C B A a e abc C B A a de bc C A B a ab ab B A A a bcd bc B A A a abc eB A A a abc ab B A A a a ab B A A a a a B A A a cd bc B A A a bcd abc

147,59 **

53,85 **

Grupos X Período 15,09 ***médias seguidas pela mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem

entre si pelo Teste Tukey (P>0,05)

Recíproca dos títulos sorológicos / Média*=Σlog(x+1)/nControle

Dia pós-inoculação

56

28

35

42

49

Oocistos Taquizoitos

63

70

Val

or d

e F

e

Sig

nific

ânci

a

Período

-1

3

5

7

11

14

21


Grupos

0,0000 2,4099 2,6190

0,0000 2,5144 2,7147

0,0000 3,6125 3,3162

0,0000 3,6125 3,6125

0,0000 2,7147 0,0000

0,0000 3,2113 3,2113

0,0000 3,4119 3,0156

0,0000 2,6102 2,6190

0,0000 1,0123 2,8108

0,0000 1,7148 2,6102

0,0000 0,8203 1,0123

0,0000 1,0123 2,0119

0,0000 0,0000 0,0000

0,0000 0,0000 0,4101

5.9 Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos (Bioprova)

Foi possível detectar a presença de T. gondii por meio da comprovação

sorológica (Figura 12) e presença de cistos cerebrais (Figura 13) em camundongos no

5º, 11º, 14º, 21º, 49º, 56º e 70º dias pós-inoculação de taquizoítos e no 14º, 35º, 42º,

49º, 56º e 63º DPI de oocistos (Tabela 15).

Figura 12 . Taquizoítos fluorescentes de Toxoplasma gondii (IFI). Soro de camundongo inoculado com amostra seminal de ovino infectado com taquizoítos. Obj. 20x.

Figura 13 . Cisto de Toxoplasma gondii em cérebro de camundongo inoculado com sêmen de ovino infectado com oocistos. Obj. 40x.

Tabela 15. Pesquisa de T. gondii em camundongos inoculados com amostras seminais oriun das dos reprodutores ovinos não

inoculados (controle) e inoculado s com oocistos ou taquizoítos.

-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Total

43 - - - - - - - - - - - - - - 0

44 - - - - - - - - - - - - - - 0

Total 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

7 - - Positivo* - - - - - - - NR - - Positivo* 2

48 - - - - - Positivo* - - - - - - - - 1

52 - - - - Positivo* - Positivo* - - - Positivo* Positivo* - - 4

Total 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 7

2 - - - - - Positivo* - - - Positivo* - - Positivo* - 3

9 - - - - - - - - Positivo* - - Positivo* Positivo* - 3

16 - - - - - - - - - - Positivo* - - - 1

Total 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 7

Positivo* = RIFI para T. gondii (≥ 1:64) e presença de cistos cerebrais em camundongos inoculados

– = Sorologia negativa (camundongos)

NR = Não realizado (amostra seminal insuficiente)

Ovino N O InóculoBioprova/dias pós-inoculação

Con

trol

e T

aqui

zoíto

s

Ooc

isto

s

5.10 Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos pela PCR

Das amostras seminais positivas na sorologia (IFI) e bioprova em camundongos

(presença de cistos cerebrais), foi possível detectar a presença de T. gondii pela técnica

da PCR no 11º, 14º, 21º, 56º e 70º dias pós-inoculação de taquizoítos e no 14º, 35º,

42º, 56º e 63º DPI de oocistos. A Figura 13 ilustra o produto de PCR amplificado de 194

bp (pares de base) para as datas supracitadas, indicando a presença/ausência do

parasita.

Figura 14. Eletroforese em gel de agarose 2% de produto da reação em cadeia da polimerase (PCR), a partir de amostras seminais dos ovinos experimentalmente infectados. (1) Marcador de peso molecular DNA Ladder (100bp). (2) Sêmen do ovino 02 (14 dias pós-inoculação). (3) Sêmen do ovino 09 (35 dias pós-inoculação). (4) Sêmen do ovino 02 (42 dias pós-inoculação). (5) Sêmen do ovino 16 (49 dias pós-inoculação). (6) Sêmen do ovino 09 (56 dias pós-inoculação). (7) Sêmen do ovino 02 (63 dias pós-inoculação). (8) Sêmen do ovino 09 (63 dias pós-inoculação). (9) Sêmen do ovino 07 (05 dias pós-inoculação). (10) Sêmen do ovino 52 (11 dias pós-inoculação). (11) Sêmen do ovino 48 (14 dias pós-inoculação). (12) Sêmen do ovino 52 (21 dias pós-inoculação). (13) Sêmen do ovino 52 (49 dias pós-inoculação). (14) Sêmen do ovino 52 (56 dias pós-inoculação). (15) Sêmen do ovino 07 (70 dias pós-inoculação). (16) Controle positivo. (17) Controle negativo.

1 2 3 5 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

2,072

1,500

600

194 100

Kb

5.11 Exames anatomopatológicos (necropsias)

Nos ovinos inoculados com T. gondii e nos não inoculados (controle),

necropsiados ao 78º DPI, não foram observadas lesões anatomopatológicas.

5.12 Exames histopatológicos

Os exames realizados não permitem visualizar alterações sugestivas de

toxoplasmose nos ovinos inoculados, e nem foi detectada a presença de T. gondii por

meio desta técnica.

5.13 Pesquisa do Toxoplasma gondii em tecidos dos reprodutores ovinos

5.13.1 Bioprova

Foi possível detectar o parasitismo tissular por T. gondii (bioensaio) IFI positiva e

presença de cistos cerebrais de T. gondii em camundongos inoculados com tecidos dos

ovinos 09 e 16 (infectado com oocistos) e 07 (infectado com taquizoítos).

5.13.2 Imunoistoquímica

Os resultados da Imunoistoquímica estão descritos na Tabela 14 e nas Figuras

14 e 15 as quais ilustram marcação antigênica, característica de reações positivas.

Tabela 16 . Parasitismo tissular detectado pela técnica de Imunoistoquímica em

testículos, epidídimos, vesícula seminal e próstata de ovinos inoculados

com 2 x 10 5 oocistos ou 1 x 10 6 taquizoítos de Toxoplasma gondii.

Tecidos Nº do

Ovino Grupo

Testículos Epidídimos Vesícula

Seminal Próstata

Total de

positivos

02 Oocistos Neg Neg Pos Pos 2

09 Oocistos Neg Pos Pos Pos 3

16 Oocistos Neg Pos Pos Pos 3

Total 0 2 3 3 8

07 Taquizoítos Neg Neg Pos Neg 1

48 Taquizoítos Neg Neg Neg Pos 1

52 Taquizoítos Neg Neg Neg Pos 1

Total 0 0 1 2 3

43 Controle Neg Neg Neg Neg 0

44 Controle Neg Neg Neg Neg 0

Total 0 0 0 0 0

Neg -Negativo

Pos – Positivo

Figura 15 . Próstata demonstrando imunomarcação ao Toxoplasma gondii. Ovino

inoculado com oocistos de Toxoplasma gondii. Obj. 40x.

Figura 16 . Vesícula seminal demonstrando agrupamento de taquizoítos com

imunomarcação ao Toxoplasma gondii. Ovino inoculado com taquizoítos de Toxoplasma gondii. Obj. 40x.

5.13.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A Figura 16 ilustra a presença/ausência do DNA de T. gondii do “pool” de tecidos

(testículos, epidídimos, vesícula seminal e próstata) de cada animal. Nas amostras

analisadas, somente aquelas dos ovinos 09 e 16 (inoculados com oocistos) e 07

(inoculado com taquizoítos), respectivamente, foi verificada a presença de T. gondii por

meio da técnica de PCR.

Figura 17. Eletroforese em gel de agarose 2% de produto da reação em cadeia da polimerase (PCR), a partir do “pool” das amostras de tecidos (testículos, vesícula seminal, próstata e epidídimos) dos ovinos experimentalmente infectados. (1) Marcador de peso molecular DNA Ladder (100bp). (2) Ovino 02 (inoculado com oocistos). (3) Ovino 09 (inoculado com oocistos). (4) Ovino 16 (inoculado com oocistos). (5) Ovino 07 (inoculado com taquizoítos). (6) Ovino 48 (inoculado com taquizoítos). (7) Ovino 52 (inoculado com taquizoítos). (8) Ovino 43 (controle). (9) Ovino 44 (controle). (10) Controle positivo. (11) Controle negativo.

2,072

1,500

600

100

Kb

194

1 2 3 54 6 7 8 9 10 11

2,072

1,500

600

100

Kb

194

2,072

1,500

600

100

Kb

194

1 2 3 54 6 7 8 9 10 11

6. DISCUSSÃO

A infecção toxoplásmica dos ovinos reprodutores utilizados nesta pesquisa, após

a inoculação de taquizoítos ou oocistos de T. gondii, confirmou-se pela parasitemia e

também pela soroconversão de todos os animais inoculados (Tabelas 12 e 13). Sinais

clínicos como hipertermia, apatia, anorexia e fezes amolecidas, foram observadas nos

animais que receberam oocistos (cepa P) entre o 5º e 7º DPI (Figuras 4 e 5). Nos

animais inoculados com taquizoítos observou-se, de modo geral, um quadro

assintomático.

COLE et al. (1954), utilizando-se de uma amostra de T. gondii isolada de um

caso natural, inocularam 10 ovelhas e três cordeiros. O período de incubação variou de

um a seis dias, e os sinais clínicos mais freqüentes em nove ovelhas e nos três

cordeiros foram febre, dispnéia e incoordenação motora. A infecção foi fatal em duas

ovelhas e em um cordeiro.

GARNHAN & LAISON (1960) infectaram cordeiros com duas semanas de idade,

com aproximadamente 100 cistos de T. gondii (cepa não mencionada), pelas vias

intraperitoneal (IP), endovenosa (EV) e oral (VO). Sinais clínicos não foram observados,

mas de duas semanas até nove meses pós-inoculação, anticorpos contra-Toxoplasma

foram detectados, utilizando-se a reação de Sabin & Feldman, nos ovinos inoculados.

DUBEY (1986) relata que as manifestações clínicas da toxoplasmose

experimental em ovinos são influenciadas principalmente pela patogenicidade da cepa

e dose do inóculo. Além disso, características individuais dos animais, como resistência

do hospedeiro, também parecem influir na manifestação clínica da toxoplasmose. Outro

aspecto a ser considerado, são as cepas de T. gondii (P e RH) utilizadas no presente

trabalho, uma vez que, nenhuma referência sobre a utilização destas cepas em ovinos

foi detectada na literatura, o que dificulta uma discussão mais profunda.

A detecção do T. gondii na corrente sanguínea (parasitemia) dos ovinos

experimentais foi verificada de forma indireta, por meio de soroconversão dos

camundongos inoculados com camadas leucocitárias. Os surtos parasitêmicos

ocorreram em cinco dos seis ovinos inoculados. Dos 10 picos de parasitemia

detectados, três foram entre o 7º e 11º DPI, três no 35º e outros três entre o 56º e 63º

DPI (Tabela 12). A alta freqüência de surtos parasitêmicos, observadas nesta pesquisa,

pode estar relacionada à susceptibilidade do hospedeiro frente às cepas empregadas

(P e RH). Resultados semelhantes foram observados por DUBEY & SHARMA (1980),

que inocularam ovinos com oocistos via oral (cepa GT-1). Detectaram parasitemia nos

sete ovinos no 6º e 11º DPI. TEALE et al (1982) de oito ovinos inoculados, recuperaram

T. gondii (parasitemia) somente em dois, sendo um no 21º e outro no 26º DPI.

A utilização da IFI para o diagnóstico e levantamentos epidemiológicos de

infecção toxoplásmica tem tido aceitação universal, tanto para espécie humana como

para outras espécies animais, principalmente por ser considerada de fácil execução e

boa sensibilidade (ARAÚJO et la., 1998). Além disso, os antígenos de superfície de T.

gondii parecem ser comuns a diferentes cepas do protozoário e apresentam papel

predominante na reação de imunofluorescência indireta (BEKNER DA SILVA et al.,

1994). Embora a IFI não seja adequada para distinguir sorologicamente diferentes

amostras de T. gondii (a técnica de Western & Blot é mais indicada para esta função),

ela foi eleita para avaliação da resposta imune humoral dos ovinos do presente estudo.

A infecção experimental em ovinos com T. gondii desencadeou um resposta

imunológica rápida, com detecção de anticorpos a partir do 5º DPI, conforme pode ser

observado na Tabela 13. Esta precocidade na resposta humoral em infecções

experimentais de T. gondii, foi também detectada por SCARPELLI (2001) em bovinos,

MOURA (2004) em suínos e por ARANTES (2005) em cães. BERVERLEY & WASTON

(1971), estudando um rebanho de 22 ovelhas com histórico de aborto natural há mais

de um ano, observaram títulos de anticorpos (detectados por meio do teste de Sabin &

Feldman) de 1:1024 (cinco fêmeas), 1:256 (nove fêmeas), 1:64 (seis fêmeas) e 1:16

(duas fêmeas).

A curva de IgG observada neste experimento (Tabela 13 e 14) teve seu início a

partir do 5º DPI (ovinos 02 e 16 inoculados com oocistos e o reprodutor 52 inoculado

com taquizoítos) todos apresentando títulos de 1:16. Picos de 1:4096 foram atingidos

pelos seis animais inoculados no 28º DPI. O ovino 52, infectado com taquizoítos, atingiu

título de 1:8192 nesta mesma data pós-inoculação. Convém salientar que a resposta

imune humoral (para os seis animais inoculados) permaneceu em patamares elevados,

do 21º ao 56º DPI, decrescendo posteriormente. Estes achados harmonizam-se com os

relatados por SHARMA & SHIMIZU (1974), citados por DUBEY (1986). Estes autores

relatam que anticorpos relacionados à infecção crônica (IgG) apresentam a capacidade

de manterem “ativos” por longo período (até 70º DPI no presente trabalho), quando

comparados com as imunoglobulinas da classe IgM, notadamente identificadas apenas

nas primeiras semanas após infecção.

A avaliação espermática é largamente utilizada no manejo reprodutivo de

diversas espécies animais, sendo considerada de extrema importância para o

monitoramento de ovinos reprodutores. Frequentemente realiza-se tal avaliação, como

exame de rotina em animais selecionados para acasalamento, ou como meio de

diagnóstico de alterações da esfera reprodutiva (VANNUCHI et al., 1998).

Diminuição no volume do ejaculado e no vigor dos espermatozóides pode ser

constatada em algumas datas pós-inoculação, nos animais dos grupos I e II (oocistos e

taquizoítos respectivamente) (Tabelas 8, 9 e 11). Semelhantemente, TEALE et al.

(1982) também avaliaram a qualidade espermática (concentração por meio da análise

visual da densidade e motilidade) para estudar possíveis influências do T. gondii nas

funções reprodutivas. É importante ressaltar que, embora alterações e variações

tenham sido observadas, no presente ensaio, estas foram aleatórias, não podendo ser

impingidas ao T. gondii. Outro fator que também pode ter contribuído para diminuição

do volume e da motilidade, pode ter sido as elevadas temperaturas constatadas ao

longo do experimento, à semelhança do ocorrido em outros estudos (KUNAVONGKRIT

& PRATEEP 1995; KUO et al., 1997 e MOURA, 2004).

PRIETO et al. (1996) e OWSIANNY et al. (1998) afirmam, ainda, que os

parâmetros seminais e a morfologia espermática podem ser influenciados por diversos

fatores, tais como: causas infecciosas (ex.: vírus da síndrome respiratória), condições

climáticas e até mesmo por características fenotípicas como tamanho/volume testicular.

Alterações anatomopatológicas decorrentes da infecção toxoplásmica induzida,

não foram observadas no presente estudo. Achados necroscópicos, inclusive

histológicos, descritos em diversos experimentos comprovam a existência de

controvérsias no que concerne aos resultados poderem ou não ser atribuídos ao T.

gondii

A primeira notificação de isolamento de T. gondii em amostras seminais de

ovinos, encontrada na literatura, pertence a SPENCE et al. (1978). DISKO et al. (1971)

tiveram sucesso na tentativa de recuperação deste agente em amostras seminais de

três de 125 homens com infecção toxoplásmica natural. SPENCE et al (1978), TEALE

et al. (1982) e AGANGA et al. (1988) pesquisando amostras seminais de ovinos,

DUBEY & SHARMA (1980) em caprinos, SCARPELLI (2001) em bovinos, MOURA

(2004) em suínos e ARANTES (2005) em caninos, obtiveram resultados positivos, pela

bioprova detectando T. gondii nos ejaculados colhidos de animais experimentalmente

infectados.

Os resultados do presente trabalho constituem a primeira descrição do

isolamento de T. gondii de amostras seminais de ovinos experimentalmente infectados,

utilizando-se de duas técnicas (bioprova e PCR) (Tabela 15 e Figura 13

respectivamente). Os autores supramencionados isolaram T. gondii apenas pela

bioprova. A despeito das diferentes cepas, inóculos e vias de infecção, os resultados

referentes à recuperação do protozoário de amostras seminais (neste trabalho)

parecem discordar com alguns autores, principalmente em relação ao período em que

se logrou êxito. SPENCE et al. (1978) inocularam T. gondii (cepa não descrita) em dois

ovinos e detectaram sêmen infectado no 20º DPI de um dos animais e no 25º DPI do

segundo ovino. Em um segundo experimento, T. gondii foi isolado de um dos ovinos de

forma constante, do 7º ao 32º DPI. Do outro animal, estes autores conseguiram

recuperar o agente somente em duas ocasiões (14º e 32º DPI).

Ainda em ovinos, TEALE et al. (1982) inocularam seis animais com 2000 cistos

cada (cepa não mencionada), pela via subcutânea. A presença de T. gondii nas

amostras seminais dos carneiros foi observada em três dos seis animais inoculados, em

duas ocasiões para cada um dos ovinos (16º e 26º DPI). Também em ovinos, AGANGA

et al. (1988), na Nigéria, num trabalho envolvendo inoculação de reprodutores ovinos

(cepa TS-1), puderam recuperar T. gondii em amostras seminais colhidas no 21º DPI de

todos os machos infectados.

Em caprinos, DUBEY & SHARMA (1980) inocularam, por via oral, 104 oocistos

da cepa GT-1 (isolada de caprinos), e conseguiram detectar T. gondii no sêmen por

meio do bioensaio (bioprova), durante um período mais prolongado (do 7º ao 59º DPI).

Os autores basearam-se na sorologia positiva e na presença de cistos cerebrais dos

camundongos inoculados com amostras seminais dos animais experimentalmente

infectados com T. gondii.

SCARPELLI (2001) na espécie bovina, detectou em amostras seminais o T.

gondii (cepas P e RH), por meio da bioprova, em diversas datas pós-inoculação (do 7º

ao 84º DPI). Entretanto, a técnica de PCR não foi tão sensível/específica na detecção

do parasito no sêmen de bovinos experimentalmente infectados. Semelhantemente

MOURA (2004), em suínos, obteve pouco sucesso no emprego da PCR para detecção

de T. gondii no sêmen de cachaços infectados experimentalmente. Por outro lado, este

autor isolou T. gondii em amostras seminais de reprodutores experimentalmente

infectados (cepas P e RH respectivamente), no 3º, 49º e 56º DPI de um suíno inoculado

com oocistos, no 5º e 49º DPI de outro cachaço inoculado com taquizoítos e no 49º DPI

de um terceiro suíno infectado também com taquizoítos. Pesquisando o DNA

toxoplásmico por meio da PCR, detectou o coccídio no 84º DPI em amostras de dois

suínos (um inoculado com oocistos e outro com taquizoítos de T. gondii).

Em cães, ARANTES (2005) isolou T. gondii (bioprova) em ejaculados de dois

dos três inoculados com taquizoítos (no 7º e 21º DPI, nas amostras seminais do cão 01

e no 35º DPI nos ejaculados do cão 24). Nos animais inoculados com oocistos, a

presença do parasito foi detectada em amostras seminais apenas do cão 31 no 7º DPI.

Utilizando a técnica da PCR, detectou o DNA de T. gondii no sêmen do cão 01

(inoculado com taquizoítos) no 7º, 21º e 35º DPI (detectados também pela bioprova).

Nas amostras seminais do cão 24 (inoculado com taquizoítos), o DNA do parasito foi

detectado no 35º DPI, confirmando os achados da bioprova das mesmas amostras. A

amostra seminal do cão 31 (inoculado com oocistos) não se mostrou positiva para T.

gondii por meio da PCR.

No presente trabalho, pela bioprova (Tabela 15) isolou-se T. gondii em

ejaculados dos três ovinos inoculados com taquizoítos (no 5º e 70º DPI nas amostras

do ovino 07, no 14º DPI do reprodutor 48 e no 11º, 21º, 49º e 56º DPI do ovino 52). Nos

ovinos que receberam oocistos, a presença do parasito também foi detectada em

amostras seminais dos três ovinos inoculados (no 14º, 42º e 63º DPI do ovino 02, 35º,

no 56º e 63º DPI do número 09 e no 49º DPI do ovino 16). Utilizando a técnica da PCR,

para amostras seminais positivas na bioprova, detectou-se o DNA de T. gondii (Figura

13) no sêmen dos ovinos inoculados com taquizoítos no 70º DPI (ovino 07), no 14º DPI

(ovino 48) e no 11º, 21º e 56º DPI (ovino 52). Nas amostras seminais dos reprodutores

inoculados com oocistos, o DNA do parasito pode ser detectado no ovino 02 (14º, 42º e

63º DPI) e no macho 09 (35º e 56º DPI). Amostras seminais (positivas na bioprova) dos

ovinos 07 (5º DPI), 52 (49º DPI), 09 (63º DPI) e 16 (49º DPI) não se mostraram

positivas para T. gondii por meio da PCR (Figura 13).

Salienta-se que, além de todos reprodutores (inoculados) produzirem anticorpos

contra-Toxoplasma, e amostras seminais mostraram-se positivas para T. gondii

(bioprova e PCR), foi possível, ainda, isolar este coccídio por meio da bioprova e da

técnica de PCR (Figura 16), no “pool” de tecidos (testículos, epidídimos, vesícula

seminal e próstata) de dois ovinos infectados experimentalmente com oocistos (ovino

02 e 16) e um inoculado com taquizoítos (ovino 07).

A ausência de positividade de parasitismo, detectada pela PCR, de algumas

amostras genômicas seminais e do “pool” tecidual dos ovinos infectados

experimentalmente, a possibilidade de T. gondii estar presente nas mesmas não pode

ser descartada, uma vez que parte destes possa ter sido perdido com a técnica de

extração de DNA, além de que, 500ng de DNA “genômico” (hospedeiro+parasito) por

reação, pode conter uma baixa quantidade de DNA do parasito, que pode ser

insuficiente para visualizar a amplificação de 194 bps no gel de eletroforese 2% corado

com brometo de etídeo (DUBEY & THULLIEZ, 1993; ESTEBANREDONDO et al 1999 e

AQUIZERATE et al 1993). Alguns autores afirmam que a técnica da PCR pode ser um

método vantajoso, quando associado a outro meio de diagnóstico (STEUBER et al 1995

e ELLIS 1998).

Deste modo, os achados da PCR apenas reforçam os achados da bioprova e

evidenciam que esta técnica pode ser uma ferramenta auxiliar no diagnóstico da

infecção toxoplásmica. Neste trabalho, um segmento de 194 bps do gene B1 de T.

gondii foi amplificado, uma vez que este gene está presente em pelo menos 35 lócus do

genoma de T. gondii e por ser amplamente conservado nos várias cepas analisadas

(BURG et al., 1989 e FUENTES et al., 1996).

Recentemente, um fragmento do DNA de T. gondii de 529 bps, que se repete

entre 200 a 300 vezes no genoma do parasito, foi mapeado, o que possivelmente

amplia a sensibilidade do teste. Este fragmento apresentou sensibilidade variando de

idêntica a dez vezes superior, dependendo do tipo de material utilizado, quando

comparado com os resultados da PCR empregando-se o gene B1 (HOMAN et al. 2000).

O gene B1, porém tem seu uso mais difundido na pesquisa do T. gondii, a partir de

diversos tecidos e fluídos.

GARNHAM & LAIHSOM (1960) notificaram o primeiro relato de T. gondii em

tecidos de ovinos. Tais ovinos foram inoculados com cistos e eutanasiádos no 112º DPI

(três animais) e no 150º DPI (um ovino). T. gondii foi isolado no cérebro, musculatura

esquelética, coração e fígado pelo bioensaio em camundongos.

JACOBS et al. (1963) isolaram T. gondii de 67% dos ovinos sorologicamente

positivos, sendo que o diafragma foi o tecido mais parasitado, seguido pela musculatura

esquelética e cérebro. WORK (1967) na Dinamarca realizou tentativas de isolamento de

T. gondii em diafragma de 30 ovinos, dos quais sete se mostraram positivos. HARTLEY

& MOYLE (1974) isolaram T. gondii em 14 de 15 cordeiros com infecção congênita.

Neste caso, cérebro e musculatura esquelética apresentaram-se positivos para este

parasito. Em oito ovinos inoculados com 10.000 oocistos da cepa GT-1, eutanasiádos

no 97 º e 173º DPI, DUBEY (1984) verificou a presença de T. gondii no coração de sete

destes animais, diafragma, fígado e musculatura esquelética em seis ovinos e quatro

animais apresentaram o cérebro parasitado por este protozoário.

7. CONCLUSÕES

Dos resultados obtidos, por meio do delineamento experimental executado, as

seguintes conclusões puderam ser extraídas.

a) A infecção toxoplásmica dos ovinos inoculados com oocistos ou

taquizoítos, ficou comprovada pela parasitemia e também pela produção de anticorpos

contra Toxoplasma gondii.

b) Foi possível registrar alterações na temperatura retal (hipertermia) e apatia

nos ovinos infectados com oocistos de Toxoplasma gondii.

c) Embora alterações na qualidade e morfologia do sêmen tenham sido

observadas ao longo do experimento, estas foram aleatórias não podendo ser

atribuídas à infecção toxoplásmica.

d) Toxoplasma gondii pode ser isolado no sêmen dos ovinos inoculados, por

meio da bioprova e pela técnica de PCR.

e) Parasitismo tissular por Toxoplasma gondii foi diagnosticado nos ovinos

inoculados, por meio da bioprova, PCR e imunoistoquímica.

f) O isolamento de Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos infectados

experimentalmente, associado ao parasitismo tissular em fragmentos do sistema

reprodutor (bioprova, PCR e imunoistoquímica) sugerem a viabilidade da transmissão

venérea deste coccídio.

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