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Ary Gadelha de Alencar Araripe Neto
CARACTERIZAÇÃO DO PAPEL DAS OLIGOPEPTIDASES (NDEL1 E ECA) NA ESQUIZOFRENIA: UM ESTUDO TRANSLACIONAL E
MULTIMODAL.
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola
Paulista de Medicina, para obtenção
do Título de Doutor em Ciências.
São Paulo
2014
ESTUDO 5: Convergent evi
i
Ary Gadelha de Alencar Araripe Neto
CARACTERIZAÇÃO DO PAPEL DAS OLIGOPEPTIDASES (NDEL1 E ECA) NA ESQUIZOFRENIA: UM ESTUDO TRANSLACIONAL E
MULTIMODAL.
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola
Paulista de Medicina, para obtenção
do Título de Doutor em Ciências.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Rodrigo Affonseca Bressan
CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Mirian Akemi Furuie
Hayashi
São Paulo
2014
ii
Gadelha, Ary Alencar Araripe Neto Caracterização do papel das oligopeptidases (NDEL1 e ECA) na esquizofrenia: um estudo translacional e multimodal. / Ary Gadelha de Alencar Araripe Neto. – São Paulo, 2014.
xxi, 246f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Psiquiatria e Psicologia Médica.
Título em inglês: Characterization of oligopeptidases (NDEL and ACE) role in schizophrenia: a translational and multimodal study.
1.Esquizofrenia. 2.NDEL1. 3.ECA 4.Memória. 5. Inflamação. 6 Biomarcador
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PSIQUIATRIA
Chefe do Departamento: Prof. Ms. José Cassio de Nascimento Pitta
Coordenadora do Curso de Pós-graduação: Profa. Dra. Andrea Parolin Jackowski
ESTUDO 5: Convergent evidences from human and animal studies implicate Angiotensin I-‐Converting Enzyme activity in cognitive performance
iv
ARY GADELHA DE ALENCAR ARARIPE NETO
CARACTERIZAÇÃO DO PAPEL DAS OLIGOPEPTIDASES (NDEL1
E ECA) NA ESQUIZOFRENIA: UM ESTUDO TRANSLACIONAL E MULTIMODAL.
Presidente da banca:
Prof. Dr. Rodrigo Affonseca Bressan
Banca examinadora:
Prof. Dr. Jaime Eduardo Cecílio Hallak
Profa. Dra. Sintia Iole Nogueira Belangero
Prof. Dr. Jair de Jesus Mari
Prof. Dr. Quirino Cordeiro Junior
Suplentes:
Prof. Dr. João Ricardo Sato
Prof. Dr. David Freitas de Lucena
v
“Learn from yesterday, live for today, hope for tomorrow. The important thing is to not stop questioning.”
― Albert Einstein, Relativity: The Special and the General Theory
vi
Dedicatória
À Daniela,
pelo seu amor,
por me fazer querer ser
uma pessoa melhor a cada dia
vii
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Rodrigo Affonseca Bressan, pela amizade e orientação em
muitos aspectos da minha vida. Pelo cuidado com minha carreira e pelas inúmeras
oportunidades que continuamente me oferece. Aprendi e aprendo diariamente com
seus exemplos, em especial a sua generosidade, entusiasmo e otimismo (sempre).
Sou grato a tudo.
À Dra. Mirian Hayashi, que me introduziu ao mundo das oligopeptidases. Sua
dedicação total ao que a pesquisa tem de mais essencial, a descoberta, ajudou a
moldar a minha identidade de pesquisador. A disponibilidade para a discussão
científica e o rigor na apreciação dos dados foram fundamentais para a conclusão
dessa tese.
Ao Drs. Arthur Berberian e Vanessa Ota que tiveram papel decisivo na
execução dos famosos mutirões de domingo. Um trabalho árduo, mas que se tornou
leve pela dedicação e companheirismo.
Aos colegas que auxiliaram nas análises, em especial ao Dr. Gerome Breen
pela paciência e cuidado durante os meus retiros de pesquisa em Londres.
Ao grupo que iniciou a pesquisa do qual esse trabalho é resultado, Dra. Sintia
Iole, Dra. Denise Cristofolini, Dra. Fernanda Belluco, Dra Marília Smith.
Às equipes da genética, neuropsicologia e de neuroimagem que tornaram os
domingos de coletas mais fraternos.
Aos colegas do Programa de Esquizofrenia (PROESQ) e do Programa de
Reconhecimento e Intervenção em Estados Mentais de Alto Risco (PRISMA).
À equipe que desenvolveu os experimentos com os camundongos e medidas
de atividade enzimática, em especial, à Camila Yonamine, Ana Vendramini e
Vanessa Abílio.
Aos colegas do Laboratório Interdisciplinar de Neurociências Clínicas (LiNC),
em especial a Luci Zeferino dos Santos Silva que sempre nos auxilia e nos
tranquiliza.
A todos os amigos que fiz durante esse caminho.
viii
Aos meus pais Ary Araripe e Rita que nunca pouparam esforços, mesmo que
tivessem que abrir mão de seus sonhos para dar a mim e a meus irmãos as
melhores oportunidades de formação. Sou eternamente grato a todo o amor e
dedicação e por terem me feito acreditar que seria possível realizar os sonhos desde
que me dedicasse a eles.
Aos meus irmãos, Guilherme e Bia; e Milena, cunhada; por serem sempre
companheiros, pelo carinho que a distância e o tempo não conseguem abalar.
Aos meus avós Ary e Zélia, Luís e Julita. A todo amor e exemplo, minha maior
riqueza. Em especial ao avô Ary que com tantas histórias vividas e contadas me
apresentou um mundo grande, complexo, mas possível de ser vivido seguindo os
mais altos princípios de respeito, lealdade e amor ao próximo.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo
financiamento deste estudo e ao Conselho Nacional de Pesquisa, que colaborou por
meio da minha bolsa de estudos.
ix
Lista de figuras
Estudo 1: Figure 1. Scatter plot for NDEL1 enzyme activity measurements.
Figure 2. Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis. for NDEL1 enzyme
activity measurements.
Supplementary figure S1. Box plot for NDEL1 enzyme activity measurements.
Estudo 2: Figure 1. Results of NDEL1 oligopeptidase GWAS – major affects
Figure 2. Results of NDEL1 oligopeptidase GWAS – interaction term results
Estudo 3: Figure 1. Scatter plot for ACE activity measurements of healthy controls (HCs) vs
SCZ patients.
Figure 2. Receiver operating characteristics (ROC) curve analysis for ACE activity
measurements.
Figure 3. ACE activity levels x ACE I/D genotypes
Estudo 5: Figure 1. Correlations for memory (evaluated by Hopkins measures) and ACE activity
in schizophrenia (SCZ) patients (A) and health controls (HCs) group (B).
Figure 2. Novel object recognition test. % of time spent exploring the familiar (object
A) and the novel objects (object B and C) for control (+/+) and transgenicmice for the
ACE gene (+/++).
x
Lista de tabelas
Tabela 1: Descrição dos estudos que investigaram os aspectos relacionados à
NDEL1 em esquizofrenia.
Tabela 2: Descrição dos estudos que investigaram aspectos relacionados à ECA
em esquizofrenia .
Estudo 1: Table 1. Sociodemographic characteristics.
Suppl.Table 1. Evaluation of influences of gender, age and educational level on
NDEL1 enzyme activity measures.
Estudo 2: Table 1. Sociodemographic characteristics.
Table 2. Top Results for genome-wide investigation of NDEL1 plasma enzyme
activity.
Table 3. Top results for genome-wide results for NDEL1 plasma enzyme
activity/clinical status interaction.
Estudo 3: Table 1. Sociodemographic characteristics.
xi
Estudo 4:
Table 1. Sociodemographic and clinical characteristics.
Table 2. Non-parametric correlations between ACE activity levels and
immune/inflammatory markers.
Table 3. Non-parametric correlations between IL-17 and ACE activity levels and
PANSS symptomatic dimension (df=29).
Suppl. Table 1. Non-parametric correlations between IL-17 levels and
immune/inflammatory markers.
Estudo 5: Table 1. Sociodemographic characteristics.
Table 2. Differences in tests performance between SCZ patients and healthy
controls.
Table 3. Correlation between ACE enzymatic level and results of cognitive tests
(adjusted for age, sex and IQ).
xii
Lista de abreviaturas
5-HT 5-hidroxitriptamina - Serotonina
5-HT1a Receptor de Serotonina Tipo 5H1a
5-HT2a Receptor de Serotonina Tipo 5H2a
5-HTTLPR 5-hydroxytryptamin Transporter Lengh Polymorphism
Abz-FRK(Dnp)P-OH Aminobenzoyl -FRK(Dnp)P-OH
Abz-GFSPFRQ-EDDnp Aminobenzoyl-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-Gln-N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine
ACE Angiotensin-I Converting Enzyme
ADP Adenosine Diphosphate
AMP Adenosine Monophosphate
Ang I Angiotensina 1
Ang II Angiotensina 2
Ang III Angiotensina 3
Ang IV Angiotensina 4
APA American Psychiatric Association
APG Antipsicóticos de Primeira Geração
ASG Antipsicóticos de Segunda Geração
ATP Adenosine Triphosphate
AUC Area Under the Curve
BD Bipolar disorder
BDNF Brain Derived Neurotrophic Factor
BOLD Blood-Oxygenation-Level-Dependent
CACNA1C Calcium channel, voltage-dependent, L-type, alpha 1C subunit
xiii
CACNB2 Calcium channel subunit beta-2
CAMK1D Calcium/calmodulin-dependent protein kinase ID
CCDC25 Coiled-Coil Domain Containing Protein 25
CID-10 Classificação Internacional de Doença - Décima edição
CNV Copy Number Variation
COMT Catecol-O-Metil Transferase
DISC1 Disrupted-in-Schizophrenia-1
DMN Default-Mode Network
DNA Deoxyribonucleic Acid
DSM III R Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Third Edition
DSM IV TR Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Forth Edition
DSM-5 Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Fifth Edition
ECA Enzima Conversora de Angiotesina I
Endo A Endooligopeptidase A
Endo B Endooligopeptidase B
FEZ1 Fasciculation and elongation protein zeta 1
FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRMPD2 FERM and PDZ domains-containing protein 2
GWAS Genome Wide Association Studies
HAPMAP International Haplotype Map Project
HC Health control
IFN- γ Interferon-gamma
IL-1 Interleukin-1
xiv
IL-12 Interleukin-12
IL-1B Interleukin-1B
IL-2 Interleukin-2
IL-17 Interleukin-17
IL-6 Interleukin-6
IPAP International Psychopharmacological Algorithm Project
IRAP Insulin Regulated Aminopeptidase
LCR Líquido Cefalorraquidiano
lincRNAs RNAs intergênicos não codantes
LIS1 Lisencephaly 1
MAGI2 Membrane-Associated Guanylate Kinase, WW And PDZ Domains-Containing 2
MIR137 MicroRNA-137
NDE1 Nuclear Distribution Element 1
NDEL1 Nuclear Distribution Element-1 Like
NF-kB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
NIMH National Institute of Mental Health
NMDA N-Metil-D-Aspartato
NOR Novel object recognition
OMS Organização Mundial de Saúde
PANSS Positive and Negative Syndrome Scale
PDE4B Phosphodiesterase 4B
PDE4D Phosphodiesterase 4D
PET Positron Emission Tomography
POP Prolyl-Oligopeptidase
xv
PPI Prepulse Inhibition of Startle Response
QI Quoeficiente de Inteligência
RAS Renin-Angiotensin System
RM Ressonância Magnética
RNAi RNA de interferência
ROC Receiver Operating Curve
SCID Structured clinical interview for DSM IV Axis I Diagnosis
SCZ Schizophrenia
SEP Sintomas extrapiramidais
Ser704Cys Substituição Serine 704 Cysteine
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SPECT Single-Photon Emission Computed Tomography
SRA Sistema Renina-Angiotensina
Th1 T-helper cell type 1
Th2 T-helper cell type 2
TNF-alpha Tumor Necrosis Factor - alpha
VIPR2 Receptor de peptídeo vasoativo intestinal
ZNF536 Zinc Finger Protein 536
xvi
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ..................................................................................................................................... VI
AGRADECIMENTOS ........................................................................................................................... VII
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................. IX
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................. X
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................... XII
RESUMO .......................................................................................................................................... XVIII
ABSTRACT ......................................................................................................................................... XX
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 1
1.1. APRESENTAÇÃO ........................................................................................................................ 1
2. REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................................... 2
2.1. CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS DA ESQUIZOFRENIA ...................................................................... 2 2.1.1. Critérios Diagnósticos ..................................................................................................... 3
2.1.1.1. Subtipos de esquizofrenia .......................................................................................................... 5 2.1.1.2. Mudanças Introduzidas pelo DSM-5 .......................................................................................... 6
2.1.2. Avaliação Dimensional dos Sintomas e Diagnóstico Diferencial .................................... 6 2.1.3. Curso Clínico ................................................................................................................... 8 2.1.4. Tratamento ...................................................................................................................... 9
2.2. FISIOPATOLOGIA ...................................................................................................................... 14 2.2.1. Teoria dos Neurotransmissores .................................................................................... 14
2.2.1.1. Teoria Dopaminérgica .............................................................................................................. 14 2.2.1.2. Teoria Serotoninérgica ............................................................................................................. 16 2.2.1.3. Teoria Glutamatérgica .............................................................................................................. 17 2.2.1.4. Teoria Adenosinérgica .............................................................................................................. 18 2.2.1.5. Outros Sistemas neurotransmissores ...................................................................................... 19
2.2.2. Neuroimagem ................................................................................................................ 20 2.2.2.1. Neuroimagem Estrutural ........................................................................................................... 20 2.2.2.2. Estudos de Neuroimagem Funcional ....................................................................................... 21
2.2.3. Genética ........................................................................................................................ 23 2.2.3.1. Sobreposição Genética entre os Diagnósticos ........................................................................ 26 2.2.3.2. Papel das Copy Number Variations - CNVs ("Variações do Número de Cópias") ................... 27 2.2.3.3. Papel das Variantes Raras e de Mutações de Novo ............................................................... 28 2.2.3.4. Novas Vias e Genes ................................................................................................................. 29 2.2.3.5. O Caso da Herdabilidade Perdida ("The case of missing Heritability") .................................... 30 2.2.3.6. Endofenótipos e a Busca por Novos Alvos para Estudos Genéticos ....................................... 32
2.2.4. Fatores de Risco Ambientais ........................................................................................ 33 2.2.5. Modelos Animais ........................................................................................................... 34 2.2.6. Cognição ....................................................................................................................... 36 2.2.7. Biomarcadores Periféricos ............................................................................................ 38
2.2.7.1. Desregulação do Sistema Imune e da Resposta Inflamatória e Esquizofrenia ....................... 39 2.2.7.2. Oligopeptidases ........................................................................................................................ 40
2.2.7.2.1. Nuclear Distribution Element-Like 1 (NDEL1) ..................................................................... 40 2.2.7.2.1.1. NDEL1 e Esquizofrenia .................................................................................................. 44
2.2.7.2.2. Enzima Conversora de Angiotensina-I (ECA) ..................................................................... 50 2.2.7.2.2.1. Sistema Renina-Angiotensina (SRA) ........................................................................... 50
xvii
2.2.7.2.2.2. SRA e Funções Cognitivas ........................................................................................... 51 2.2.7.2.2.3. SRA, Resposta Inflamatória e Estresse Oxidativo ....................................................... 52 2.2.7.2.2.4. Demência e Prejuízo Cognitivo Leve ........................................................................... 52 2.2.7.2.2.5. Parkinson ...................................................................................................................... 54 2.2.7.2.2.6. ECA e esquizofrenia ..................................................................................................... 54
2.2.8. Teorias Fisiopatológicas Atuais ..................................................................................... 66 2.2.8.1. Teoria do Neurodesenvolvimento ............................................................................................. 66 2.2.8.2. Teoria de Desconexão ("desconectividade") ............................................................................ 67 2.2.8.3. Teoria da Saliência ................................................................................................................... 67
3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................................ 69
4. OBJETIVOS .................................................................................................................................. 70
5. MÉTODOS, RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 72
5.1. ESTUDO 1: PLASMA NDEL1 ENZYME ACTIVITY IS REDUCED IN PATIENTS WITH SCHIZOPHRENIA – A
POTENTIAL BIOMARKER? ...................................................................................................................... 72 5.2. ESTUDO 2: GENOME-WIDE INVESTIGATION OF NDEL1 ENZYMATIC LEVELS IN PLASMA OF PATIENTS
WITH SCHIZOPHRENIA AND HEALTHY CONTROLS REVEAL NEW PUTATIVE RISK GENES FOR SCHIZOPHRENIA 95 5.3. ESTUDO 3: ACE I/D GENOTYPE-RELATED INCREASE IN ACE PLASMA ACTIVITY IS A BETTER
PREDICTOR FOR SCHIZOPHRENIA DIAGNOSIS THAN THE GENOTYPE ALONE ............................................. 116 5.4. ESTUDO 4: ANGIOTENSIN CONVERTING ENZYME ACTIVITY IS POSITIVELY ASSOCIATED WITH IL-17
LEVELS IN PATIENTS WITH SCHIZOPHRENIA .......................................................................................... 136 5.5. ESTUDO 5: CONVERGENT EVIDENCES FROM HUMAN AND ANIMAL STUDIES IMPLICATE ANGIOTENSIN
I-CONVERTING ENZYME ACTIVITY IN COGNITIVE PERFORMANCE IN SCHIZOPHRENIA ............................... 153
6. CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 181
7. REFERÊNCIAS ........................................................................................................................... 184
8. ANEXOS ..................................................................................................................................... 209
8.1. PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O DOUTORADO ..................................................................... 209 8.2. ANÁLISES EM ANDAMENTO RELACIONADAS À TESE ................................................................... 223
xviii
Resumo
A esquizofrenia (SQZ) é uma doença causada por uma complexa interação entre
fatores genéticos e ambientais ao longo do desenvolvimento cerebral. O curso é
geralmente crônico e cerca de 80% dos pacientes ainda apresentam importante
prejuízo funcional e cognitivo. Não existem exames complementares que confirmem
o diagnóstico ou indiquem o melhor tratamento e lacunas importantes persistem
sobre a fisiopatologia da doença. As oligopeptidases são uma categoria de enzimas
envolvidas na regulação de importantes processos fisiológicos. A
endooligopeptidase NDEL1 (Nuclear-Distribution-Element-1 Like) atua na migração
neuronal e na formação de neuritos durante a embriogênese. A oligopeptidase ECA
(enzima conversora de angiotensina) é um componente-chave do Sistema Renina-
Angiotensina, recentemente relacionado à memória e à Demência de Alzheimer. A
NDEL1 e ECA clivam substratos em comum, como a bradicinina e a neurotensina,
ambos previamente associados à SQZ Nessa tese apresentamos cinco estudos que
investigam a associação de diferentes aspectos das medidas de atividade
enzimática plasmáticas da NDEL1 e ECA com a SQZ. OBJETIVOS: Estudo 1 -
Investigar a associação entre a atividade enzimática da NDEL1 e a SQZ. Estudo 2 -
Identificar variantes polimórficas relacionados à NDEL1 através de estudo de
varredura genômica. Estudo 3 - Investigar a associação entre a atividade enzimática
da ECA, sua relação com um polimorfismo funcional do gene da ECA (Inserção
/Deleção no íntron 16), e a SQZ. Estudo 4 - Explorar a relação entre marcadores
inflamatórios periféricos e a atividade da ECA. Estudo 5 - Investigar se a atividade
da ECA se relaciona aos distúrbios cognitivos observados na SQZ. MÉTODOS:
Estudo 1 - A medida da atividade enzimática da NDEL1 foi determinada através de
ensaio fluorimétrico, usando o substrato peptídeo Abz-GFSPFRQ-EDDnp. Estudo 2 -
DNA foi extraído de sangue total e a genotipagem foi realizada utilizando o chip
Illumina Omni Express. Estudo 3 - A medida da atividade da ECA foi determinada
por ensaio fluorimétrico, usando o substrato peptídeo Abz-FRK(Dnp)P-OH. A
identificação dos polimorfismos foi realizada por PCR. Estudo 4 - As citocinas IL-2,
IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17a, IFN-γ e TNF-alpha foram analisadas por citometria de
xix
fluxo. Estudo 5 - Pacientes e controles completaram testes para avaliar as seguintes
dimensões cognitivas: controle inibitório, flexibilidade cognitiva, memória verbal e
função executiva. Camundongos com 2 (controles selvagem) ou 3 (transgênicos)
cópias do gene da ECA foram submetidos ao teste de reconhecimento de objetos,
uma medida padrão para avaliação de memória. RESULTADOS: Estudo 1 - Menor
nível da atividade enzimática da NDEL1 foi observada nos pacientes comparados
aos controles saudáveis (p < 0.001) e nos pacientes resistentes ao tratamento
comparados aos não-resistentes (p = 0,027). Estudo 2 - Foram observados
resultados sugestivos para a associação entre os níveis plasmáticos de atividade
enzimática da NDEL1 e genes relacionados à resposta imune (CAMK1D, FRMPD2)
e ao neurodesenvolvimento (GABGR3, MAGI2 e ZNF536). Estudo 3 - Um nível
significativamente maior de atividade da ECA foi observado no grupo de pacientes
comparado ao de controles saudáveis (p < 0,001), não houve diferença significativa
na frequência dos genótipos entre os grupos (p = 0,35); mas a diferença entre o
valor observado da atividade da ECA de cada indivíduo em relação ao valor médio
esperado para o seu genótipo foi um melhor preditor para o diagnóstico. Estudo 4 -
A atividade enzimática da ECA esteve significativamente associada a IL-17a em
pacientes (p = 0,003), mas não em controles (p = 0,930). Estudo 5 - Indivíduos com
maior atividade enzimática da ECA e camundongos com maior número de cópias do
gene da ECA apresentaram pior desempenho em testes de memória. DISCUSSÃO:
Pela primeira vez foi demonstrada uma associação da atividade da ECA e da
NDEL1 com mecanismos imune-inflamatórios e entre ECA e memória em SQZ.
Usando uma abordagem inovadora (atividade enzimática das oligopeptidases) e
buscando convergência entre diferentes metodologias, os resultados obtidos
geraram novas perpectivas na compreensão dos mecanismos fisiopatológicos
associados à SQZ. O potencial das oligopeptidases como biomarcadores periféricos
para diagnóstico (ECA e NDEL1) e predição de resposta ao tratamento (NDEL1) foi
demonstrado, o que possibilitou o depósito de uma patente com essa finalidade
(PCT/BR2011/000417).
xx
Abstract
Schizophrenia (SCZ) is a disease caused by a complex interaction between genetic
and environmental factors during brain development. The course is usually chronic,
and approximately 80% of patients still have significant functional and cognitive
impairment. There are no laboratory tests to confirm the diagnosis or indicate the
best treatment and important gaps persist about the pathophysiology of the disease.
The oligopeptidases are a class of enzymes involved in the regulation of important
physiological processes. The NDEL1 (Nuclear Distribution Element - 1 Like) has
been associated with neuronal migration and neurite outgrowth. ACE (Angiotensin
Converting Enzyme) is a key component in the Renin-Angiotensin System that was
recently identified as being associated with memory and Alzheimer's dementia. The
NDEL1 and ECA cleave substrates in common as bradykinin and neurotensin, both
previously associated with SCZ this thesis present five studies investigating the
association of different aspects of plasma enzyme activity measurements NDEL1
and ECA with SCZ. OBJECTIVES: Study 1 - To investigate whether the enzymatic
activity of NDEL1 is associated with the diagnosis of SCZ. Study 2 - Genome-Wide
Association Study to characterize genetic factors related to NDEL1 plasma
enzymatic activity. Study 3 - To investigate the association between ACE activity, its
relationship with a functional polymorphism of the ACE gene and the diagnosis of
schizophrenia. Study 4: To explore the relationship between peripheral inflammatory
markers and ACE activity. Study 5 - To investigate whether the ACE activity is
related to cognition in SCZ. METHODS: Study 1 - The measure of the enzymatic
activity of NDEL1 was performed by fluorimetric assay using the peptide substrate
Abz - GFSPFRQ - EDDnp. Study 2: DNA was extracted from whole blood and
genotyping was performed with the Illumina Omni Express chip. Study 3: The
measurement of ACE enzyme activity was performed by fluorimetric assay using the
peptide substrate Abz - FRK (Dnp) P - OH. I/D genotypes were assessed using
polymerase chain reaction (PCR) followed by agarose gel electrophoresis. Study 4:
Kit for Human FlexSet cytometric analysis was used to measure IL- 2, IL- 4, IL- 6, IL-
8, IL- 10, IL- 17a, IFN-γ and TNF -alpha cytokines. Study 5: The sample of
xxi
patients/healthy controls completed tests to assess the following cognitive
dimensions: verbal memory, inhibitory control, cognitive flexibility, verbal
memory/learning and executive function. Mice with 2 (wild-type) or 3 (transgenic)
copies of the ACE gene were submitted to the Novel Object Recognition (NOR), a
standard measure to evaluate memory performance. RESULTS: Study 1 - A
significantly lower level of enzyme activity was observed in patients compared to
healthy controls (p < 0.001) and, among patients, to treatment-resistant patients
compared to non-treatment resistant patients (p = 0.027). Study 2 - GWAS analyses
were suggestive (p-values < 10-6) for the association between genes related to
immune response (CAMK1D, FRMPD2) and neurodevelopment (GABGR3, MAGI2
and ZNF536) and NDEL1 plasma levels of enzymatic activity. Study 3 - A
significantly higher level of ACE enzyme activity was found in patients compared to
healthy controls (p < 0.001), the ACE genotypes did not significantly differ between
groups (p = 0.35); and, overall, the best predictor of schizophrenia diagnosis was the
relative increase in ACE activity, considering each subjects' expected genotype ACE
activity mean. Study 4 - The ACE enzyme activity was significantly related to IL-17a
among patients (p = 0.003), but not among healthy controls (p = 0.930). Study 5 -
Individuals with higher ACE activity and mice with more copies of ACE gene
performed worse on tests assessing memory Discussion: For the first time it was
demonstrated an association for both ACE and NDEL1 enzyme activity with immune-
inflammatory mechanisms and between ACE and memory in SCZ. The results
obtained using an innovative approach (enzymatic activity of oligopeptidases) and
searching for convergence between different methodologies have generated new
perspectives in understanding the pathophysiological mechanisms associated with
SCZ. The potential of oligopeptidases as peripheral biomarkers for diagnosis (ECA
and NDEL1) and prediction of response to treatment (NDEL1) was demonstrated,
which enabled the deposit of a patent for this purpose (PCT / BR2011 / 000417).
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Apresentação
Esta tese será apresentada na forma de artigos científicos. Na introdução da
tese é feita uma descrição dos aspectos gerais da esquizofrenia (dados
epidemiológicos, definição, sintomatologia, diagnóstico diferencial e subtipos), com
ênfase na fisiopatologia da doença. Na seção sobre a fisiopatologia da
esquizofrenia, foi realizada uma revisão mais detalhada das funções das
oligopeptidases NDEL1 e ECA. Em seguida é apresentada a justificativa da tese e
os estudos desenvolvidos, cada um contendo seções descrevendo Métodos,
Resultados e Discussão.
No primeiro estudo, apresentamos o resultado da comparação da atividade
enzimática da NDEL1 no plasma entre pacientes com esquizofrenia e controles
saudáveis. No segundo, exploramos os fatores genéticos relacionado aos níveis de
atividade enzimática da NDEL1 através de estudo de varredura genômica. No
terceiro, descrevemos o resultado da comparação entre pacientes e controles da
atividade enzimática da ECA no plasma. No quarto, exploramos a relação entre a
ECA e os marcadores inflamatórios em sangue periférico. No quinto, verificamos se
a atividade enzimática da ECA se correlaciona à performance em testes cognitivos
em pacientes e controles e, adicionalmente, se as alterações cognitivas equivalentes
são observadas em um modelo animal transgênico para ECA e que apresenta
alteração na expressão desta enzima (camundongos com 2 ou 3 cópias do gene da
ECA).
No final da tese são apresentadas as principais conclusões e, por fim, as
perspectivas futuras ou já em andamento de análises e projetos decorrentes dos
trabalhos desenvolvidos durante o projeto de doutorado.
2
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Características Principais da Esquizofrenia
A esquizofrenia é um transtorno mental que acomete entre 0,3 a 1,6% da
população ao longo da vida(1, 2). Afeta indivíduos do sexo masculino em uma
proporção ligeiramente maior do que o sexo feminino (1,4:1)(3). Normalmente, a
doença se inicia no final da adolescência e início da vida adulta. Indivíduos do sexo
masculino tendem a apresentar um início de doença mais precoce, em média cinco
anos mais cedo, e um pico mais pronunciado nas taxas de incidência quando
comparado a indivíduos do sexo feminino(4). As taxas de incidência, em geral,
reduzem a partir dos 20 anos, mas alguns estudos relatam um segundo pico de
incidência para o sexo feminino por volta dos 45 anos de idade(5). A mediana de
incidência em uma revisão sistemática foi de 15,2/100.000, mas com grandes
variações da medida entre diferentes regiões e estudos(3).
Cerca de 80% dos indivíduos afetados apresentam dificuldades em retomar
as expectativas pré-mórbidas(6). Uma outra questão associada à esquizofrenia e
muitas vezes negligenciada é a redução na expectativa de vida. Estima-se que os
pacientes com esquizofrenia apresentem, em média, uma redução de 15 anos na
expectativa de vida em relação à população em geral(7). O excesso de mortalidade
se deve a um risco de suicídio aproximadamente 10 vezes maior e a um maior risco
de morte por causas naturais (por exemplo, doença cardiovascular, tumores,
diabetes)(8). Considerando a doença como um todo, as causas naturais são a
principal causa de mortalidade. As causas desse aumento da mortalidade são
possivelmente múltiplas e relacionadas a uma combinação de fatores de risco
associados aos processos fisiopatológicos relacionados à própria esquizofrenia,
menor acesso a serviços de saúde e adoção de hábitos de vida não-saudáveis
(tabagismo, ingesta excessiva de gordura e alcoolismo)(9, 10). Um dado preocupante
é a diferença entre a expectativa de vida de um portador de esquizofrenia em
comparação a de um indivíduo da população em geral, diferente do que se poderia
imaginar com o advento de melhores tratamentos, tem aumentado com o tempo(11).
Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), a esquizofrenia,
devido as suas características de início precoce e prejuízo no funcionamento geral, é
3
a 8ª principal causa de anos de vida saudável perdidos(12). Os custos diretos com o
tratamento da doença representam 1,3 a 2,5% do total de gastos em saúde em
países ocidentais, sendo o principal custo entre os transtornos mentais(13). Além dos
custos diretos com o tratamento da doença, existem os custos indiretos,
representados pela perda de capacidade produtiva dos indivíduos acometidos e
familiares envolvidos no cuidado. Em 2002, os custos totais da doença nos Estados
Unidos foram estimados em 62,7 bilhões de dólares, sendo que os custos indiretos
foram estimados em 32,4 bilhões de dólares, representando 52% do valor total(14). O
fator que mais contribuiu na composição dos custos indiretos foi o desemprego.
Apesar da importância do tema para os pacientes, familiares e para o sistema
de saúde e de ser alvo de estudos há mais de 100 anos, ainda temos mais lacunas
do que respostas sobre a sua fisiopatologia e a prática clínica é ainda guiada pela
avaliação subjetiva dos profissionais de saúde mental.
2.1.1. Critérios Diagnósticos
Os critérios diagnósticos mais utilizados são a Classificação Internacional de
Doença, proposta pela OMS, e atualmente na Décima edição (CID-10), e o Manual
Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais, organizado pela Academia
Americana de Psiquiatria (APA), atualmente na Quinta Edição (DSM-5). Ambos os
critérios incorporam aspectos propostos por Kraepelin, Bleuler e Schneider em
diferentes combinações, e com diferenças nas interpretações desses elementos, o
que tem gerado algumas críticas quanto a sua validade(15). Ainda assim, esses
critérios são amplamente utilizados nos trabalhos de pesquisa e na prática clínica. O
CID-10 é o código oficial no Brasil, mas os critérios do DSM por serem mais
claramente operacionalizados têm sido amplamente usados na prática clínica..
Durante a coleta de dados dessa tese, o DSM-IV-TR era a versão corrente e os
critérios não diferem significativamente da versão DSM-IV, que foram usados como
base na entrevista diagnóstica. Segue abaixo a descrição dos critérios do DSM-IV.
Os critérios para o diagnóstico da esquizofrenia segundo o DSM-IV-TR, são:
a) Sintomas característicos: pelo menos dois dos seguintes, cada um
presente por um espaço significativo de tempo durante um período de um mês (ou
menos, caso tratado com êxito).
4
1) delírios;
2) alucinações;
3) fala desorganizada (p. ex.: descarrilamento frequente ou incoerência);
4) comportamento totalmente desorganizado ou catatônico;
5) sintomas negativos, ou seja, embotamento afetivo, alogia ou avolição.
Nota: Somente um sintoma do critério A é necessário, se os delírios são
bizarros ou as alucinações consistem de vozes que comentam os comportamentos
ou pensamentos dos indivíduos, ou duas ou mais vozes conversando uma com a
outra.
b) Disfunção ocupacional/social: durante um espaço significativo de tempo,
desde o início do distúrbio, uma ou mais áreas principais de funcionamento, como
trabalho, relações interpessoais ou autocuidado, encontra-se significativamente
abaixo do nível atingido antes do surgimento do transtorno (ou quando se inicia na
infância ou na adolescência, fracasso em atingir o nível esperado de desempenho
interpessoal, acadêmico ou ocupacional).
c) Duração: Sinais contínuos do distúrbio persistem no mínimo durante seis
meses. Esse período deve incluir pelo menos um mês com os sintomas que
satisfazem o critério A (ou seja, sintomas da fase ativa) e pode incluir períodos
prodrômicos e/ou residuais, quando o critério A não é plenamente satisfeito. Durante
esses períodos, os sinais do distúrbio podem ser manifestados por sintomas
negativos ou por dois ou mais sintomas listados no critério A presentes em uma
forma atenuada (p. ex.: a duração total dos períodos ativo e residual).
d) Distúrbio esquizoafetivo e distúrbio de humor com características psicóticas
foram descartados devido a: (1) nenhum episódio significativo depressivo ou
maníaco ocorreu simultaneamente com os sintomas da fase ativa; ou (2) se
episódios de humor ocorreram durante o episódio psicótico, sua duração total foi
breve em relação à duração do episódio psicótico (ou seja, à duração total dos
períodos ativo e residual).
e) Exclusão de substância/condição clínica geral: o distúrbio não é devido a
efeitos fisiológicos diretos de uma substância (p. ex.: uma droga de abuso, uma
medicação) ou uma condição clínica geral.
f) Relação com transtorno invasivo do desenvolvimento: se há uma história de
distúrbio autístico, o diagnóstico adicional de esquizofrenia é estabelecido apenas se
5
há presença de delírios ou alucinações proeminentes também durante pelo menos
um mês (ou menos, caso o tratamento tenha êxito).
2.1.1.1. Subtipos de esquizofrenia
A esquizofrenia tem sido tradicionalmente dividida em subtipos. Na verdade
alguns subtipos eram entidades nosológicas independentes que foram reunidas por
Kraepelin no conceito de Dementia Praecox, notadamente a Hebefrenia, a Catatonia
e a Paranoia. Os critérios sistematizados pela CID-10 e DSM-IV divergem
ligeiramente da descrição clássica dessas entidades, mas têm sido usados nos
estudos atuais. Para se definir um subtipo, deve-se considerar os sintomas
apresentados no momento da avaliação; contudo, os sintomas podem variar de
proeminência durante o curso(16) . As classificações obedecem aos seguintes
padrões hierárquicos(16, 17):
• esquizofrenia catatônica – caracterizada por distúrbios psicomotores
proeminentes que podem alternar entre extremos, tais como hipercinesia e estupor,
ou entre a obediência automática e negativismo;
• esquizofrenia hebefrênica (CID-10) ou desorganizada (DSM-IV) –
caracterizada por afeto embotado ou inapropriado, pensamento e discurso
desorganizado, tendência ao isolamento social, delírios e alucinações fugazes e
fragmentárias e comportamentos irresponsáveis;
• esquizofrenia paranóide – caracteriza-se essencialmente pela presença de
ideias delirantes relativamente estáveis, frequentemente persecutórias, em geral
acompanhadas de alucinações e perturbações das percepções;
• esquizofrenia indiferenciada – preenche os critérios diagnósticos gerais para a
esquizofrenia mas que não corresponde a nenhum dos subtipos acima citados;
• esquizofrenia simples (subtipo presente apenas na CID-10) – presença de
conduta estranha, incapacidade para atender as exigências da sociedade com um
declínio no desempenho total, e desenvolvimento lento de sintomas negativos, sem
a presença de sintomas positivos;
6
• esquizofrenia residual – caracterizada pela ocorrência de um ou dois
episódios de sintomas positivos e remissão destes, porém, com desenvolvimento
progressivo claro e lento de sintomas negativos.
2.1.1.2. Mudanças Introduzidas pelo DSM-5
A última edição do DSM-5, publicada em 2013, introduziu mudanças
importantes(18): 1) Os subtipos de esquizofrenia foram excluídos; 2) Criou a
necessidade de que pelo menos um dos seguintes sintomas seja obrigatoriamente
observado: alucinação, delírio ou desorganização; 3) Extingue o critério segundo o
qual apenas 1 sintoma tipo delírio ou alucinação, se bizarro, seria suficiente para o
diagnóstico; 4) Catatonia passa a ser um especificador de curso, não restrito à
esquizofrenia; 5) No Item F acrescenta aos transtornos de espectro autístico a
descrição dos quadros de atraso de desenvolvimento global.
O alcance e implicações dessas mudanças ainda não puderam ser
estabelecidos. Especificamente no tocante aos subtipos, a exclusão da
esquizofrenia Desorganizada, subtipo do DSM-5 equivalente à definição clássica de
Hebefrenia, parece precipitada por ser uma entidade de quadro clínico e evolução
característicos. Mais recentemente, evidências sugerem também que este subtipo
apresenta resposta clínica diferente(19). Quanto aos outros subtipos realmente
careciam de valor prognóstico, no caso do subtipo Paranoide, ou melhor se
caracterizavam como descritores de curso, no caso da Catatonia.
2.1.2. Avaliação Dimensional dos Sintomas e Diagnóstico Diferencial
A esquizofrenia é uma doença clinicamente heterogênea, em que os
pacientes podem apresentar grandes diferenças quanto ao perfil de sintomas,
prognóstico, funcionamento social e cognitivo. Com o objetivo de auxiliar a descrição
e investigação clínica têm sido propostos métodos para sistematizar a observação
da heterogeneidade da doença. A mais amplamente usada é a avaliação
dimensional dos sintomas. Dentro desse contexto, o DSM-5 propôs um modelo para
7
avaliação de dimensões sintomáticas, ainda não incorporado para a definição
diagnóstica propriamente dita.
As dimensões mais consistentemente relatadas na literatura são: positiva;
negativa; desorganização, cognitiva; e de humor. Recentemente, foi demonstrado
por nosso grupo, avaliando a estrutura fatorial da Escala para Síndromes Positiva e
Negativa, que as mesmas dimensões podem ser identificadas em uma amostra de
pacientes no Brasil(20). Os sintomas positivos são os mais facilmente percebidos e
respondem melhor ao tratamento farmacológico. Tratam-se de distorções da
realidade, como os delírios e as alucinações. Sintomas negativos ou deficitários
compreendem o distanciamento ou embotamento afetivo, o retraimento social, a
redução de interesse pelas atividades habituais e o pensamento estereotipado e/ou
empobrecido. Tendem a se intensificar com a evolução da doença e respondem pior
ao tratamento farmacológico. Entre os sintomas cognitivos, estão o déficit de
atenção, a dificuldade de abstração e baixa flexibilidade cognitiva. Os sintomas de
desorganização se manifestam no discurso e no comportamento como ideias ou
ações sem propósito ou que não seguem o fluxo esperado em um dado contexto.
Finalmente, os pacientes com esquizofrenia podem apresentar alterações de humor,
sendo muito comuns os sintomas depressivos e de mania.
Para o diagnóstico, uma vez definida a presença de delírios e/ou alucinações,
deve-se excluir que sejam causados por condição médica geral ou uso de
medicamentos ou substâncias. A anamnese deve investigar o curso clínico de
aparecimento dos sintomas psicóticos e identificar sintomas comórbidos sugestivos
de organicidade (febre, emagrecimento, cefaleia recente, diplopia, crise convulsiva).
Os exames físico e neurológico são obrigatórios. Os exames complementares
devem ser pedidos de acordo com as hipóteses formuladas a partir da
anamnese/exame físico. A realização de tomografia computadorizada ou
ressonância magnética de crânio é sugerida em casos de primeiro episódio
psicótico. Se uma doença orgânica, o uso ou abstinência de medicação ou droga for
identificada como causa provável dos sintomas, o diagnóstico será de transtorno
psicótico secundário à condição médica geral ou transtorno psicótico secundário a
uso de substâncias.
Depois de afastada a possibilidade de causa orgânica, inicia-se o diagnóstico
diferencial psiquiátrico. O objetivo nessa etapa é definir se os sintomas se devem a
8
um transtorno psicótico primário, em que a alteração do pensamento é o elemento
central, ou secundário, no qual os sintomas psicóticos são consequência de outro
transtorno psiquiátrico, como depressão maior ou transtorno bipolar. A fim de fazer
essa distinção, deve-se caracterizar o padrão de início dos sintomas, o tempo de
duração e os sintomas comórbidos. Se os sintomas psicóticos iniciam e têm duração
total superior às outras alterações comportamentais, provavelmente trata-se de um
transtorno psicótico primário. No entanto, uma ressalva deve ser feita quanto ao tipo
de sintoma que inicia o quadro, uma vez que é situação comum transtornos
psicóticos surgirem com sintomas de humor, ansiosos ou mesmo obsessivos. Se os
sintomas psicóticos ocorreram unicamente durante episódios de depressão ou
mania, o diagnóstico mais provável é de transtorno de humor com sintomas
psicóticos. Uma vez confirmado se tratar de um transtorno psicótico primário, o
diagnóstico diferencial se dará pelo tempo de duração de doença e pela
apresentação clínica.
2.1.3. Curso Clínico
Quanto ao curso, a esquizofrenia pode ser caracterizada por uma trajetória
sequencial que habitualmente envolve: uma fase pré-mórbida com sutis disfunções
cognitivas e/ou de relacionamento social; uma fase prodrômica caracterizada por
sintomas positivos atenuados ou sintomas básicos e declínio no funcionamento; o
primeiro episódio psicótico que marca o início formal da esquizofrenia; a década
inicial de doença marcada por episódios repetidos de psicose com graus variáveis
de recuperação e duração de remissão entre episódios (com uma tendência a maior
prejuízo quanto maior o número de episódios); e, finalmente, uma fase estável,
quando os sintomas psicóticos são menos pronunciados e os sintomas negativos e
prejuízos cognitivos são predominantes(21). É importante ressaltar que o curso da
esquizofrenia não é uniforme, os pacientes podem apresentar grande variação na
intensidade das fases descritas ou mesmo não apresentarem a mesma sequência
de eventos. Estima-se que apenas 13,5% dos pacientes apresentem recuperação
plena após o diagnóstico de esquizofrenia(22). Alguns fatores foram associados a um
bom prognóstico, como gênero feminino, início tardio, início agudo, melhor
funcionamento pré-mórbido, enquanto outros foram associados a mau prognóstico,
9
como história familiar de esquizofrenia, insight pobre, maior duração de psicose
não-tratada e início insidioso(23, 24).
O estadiamento clínico é uma abordagem amplamente usada em outras
áreas da medicina (por exemplo, oncologia e cardiologia) onde se busca definir em
que fase o paciente se encontra considerando o curso natural da doença(25). Uma
proposta foi feita recentemente com base na apresentação clínica e grau de prejuízo
na qual os 4 estágios identificados se sobrepõe às fases já descritas do curso da
esquizofrenia: pré-mórbido, pródromo, fase aguda ou primeiro episódio e fase de
doença crônica ou residual(26). Recentemente, foi demonstrado que o ômega-3 pode
ser efetivo em prevenir a evolução da doença se administrado durante a fase
prodrômica, enquanto estudos em indivíduos com a doença estabelecida não
apresentaram melhoras consistentes(27). Esse resultado sugere o potencial do
estadiamento em direcionar as condutas terapêuticas. De fato, uma justificativa para
a sua utilização é a possibilidade de criar um sistema orientado para a prevenção
visando uma melhor compreensão da patogênese e avaliação das intervenções(25).
A busca e implantação de modelos de estadiamento clínico possivelmente terão
impacto para direcionar o tratamento e a investigação de biomarcadores da
esquizofrenia.
2.1.4. Tratamento
Após o diagnóstico deve-se buscar individualizar a proposta de tratamento
para o paciente em avaliação ponderando características clínicas e a rede de
suporte disponível. O objetivo final do tratamento é a recuperação funcional e social
do paciente. Os objetivos imediatos variam de acordo com a fase do tratamento,
aguda (pacientes em crise) ou de manutenção (pacientes remitidos). O uso de
antipsicóticos é obrigatório tanto na fase aguda como na de manutenção, quando os
sintomas estão remitidos, mas o tratamento permanece sendo essencial para a
prevenção de possíveis recaídas. O maior número de recaídas está associado a pior
evolução, maior taxa de resistência ao tratamento e a uma redução do volume em
regiões corticais, reforçando a importância do controle dos sintomas ao longo da
evolução da doença(28-30).
10
Na fase aguda deve-se avaliar inicialmente o risco quanto a suicídio,
agressão e não-adesão à medicação. Com base nesses parâmetros é possível
estabelecer o local ideal para o tratamento (ambulatorial, hospital-dia, internação) e
a melhor medicação e via de administração a serem utilizadas (oral ou injetável).
Os antipsicóticos são classificados em dois grupos: os de primeira geração
(ou típicos) e os de segunda geração (atípicos). São similares na eficácia, mas
apresentam diferentes efeitos colaterais e, consequentemente, diferenças quanto à
tolerabilidade(31, 32). Os antipsicóticos de primeira geração (APG) frequentemente
induzem aumento de prolactina e produzem sintomas extrapiramidais (SEP),
semelhantes aos da doença de Parkinson, como rigidez, tremores e bradicinesia. Já
os de segunda geração (ASG) apresentam menor potencial para induzir SEP. Os
ASG estão associados a maior ganho de peso e risco de síndrome metabólica e,
portanto, esses parâmetros devem ser monitorizados de forma mais cuidadosa no
seguimento clínico.
Após a avaliação inicial, o passo seguinte do tratamento envolve a escolha da
medicação e a questão é a indicação de antipsicótico de primeira ou segunda
geração. Há um consenso entre diferentes algoritmos e diretrizes de que se deve
dar preferência a um ASG(33, 34). Essa recomendação é especialmente válida para
pacientes em primeiro episódio psicótico, pois parecem ser mais sensíveis aos
sintomas extrapiramidais, principal efeito colateral aos APG(35).
É preciso enfatizar que essa recomendação fundamenta-se, principalmente,
em diferenças quanto à tolerabilidade, um importante preditor de adesão ao
tratamento(36). Em relação à eficácia, embora existam resultados conflitantes, vários
ensaios clínicos bem conduzidos recentemente não foram capazes de evidenciar a
superioridade dos ASG(31, 32). Dessa forma, não havendo a possibilidade de
prescrição de um ASG, normalmente de custo mais elevado, a prescrição de um
APG está corretamente indicada, sendo importante para otimizar o seu uso, a
redução do risco dos sintomas extrapiramidais iniciando o tratamento com doses
baixas (dose-equivalente a 1- 4 mg de haloperidol).
A indução de sintomas extrapiramidais é uma situação especialmente
importante. Anteriormente, se considerava que para haver resposta, havia a
necessidade de induzir sintomas extrapiramidais. Estudos recentes demonstraram,
no entanto, que a taxa de ocupação de receptores dopaminérgicos para alcançar
11
resposta ao tratamento gira em torno de 65%, e que ocupação de receptores acima
de 80% não gera ganho adicional de resposta, associando-se apenas ao surgimento
de sintomas extrapiramidais(37). Sabemos atualmente que doses de 2 mg de
haloperidol já são suficientes, em alguns pacientes, para promover a ocupação em
torno de 65% dos receptores e gerar resposta clínica. Segundo os pacientes, os
sintomas extrapiramidais são os efeitos colaterais mais incômodos(36). Dessa forma,
a presença de sintomas extrapiramidais não está associada a aumento da resposta,
e que é pior, ainda reduz a qualidade de vida dos pacientes e ainda diminui a
adesão.
A escolha da medicação deverá, sempre que possível, ser uma decisão
compartilhada pelo médico e paciente, levando em conta os interesses do paciente e
a experiência do médico(38). Permitir que o paciente participe na tomada de decisões
aumenta sua percepção sobre a autonomia do tratamento, e é uma forma de
aumentar a adesão. Como já foi dito anteriormente, os ensaios clínicos não têm
demonstrado diferenças em termos de eficácia entre os ASG ou entre estes e os
APG, à exceção da clozapina para casos de pacientes refratários(32, 39). Assim, a
escolha do antipsicótico se baseia no perfil de efeitos colaterais mais toleráveis, em
uma posologia e forma de administração mais confortáveis para o paciente.
A dose de início do tratamento pode variar e deve ser individualizada para a
situação apresentada pelo paciente. A titulação da dose, iniciando-se e aumentando-
se de acordo com a resposta terapêutica até atingir a dose mínima eficaz seria o
esquema ideal para se determinar a dose adequada a cada paciente, mas ainda
pouco factível no contexto normal de tratamento. Assim, mais frequentemente
costuma-se definir e atingir uma dose alvo, normalmente um valor intermediário
entre os extremos mínimo e máximo de dosagem para cada antipsicótico, e
aguardar a resposta. Para pacientes em primeiro episódio psicótico, deve-se iniciar
com doses mais baixas. Para pacientes crônicos, deve-se avaliar o histórico anterior
de medicação, resposta e dosagem utilizadas, para estimar uma dose alvo, nesses
casos, frequentemente mais elevada. Embora os efeitos antipsicóticos já possam ser
observados em poucos dias em alguns casos, preconiza-se um período de 4 a 6
semanas para decidir sobre a resposta ao tratamento(34). Esse prazo deve ser
sempre reavaliado diante de situações de risco definidas na avaliação inicial. Por
12
exemplo, a detecção de ideação suicida após a introdução da medicação deve ser
acompanhada de uma reavaliação do contexto de tratamento e da medicação.
O tratamento de manutenção se inicia após o controle adequado dos
sintomas e corresponde à fase estável da doença na qual o objetivo do tratamento
deve ser não só manter a remissão dos sintomas, mas a melhora na qualidade de
vida, a reabilitação funcional do paciente, o monitoramento e o manejo dos efeitos
colaterais das medicações(40).
A fim de garantir a manutenção da remissão dos sintomas, o primeiro passo é
verificar e reforçar com o paciente a necessidade de manter-se aderido ao
tratamento. Após a melhora é comum os pacientes considerarem que já estão
curados ou que não precisam mais manter o tratamento. Essa é a principal causa de
recaída psicótica(41). É importante deixar o paciente e a família cientes do plano de
tratamento e esclarecer eventuais dúvidas. Os antipsicóticos de depósito são um
instrumento importante para o manejo da não-adesão. A sua aplicação pode ser
monitorada pelos profissionais de saúde, o que permite mais facilmente identificar
falhas quando estas ocorrem, possibilitando uma intervenção mais rápida nos casos
em que isso decorre de nova crise. Os antipsicóticos de depósito conferem em
relação às preparações orais, um melhor prognóstico global(42). Em um estudo
prospectivo de 1 ano realizado nos Estados Unidos comparando olanzapina,
quetiapina, risperidona, ziprasidona e aripiprazol orais, haloperidol decanoato e
risperidona de longa duração; a risperidona de longa duração esteve relacionada
com menor taxa de recaída com necessidade de internação(43).
Outra causa importante de não-adesão é a ocorrência de efeitos colaterais. É
importante investigar ativamente sua presença envolvendo o paciente na tomada de
decisão sobre possíveis mudanças no regime terapêutico, pesando o risco de
remissão e a busca por melhor qualidade de vida(36). Em relação à dosagem da
medicação, recomenda-se manter a dose mínima eficaz, que permita manter os
sintomas em remissão. O manejo específico dos efeitos colaterais mais comuns
associados ao uso de antipsicóticos será discutido a seguir.
O controle dos delírios ou alucinações, embora seja uma condição
necessária, muitas vezes não é suficiente para a recuperação funcional do paciente.
A intensidade dos sintomas negativos e dos prejuízos cognitivos parecem predizer
melhor a recuperação(44, 45). No entanto, os antipsicóticos têm ação limitada sobre
13
essas dimensões da doença e as intervenções psicossociais, têm se demonstrado
mais promissoras na promoção da adaptação social dos pacientes(46). A presença de
uma equipe multidisciplinar e a possibilidade de intervenções focadas em melhorar a
sociabilidade, a autonomia, a independência e a resolução de problemas são
especialmente úteis aos pacientes nessa fase da doença. Intervenções
psicoeducativas, focadas em esclarecer pacientes e familiares sobre a natureza da
doença e o porquê do tratamento, são também uma forma simples de melhorar a
qualidade de vida dos pacientes e aumentar a adesão ao tratamento(46, 47).
O desfecho funcional parece não ter melhorado apesar da evolução no
tratamento farmacológico no último século e estudos têm demonstrado que
indivíduos no primeiro episódio já apresentam alterações significativas no volume
cortical(48, 49), o que reforça a necessidade de novos meios de abordagem
terapêutica e diagnóstica em esquizofrenia.
14
2.2. Fisiopatologia
Segue abaixo um resumo dos principais achados de diferentes linhas de
pesquisa em esquizofrenia:
2.2.1. Teoria dos Neurotransmissores
O advento da identificação e uso dos antipsicóticos na década de 50 teve um
grande impacto para a prática psiquiátrica e para a pesquisa. A investigação do
mecanismo farmacológico dessa classe de medicação propiciou o desenvolvimento
inicial de teorias que associavam substâncias neurotransmissoras à esquizofrenia.
2.2.1.1. Teoria Dopaminérgica
Na década de 60, Arvid Carlsson demonstrou que o haloperidol e a
clorpromazina aumentavam os níveis de metabólitos da dopamina em regiões do
cérebro de ratos ricas em dopamina enquanto tiveram efeitos inconsistentes para
outros neurotransmissores(50). Essa observação foi uma das evidências que serviram
de base à hipótese clássica da dopamina em esquizofrenia segundo a qual a
hiperatividade dopaminérgica seria responsável pelos sintomas positivos do
transtorno. Os antipsicóticos agiriam através do antagonismo de receptores
dopaminérgicos o que causaria um aumento compensatório nos níveis de dopamina.
Observações posteriores fortaleceram essa hipótese. Seeman et al.(51)
demonstraram haver uma relação entre a potência dos diferentes antipsicóticos e
sua afinidade pelos receptores dopaminérgicos D2. Mais recentemente, foi
demonstrado in vivo uma relação entre o grau de ocupação dos receptores D2, a
resposta clínica e os sintomas extrapiramidais(37). Atualmente sabemos que todos os
antipsicóticos bloqueiam os receptores D2, mas com diferentes graus de
afinidade(52).
Se a participação da desregulação da transmissão dopaminérgica parece
certa, o seu papel como agente causal ou alteração inicial na cascata de eventos
15
que culmina com a esquizofrenia em todas as suas manifestações ainda é alvo de
discussões.
No início da década de 90, foi proposta uma versão modificada para a
hipótese dopaminérgica segundo a qual haveria uma hipofunção dopaminérgica no
córtex pré-frontal, e uma hiperfunção na região subcortical, alterações
respectivamente relacionadas aos sintomas negativos e positivos(53, 54). Essa
proposição se baseava na observação de diferenças nos níveis de dopamina entre
as diferentes regiões do cérebro, e as evidências em estudos animais que sugerem
uma regulação dos níveis de dopamina na região subcortical pelos neurônios
dopaminérgicos no córtex pré-frontal.
Apesar de todas essas evidências do envolvimento do sistema dopaminérgico
na esquizofrenia, até a década de 90, não havia sido possível demonstrar
claramente o aumento de índices dopaminérgicos in vivo em pacientes
esquizofrênicos. Somente em 1996, Laruelle et al.(55)., em um estudo de SPECT
(Single-Photon Emission Computed Tomography), demonstraram um maior aumento
da liberação de dopamina após administração de anfetamina em pacientes
esquizofrênicos quando comparados a controles. Dois trabalhos subsequentes
publicados pelo mesmo grupo demonstraram que a desregulação é mais
pronunciada durante os episódios de exacerbação da doença quando comparada a
períodos de remissão ou estabilização(56, 57), sendo, dessa forma, um estado e não
um traço da doença. Mais que isso, verificaram que a estimulação mediada por
dopamina nos receptores D2 explicaria apena 30% da variância na mudança de
sintomas positivos, indicando que outros fatores estariam envolvidos na
exacerbação dos sintomas. Com base nessas evidências, foi sugerido que a
alteração da transmissão dopaminérgica seria uma via efetora final comum da
psicose, mas não a alteração fundamental, cunhando a expressão “dopamine as the
wind of psychotic fire”.
Posteriormente, Kapur(58) propôs o que pode ser considerada uma terceira
formulação da teoria dopaminérgica, sugerindo que o papel da dopamina na
esquizofrenia seria influenciar a Saliência, um processo meta-cognitivo de
hierarquização da relevância de estímulos internos e externos.
A teoria dopaminérgica é limitada em responder algumas questões centrais
da doença: o porquê do início dos sintomas ocorrer usualmente na adolescência e
16
início da vida adulta, como se dão as alterações estruturais cerebrais e os prejuízos
cognitivos e o motivo dos antipsicóticos não serem igualmente eficazes sobre
sintomas negativos.
2.2.1.2. Teoria Serotoninérgica
O uso de LSD causa sintomas como desrealização, despersonalização e
alucinações visuais, experiências estas semelhantes a alguns sintomas da
esquizofrenia. Esses efeitos se dão através do antagonismo de receptores
serotoninérgicos. Essa observação, feita ainda na década de 50, levantou a
possibilidade de que um déficit de serotonina estivesse envolvido na patogênese da
esquizofrenia. No entanto, as evidências em favor da teoria dopaminérgica fizeram
com que essa ideia fosse deixada em segundo plano até o final da década de 80,
quando do surgimento dos ASG.
Como já abordado na seção sobre tratamento, os ASG são medicações
efetivas com perfil de efeitos colaterais mais tolerável, marcadas pelo menor
potencial em induzir sintomas extrapiramidais. Uma das hipóteses explicativas
iniciais para a diferença entre típicos e atípicos sugeria que sua melhor tolerabilidade
e possível maior ação sobre sintomas negativos estavam relacionadas, direta ou
indiretamente, ao antagonismo de receptores 5-HT, especialmente os receptores 5-
HT1a e 5-HT2a(59, 60). A observação inicial para essa hipótese que os antipsicóticos
atípicos apresentavam grande afinidade pelo receptor 5-HT2a. No entanto, verificou-
se que essa não seria uma condição exclusiva, uma vez que alguns antipsicóticos
típicos, como a clorpromazina, também apresentam alta afinidade pelo receptor 5-
HT2a. Meltzer et al.(61), propuseram então que a diferença entre eles não seria a
afinidade isoladamente pelo receptor 5-HT2a, mas uma elevada razão entre
bloqueio 5-HT2a/D2 entre os atípicos. Vários dos antipsicóticos atípicos disponíveis
atualmente foram desenvolvidos com base nesse modelo farmacológico, como a
olanzapina, a risperidona e a quetiapina.
Kapur e Seeman(62) discordam dessa observação em relação à ação dos ASG
apontando as seguintes evidências: antipsicóticos típicos como a loxapina e a
clorpromazina mostram grau comparáveis aos atípicos de ocupação 5-HT2A; a
ocupação máxima 5-HT2A é obtida com doses de atípicos que não são
17
antipsicóticas e os atípicos só se tornam efetivos quando a ocupação de receptores
D2 excede 65%, limiar que não difere do necessário para a ação do haloperidol. A
teoria serotoninérgica enquanto modelo explicativo da esquizofrenia é controversa e
carece de evidências mais consistentes.
2.2.1.3. Teoria Glutamatérgica
A ligação entre a esquizofrenia e o sistema glutamatérgico, através do
envolvimento de receptores N-Metil-D-Aspartato (NMDA), foi sugerida inicialmente
pelos efeitos psicotogênicos de anestésicos dissociativos como a fenciclidina e a
quetamina(63). A fenciclidina é uma substância que inicialmente fora utilizada como
anestésico e que teve o uso clínico abolido após relatos associando seu uso
sintomas psicóticos, uso abusivo (angel dust) e neurotoxicidade. Essa substância
atua como antagonista não-competitivo de receptor glutamatérgico tipo NMDA. Uma
revisão realizada por Javitt e Zukin(64) demonstrou que o abuso de fenciclidina
causava um quadro de alterações comportamentais e neurocognitivas associados
normalmente à esquizofrenia. Os mesmos autores propuseram, reunindo evidências
prévias e os resultados obtidos, a hipótese de que a hipofunção do receptor NMDA
contribuiria para a fisiopatologia da doença. A quetamina é um anestésico usado em
crianças e quimicamente relacionado à fenciclidina, mas com uma afinidade 10 a 50
vezes menor para esse receptor. A infusão intravenosa de quetamina em indivíduos
controles saudáveis induziu delírios, desorganização, ilusões visuais e auditivas e
um estado amotivacional marcado por embotamento afetivo, isolamento e retardo
psicomotor(65). Esse estudo foi importante por demonstrar que os efeitos
psicotogênicos poderiam ser dissociados de uma vulnerabilidade em comum para a
dependência a substâncias da classe da fenciclidina. O potencial para indução de
sintomas psicóticos parece ser menor em crianças do que em adultos, sugerindo
uma dependência da idade semelhante para a ação dos antagonistas NMDA e o
início da esquizofrenia(66).
Uma série de ensaios clínicos com agentes que aumentam indiretamente a
ativação do receptor NMDA (glicina, d-serina e d-cicloserina, por exemplo)
demonstraram efeitos significativos em sintomas positivos, negativos e cognitivos(64,
67, 68). É importante ressaltar que foram observados resultados negativos com as
18
mesmas substâncias, e que a aplicabilidade em contexto clínico parece ser limitada
por problemas relacionados à dificuldade em se estabelecer uma dosagem ideal,
dificuldade em passar a barreira hemato-encefálica e reduzido tamanho de efeito.
Estudos post-mortem identificaram alterações na densidade de receptores
glutamatérgicos e, também alterações em sua composição no córtex pré-frontal,
tálamo e lobo temporal, regiões cerebrais habitualmente implicadas em estudos de
imagem em esquizofrenia(67, 69).
Inúmeras evidências sugerem haver interação tanto do sistema
glutamatérgico sobre a transmissão dopaminérgica como uma relação no sentido
inverso, de modo que as alterações em cada um dos sistemas pode potencializar o
efeito no outro(70).
O glutamato tem um papel importante na migração neuronal, no
desenvolvimento de neuritos, na sinaptogênese e na poda neuronal por apoptose.
Há uma grande diversidade de subtipos de receptores glutamatérgicos que são
codificados geneticamente(71), mas cuja expressão pode ser alterada por fatores
ambientais durante o desenvolvimento cerebral, criando um modelo de disfunção
glutamatérgica para a interação de fatores de risco genéticos e ambientais
observados na esquizofrenia(67). Essas características, somados a achados de
estudos genéticos tornaram a teoria glutamatérgica uma das mais relevantes no
campo da investigação da fisiopatologia da esquizofrenia.
2.2.1.4. Teoria Adenosinérgica
A adenosina faz parte do sistema das purinas e representa uma outra classe
se substâncias capaz de modular o sistema nervoso, sendo diferentes dos
neurotransmissores clássicos. A adenosina tem suas ações mediadas pela ativação
dos receptores A1, A2a, A2b e A3, que diferem entre si em relação à afinidade pela
adenosina, ao tipo de proteína G a eles ligados, e às vias de sinalização intracelular
ativadas(72). Os níveis de adenosina dependem da taxa de formação, difusão e
degradação de ATP, ADP, AMP e do nucleosídeo adenosina(73).
Os receptores A1 estão entre os mais abundantes, e amplamente expressos
receptores inibitórios ligados à proteína G no cérebro(74). A ativação de receptores
19
A1 inibe a liberação de inúmeros neurotransmissores como o glutamato, dopamina,
serotonina e acetilcolina, além de inibir a ativação pós-sináptica por
hiperpolarização(75). Agonistas A1R têm ação anticonvulsivante, ansiolítica, sedativa,
antidepressiva e antipsicótica(76).
Todas as condições que levam à quebra de ATP como a hipóxia, convulsões,
hipoglicemia e trauma levam a um aumento nos níveis de adenosina(73). Turner et
al.(77) demonstraram em camundongos que a administração de agonistas A1R no
período pós-natal imediato levava a alargamento ventricular, alterações difusas de
substância branca e cinzenta, com redução do volume axonal e da densidade de
receptores A1. Camundongos selvagens apresentam um aumento 3 vezes maior do
volume ventricular e de anormalidades de substância branca resultantes de hipóxia
quando comparados a camundongos knockout para receptor A1(78). As alterações
cerebrais em camundongos expostos a agonistas A1R são semelhantes às
encontradas em pacientes com esquizofrenia. Além disso, as complicações
obstétricas têm sido relatadas nos relatórios médicos em até 20% dos pacientes(79),
sendo mais comuns nos pacientes com esquizofrenia do que em controles(80). A
ação da adenosina fornece um possível modelo explicativo para essa associação.
O dipiridamol e o alopurinol aumentam os níveis de adenosina por vias
distintas e foram testados com sucesso na redução de sintomas positivos, mas não
de sintomas negativos da esquizofrenia como potencializadores de antipsicóticos
típicos(81, 82).
A partir dessas e de outras evidências foi proposta a teoria adenosinérgica da
esquizofrenia segundo a qual os pacientes esquizofrênicos apresentariam uma
atividade adenosinérgica persistentemente diminuída(76).
2.2.1.5. Outros Sistemas neurotransmissores
Foram ainda descritas alterações em outros sistemas neurotransmissores,
como o colinérgico(83), o gabaérgico(84) e o do óxido nítrico(85). Cada um desses
sistemas ou substâncias parece explicar melhor aspectos específicos da doença
como alterações cognitivas, relação com neurodesenvolvimento ou resposta
farmacológica. Além disso, é evidente a interação entre eles, potencializando um ao
20
outro, e possivelmente, resultando em um quadro geral complexo em que toda a
neuroquímica cerebral parece estar alterada nos portadores de esquizofrenia.
2.2.2. Neuroimagem
2.2.2.1. Neuroimagem Estrutural
Os primeiros estudos realizados por tomografia computadorizada e
ressonância magnética (RM) do crânio demonstraram a existência de alterações
anatômicas cerebrais em associação ao diagnóstico de esquizofrenia, através da
identificação de achados de aumento de ventrículos laterais e alargamento de sulcos
corticais em uma parcela significativa de casos(86). Estudos posteriores confirmaram
o alargamento de ventrículos laterais e do terceiro ventrículo como achados mais
comuns, mas também identificaram reduções volumétricas cerebrais significativas
envolvendo o córtex temporal medial (hipocampo, giro parahipocampal e amígdala),
o córtex pré-frontal, o neocórtex temporal, a insula, os gânglios da base e o tálamo
de portadores de esquizofrenia(87-89). Uma crítica a esses resultados é o fato desses
estudos terem sido realizados em sua maioria com pacientes crônicos, o que não
permite determinar o efeito dos antipsicóticos sobre essas alterações. Uma revisão
de estudos de RM em pacientes de primeiro episódio demonstrou a presença de
alterações estruturais já no início da doença(90). A mesma revisão identificou 14
estudos longitudinais que demonstram que essas alterações são progressivas, com
redução do volume cerebral após o diagnóstico. De fato, alguns estudos com
medidas repetidas de volume cerebral por RM em pacientes com esquizofrenia têm
mostrado que algumas das alterações cerebrais mencionadas acima, tais como a
dilatação de ventrículos, podem progredir ao longo do tempo(91).
Alterações em substância branca foram consistentemente relatados em
diferentes estudos(92). Esses achados são especialmente relevantes diante das
teorias que propõe alterações na conectividade como um elemento central na
fisiopatologia da doença(93).
21
A redução de volume de hipocampo foi observada em indivíduos na fase de
estado mental de risco (pródromo) para a esquizofrenia, sugerindo que lesões já
estão presentes antes do início da doença (94, 95).
2.2.2.2. Estudos de Neuroimagem Funcional
Pesquisas utilizando as técnicas de PET (Positron Emission Tomography),
SPECT (Single-Photon Emission Computed Tomography) e RM funcional (em
inglês, fMRI) permitem avaliar os níveis de atividade funcional do cérebro em
repouso ou durante a execução de tarefas de estimulação cognitiva ou emocional.
Tais estudos têm possibilitado a investigação dos substratos cerebrais envolvidos
nos sintomas e no processamento cognitivo e emocional dos pacientes com
esquizofrenia. Na década de 1980, pesquisas iniciais utilizando as técnicas de
SPECT e PET demonstraram reduções no metabolismo cerebral de pacientes com
esquizofrenia quando comparados a controles saudáveis em porções do córtex pré-
frontal (“hipofrontalidade”)(96). Desde então, estudos nesta área têm identificado
alteração da atividade funcional não só em áreas pré-frontais, mas também
envolvendo os córtices parietal e temporal, o tálamo e os gânglios da base em
grupos de portadores de esquizofrenia e indivíduos de alto risco(97). Pesquisas de
neuroimagem funcional têm sido também realizadas para investigar diretamente os
padrões de funcionamento cerebral subjacentes a sintomas específicos da
esquizofrenia. Um exemplo desta linha é o uso da fMRI na investigação do substrato
cerebral das alucinações. Shergill et al.(98) demonstraram que durante a experiência
de alucinações auditivas pacientes com esquizofrenia apresentam ativação de áreas
relevantes para o processamento de linguagem (incluindo o córtex temporal, o
córtex frontal inferior esquerdo e o tálamo), bem como do giro parahipocampal, da
porção anterior do giro do cíngulo e de porções superiores do córtex pré-frontal.
O desenvolvimento de técnicas estatísticas e de neuroimagem mais
modernas permitiu abordar a conexão entre as áreas cerebrais de forma mais direta.
A ativação funcional do cérebro pode ser detectada através de RM, via medidas de
perfusão tecidual, mudanças no volume de sangue ou mudanças na concentração
de oxigênio(99). O sinal BOLD (Blood-Oxygenation-Level-Dependent) é a técnica
mais utilizada e parte do princípio de que o sangue libera maior quantidade de
22
oxigênio para neurônios ativos do que inativos, ou seja, mais hemoglobina
oxigenada (oxiemoglobina) do que não oxigenada (deoxiemoglobina), o que leva a
uma variação do sinal magnético, que é detectada pelo aparelho de RM. O sujeito
de pesquisa ao longo da aquisição pode estar em repouso (resting state), ou ser
submetido a testes neuropsicológicos ou tarefas físicas/mentais (task-based). Os
estudos iniciais focaram em detectar variações no sinal BOLD durante a realização
de testes cognitivos, e identificaram diversas alterações no padrão de ativação de
regiões cerebrais isoladas e de diferentes regiões entre si nos portadores de
esquizofrenia(100). Também foram identificadas uma série de redes associadas a
tarefas específicas: Motora, Visual, Controle Atencional e Saliência(101). No entanto,
uma série de questões metodológicas surgiram pela dificuldade de replicação exata
dos paradigmas e dúvidas sobre quais funções os diferentes testes estariam de fato
avaliando. Identificou-se que durante a aquisição havia um padrão em que
determinadas regiões aumentavam a ativação durante o repouso e reduziam
durante o engajamento em uma atividade(102). Propôs-se que essas regiões
constituiriam uma rede cortical, atualmente denominada de Default-Mode Network
(DMN). Posteriormente, demonstrou-se que diversas redes identificadas durante a
realização de tarefas, também apresentam um padrão de atividade coerente durante
o repouso(103).
A função da DMN ainda é alvo de discussões, e diversos estudos a
relacionam a mind-wandering ("divagação-mental"). Especula-se que essa rede se
engaje quando a atividade cortical está voltada para percepções internas(104). As
regiões implicadas na DMN são funcional e anatomicamente relacionadas a
estruturas límbicas, incluindo o córtex parahipocampal, sugerindo que esse circuito
tem acesso a informações mnêmicas(105). Outros autores sugerem que a DMN não
seria uma rede em si, mas representaria "ecos" das demais redes quando essas não
estão ativas(101). Mesmo assim, a avaliação da DMN permitiria entender a integração
entre as diferentes redes. É importante esclarecer aqui que, entende-se por rede, a
representação matemática de um sistema complexo na vida real, definida por uma
coleção de nós (vértices) e conexões (arestas) entre pares de nós. Esse conceito de
rede, assim como as medidas e análises usadas para a sua investigação e
comparação das diferentes redes entre si, têm sido amplamente influenciadas pela
23
teoria dos grafos (para revisão desse tópico ler Rubinov e Sporns(106) e Bullmore e
Sporns(107)).
Alguns resultados demonstram que o padrão de conectividade funcional sofre
influências independentes de fatores genéticos e ambientais(108, 109). Tanto o
desenvolvimento normal, quanto os sintomas psiquiátricos possivelmente sinalizam
o resultado final dessas interações na atividade cerebral.
Em uma revisão recente, Karbasforoushan e Woodward(110) verificaram que a
maioria dos estudos comparando portadores de esquizofrenia e controles saudáveis
identificaram alteração na conectividade funcional relacionada a DMN. No entanto,
os resultados foram variáveis, incluindo achados de hipo-conectividade, hiper-
conectividade intra-DMN e aumento da conectividade entre a DMN e regiões
cerebrais engajadas em outras redes. O achado mais consistente foi de uma maior
hiper-conectividade entre nós da DMN, sendo que outros achados sugerem
alterações nas redes Fronto-Parietal e conexões Talamo-Cortical(111). Alguns
resultados também sugerem uma relação entre disfunção da DMN e sintomas
positivos(112). Mais recentemente, foi demonstrado que os portadores de
esquizofrenia também apresentam alterações no padrão de conectividade estrutural
entre as diversas redes corticais(113). Os achados em relação a DMN e conexão
entre redes são particularmente relevantes, e estão de acordo com previsões
baseadas na teoria de desconexão para esquizofrenia.
2.2.3. Genética
A esquizofrenia é considerada, do ponto de vista genético, uma doença
complexa e multifatorial. Isso significa que as evidências disponíveis sugerem que a
esquizofrenia seja causada por diversos genes em interação com o ambiente. A
herdabilidade (proporção da variação fenotípica da doença numa população
atribuída a fatores genéticos) da esquizofrenia é estimada entre 73 a 90%, sendo
uma das mais altas entre os transtornos psiquiátricos(114). O risco familiar apresenta
uma relação direta com o grau de parentesco: 10% de prevalência entre familiares
de 1º grau e 45% para gêmeos monozigóticos(115). Grandes expectativas foram
geradas com base nas estimativas de herdabilidade, e por se acreditar que uma vez
24
decifrada as bases genéticas da doença pudessem esclarecer as suas causas. No
entanto, esse desafio tem se mostrado mais difícil do que o esperado.
Uma das teorias que direcionou inicialmente os estudos propõe que as
doenças comuns seriam causadas por variantes comuns de pequeno tamanho de
efeito ("Common Disease, Common Variants"), sendo que a soma total dos riscos de
cada gene causaria a doença(116). Segundo essa teoria nenhuma variante seria
necessária ou suficiente. Esse é o modelo teórico que predomina e que orientou os
primeiros trabalhos em estudos de varredura genômica (do inglês, Genome-Wide
Association Studies- GWAS). Uma teoria alternativa propõe que as doenças comuns
seriam melhor explicadas por variantes raras ("Common Disease, Rare Variants") de
maior efeito, o que, por sua vez, explicaria a menor frequência desses variantes(117).
Por essa teoria, as doenças comuns seriam causadas por um grande número
(centenas ou milhares) de diferentes variantes de baixa frequência (menos do que
1:1000), mas com maior proporção de risco agregado.
Em relação a investigação dos determinantes genéticos de uma doença,
busca-se inicialmente determinar, como já mencionado acima, a existência de
agregação familiar, taxa de concordância de gêmeos mono e dizigóticos, e as
estimativas de herdabilidade. Uma vez demonstrado haver um componente
genético, a pergunta seguinte é qual o gene ou genes associados a essa doença.
Existem vários modos de se proceder essa investigação. Abaixo segue uma
descrição dos principais métodos utilizados, os resultados observados em
esquizofrenia e as implicações para estudos futuros.
A análise de Linkage (ou Associação) é uma abordagem clássica para
identificar a localização de regiões cromossômicas associadas a doenças
genéticas(118), cuja principal vantagem reside em potencialmente detectar genes de
efeito moderado a grande. Isso contrasta com estudos GWAS, que são mais
eficazes na identificação loci de menor efeito(116). Estudos de Linkage em
esquizofrenia geraram achados positivos em muitas regiões do genoma, mas com
um quadro complexo de replicações e não-replicações. Entre as regiões mais
comumente implicadas estão a 22q11.2, onde uma grande deleção foi associada a
Síndrome Velocardiofacial. Estima-se que 30% de indivíduos com essa deleção
desenvolvam quadros psicóticos, o que a coloca como o principal fator de risco
genético conhecido para esquizofrenia(119). Por outro lado, dados mais recentes
25
sugerem que menos de 1% dos pacientes diagnosticados com esquizofrenia
apresentem esta deleção(120, 121). Há, assim, uma clara sugestão de heterogeneidade
no risco genético para a esquizofrenia, sendo que nenhuma região isoladamente foi
implicada em mais de 20% de estudos independentes(122) .Recentemente, um
estudo de replicação da associação da região 13q32 em esquizofrenia sugeriu que
a seleção de populações mais homogêneas de pacientes (com maior número de
afetados e menor idade de início de doença) pode aumentar a possibilidade de
resultados positivos(123) . Os estudos de Linkage são importantes por fornecer dados
sobre a forma de transmissão genética da doença, e direcionar os esforços de
identificação de genes envolvidos para uma porção menor do genoma, mas ainda
assim não respondem a pergunta sobre qual gene exatamente estaria envolvido na
doença.
Os estudos que buscaram responder a essa pergunta escolheram genes com
base no conhecimento disponível sobre a doença, e por isso foram conhecidos
como estudos de gene-candidato. É interessante notar que a escolha inicial de
genes a serem estudados foi baseado, em sua maioria, em teorias de respostas
farmacológicas dos antipsicóticos (COMT, 5-HTT, etc.) e, posteriormente, se
direcionou a genes relacionados ao neurodesenvolvimento (DISC1, NDEL1,
Dysbindin). Nos últimos 15 anos foram realizados cerca de 1600 estudos de
associação, investigando o papel de 952 genes e 8932 polimorfismos(124). Vários
estudos identificaram associações significativas com a doença, especialmente dos
genes relacionados ao neurodesenvolvimento. No entanto, o panorama geral ainda
é bem semelhante ao descrito para os estudos de linkage, com limitações evidentes
na generalização dos achados entre os diferentes estudos. O pequeno tamanho das
amostras e o reduzido número de variantes investigadas em cada estudo foram
repetitivamente apontadas como as maiores limitações desses estudos. Estima-se
que os seres humanos apresentem entre 20 a 30 mil genes, 3,2 bilhões de
nucleotídeos, e que cada indivíduo apresente cerca de 3,5 milhões de SNPs em um
total de mais de 37 milhões de SNPs já identificados na espécie humana(125). Além
disso, com os pequenos tamanhos de efeito previstos para as variantes comuns, a
maior parte dos estudos de gene candidato não teriam poder estatístico para
demonstrar associações.
26
Nesse ponto, avanços tecnológicos permitiram a realização de estudos de
varredura genômica, em que milhares ou milhões de variantes são investigadas para
cada indivíduo. Os microarrays ou chips de DNA são lâminas de vidro nas quais
segmentos de fita-única (denominados de "sondas") são fixados e imobilizados de
forma ordenada e em áreas específicas (chamadas de "célula de sonda"). Na
lâmina, cada célula de sonda contém milhões de cópias de um determinado
transcrito, ou um segmento gênico em particular, que pode posteriormente ser
identificado(126). Com os resultados do HAPMAP e a utilização dos arrays, as
plataformas disponíveis atualmente cobrem 80% das variações comuns presentes
no genoma de amostras de população de origem europeia(127).
Os estudos de varredura genômica realizados permitiram a identificação de
novas vias e percepções sobre a genética da esquizofrenia conforme apresentados
abaixo:
2.2.3.1. Sobreposição Genética entre os Diagnósticos
Uma meta-análise recente usando dados de varredura genômica do
Psychiatric Genomics Consortium (PGC) de controles saudáveis e casos em
esquizofrenia, transtorno bipolar, depressão maior, autismo e transtorno de déficit de
atenção e hiperatividade investigou a etiologia genética compartilhada entre esses
transtornos(128). Usando uma amostra total (pacientes para cada transtorno e
controles) superior a 70 mil indivíduos, a herdabilidade associada a SNPs variou de
de 17 a 29% e demonstrou grande sobreposição entre os diagnósticos, sobretudo
esquizofrenia e transtorno bipolar, com 68% de correlação entre os SNPs.
Considerando outros estudos, os achados de variância genética compartilhada são
mais consistentes para esquizofrenia, Autismo e Transtorno Bipolar. A principal
limitação a esses achados é o possível efeito confundidor do diagnóstico e a
sobreposição entre elas ou entre espectros de alguns fenótipos específicos
(memória de trabalho, por exemplo). Tudo acima considerado, reforça-se a
necessidade de se rediscutir as fronteiras entre os diagnósticos psiquiátricos.
27
2.2.3.2. Papel das Copy Number Variations - CNVs ("Variações do Número de Cópias")
As Variações do Número de Copias ou Copy Number Variations (CNVs) são
variações estruturais do genoma que resultam em uma alteração anormal (aumento
ou redução) de seções do DNA(129). Podem afetar extensões que vão de 1 kilobase
(1000 pares de bases) a várias megabases e estima-se que afetem cerca de 12% do
DNA genômico humano, sendo reconhecidas atualmente como uma das mais
importantes fontes de variabilidade genética. Pela sua extensão, normalmente
afetando mais de um gene, o potencial impacto de 1 CNV é normalmente maior do
que o de 1 SNP. Outro ponto a se considerar é que como apresentamos 2 cópias
para cada cromossomo autossômico, o efeito de um CNV, que normalmente afeta
apenas um cromossomo do par de cromossomos autossômicos, dependerá do seu
efeito final sobre a dosagem dos genes na região, que dependerá das variantes
polimórficas nos genes do cromossomo não afetado.
O papel das alterações cromossômicas é bem conhecido na esquizofrenia. A
deleção da região 22q11.2, por exemplo, foi implicada em estudos de Linkage, como
mencionado anteriormente. Se a deleção em si isoladamente não parecia explicar a
esquizofrenia, ela passou a ser um modelo para investigar como se compõe o risco
genético. Nesse caso, a deleção 22q11.2 pode apresentar extensões diferentes,
mas normalmente envolve uma região de 1,5 megabase que abrange 32 genes,
alguns fortemente implicados na esquizofrenia, como o da Catecol-O-Metil
Transferase (COMT)(130). Estudos usando o modelo da deleção 22q11.2 para a
investigação genética em esquizofrenia encontraram associações significativas de
genes dessa região à idade de início da doença, volume de regiões corticais e
performance cognitiva(131-133). De modo interessante, o contrário, ou seja, apresentar
uma duplicação da região, parece proteger para o desenvolvimento da doença(134).
No entanto, apenas após o advento dos estudos de varredura genômica, e a
demonstração de que essas variações sejam mais comuns do que se imaginava,
explicando uma parte considerável da variabilidade genética humana, é que os
CNVs passaram a ser sistematicamente investigados.
Em 2008, Stefansson et al.(135) identificaram 66 de novo CNVs associados à
esquizofrenia, sendo que 3 foram replicados em uma segunda amostra, envolvendo
28
as regiões 1q21.1, 15q11.2 e 15q13.3. Considerando os estudos publicados até o
momento, oito CNVs apresentaram um forte efeito no risco para a doença e foram
replicados em diferentes estudos(136). Apenas dois desses CNVs afetam genes
isolados: deleção de 2p16.3 (Neurexina 1 - NRXN1) e a duplicação 7q36.3 (receptor
de peptídeo vasoativo intestinal - VIPR2), os demais CNVs afetam potencialmente
múltiplos genes, como a duplicação na região 15q11.2 (70 genes nessa região). Um
estudo recente demonstrou que a penetrância* desses CNVs não é completa, e que,
portanto, somente apresentar o CNV não seria o suficiente para desenvolver a
esquizofrenia(137). Se os CNVs parecem ser importantes fatores de risco, eles
normalmente afetam múltiplos genes o que limitam a sua utilidade para a
contribuição de mecanismos relacionados a genes individuais. Outro ponto
importante, é que os CNVs associados à esquizofrenia são geralmente variantes
raras, o que contraria a premissa inicial de estudos de varredura genômica, na qual
o risco genético para a esquizofrenia estaria relacionada a variantes comuns.
2.2.3.3. Papel das Variantes Raras e de Mutações de Novo
São consideradas variantes raras as que apresentam uma frequência
populacional inferior a 1%. Evidências recentes têm sugerido que as variantes raras
apresentam maior chance de afetar a estrutura ou a função de proteínas e, portanto,
de ter maior impacto biológico ou consequências médicas(138, 139). Existem diversos
motivos para uma variante ser rara. Um deles é estar sobre pressão evolutiva
negativa, o que causa uma redução progressiva na sua frequência populacional. A
pressão evolutiva negativa ocorre quando a variante está associada a algum evento
que reduz o sucesso reprodutivo do seu portador. Assim, potencialmente, espera-se
que as variantes raras se associem a um risco maior quando associadas a doenças.
Já mutações de novo são variantes herdadas, mas não presentes nos pais, geradas
a partir de "erros" no processo de meiose. Não são necessariamente negativas, mas
por não terem passado pelo processo de seleção natural, tem um risco potencial
maior para serem neutras ou negativas, do que positivas em termos adaptativos.
* Define-se aqui a penetrância como a proporção em que indivíduos com determinado genótipo
efetivamente expressam um fenótipo. * Breen, G. comunicação pessoal * Para mais informações, ler http://www.nimh.nih.gov/research-priorities/rdoc/nimh-research-
domain-criteria-rdoc.shtml
29
Uma dificuldade nesses casos é que a detecção de variantes raras ou mutações de
novo exige abordagens mais complexas, como a investigação genética dos pais e o
sequenciamento. No sequenciamento, uma porção do DNA, que pode ser um gene,
uma região, um exoma, ou todo o DNA (sequenciamento de genoma inteiro), é
investigada base a base. A vantagem é não necessitar de uma hipótese ou
conhecimento a priori de uma região. A desvantagem é a complexidade maior na
avaliação dos resultados, as dificuldades técnicas e o custo mais elevado. Estima-se
que cada indivíduo apresente 30 alterações de novo.
Uma série de evidências recentes tem sugerido que, diferente do que se
imaginava no início, as variantes raras têm um papel importante na esquizofrenia(140-
142). Um dado consistentemente replicado, é que portadores de esquizofrenia
apresentam uma maior número de mutações de novo do que o esperado sobretudo
em vias relacionados ao neurodesenvolvimento(143). Essas evidências reforçam a
necessidade de novos desenhos de estudo que permitam analisar adequadamente
essa maior complexidade genética.
2.2.3.4. Novas Vias e Genes
Por permitirem uma varredura genômica ampla, não enviesada pela escolha a
priori de genes específicos, os estudos de GWAS possibilitam identificar uma série
de genes e polimorfismos até então não investigados em esquizofrenia.
No maior estudo de varredura genômica realizado até o momento, 21 mil
pacientes com esquizofrenia e 38 mil controles foram avaliados e os resultados
foram reunidos em 4 grupos ou temas: 1) sinalização neuronal mediada por canais
de cálcio (CACNA1C, CACNB2); 2) complexo de histocompatibilidade principal; 3)
microRNA 137 (MIR137); 4) RNAs intergênicos não codantes (lincRNAs)(144). Esses
grupos podem ainda ser reunidos/agrupados quanto à sua função em 2 categorias:
regulação de plasticidade cerebral/neurodesenvolvimento e regulação de expressão
gênica.
O gene CACNA1C codifica uma subunidade do canal de cálcio voltagem-
dependente do tipo L. Os canais de cálcio mediam o influxo de cálcio ionizado para
o interior da célula durante a despolarização, evento essencial para a atividade
neuronal e transmissão sináptica. Os resultados para o CACNA1C são
30
especialmente relevantes pelo grande número de estudos, sugerindo um papel para
esse gene no desenvolvimento de transtornos psiquiátricos graves (autismo e
transtorno bipolar) e funções cognitivas, em especial a memória, por estar
relacionado ao processo de potencialização de longo prazo(145, 146). Além disso, foi
um dos poucos achados replicados em diferentes estudos de varredura
genômica(147). O potencial impacto no funcionamento cognitivo torna essa proteína
especialmente relevante, uma vez que a dimensão cognitiva é atualmente
considerada central no desenvolvimento dos sintomas e prejuízo funcional
tipicamente associados à esquizofrenia(148). Recentemente, Erk e cols.(149)
demonstraram uma relação entre um escore poligênico de risco para a
esquizofrenia, gerado por dados de varredura genômica para polimorfismos do gene
CACNA1C e menor ativação, detectada através de RM funcional, do córtex
dorsolateral pré-frontal, cíngulo anterior e hipocampo em portadores de
esquizofrenia.
Um modo interessante de interpretar os dados de varredura genômica é
entender o modo como essas alterações potencialmente afetam o desenvolvimento
cerebral, para criar modelos mais abrangentes do efeito dos genes na doença.
Assim, fatores que potencialmente impactam diversas vias, como os micro ou linc
RNAs, ou diferentes circuitos cerebrais são alvos potenciais para a compreensão do
risco de desenvolver a esquizofrenia.
2.2.3.5. O Caso da Herdabilidade Perdida ("The case of missing Heritability")
Os dados de herdabilidade sugeriam que seria fácil a tarefa de identificar os
"genes da esquizofrenia". Como exposto acima, apesar dos grandes avanços, não
se identificou nenhum gene que permitisse tal nível de certeza ou replicabilidade em
diferentes populações de portadores de esquizofrenia. Mais que isso, mesmo nos
maiores estudos de GWAS como o de Ripke et al.(144), a variância total explicada
pelos SNPs na amostra é estimada em 17%. Estima-se que com amostras em torno
de 100 mil indivíduos, a variância explicada por SNPs e CNVs alcance em torno de
31
40%*. Considerando-se que todos esses estudos se baseiam na premissa de que o
clínico que selecionou os sujeitos para o estudo é capaz de identificar com certeza
100% dos casos, esse dado se mostra ainda mais frágil frente às estimativas iniciais
de herdabilidade. Essa dificuldade em achar resultados consistentes, mesmo em
amostras grandes, gerou discussões acerca das possíveis causas dessa
herdabilidade perdida ("missing heritability").
Maher(150) apontou as possíveis causas para esse fenômeno:
1) Pequeno número de genes/polimorfismos estudados. Já discutido no início
da seção Genética.
2) Variantes Não-Estudadas. Existem dois motivos para não ter se
investigado uma variante: não serem conhecidas, como os CNVs nos estudos
iniciais; ou simplesmente não-estudadas, como as variantes raras, colocadas de fora
dos estudos de GWAS iniciais, ou de polimorfismos não-identificados. Um estudo de
sequenciamento do gene do Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) em uma
população mexicana identificou 83 SNPs não conhecidos previamente (151). Como os
arrays dependem de sequencias conhecidas de DNA, isso indica que a ampliação
dos estudos de sequenciamento em diferentes populações possivelmente
melhorarão a cobertura dos estudos de GWAS para as populações não-
caucasianas.
3) Interações. Os efeitos de um gene podem ser significativos dependendo da
interação com um fator ambiental (interação gene-ambiente) ou outro gene
(interação gene-gene ou epistasia). Nesse caso, o estudo da sequência gênica não
revelaria o efeito da variante investigada na doença.
4) Heterogeneidade Clínica. O quanto se acredita que todos os pacientes
com esquizofrenia compartilham a mesma base fisiopatológica? Esses dados
estariam de acordo com observações históricas, como a de Eugen Bleuler, que se
referia ao "grupo das esquizofrenias", não a uma única doença. Nesse contexto, a
pequena porção de herdabilidade observada até o momento poderia ser explicada
por se restringir à parcela compartilhada por todos os pacientes, o que poderia ter
um tamanho de efeito menor do que alguns fatores genéticos afetando sub-grupos
de pacientes.
* Breen, G. comunicação pessoal
32
Em relação ao problema da heterogeneidade clínica algumas alternativas
foram propostas, destacando-se a avaliação dimensional, a descrição de subtipos, o
estadiamento clínico (já discutidos em seções anteriores), e os endofenótipos .
Segue abaixo uma revisão sobre os endofenótipos, tópico que merece especial
relevância por sua relação com fatores genéticos e implicações para a investigação
da fisiopatologia da esquizofrenia.
2.2.3.6. Endofenótipos e a Busca por Novos Alvos para Estudos Genéticos
Em 1973, Gottesman e Shields(152) propuseram pela primeira vez a ideia de
endofenótipo em psiquiatria, que seriam características, passíveis de serem medidas
através de testes bioquímicos ou análises microscópicas, situadas a meio caminho
entre a doença como um todo e suas bases genéticas. Essa abordagem parte do
pressuposto teórico de que quanto mais complexo o fenótipo, por exemplo, o
conjunto de comportamentos de um indivíduo, maior o número de genes associados.
Dessa forma, fenótipos mais simples (um sintoma, uma dimensão cognitiva)
estariam relacionados a um menor número de genes. O uso do conceito se expandiu
e passou a ser utilizado em diferentes contextos, alguns bem distintos da proposta
inicial. Gottesman e Gould, cerca de 30 anos após o artigo original, sistematizaram
seis critérios que seriam definidores do conceito(152, 153):
1) O endofenótipo está associado com a doença na população
2) O endofenótipo é hereditário
3) O endofenótipo é primariamente independente de estado (manifesta-se no
indivíduo com a doença ativa ou não).
4) Dentro de famílias, endofenótipos e a doença segregam juntos.
5) O endofenótipo presente em membros afetados da família, está presente
em membros não afetados em uma taxa maior do que a esperada na população em
geral.
6) O endofenótipo deve ser um trato que possa ser medido de modo
confiável, e que esteja, idealmente, mais fortemente associado com a doença de
interesse do que com outras doenças psiquiátricas.
33
Essa proposta tem direcionado esforços nos últimos nos, o Consórcio em
Genética da esquizofrenia (Consortium on Genetics of Schizophrenia - COGS) é
uma iniciativa do National Institute of Mental Health (NIMH) com a participação de 7
centros que se propôs a identificar e investigar endofenótipos em esquizofrenia(154).
É interessante notar que foram sugeridos apenas endofenótipos baseados em testes
neuropsicológicos e em medidas neurofisiológicas, nenhum baseado em sintomas. É
claro o objetivo no campo de identificar medidas que sejam mais confiáveis,
reprodutíveis e menos dependentes de avaliação subjetiva. Ao mesmo tempo, essa
perspectiva pode retardar a translação desse conhecimento para a prática clínica.
Uma outra proposta realizada considerando essas premissas é a do Research
Domain Criteria (RDoC), também do NIMH que se propõe explorar, de modo
independente das categorias diagnósticas atuais, dimensões sintomatológicas e
neurobiológicas. A partir das informações de distribuição dessas dimensões se
espera desenvolver uma nova proposta diagnóstica*.
2.2.4. Fatores de Risco Ambientais
Diversos estudos epidemiológicos demonstraram a associação entre fatores
de risco ambientais e o risco para a esquizofrenia. Esses fatores de risco podem ser
agrupados, de acordo com a fase de vida em que tendem a ocorrer, em precoces ou
tardios. Complicações obstétricas, idade paterna avançada, infecções perinatais,
trauma e uso de maconha foram associados à doença(94, 155). Esses fatores parecem
interagir com características genéticas na determinação do risco de acometimento.
Caspi e colaboradores(156) demonstraram que o risco isolado associado ao uso de
maconha é baixo, mas quando indivíduos com uma variante gênica de risco usam
maconha antes dos 18 anos, o risco de desenvolver esquizofrenia aumenta em 10
vezes. Esse estudo também ressalta a importância do conceito de "janela de
desenvolvimento", uma vez que essa interação só foi significativa quando a
exposição ao fator de risco ocorreu antes dos 18 anos, mas não depois, sugerindo
haver fases vulneráveis para a exposição ambiental durante o desenvolvimento,
possivelmente relacionadas à plasticidade cortical.
* Para mais informações, ler http://www.nimh.nih.gov/research-priorities/rdoc/nimh-research-domain-criteria-rdoc.shtml
34
Epigenética é o estudo de mudanças relativamente estáveis do padrão de
expressão de um gene não relacionadas a alterações na sequência de DNA(157).
Tem se mostrado relevante para a compreensão de fenômenos tradicionalmente
atribuídos ao ambiente, como o comportamento materno(158). A sua importância
pode ser melhor entendida quando se considera que todas as células de um
indivíduo contêm a mesma sequência de DNA, mas podem formar tecidos e órgãos
tão diferentes quanto um osso ou o coração; esse fenômeno é mediado por
mecanismos epigenéticos. Vários mecanismos moleculares de regulação
epigenéticos foram identificados, como a metilação de DNA, acetilação de histonas e
os micro-RNAs(159). Alterações epigenéticas foram relacionadas à esquizofrenia. Por
exemplo, diferenças no padrão de metilação foram identificadas em gêmeos
monozigóticos discordantes para o diagnóstico de esquizofrenia, o que poderia
explicar a diferença na suscetibilidade para a doença(160). Polimorfismos do gene
MIR137 (um microRNA) foram associados à esquizofrenia e afetam a expressão de
genes que haviam sido associados de modo independente à doença, como o
CACNA1C(144, 161) . Os traços epigenéticos são específicos para cada tecido, o que
implicaria, na esquizofrenia, em investigar o tecido cerebral. Pela dificuldade
evidente em acessar o tecido cerebral, a maior parte dos estudos investiga traços
epigenéticos no sangue. O que, por sua vez, gera incertezas na correspondência
entre os resultados do sangue e cérebro. Recentemente, foi demonstrado haver uma
correspondência entre resultados do estado de metilação de algumas regiões do
cérebro e de células presentes no sangue após a administração de decanoato de
haloperidol(162). Esse resultado sugere que o estudo da expressão gênica no sangue
pode ser uma ferramenta para avançar na compreensão de seus fatores
reguladores. Essa evidência também pode sinalizar que o estudo dos produtos finais
da expressão gênica do sangue (proteínas, enzimas, imunoglobulinas), podem ser
formas interessantes para entender a cascata de eventos genéticos e fisiológicos
que resultam na esquizofrenia.
2.2.5. Modelos Animais
Os modelos animais são ferramentas importantes para investigar as causas
de doenças em humanos e para o desenvolvimento de novos tratamentos. As
35
doenças mentais adicionam um maior desafio à transposição dos achados em
camundongos ou macacos para os seres humanos. A esquizofrenia, em especial, ao
afetar o mais humano dos elementos, o pensamento, torna essa transposição uma
tarefa ainda mais complexa.
Os modelos animais podem representar uma doença em três níveis
diferentes: 1) Podem reproduzir fatores causais (alteração gênica); 2) Replicar
aspectos da fenomenologia (um sintoma específico, por exemplo); 3) predizer
resposta a tratamentos atualmente disponíveis (medicações antipsicóticas)(163).
A complexidade da esquizofrenia impõe de início um desafio no
desenvolvimento dos modelos animais, uma vez que não existe um único genótipo,
marcador comportamental ou fenótipo celular que possa representar a doença como
um todo. A falta desse "padrão-ouro" dificulta o desenvolvimento de um modelo
completo da doença. De fato, apesar dos inúmeros esforços nesse sentido, nenhum
modelo pode ser considerado, até o momento, definitivo. Mesmo em estudos que
avaliam os modelos quanto a um único aspecto ou dimensão de funcionamento, a
validade de quanto esse comportamento animal se correlaciona de fato ao
observado em humanos deve ser sempre questionada. Além disso, um
comportamento pode ser útil para obter uma determinada resposta, mas não estar
diretamente relacionado à doença. Por exemplo, a redução da atividade motora
frente à administração de um composto é um bom critério para rastreamento de
potenciais antipsicóticos. No entanto, a hiperlocomoção não apresenta uma boa
validade de construto para os sintomas positivos(164).
Os diferentes modelos animais caracterizados até o momento podem ser
reunidos em quatro grupos(165): neurodesenvolvimentais; derivados de manipulação
farmacológica, lesionais e genéticos. O modelo animal clássico de esquizofrenia é o
uso de substâncias que estimulam a transmissão dopaminérgica, em especial, a
anfetamina. Esse modelo foi importante para o desenvolvimento de medicações,
sendo, portanto, um bom modelo preditivo de resposta, mas a rigor, apresenta
reduzidas validades de construto e de face(163). No geral, induz alterações
compatíveis com sintomas positivos, mas não replica sintomas negativos ou
cognitivos da esquizofrenia(165). Estima-se atualmente que tenham sido
desenvolvidos mais de 20 modelos(166). Estes modelos contribuíram para entender o
36
papel de genes e substâncias na fisiopatologia da esquizofrenia, mas ainda
apresentam limitada translação de resultados aplicáveis para humanos.
Uma proposta para melhorar a possibilidade de translação seria usar modelos
com alterações genéticas mais específicas que possam informar sobre alterações
em fenótipos específicos e possibilidade mais clara de intervenções
farmacológicas(164). Os estudos de modelos animais se tornaram muito importantes
na área de pesquisa translacional que busca levar o conhecimento de áreas básicas
para aplicações com repercussão clínica em humanos. Mais recentemente, vem
sendo discutido o conceito de translação reversa, na qual as hipóteses geradas pela
pesquisa em humanos são testadas em modelos animais(167).
2.2.6. Cognição
Os déficits cognitivos têm sido considerados uma característica central da
esquizofrenia, e um dos principais determinantes do prejuízo funcional associado à
doença, com mais de 75% dos pacientes apresentando prejuízo cognitivo
significativo(148, 168).
O prejuízo cognitivo tem sido relacionado a diferentes aspectos da doença:
fator de risco, marcador comportamental das alterações biológicas subjacentes e
marcador da progressão da doença.
Uma metanálise de 12 estudos incluindo mais de 4000 pacientes com
esquizofrenia indicou que menores valores de Quoeficiente de Inteligência (QI)
aumentam o risco de desenvolver esquizofrenia dentro de uma relação tipo dose-
resposta (com um tamanho de efeito de 0,43)(169). Esse efeito foi evidente a partir
dos 13 anos. Antes, portanto, da idade média de início da esquizofrenia. Nessa
mesma direção, apresentar baixo desempenho acadêmico foi associado a um
aumento de quatro vezes no risco para esquizofrenia, enquanto repetir uma série
apresentou o maior risco, em torno de nove vezes(170).
Parentes de primeiro grau não afetados também apresentam prejuízos no
funcionamento cognitivo, mas em menor intensidade quando comparados aos
pacientes com esquizofrenia(171).
O momento em que essas alterações ocorrem e qual a sua relação com a
progressão da doença são alguns dos temas mais relevantes no campo. Uma série
37
de evidências, como as descritas acima sugerem que os prejuízos antecedem o
início da doença. Estudos em indivíduos em Estado Mental de Risco (EMR)
demonstraram que esse grupo apresenta pior desempenho em testes cognitivos
comparado aos controles saudáveis, e que dentro do grupo de indivíduos em risco,
os que tem pior desempenho apresentam maior risco para conversão(172, 173). Uma
metanálise sobre o funcionamento cognitivo pré-mórbido sugere que há progressão
desses déficits, uma vez que o grau de prejuízo cognitivo na ordem de dois desvios
padrões (em comparação à população em geral) encontrados em pacientes é maior
que o de meio desvio padrão observado em indivíduos antes de iniciar a doença(174).
Foram identificadas alterações em praticamente todas as funções cognitivas
na esquizofrenia, com grande variações para uma mesma dimensão cognitiva em
cada estudo; o que pode ser explicado parcialmente por diferenças metodológicas,
mas parece traduzir, de fato, as diferenças entre os pacientes(175). De fato, um dos
melhores fatores para diferenciar amostras de pacientes, parentes não-afetados e
controles saudáveis, é a extensa variabilidade intra-grupo observada entre os
pacientes(176).
Considerando a importância relativa de dimensões cognitivas específicas, a
literatura tem enfatizado o papel do prejuízo nas funções executivas. As funções
executivas são processos cognitivos que permitem o ajuste dinâmico do
comportamento com base em representações internas (intenção) ou em função de
mudanças externas(177). Outras funções habitualmente apontadas como déficits
centrais são: memória de evocação, memória de trabalho, atenção, aprendizagem e
cognição social(178).
Dentro do campo de cognição em esquizofrenia, linhas de pesquisa que
investigam as alterações em processos cognitivos como elementos centrais para o
desenvolvimento dos sintomas da doença, sobretudo delírios e alucinações, tem
crescido. Nesse sentido, um conceito interessante é o processo chamado “jumping
to conclusions” (pular para conclusões). Esse conceito pode ser definido como um
viés ou tendência em usar menos dados para chegar a uma conclusão sem uma
consideração de hipóteses alternativas(179), o que contribuiria para a formação e
perseveração da ideia delirante. Resultados preliminares sugerem que pode se
tratar de um endofenótipo da doença. Como discutido acima na seção sobre
endofenótipos, outros marcadores cognitivos também foram propostos para
38
investigação da sua possível associação ao risco em desenvolver alucinações (não
supressão do P50).
Recentemente, Kahn e Keefe(180) propuseram que a esquizofrenia deveria ser
redefinida como um distúrbio primário da cognição. Essa proposta gerou grande
controvérsia e vários dos argumentos apontados por Kahn e Keefe foram
contestados(181, 182). Essa discussão demonstra a importância que a investigação da
cognição assumiu na pesquisa em esquizofrenia. Não existe ainda uma medicação
efetiva na melhora dos déficits cognitivos associados à doença.
2.2.7. Biomarcadores Periféricos
Um biomarcador pode ser uma característica biológica mensurável que pode
funcionar como um indicador de processo biológico normal, processo patogênico ou
resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica(183). Exemplos de
biomarcadores incluem desde a pressão arterial e frequência de pulso, passando
por medidas bioquímicas simples até testes mais complexos(184). Podem ser
classificados de diferentes formas, por exemplo, quanto ao seu propósito
(diagnóstico, prognóstico, resposta terapêutica). No campo da pesquisa em
neurociência, uma mutação gênica em particular, um fator de transcrição, o nível de
uma proteína no sangue ou urina, ou uma imagem de ressonância do encéfalo
podem ser biomarcadores. Ou seja, várias das características descritas nas seções
anteriores podem ser consideradas biomarcadores. Segunda a Agência Europeia de
Medicamentos, as mais importantes características de um biomarcador são: a sua
validade analítica, a validade clínica, utilidade clínica, viabilidade, ser não-invasivo e
tempo/custo efetivo(185). Considerando essas características, biomarcadores em
sangue periférico surgem como alvos especialmente interessantes por agregar
viabilidade, serem pouco invasivos e apresentar potencialmente boa relação custo-
efetividade. Ainda assim, a identificação e validação de potenciais biomarcadores é
um processo trabalhoso. Uma técnica recente que tem se apresentado promissora é
a parallel-omics, na qual diferentes abordagens "ômicas" (genômica, proteinômica,
metabolômica) são realizadas, em paralelo, no mesmo indivíduo.
Em esquizofrenia, a investigação de biomarcadores periféricos ganhou
impulso recente com a investigação de marcadores inflamatórios. Segue abaixo a
39
descrição dos achados com marcadores inflamatórios e de uma classe de enzimas
ainda pouco estudadas em esquizofrenia, as oligopeptidases.
2.2.7.1. Desregulação do Sistema Imune e da Resposta Inflamatória e Esquizofrenia
A hipótese de que anormalidades imunológicas poderiam desempenhar um
papel importante na fisiopatologia da esquizofrenia foi inicialmente proposta há cerca
de 40 anos(186). Nos últimos anos houve um acúmulo de evidências de alterações
nos níveis de citocinas em pacientes com esquizofrenia(187) e em parentes de
primeiro-grau(188).
Como revisado por Miller et al.(189) podem-se apontar 3 hipóteses principais
sobre a base de imunidade/citocinas na esquizofrenia: 1) Teoria Macrófago-Linfócito
T na qual IL-1, IL-2, Interferon-gama (IFN-γ) produzidos por macrófagos
cronicamente ativados e os linfócitos T seriam os mediadores fundamentais da
esquizofrenia(190); 2) Teoria dos Linfócitos T helper tipo 2 (Th2) que propõe haver um
mudança na resposta imune das células Th1, citotóxica, para células Th2,
dependentes de anticorpo(191); 3) Hipótese da Micróglia que sugere uma papel
central da liberação de citocinas e radicais livres por parte da micróglia no sistema
nervoso central (SNC), o que causaria alteração na neurogênese, degradação
neuronal e anormalidades em substância branca.
Uma metanálise recente dos estudos de citocinas no sangue e em líquido
cefalorraquidiano demonstrou aumento significativo de citocinas produzidas por
macrófagos (IL-1B, IL-6, TNF-alpha), assim como as produzidas por células Th1
(IFN-γ e IL-12) em pacientes com esquizofrenia(189). Esse achado reforçaria a Teoria
Macrófago-Linfócito T.
Ripke et al.(144), em estudo de varredura genômica com cerca de 22 mil
pacientes e 36 mil controles saudáveis, sugeriram o envolvimento de polimorfismos
de vários genes ligados ao complexo de histocompatibilidade principal, o que reforça
a ideia de uma papel de alterações na imunidade para o início ou progressão da
doença.
40
Um fator confundidor no estudo e compreensão do papel das citocinas é que
a ação dos antipsicóticos parece normalizar o nível de resposta imune após o
tratamento para uma episódio psicótico agudo(192).
2.2.7.2. Oligopeptidases
As oligopeptidases são uma categoria especial de enzimas, cujos substratos
são oligopeptídeos e não proteínas. As oligopeptidases que quebram ligações
peptídicas não terminais (localizadas fora das extremidades da molécula peptídica)
são denominadas de endopeptidases, que se contrapõem, como as exopeptidases,
quebram as ligações peptídicas mais próximas às porções terminais de um substrato
peptídico. Assim, as endopeptidases não são capazes de liberar monômeros de
aminoácidos a partir de peptídeos, enquanto as exopeptidases podem apresentar
essa habilidade ou podem liberar dipeptídeos (ou seja, dois aminoácidos), como é o
caso da Enzima Conversora da Angiotensina I (ECA). Os estudos com essas
oligopeptidases estimularam o desenvolvimento dos primeiros peptídeos com
fluorescência “apagada” (quenched fluorescent), que permitem medir
quantitativamente a atividade de dessas enzimas(193). Esse foi o precursor para o
desenvolvimento dos peptídeos FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer),
atualmente usados para a dosagem de atividade de peptidases em fluidos
biológicos, tecidos e homogenatos de células(194, 195). Nos estudos aqui conduzidos e
descritos para a determinação da atividade da NDEL1 e da ECA, o método de
fluorimetria utilizando os peptídeos FRET específicos foi empregado.
Segue abaixo a descrição das funções destas duas oligopeptidases e a
revisão dos principais achados que as associam à esquizofrenia.
2.2.7.2.1. Nuclear Distribution Element-Like 1 (NDEL1)
Nuclear Distribution Element 1 (NDE1) e NDE-like 1 (NDEL1) são proteínas
coiled-coil com alta similaridade estrutural primária e que aparentemente não
apresentam um gene ancestral comum. Entretanto, devido à função biológica
comum sugerida, ou seja, na distribuição o gene NudE identificado inicialmente no
41
Aspergillus nidulans motivou a nomenclatura destes genes(196). A NDE1 foi descrita
também como um importante ligante da LIS1, cujo gene foi associado à lissencefalia
e/ou síndrome de Miller-Dieker, que é uma síndrome rara de má-formação cerebral
determinado por migração neuronal defeituosa, devido à presença de mutações e/ou
deleções neste gene em indivíduos afetados(196). Posteriormente, uma proteína
semelhante à NDE1 foi descrita em um estudo que investigava ligantes da LIS1,
denominada atualmente de NDEL1. Apesar da alta similaridade na
sequênciaprimária e ambas adotarem estruturas e estados olimogéricos
semelhantes, NDE1 e NDEL1 são reguladas diferentemente por mudanças pós-
translacionais e apresentam afinidades para diferentes para cada um dos ligantes,
muitos dos quais são comuns a estas duas proteínas(197). A maior diferença entre
elas é o fato da NDEL1 apresentar atividade enzimática, enquanto o mesmo não foi
demonstrada/comprovada para a NDE1 até o momento. A geração de proteínas com
estruturas e ações semelhantes ao longo da evolução, mas com algumas
características distintas, permite uma regulação mais precisa de suas funções e
sugere a importância destas no desenvolvimento e sobrevivência das espécies. A
inativação do gene da NDEL1 através de RNA de interferência (RNAi) em uma
linhagem de células de neuroblastoma, derivada de neurônios corticais primários ou
de cérebro de rato (pós-natal) desestabiliza o Neurofilamento-L alterando a
homeostase dos neurofilamentos, que são os principais constituintes do
citoesqueleto neuronal(198). No mesmo estudo, foram observados níveis reduzidos de
NDEL1 em um modelo animal de doença neurodegenerativa (ou seja, rato mutante
capaz de superexpressar a superóxido dismutase-1), onde estes níveis de NDEL1
acompanhavam a evolução do quadro clínico. Esses resultados e a expressão
preferencial em células do SNC sugerem um papel importante da NDEL1 no
desenvolvimento cerebral(199-202).
É interessante ressaltar que a NDEL1 já havia sido identificada anteriormente
por um grupo de pesquisadores brasileiros, e que vinha sendo estudada desde o
início dos anos 70, devido às suas propriedades funcionais dependentes da
atividade enzimática (201, 203, 204).Inicialmente denominada de endooligopeptidase A
(Endo A), a NDEL1 foi primeiramente isolada do citosol de cérebro de coelho, da
mesma forma que uma outra endopeptidase denominada inicialmente de
endooligopeptidase B (Endo B), hoje conhecida como Prolyl-Oligopeptidase (POP),
42
devido à sua habilidade em degradar peptídeos como a bradicinina e a
neurotensina(205, 206).
A especificidade primária da Endo B limita-se ao reconhecimento de resíduos
de prolina em P1, e, por isso posteriormente foi renomeada como POP(207).
Interessantemente, a POP foi encontrada em menores níveis no plasma de
pacientes com esquizofrenia, o que levou a sugerir a POP como um potencial alvo
para o tratamento de diversas doenças mentais, como o transtorno de estresse pós-
traumático, depressão e esquizofrenia(208, 209). Além disso, níveis anormais de
atividade enzimática da POP foram associados a condições psicóticas, como mania
e esquizofrenia em ensaios clínicos(208). E por fim, a inibição da atividade da POP
demonstrou reverter os efeitos de estabilizadores de humor como o lítio, o ácido
valpróico e a carbamazepina(210, 211).
A Endo A ou NDEL1, por sua vez, compartilha com a POP vários substratos
peptídicos, incluindo a bradicinina e a neurotensina, destacando-se ainda por ser
expressa preferencialmente no cérebro, enquanto a POP é ubíquamente
expressa(200, 201, 212). Interessantemente, a própria neurotensina, um potencial
substrato para a NDEL1, foi implicada na fisiopatologia da esquizofrenia, uma vez
que agonistas de receptores da neurotensina, incluindo a própria neurotensina,
demonstraram atividade antipsicóticas(213, 214). Além disso, foi observado um nível
aumentado de neurotensina e pró-encefalina (outro substrato da NDEL1) em
pacientes tratados com antipsicóticos(202, 215-217). Apesar de inúmeros potenciais
substratos terem sido demonstrados em estudos in vitro, o substrato endógeno
NDEL1 em humanos ainda não foi identificado até o momento.
Posteriormente, a NDEL1 foi caracterizada como a principal ligante do
produto do gene Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1), um gene amplamente
estudado em esquizofrenia. O gene DISC1 foi inicialmenteidentificado em um estudo
conduzido em uma família escocesa com alta incidência de transtornos mentais, na
qual foi identificada uma translocação balanceada desse gene associada a casos de
esquizofrenia e transtorno afetivo bipolar, sugerindo este gene como um
importantealvo para os estudos de suscetibilidade para transtornos psiquiátricos(218,
219). Evidências sugerem ainda a importância do gene DISC1 para o
desenvolvimento e formação do cérebro e, em particular, para o desenvolvimento e
funcionamento do hipocampo. O produto do gene DISC1 foi caracterizado também
43
como uma proteína multifuncional capaz de interagir, utilizando em domínios
distintos, com múltiplas outras proteínas relacionadas ao centrossomo e ao
citoesqueleto celular(220, 221). Nessa mesma direção, foi proposto que a principal
função da DISC1 seria possibilitar a formação de complexos proteicos (atuando
como uma grande proteína carregadora), e cuja função biológica dependeria da
composição destes complexos, que podem ser formados com diferentes ligantes(222,
223).
Nesse ponto, é importante ressaltar que estas proteínas estão normalmente
associadas a outras proteinas formando complexos em organismos vivos e uma
mesma proteína pode exercer funções biológicas distintas dependendo da
composição desses complexos e de sua compartimentalização (ou seja, em que
região com compartimento da célula, em qual tecido, e em qual sistema estão
majoritariamente presentes). Esse nível de complexidade não é abordado na maioria
dos estudos, que normalmente investigam o papel isolado de uma determinada
proteína, que é também um conhecimento importante, mas que representa apenas
uma porção limitada da ação dos complexos de proteína, ao longo do processo de
desenvolvimento e maturação do cérebro.
Assim, a identificação da NDEL1 como a principal ligante da DISC1
intensificou a investigação do papel da interação entre essas proteinas, e a
possibilidade da NDEL1 apresentar um papel na fisiopatologia da esquizofrenia.
Outro dado que reforça a importância da interação entre a NDEL1 e a DISC1 é que
a translocação balanceada do gene da DISC1, que levou a sua identificação, gera
uma proteína DISC1 truncada, com perda do segmento contendo o domínio de
ligação com a NDEL1(221). Uma série de estudos passou então a investigar o
impacto potencial dessa interação entre a NDEL1 e DISC1 em processos
relacionados ao desenvolvimento cerebral, demostrando importância da interação
NDEL1/DISC1 para a formação de neuritos(224, 225). Outros estudos demonstraram a
importância da ligação entre a NDEL1 e DISC1 para a neuritogenêse, e um possível
papel na migração neuronal e posicionamento durante a embriogênese(194, 226). Em
conjunto, essas evidências permitem hipotetizar que a interferência na interação
habitual DISC1/NDEL1 possa levar a alterações em eventos centrais para o
desenvolvimento normal do cérebro (crescimento de neuritos, e migração neuronal).
44
Mais ainda, ficou demonstrado que tanto a capacidade de se ligar a DISC1 como a
atividade enzimática da NDEL1 são importantes moduladores desses processos(224).
2.2.7.2.1.1. NDEL1 e Esquizofrenia
Alguns estudos investigando aspectos genéticos avaliaram o envolvimento da
NDEL1 na esquizofrenia. O resumo dos estudos encontrados são apresentados na
Tabela 1.
Lipska et al.(227) encontraram uma redução significativa da expressão de
NDEL1 no hipocampo de pacientes com esquizofrenia. No mesmo estudo, relataram
que três alelos do gene DISC1, que foram associados ao diagnóstico de
esquizofrenia na mesma amostra, prediziam a expressão de NDEL1 no hipocampo.
Nicodemus et al.(228) demonstraram que a interação entre três genes (DISC1,
CIT e NDEL1), que já haviam sido previamente descritos por gerar proteínas que se
interagem entre si nas células, influenciam o risco para esquizofrenia em uma
amostra caso-controle. As mesmas combinações se relacionaram a um
processamento cognitivo menos eficiente durante um teste de memória de trabalho
entre controles saudáveis, avaliados por RM funcional. Não houve efeito significativo
para nenhuma variante isolada da NDEL1 e o diagnóstico de esquizofrenia. Burdick
et al.(229) também investigaram o papel de polimorfismos da NDEL1 e o diagnóstico
de esquizofrenia, e relataram: 1) nenhum efeito significativo de SNP isolado da
NDEL1; 2) um haplótipo de 4 polimorfismos da NDEL1 foi associado
significativamente ao diagnóstico; 3) a interação entre polimorfismos da NDEL1 e um
polimorfismo funcional da DISC1, Ser704Cys, estiveram associados ao diagnóstico,
mas não a interação entre os polimorfismos da NDEL1. Tomppo et al.(230)
investigaram se polimorfismos da via da DISC1 (DISC1 pathway) estavam
relacionados ao diagnóstico de esquizofrenia e identificaram achados significativos
para variantes de 3 genes: PDE4D, PDE4B e NDEL1. Quando avaliados haplótipos
de cada um desses genes, os achados foram mais robustos. Entretanto, a relação
entre os polimorfismos desses genes e a performance em testes cognitivos não foi
45
identificada. Kähler et al.(231) avaliaram um conjunto de genes previamente
identificados por seu papel na adesão celular e migração neuronal, 12 SNPs da
NDEL1 foram estudados, mas nenhum atingiu nível de significância estatística. Kang
et al.(232) usaram uma abordagem translacional avaliando um modelo animal para a
esquizofrenia e validando os achados em diferentes grupos de pacientes,
identificando uma interação significativa entre a NDEL1 e DISC1 na migração e
posicionamento neuronal, sem efeitos significativos para a NDEL1 e outros genes
estudados. Moens et al.(141) fizeram um sequenciamento em grupos, e depois,
buscando validar os achados, genotipando cada indivíduo. Nenhum resultado
significativo isolado foi identificado nesse estudo, mas um número
proporcionalmente maior de mutações não-sinônimas em portadores de
esquizofrenia e uma mutação no gene da NDEL1 foram identificados. Newburn et
al.(233) investigaram se as variantes de splice da DISC1 apresentavam afinidade pela
NDEL1 e PDE4B, mas não conseguiram demonstrar ligação entre as variantes de
splice da DISC1 e NDEL1.
Em resumo, os estudos parecem sugerir um papel pequeno de polimorfismos
isolados da NDEL1, com achados mais robustos para a avaliação de haplótipos da
própria NDEL1 e interações da NDEL1 com ligantes, sobretudo a DISC1.
Esses estudos também demonstram que apesar do grande número de
potenciais ligantes e substratos, a investigação da NDEL1 em esquizofrenia tem sido
feito quase que em sua totalidade, sob a perspectiva de sua ligação com a DISC1.
46
Tabela 1 - Descrição dos estudos que investigaram aspectos relacionados a NDEL1 em esquizofrenia Referência Desenho do Estudo Objetivo Resultados Principais Avaliação Crítica
Lipska et al., 2006, Hum Mol Genetics(227)
Estudo de corte transversal, comparando tecidos post-mortem do córtex frontal dorsolateral e hipocampo de 79 controles e 43 pacientes com esquizofrenia.
Investigar a expressão da DISC1 e de três ligantes da DISC1 (FEZ1, NDEL1 e LIS1) em diferentes tecidos no cérebro e sua relação com um SNP funcional da DISC1.
- A expressão de DISC1 varia ao longo da vida no cérebro humano. - A expressão de 3 moléculas que interagem com a DISC1: Fez1, LIS1 e NDEL1 está reduzida no hipocampo de pacientes e a de FEZ1 no DLPFC. - Genótipos de risco para esquizofrenia da DISC1 predizem os níveis de expressão alterados no hipocampo e DLPFC, no entanto, não há correlação direta entre o nível de mRNA e o de expressão dessas proteínas
- Esse foi o primeiro estudo a investigar a NDEL1 na esquizofrenia e, portanto, o primeiro a demonstrar que havia diferenças entre casos e controles saudáveis para a expressão da NDEL1. - A evidência de que as alterações oscilam ao longo da vida é importante ao interpretar os resultados.
Burdick et al., 2008, Hum Mol Genetics(229)
Estudo de corte transversal, comparando 275 pacientes com esquizofrenia e 200 controles saudáveis, todos de uma população caucasiana. Estudos in vitro para avaliar a interação entre NDEL1, NDE1 e DISC1.
Investigar a relação entre NDEL1 e SCZ e testar interações epistáticas entre genótipos da NDEL1 e DISC1 para o risco de esquizofrenia. Investigar se NDE1 e NDEL1 compartilham o mesmo sítio de ligação com a DISC1.
- Associação significativa de um haplótipo de 4 locus para NDEL1 e a esquizofrenia. Sujeitos com uma ou mais cópias do segundo haplótipo menos comum apresentaram risco maior para a doença. - Houve uma interação epistática significativa entre o polimorfismo funcional da DISC1, Ser704Cys, e o SNP rs1391768 da NDEL1, na suscetibilidade à esquizofrenia. - Não houve resultado significativo para os polimorfismos da NDE1. A interação com a DISC1, no entanto, foi limiar estatisticamente para suscetibilidade para SCZ.
- Reforça papel pequeno para a suscetibilidade, considerando a NDEL1 isolada e a importância do papel da interação com outros fatores, sobretudo da DISC1.
47
- NDE1 compete com a NDEL1 para ligação com a DISC1.
Kähler et al., 2008, Am J Med Gen B(231)
Estudo de corte transversal, compara 839 pacientes com esquizofrenia e 1473 controles, todos de origem escandinávia.
Investigar a associação entre a esquizofrenia e os genes relacionados ao processo de migração neuronal
- Investigou genes relacionados a adesão celular e migração neuronal. Principais SNPs associados foram do gene MDGA1. - 12 SNPs da NDEL1 foram estudados, mas não houve associação significativa para nenhum e o diagnóstico de esquizofrenia.
- Maior amostra a investigar polimorfismos da NDEL1 e esquizofrenia. Foi também a que investigou maior número de polimorfismos da NDE1. - Resultado sugere que o resultado da NDEL1 é mais relevante em associação a seus ligantes.
Nicodemus et al., 2010, Hum Genetics(228)
Estudo de corte transversal, usa 2 amostras para comparação: 1 - 296 pacientes e 365 controles - estudo de epistasia 2 - 260 e 237 controles para o estudo de epistasia e associação com estudo de imagem funcional
Explorar o efeito das interações da DISC1 e potenciais ligantes sobre o diagnóstico e o funcionamento cerebral.
-7 SNPS se mostraram significativos na interação 2 a 2 na amostra 1: DISC1 rs1411771–CIT rs10744743; CIT rs3847960–CIT rs203332; CIT rs3847960–CIT rs440299; apenas um permaneceu quando aplicada a correção de Bonferroni (NDEL1 rs4791707–CIT rs10744743. -Três interações (rs3847960–rs440299; rs1411771– rs10744743, rs4791707–rs10744743) estavam significativamente associadas à redução da eficiência de processamento em teste de memória entre controles saudáveis.
- Nenhum efeito direto da NDEL1 sobre o diagnóstico. - A interação entre a DISC1 e a NDEL1 foi a única que sobreviveu após a correção para múltiplas comparações. - Foi realizada uma escolha de SNPs da DISC1 e de outros genes estudados, não pode excluir a influência de outros polimorfismos não incluídos.
Kang et al., 2011, Neuron(232)
Avalia diferentes amostras, com diferentes desenhos
Investigar os mecanismos através dos quais
1 - A interação da FEZ1 e DISC1 interfere no crescimento de dendrito e no tamanho de soma no giro denteado do hipocampo
- Os achados sugerem que FEZ1 e NDEL1 interagem com a DISC1 para promover ações
48
para responder cada uma das perguntas de pesquisa: 1 - Estudo de modelo animal com rato 2 - Avaliação bioquímica in vitro 3 - Coorte 1: 279 pacientes SCZ e, 249 HC; 4 - Coorte 2: 1351 pacientes SCZ e 1378 HCs.
a DISC1 regula o desenvolvimento neuronal, com ênfase para os ligantes da DISC1, FEZe NDEL1.
em ratos. 2 - Não houve ação sinérgica do bloqueio simultâneo FEZ1 e NDEL1. 3 - Não houve nenhuma relação epistática significativa entre FEZ e NDEL1. 4 - NDEL1 e DISC1 apresentaram uma interação significativa na migração e posicionamento neuronal
complementares, mas distintas.
Moens et al., 2011, PLoS One(141)
Estudo de corte transversal, compara 486 pacientes com SCZ e 514 controles saudáveis usando uma combinação de PCR com sequenciamento de próxima geração usando pool de DNA.
Explorar a taxa de mutação da DISC1 e em dez genes moléculas de interação com a DISC1 (ATF5, GRB2, FEZ1, LIS-1, PDE4B, NDE1, NDEL1, TRAF3IP1, YWHAE, e ZNF365).
- Fez um sequenciamento em pool e depois validou os achados genotipando cada indivíduo. - Resultados não-significativos, mas encontrou uma maior taxa de variantes raras entre os pacientes, proporcionalmente maior em indivíduos de início precoce. - Nenhum achado significativo com a NDEL1 foi descrito, mas foi identificada mutação na NDE1
- Nenhum resultado significativo para a NDEL1, mas a priori variantes da NDEL1 não foram estudados . - Demonstra o possível papel de variantes raras na via da DISC1 na esquizofrenia.
49
Newburn et al., 2011, Transl Psychiatry(233)
Faz uso de 2 tipos de estudo: 1 - In vitro 2 - corte transversal, usando banco de cérebro com 272 controles saudáveis, com distribuição de idade entre 1 dia de vida e 78 anos de idade.
Investigar o papel das variantes de splices da DISC1 e suas interações com genes identificados como parte da via da DISC1.
- As variantes de splice da DISC1 ligaram com a DISC1 e apresentaram resultados variáveis com os demais, várias delas não ligaram à NDEL1 e à PDE4B. - No estudo de expressão em tecido cerebral, foi demonstrado que a expressão de NDEL1 é baixa em neonatos e aumenta com o tempo, com pico em adultos jovens
Forneceu dados relevantes sobre mudanças no padrão de expressão da NDEL1 ao longo do desenvolvimento. O pico esperado em adultos jovens pode servir de padrão comparador nas análises de pacientes.
Gadelha et al., 2013; J Psychiatr Research(123)
Estudo de corte transversal, compara 92 pacientes com esquizofrenia e 96 controles saudáveis oriundos de uma população brasileira.
Investigar diferenças na atividade enzimática da NDEL1 entre pacientes com esquizofrenia e controles saudáveis
- Investigou a atividade enzimática da NDEL1 em pacientes e controles, com níveis significativamente menores em pacientes. - A atividade foi menor em pacientes com esquizofrenia hebefrênica e os refratários ao tratamento.
Primeiro estudo a investigar a atividade enzimática plasmática da NDEL1.
50
2.2.7.2.2. Enzima Conversora de Angiotensina-I (ECA)
A Enzima Conversora de Angiotensina-I (ECA), ou quininase II, é uma
dipeptil-carboxipeptidase, inicialmente descrita pela sua habilidade em converter a
angiotensina I (Ang I) em angiotensina II (Ang II)(234). É codificada por um gene
localizado no cromossomo 17q23.3, composto por 26 exons e que se estende por
cerca de 2.1 kb(235).
Por regular a produção de Ang II, a atividade da ECA é considerada um
elemento central no Sistema Renina-Angiotensina (SRA). A Ang II é considerada o
principal efetor do SRA, e foi inicialmente descrito pelo seu papel no controle
pressórico, mas mais recentemente, foi associada a funções no SNC(236).
A ECA pode catalisar a degradação de vários outros substratos peptídicos,
como a bradicinina, neurotensina, substância P, encefalinas e outros peptídeos
(como revisado por Gonzales-Villalobos et al.(237)). Esses substratos podem explicar
algumas das ações associadas à ECA no SNC, onde se encontra ancorada na
membrana plasmática de neurônios(238, 239), possivelmente influenciando a
neurotransmissão peptidérgica.
Abaixo fazemos uma breve descrição do SRA e das suas funções
relacionadas ao SNC, por ser o paradigma para compreensão das ações da ECA.
Em seguida, fazemos uma descrição dos achados de estudos que investigaram a
ECA no contexto da esquizofrenia.
2.2.7.2.2.1. Sistema Renina-Angiotensina (SRA)
Diversas descobertas recentes têm contribuído para o aumento no
conhecimento sobre o SRA, evidenciado a sua complexidade. Além do que se pode
chamar de SRA “clássico” ou “circulante”, houve a identificação de seus
componentes em diversos órgãos e tecidos, constituindo o que atualmente se
conhece como “SRA local”(240). O SRA local pode atuar junto ou de modo
independente do SRA circulante.
Os peptídeos derivados da proteína precursora, o angiotensinogênio, por
meio de diversas vias de conversão enzimática, geram um grande número de
moléculas efetoras: angiotensina I a IV, angiotensina 1-7; angiotensina 1-9. Vários
51
receptores para estes peptídeos foram identificados (AT1, AT2, IRAP, MAS), e
estes podem ser ativados por um ou mais destes peptídeos derivados do
angiotensinogênio. Esses receptores, por sua vez, podem desencadear ações com
resultados antagônicos(241). A geração desses peptídeos depende de um grande
número de enzimas e, na maioria das vezes, vias alternativas coexistem. Por
exemplo a II, em algumas situações, pode ser produzida por uma enzima
denominada quimase, ou ainda, a Ang I pode ser clivada pela ECA2 a
angiotensina1-9 pela ECA2. Possivelmente, essa diversidade de vias e funções tem
como objetivo aumentar a capacidade do sistema de manter a homeostase.
A renina e as angiotensinas não atravessam a barreira hematoencefálica,
assim o SRA local opera de modo independente do SRA circulante(242). O
angiotensinogênio é produzido na maior parte das regiões cerebrais, principalmente
por astrócitos, e em menor parte por neurônios, sendo uma das proteínas mais
abundantes do líquido cefalorraquidiano (LCR). Quanto aos peptídeos, Ang I e Ang II
são os mais abundantes, com concentrações mais baixas de Ang III e Ang 1-7.
Receptores da Ang II do tipo AT1 foram identificados em regiões cerebrais
relacionadas ao comportamento e à cognição, como a amigdala, o hipocampo, o giro
do cíngulo e o giro piriforme(242).
2.2.7.2.2.2. SRA e Funções Cognitivas
Uma série de evidências tem sugerido um papel do SRA no cérebro, com
ações específicas ligadas à memória e aprendizagem. Em resumo, a Ang II parece
interferir com a performance na maior parte de testes de memória usados em
modelos animais, enquanto a Ang IV parece facilitar a memória(243). Ao encontro
dessa proposta, inibidores da ECA com ação central demonstraram melhorar o
processamento cognitivo em humanos(244, 245) e em modelos animais(246). Por outro
lado, a administração crônica de Ang II por via subcutânea em camundongos
resultou em hipertensão e prejuízo em teste de memória espacial (labirinto de água
de Morris) após a terceira semana de tratamento(247). Por outro lado, uma série de
evidências tem demonstrado que a Ang IV e seus análogos facilitam a potenciação
de longo prazo, o aprendizado e a consolidação de memória(248). O receptor MAS foi
identificado no cérebro, em concentrações particularmente altas no giro dentado do
52
hipocampo e córtex piriforme. Interessantemente, a angiotensina 1-7 demonstrou
facilitar a potenciação de longo-termo(249), sugerindo um papel importante na
memória e aprendizagem. É importante destacar que em condições fisiológicas, as
concentrações de Ang III, Ang IV e angiotensina 1-7 são várias vezes menores do
que a de Ang II.
2.2.7.2.2.3. SRA, Resposta Inflamatória e Estresse Oxidativo
A ativação do SRA foi consistentemente relacionada a um aumento no estado
inflamatório, caracterizado por uma indução da expressão de diversas citocinas e
quimiocinas, fatores de transcrição e moléculas de adesão celular(250). A maior parte
dos efeitos pró-inflamatórios parece ser mediado pela ação da Ang II sobre
receptores AT1. A ativação de receptores AT1 aumenta a expressão de moléculas
de adesão, quimiocinas e citocinas através de diferentes vias incluindo a ativação de
NF-kB, endotelina 1 e vias de estresse oxidativo(251, 252).
A associação entre a ativação do SRA e o aumento da produção de espécies
reativas de oxigênio tem sido enfatizada pelo seu papel potencial na aceleração do
envelhecimento celular, risco cardiovascular e doenças neurodegenerativas(251).
2.2.7.2.2.4. Demência e Prejuízo Cognitivo Leve
Entre as doenças neuropsiquiátricas, a Demência de Alzheimer é a que mais
apresenta estudos sobre o envolvimento da ECA e do SRA em sua fisiopatologia.
Interessantemente, a doença de Alzheimer foi o primeiro paradigma para a
compreensão da esquizofrenia e, por isso, chegou a receber de Kraepelin,
considerado o pai da psiquiatria moderna, o nome de dementia praecox. Estudos
posteriores mostraram divergência quanto aos achados histopatológicos entre as
duas doenças (como a ausência de gliose reativa na esquizofrenia). A demonstração
de que a ECA pode degradar a proteína β-amiloide foi um elemento central para o
interesse, já que pacientes com Demência de Alzheimer apresentam uma
degradação anormal da proteína derivada do precursor amilóide, resultando em um
acúmulo patológico da proteína β-amilóide e em morte neuronal(253).
53
Os estudos que investigaram a associação entre ECA e a demência podem
ser reunidos em três grupos: (1) os que investigaram o papel dos genótipos da ECA,
(2) os que investigaram a atividade enzimática e as medidas funcionais, quanto ao
risco de desenvolver demência e a evolução da doença, e (3) os que investigaram
as intervenções farmacológicas com inibidores da ECA ou bloqueadores de receptor
de Ang II na prevenção da doença.
Todos os estudos genéticos investigaram o papel de um polimorfismo
funcional, a presença de uma inserção/deleção (I/D) no íntron 16 do gene da
ECA(254). Uma metanálise dos resultados sugeriu que a presença do alelo I é um
fator de risco, enquanto o alelo D seria protetor(255). No entanto, a medida de
heterogeneidade encontrada entre os estudos dessa metanálise foi altamente
significativa (p<0,001), possivelmente devido ao grande número de resultados
negativos ou paradoxais, o que sugere cautela na compreensão desses achados.
Em estudos de tecido cerebral post-mortem de indivíduos com doença de
Alzheimer, os achados sugerem aumento tanto dos níveis de proteína como de
atividade da ECA em diversas regiões: hipocampo, caudado, córtex frontal e córtex
parietal (como revisto por Miners et al.(256)). A investigação dos níveis de atividade
enzimática no LCR também revelou níveis de atividade da ECA aumentados em
indivíduos com Doença de Alzheimer ou Prejuízo Cognitivo Leve(257). Se os
resultados de atividade enzimática se correlacionam aos níveis de proteína ainda é
questionável, pois estudos que avaliaram apenas o nível de proteína não
encontraram alterações significativas na comparação entre pacientes com Demência
de Alzheimer e controles(258).
Vários estudos demonstraram uma redução do risco em desenvolver
demência em indivíduos que fizeram uso de inibidores da ECA ou bloqueadores do
receptor de angiotensina(259, 260). Um possível viés destes estudos seria o quanto
esse resultado se deve a uma ação específica desses fármacos na modulação do
SRA ou no controle da pressão arterial. No estudo de Gao et al.(259), o resultado foi
significativo de modo independente da indicação para hipertensão, mas o tamanho
de efeito foi pequeno. Uma recente análise de metarregressão não demonstrou um
efeito significativo de inibidores da ECA ou bloqueadores de receptores de
angiotensina na prevenção de declínio cognitivo(261). Por outro lado, como revisado
na seção sobre SRA e funções cognitivas, manipulações farmacológicas em
54
modelos animais apresentaram resultados que sugerem a associação de maiores
níveis de Ang II a um pior desempenho cognitivo.
Uma análise conjunta dessas evidências parece sugerir que: 1) níveis
elevados de ECA são observados na doença de Alzheimer; 2) a I/D no intron 16 do
gene da ECA parece não predizer o risco para desenvolver a Demência de
Alzheimer; 3) ensaios farmacológicos em modelos animais sugerem que o sistema
SRA está relacionado ao desempenho cognitivo, mas nos ensaios clínicos em
pacientes com demência os resultados sugerem um pequeno tamanho de efeito na
redução do risco e/ou melhora no funcionamento cognitivo, que não pode ser ainda
dissociado do efeito hipotensor.
2.2.7.2.2.5. Parkinson
A ECA está presente na via nigro-estriatal e nas vias dos gânglios da
base(262). Pacientes tratados com inibidor da ECA apresentam melhor resposta de
sintomas motores frente ao tratamento com uma substância precursora de
dopamina(263).
2.2.7.2.2.6. ECA e esquizofrenia
Os estudos relacionando a ECA e a esquizofrenia podem ser organizados em
3 grupos: 1) estudos em tecido post-mortem 2) estudos em LCR, 3) estudos
genéticos em pacientes. Após uma revisão sistemática, foram identificados 17
estudos cujos resultados são apresentados na Tabela 2.
Os primeiros estudos relacionando a ECA e a esquizofrenia avaliaram a sua
atividade enzimática em áreas cerebrais comparando pacientes e controles, a partir
de tecidos obtidos post mortem. Arregui et al.(264) demonstraram uma redução
significativa na atividade enzimática da ECA na substantia nigra pars reticulata, mas
não em outras regiões cerebrais, aparentemente restrita a indivíduos com início de
doença entre 15 e 24 anos. Entretanto, esse achado não foi replicado por Owen et
al.(265).
Esses estudos post mortem apresentam uma série de limitações, como as
questões relacionadas ao tempo para processamento e procedimento de
55
processamento das amostras, causa da morte e o seu impacto no funcionamento
cerebral e a composição do grupo controle. Especificamente quanto ao grupo
controle, as evidências de que indivíduos com prejuízo cognitivo leve e demência
apresentam níveis aumentados de atividade enzimática poderiam explicar em parte
os resultados de redução relativa considerando os pacientes com esquizofrenia. No
estudo de Arregui et al.(266), por exemplo, alguns indivíduos do grupo controle
apresentaram idade ao falecimento superior a 90 anos.
O primeiro estudo em LCR de pacientes com esquizofrenia sugeriu uma
redução significativa da ECA(267). No entanto, o achado mais consistente foi o maior
nível de atividade da ECA em pacientes com esquizofrenia tratados com
neurolépticos comparados aos controles(268), reproduzido em diversos outros
estudos desenvolvidos pelo mesmo grupo. Foi observada uma menor atividade
quando comparados a pacientes sem medicação e medicados(269), apesar do grupo
sem medicação ser bastante reduzido (composto por apenas 7 indivíduos). Quando
os pacientes foram avaliados antes e após o tratamento, não houve diferenças nos
níveis de atividade da ECA(270). Foi observada uma correlação positiva significativa
entre a duração de doença e os níveis de ECA determinados por sensitive inhibitor-
binding assay (IBA)(271). Esse achado pode sugerir que os níveis de ECA
acompanhariam alterações fisiopatológicas relacionadas à cronicidade, assim como
já observado na demência. A origem da ECA no LCR não pareceu estar relacionada
a ativação de células mononucleares(272), e foi sugerido que a ECA seria proveniente
da sua solubilização da membrana celular do CNS ou derivado do aumento da sua
expressão frente a um estímulo, em função do tratamento ou simplesmente do
processo de deterioração característico da esquizofrenia(271).
Todos os estudos que avaliaram a associação de aspectos genéticos da ECA
e esquizofrenia investigaram um polimorfismo do tipo I/D no exon 16 do gene da
ECA. Esse polimorfismo foi demonstrado ser funcional e influenciar os níveis
circulantes e a atividade da ECA em diferentes tecidos(254). Seis estudos não
encontraram diferenças significativas na comparação da frequência dos alelos I/D da
ECA entre pacientes com esquizofrenia e controles(273-278) , enquanto um encontrou
uma redução significativa da frequência do alelo D em pacientes com
esquizofrenia(279) e outro observou redução do genótipo I/I em pacientes(280). Estes
últimos resultados sugerem direções opostas. Em sua maioria, estes estudos são
56
com amostras pequenas e em populações com diferentes estruturas de
ancestralidade (chinesa, japonesa, turca, finlandesa, croata e espanhola).
Considerando os resultados, não parece haver uma relação entre o genótipo I/D da
ECA e o risco para esquizofrenia. Um dos estudos demonstrou uma interação
significativa entre os genótipos da ECA e a COMT, e uma pior resposta ao
tratamento convencional(275). Em outro, foi observada uma associação do número de
cópias do alelo D e maiores escores de sintomas negativos(276).
Um único estudo apresentou diferenças na concentração da ECA no sangue
entre pacientes e controles (274) e encontrou níveis significativamente maiores em
pacientes com esquizofrenia comparados a controles (p<0,05). Beckmann et al.(267)
encontraram uma redução significativa dos níveis de ECA no LCR de pacientes que
apresentou uma correlação inversa com níveis de dopamina e noradrenalina
também medidos no LCR. No estudo de 1993(268), não foi encontrada uma
correlação significativa entre os níveis da ECA no sangue e LCR. É importante
ressaltar que, à exceção do estudo de Beckmann, os estudos descritos acima
mediram a quantidade ou nível de ECA, não a sua atividade enzimática. Pela
relevância biológica da ECA estar ligada a sua capacidade de clivar substratos
peptídicos, acreditamos que a atividade enzimática seja uma medida mais funcional
em relação às doenças estudadas comparado à simples quantificação da
concentração protéica da ECA.
57
Tabela 2 - Descrição dos estudos que investigaram aspectos relacionados a ECA em esquizofrenia Referência Desenho do Estudo Objetivo Resultados Principais Avaliação Crítica
Arregui et al., 1979, N Eng J Med(264)
Estudo de corte transversal, comparando a atividade da ECA em tecido cerebral post mortem de 40 controles, 32 pacientes com esquizofrenia e 19 pacientes com quadro esquizofreniforme.
Verificar diferenças na atividade enzimática em regiões cerebrais de pacientes e controles.
- Redução significativa da atividade da ECA nos pacientes com esquizofrenia comparados aos controles na substantia nigra pars reticulata (p<0.02). Não foram encontradas diferenças nas demais regiões estudadas e entre o grupo com quadro esquizofreniforme (definição usados pelos autores) e os demais grupos estudados. - No grupo de pacientes com esquizofrenia e quadro esquizofreniforme a diferença foi observada para indivíduos com idade de início de doença entre 15 e 24 anos, mas não com o grupo que apresentou início de doença posterior.
- Não descreve critérios diagnósticos ou quais instrumentos diagnósticos foram utilizados. - Não descreve causa da morte ou procedimentos de processamento das amostras até a análise. - Alguns indivíduos no grupo controle com idade acima dos 90 anos de idade, sugerindo possível influência nos resultados.
Owen et al., 1980, N Eng J Med(265)
Estudo de corte transversal, comparando a atividade da ECA em tecido cerebral post mortem de 22 controles e 17 pacientes com esquizofrenia.
Confirmar o achado anterior de redução da atividade enzimática na substantia nigra de pacientes com esquizofrenia comparados a controles saudáveis
- Foi verificado aumento da atividade enzimática na substantia nigra e núcleo caudado em portadores de esquizofrenia, mas a diferença não foi estatisticamente significativa. - Não observou diferença significativa quanto à idade de início no resultado.
- Não descreve critérios diagnósticos ou quais instrumentos foram utilizados - Não descreve causa da morte ou procedimentos de processamento
58
Arregui et al., 1980, Psychological Medicine(266)
Estudo de corte transversal, comparando a atividade da ECA em tecido cerebral post mortem de 40 controles, 51 pacientes com esquizofrenia e 25 indivíduos com Coréia de Huntington.
Verificar diferenças na atividade enzimática em regiões cerebrais de pacientes com esquizofrenia, indivíduos com Coreia de Huntington e controles
Esse estudo usa exatamente a mesma amostra do estudo anterior do mesmo grupo (Arregui et al., 1979), mantendo os resultados na comparação com os controles para substantia nigra. Outras regiões foram estudadas e foi encontrada uma redução significativa da ECA nos pacientes comparados a controles nas regiões lateral e média do globus pallidus.
- Diagnóstico feito por 2 psiquiatras que avaliaram dados clínicos disponíveis. Não usa instrumentos padronizados para coleta de dados. - Descreve processamento das amostras. Não houve diferença no tempo entre morte e autópsia entre os grupos.
Beckmann et al., 1984, Biol Psychiatry(267)
Estudo de corte transversal comparando atividade enzimática no LCR de pacientes com esquizofrenia paranoide e controles
Investigar diferenças na atividade enzimática da ECA no LCR de pacientes e controle saudáveis.
- Pacientes com ou sem uso de medicação apresentaram menores valores de atividade enzimática da ECA quando comparados a controles. Sem associação com escores de sintomas (psicopatologia). - Foi observada uma correlação negativa entre a atividade enzimática e níveis de dopamina e noradrenalina no LCR.
Primeiro estudo a investigar ECA no LCR de pacientes com esquizofrenia
Wahlbeck et al., 1993, Scz Res(268)
Estudo de corte transversal,
Investigar a possível ativação do sistema
- Pacientes com esquizofrenia apresentaram aumento
Diagnóstico de acordo com os critérios para
59
comparação de 14 pacientes com esquizofrenia internados com 9 controles saudáveis.
Renina-Angiotensina no Líquido Cefalorraquidiano em uma população de pacientes com esquizofrenia crônica
significativo dos níveis de ECA no LCR comparados a controles saudáveis (p<0.001). - Não houve correlação significativa entre os níveis de ECA no LCR e no soro (sangue).
esquizofrenia segundo o DSM-III-R
Arinami et al., 1996, Biol Psychiatry(273)
Estudo de corte transversal, compara 2 amostras: 1 - tecido cerebral post mortem de 10 pacientes com esquizofrenia e 10 controles; 2 - Estudo de associação com 292 pacientes com esquizofrenia, 31 com transtorno bipolar, 34 com depressão maior e 579 controles,
Explorar a associação entre o polimorfismo I/D com o diagnóstico de esquizofrenia e/ou transtorno bipolar e com os níveis de substância P no tecido cerebral post mortem
- Não foi encontrada associação significativa entre os genótipos ou frequência alélica e esquizofrenia. O genótipo DD foi significativamente mais frequente em pacientes com transtorno afetivo. - Uma associação significativa foi observada entre genótipos da ECA e nível de Substância P no caudado, putâmen, substância negra, n. dorsomedialis de tálamo, cornus ammonis do hipocampo e no giro superior do córtex temporal, tanto nas análises multivariadas, como nas comparações não paramétricas. - Nessas áreas, os genótipos do polimorfismo I / D da ECA explica mais de 20% da variabilidade inter-individual.
- Diagnóstico de acordo com os critérios para esquizofrenia, transtorno bipolar e depressão maior segundo o DSM-III-R. - Avalia população de origem japonesa.
Wahlbeck et al., 1997, Prog Neuro
Faz duas comparações: 1) Nível de ECA de 43
Verificar o efeito do tratamento com
- Níveis de ECA não diferiram significativamente entre as duas
-Diagnóstico realizado através da Entrevista Clínica
60
Psychopharmacol Biol Psychiatry.(270)
pacientes com esquizofrenia, não medicados há pelo menos 4 meses, agudamente psicóticos e 20 controles saudáveis; 2) 2 coletas de 9 pacientes com intervalo de 3-4 semanas.
neurolépticos no nível de ECA no LCR em relação à psicopatologia em um desenho longitudinal.
medidas (0,44 vs 0,42). - Controles saudáveis tinham níveis mais baixos de ECA (0,36), mas a diferença não foi significativa. - Não houve correlação entre os níveis de ECA e a dose de equivalentes de clorpromazina em ambas as avaliações. Nenhuma correlação significativa com o nível de ECA e escores totais da BPRS.
Estruturada para o Diagnóstico pelo DSM-IV -Versão de 18 itens da Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS). - Após o aumento da amostra em relação ao estudo anterior, o resultado da comparação entre casos e controles não foi mais estatisticamente significante.
Wahlbeck et al., 1998, SCZ Bulletin(269)
Estudo de corte transversal, comparando 43 pacientes com esquizofrenia e 20 controles saudáveis. Dos pacientes, 7 não usavam medicação na coleta do LCR e os outros 36 usavam alguma medicação (em média há 7 dias).
Replicar resultados anteriores de níveis elevados de ECA no LCR em pacientes com esquizofrenia e investigar o efeito do tratamento com neurolépticos nesse achado.
- Níveis séricos da ECA não diferiram entre os três grupos (controles, pacientes medicado e não medicados). - Pacientes sem medicação apresentaram níveis significativamente mais baixos de ECA no LCR do que os pacientes tratados com neurolépticos, mas não houve diferenças entre as medidas desses grupos e dos controles. - Não houve correlações significativas entre os níveis séricos ou no LCR de ECA e idade, sexo, altura ou pressão arterial em nenhum dos grupos estudados.
- Diagnóstico realizado através da Entrevista Clínica Estruturada para o Diagnóstico pelo DSM-IV. - Versão de 18 itens da Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS). - Foram analisados apenas 7 pacientes, e não medicados, não foi feita análise para identificar diferenças quanto a possíveis variáveis confundidoras com o grupo de pacientes medicados.
61
- No grupo de pacientes, não houve correlações significativas entre o nível ECA e número de internações hospitalares, dose de equivalentes de clorpromazina, duração de internação atual ou do surto psicótico.
Wahlbeck et al., 2000, Psychiatry Res(272)
Estudo transversal com 25 portadores de esquizofrenia agudamente psicóticos e há pelo menos 4 meses sem medicação antipsicótica.
Elucidar o possível papel de células mononucleares como a origem dos níveis elevados de ECA no líquido cefalorraquidiano de pacientes com esquizofrenia e tentar relacionar a contagem de células mononucleares com história de doença, escores psicopatológicos e variáveis de tratamento.
- Não houve correlação entre a contagem de células mononucleares e atividade enzimática no LCR. - Foi verificada uma correlação significativa entre a dose de antipsicótico e a contagem de células mononucleares no LCR.
- Diagnóstico realizado através da Entrevista Clínica Estruturada para o Diagnóstico pelo DSM-IV. - Versão de 18 itens da Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS)
Wahlbeck et al., 2000, SCZ Res(271)
Estudo de corte transversal, 43 pacientes com esquizofrenia, agudamente psicóticos.
Investigar a relação entre duração de doença e nível de ECA no LCR.
Correlação significativa entre o nível de ECA no LCR, duração total de doença (r = 0,39, p = 0,003) e duração da hospitalização atual (r = 0,66, p<0,001).
- Diagnóstico realizado através da Entrevista Clínica Estruturada para o Diagnóstico pelo DSM-IV. - Versão de 18 itens da Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS).
62
Ouyang et al., 2001, Neuropsychobiology(277)
Estudo de corte transversal compara 124 pacientes com esquizofrenia e 117 controles.
Para testar a hipótese de que os polimorfismos do gene da ECA conferem suscetibilidade para a esquizofrenia, ou se ela está relacionada à idade de início ou sintomas. Verificar a associação entre o polimorfismo e polidipsia no grupo de pacientes.
- Não houve diferença significativa para a frequência de alelo ou genótipo comparando pacientes com esquizofrenia e controles (p = 0,768 e p = 0,553, respectivamente). - Nenhuma diferença significativa foi encontrada para a idade ou pontuações de sintomas, comparando os três genótipos ECA. - Não houve associação significativa com polidipsia
- Diagnóstico de acordo com o critério DSM-III-R para esquizofrenia. - Para a avaliação de sintomas foi usada a Chinese Positive and Negative Symptom Rating Scale
Segman, 2002, Am J Med Gen B(278)
Estudo de corte transversal, compara 5 populações: 2 grupos de pacientes com esquizofrenia (n =104 e 113), transtorno bipolar (n = 87), depressão maior (n = 55) e controles saudáveis (n = 87). Investigou ainda 61 famílias com pelo menos 1 indivíduo afetado por esquizofrenia.
Avaliar o papel de genótipos da ECA em esquizofrenia, transtornos de humor e discinesia tardia.
- Nenhuma comparação entre grupos diagnósticos e o grupo de controles saudáveis para frequência de alelos ou genótipos alcançou significância estatística. - Sem diferenças significativas nos escores de discinesia ou sintomas extrapiramidais entre os genótipos do polimorfismo I/D da ECA. - Sem evidências para diferença na transmissão dos alelos nessa amostra.
- Diagnóstico avaliado através do Inventário para Transtornos do Humor e Esquizofrenia (Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia - Lifetime Version - SADS-L). - Escala de Movimentos Involuntários Anormais (Abnormal Involuntary Movement Scale -AIMS) para investigar movimentos discinéticos. - Amostra total grande, mas dividida em pequenos
63
grupos, o que limita o poder para detectar efeitos verdadeiros.
Illi, 2003, Eur Neuro Psychopharmacology(275)
Estudo de corte transversal, 94 pacientes com esquizofrenia separados como respondedores (n = 43) ou não respondedores (n = 51). 94 controles pareados por gênero e idade foram usados para comparação.
Avaliar a associação dos genótipos da ECA em uma amostra finlandesa de portadores de esquizofrenia.
- Não houve diferenças significativas entre o grupo de pacientes e controles ou entre respondedores e não-respondedores em relação ao genótipo da ECA. - Foi encontrada uma interação significativa entre os genótipos da ECA e COMT, e responder ao tratamento (p = 0,02). O risco de ser um não-respondedor aos antipsicóticos convencionais é mais de 10 vezes maior (OR = 10,89, IC 95 1,14-103,98, p = 0,04), quando se tem baixa COMT e alta ECA, em vez de alta COMT e baixa ECA.
- Pacientes preencheram os critérios para esquizofrenia do DSM-IV. - Escala de Impressão Clínica Global (Clinical Global Impression- CGI)
Crescenti et al., 2009; Psychiatry Research(279)
Estudo de corte transversal compara 243 pacientes com esquizofrenia ou transtornos relacionados (dos quais 160 com esquizofrenia) e 291 controles.
Estudar se um polimorfismo do gene da ECA é um fator de risco para a esquizofrenia.
- O alelo D do gene da ECA foi identificado como um fator de proteção e foi associado com um risco reduzido de esquizofrenia e transtornos associados (OR 0,6, IC 0,4-0,9, p = 0,02). - A proteção foi maior quando apenas os pacientes com esquizofrenia foram analisados (OR 0,5, IC 0,3-0,9) e aumentou de acordo com um modelo aditivo
- Pacientes preencheram os critérios para esquizofrenia do DSM-IV. - Grupo controle consistiu de 291 pacientes consecutivamente admitidos a um serviço de trauma de referência no período de 1 ano.
64
para o número de alelos D.
Kucukali et al., 2010, Psychiatric Res(280)
Estudo de corte transversal, 239 pacientes com esquizofrenia, 184 pacientes com transtorno bipolar, 284 parentes de primeiro grau de pacientes de esquizofrenia sem a doença, 301 parentes de primeiro grau de pacientes com transtorno bipolar e 210 controles saudáveis.
Elucidar o papel de variantes genética da ECA em pacientes com esquizofrenia, transtorno bipolar e seus parentes de primeiro grau.
- Frequência de genótipos I/I da ECA foram diminuídas, tanto em pacientes com esquizofrenia (p <0,01), como entre pacientes com transtorno bipolar (p <0,001) e seus parentes de primeiro grau (p <0,05 e p <0,001, para esquizofrenia e transtorno bipolar, respectivamente), quando comparada com os controles. - Na amostra de famílias, os autores não encontraram evidências de transmissão diferenciada de alelos I / D da ECA para os pacientes com esquizofrenia ou transtorno bipolar.
- Entrevista Clínica Estruturada para o Diagnóstico pelo DSM-IV. - Escala para a avaliação de Sintomas Positivos (Scale for Assessment of Positive Symptoms - SAPS), Escala para a avaliação de Sintomas Negativos (Scale for the Assessment of Negative Symptoms - SANS), Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS), and Extrapyramidal Symptom Rating Scale. - Avalia população de origem turca.
Baskan et al., 2010, Genetic Testing and Molecular Biomarkers(274)
Estudo de corte transversal, 132 pacientes com esquizofrenia e 105 controles. Uma sub-amostra de 31 pacientes e 26 controles tiveram a dosagem de ECA medida no sangue para comparação.
Detectar a incidência do polimorfismo I / D do gene da ECA em pacientes com esquizofrenia, e para determinar se esta doença pode estar relacionada ao polimorfismo I / D da ECA e as concentrações séricas de ECA.
- Não houve diferença significativa entre a frequência dos polimorfismos I / D da ECA entre os grupos (p> 0,05). - Pacientes com esquizofrenia apresentam atividade sérica da ECA significativamente maior em comparação aos indivíduos controle (p <0,05). - Genótipos da ECA estiveram significativamente relacionados com os níveis enzimáticos no
- Diagnóstico de acordo com o DSM-IV para esquizofrenia. - Avalia população de origem turca. - Único estudo que investiga a concentração da ECA (e não a sua atividade enzimática) em relação ao genótipo. A diferença foi significativa para a concentração, mas não para
65
soro, tanto em pacientes e controles, com genótipos DD mostrando níveis mais elevados.
o genótipo.
Nadalin, 2012, Psychiatr Genet(276)
Estudo de corte transversal compara 211 pacientes (187 com esquizofrenia e 24 esquizoafetivo) e 270 controles (doadores de sangue).
Para testar se o risco de esquizofrenia está associado com o polimorfismo I/D da ECA em uma população croata e examinar seu possível impacto sobre a gravidade dos sintomas da esquizofrenia.
- Sem efeito significativo do polimorfismo I / D da ECA no diagnóstico. - Aumento das pontuações negativa e total da PANSS foram significativamente correlacionadas com o número de alelos D (B = 0,26, p = 0,006) e l (B = 0,29, p = 0,002). - Nos homens, a gravidade dos sintomas da escala geral psicopatologia também pode ser atribuído ao número de alelos D (B = 0,37, p = 0,008).
- Entrevista Clínica Estruturada para o Diagnóstico pelo DSM-IV. - Escala para Síndromes Positiva e Negativa (Positive and Negative Symptom Scale - PANSS). - Estudo uma amostra de origem croata.
Hui et al., 2014, Hum Psychopharmachol Clin Exp(281)
Estudo de corte transversal compara 220 indivíduos em primeiro episódio psicótico e 538 controles saudáveis quanto à frequência de polimorfismos I/D do gene da ECA.
Avaliar se polimorfismos do gene I/D da ECA está associado a pacientes em primeiro episódio de esquizofrenia em uma população chinesa
- Sem efeito significativo do polimorfismo I / D da ECA no diagnóstico. - Pacientes com genótipo D/D apresentaram escore significativamente maior na escala de sintomas negativos da PANSS (p<0,05). O número de alelos D entre os pacientes está associado ao maior escore de sintomas negativos.
- Primeiro estudo a incluir apenas pacientes em primeiro episódio. - Primeiro estudo em população Chinesa de ascendência Han. - Primeiro a avaliar dimensões da PANSS.
66
2.2.8. Teorias Fisiopatológicas Atuais
Várias teorias foram propostas ao longo do último século para explicar a
fisiopatologia da esquizofrenia. O próprio nome dado inicialmente por Emil Kraepelin,
dementia praecox, já traduzia uma hipótese de que seria uma forma de demência,
semelhante à Demência de Alzheimer, mas de início em uma fase mais precoce da
vida.
Algumas teorias, sobretudo as relacionadas a neurotransmissores isolados já
foram abordadas nas seções anteriores dessa tese. Atualmente essas teorias ainda
são válidas, mas são compreendidas, geralmente, dentro do contexto de teorias
mais amplas. Faremos uma breve descrição das principais hipóteses que direcionam
as pesquisas em esquizofrenia atualmente. Essas hipóteses não devem ser
entendidas como mutuamente excludentes, mas complementares.
2.2.8.1. Teoria do Neurodesenvolvimento
A proliferação neuronal e das células da glia, a migração celular, a
diferenciação morfológica e a bioquímica, e a formação de sinapses, dependem de
complexas interações intracelulares com o ambiente celular, que determinam cada
fase do processo de desenvolvimento cerebral. Esses eventos são definidos pela
carga genética individual, mas podem ser modulados por fatores ambientais. Uma
variação genética ou um fator ambiental podem levar a uma cadeia de eventos, que
ocorrendo em uma fase sensível, podem determinar um desenvolvimento cerebral
alterado eliciando uma estrutura mais vulnerável ao surgimento e perpetuação da
psicose e/ou de outros sintomas que compõe a esquizofrenia(282-285). Essa é a
premissa da hipótese de neurodesenvolvimento como um evento central da
esquizofrenia. Alguns autores como Lieberman et al.(286) e Woods(287) publicaram
revisões em que questionam a exclusividade de processos relacionados ao
neurodesenvolvimento. Assim, o panorama mais atual indica que ambos os
processos ocorrem, mas as alterações de desenvolvimento cerebral seriam o
mecanismo fisiopatológico inicial.
67
2.2.8.2. Teoria de Desconexão ("desconectividade")
Uma série de teorias foram formuladas e sugerem que uma falha na
integração funcional entre diferentes regiões cerebrais desencadeariam os sintomas
e o perfil de funcionamento cognitivo característicos da doença(93, 288). Andreasen(93)
propôs especificamente que haveria uma perda do padrão de conexão normal entre
regiões corticais, subcorticais e o cerebelo, cunhando o termo "dismetria cognitiva"
para se referir a esse modelo. As evidências disponíveis sugerem que essa
desconexão é melhor explicada em termos funcionais, de efetividade conectiva, do
que em termos anatômicos(289). O termo integração funcional significa a influência
que a dinâmica de um sistema neuronal exerce sobre outro, o que por sua vez, é
determinado pelas conexões estabelecidas entre esses sistemas. De fato, como
revisado acima, estudos de RM funcional realizados em estado de repouso
identificaram alterações na composição e integração funcional de redes corticais em
esquizofrenia (ver revisão de Karbasforoushan e Woodward(110)).
Essa teoria representa um avanço em relação à teoria do
neurodesenvolvimento, por propor um mecanismo através do qual a alteração do
desenvolvimento cerebral determinaria a esquizofrenia. Vários estudos identificaram
alterações na relação funcional entre as regiões e entre as redes cerebrais
específicas, mas nenhuma em um nível que permita a identificação de um padrão
exclusivo da esquizofrenia.
2.2.8.3. Teoria da Saliência
Saliência é um conceito usado em ciências cognitivas para designar a
capacidade de um estímulo direcionar a atenção. Assim, ao entrar em um
determinado ambiente, alguns estímulos tendem a ser mais relevantes e capturam a
atenção ("salientes"), enquanto outros tendem a ser neutros. A atribuição de
saliência é um processo complexo que varia para cada indivíduo, e que influencia e
é, ao mesmo tempo, influenciada pela memória relacionada a experiências
anteriores(290). Esse processo foi associado à liberação fásica de dopamina,
condicionada pela exposição a situações específicas que antecedem a atribuição de
saliência(291). Em quadros psicóticos foi observada uma desregulação da
68
transmissão dopaminérgica que leva a liberação de dopamina em situações ou
contextos não apropriados(292). Kapur(58) propôs que esta alteração neuroquímica
prejudicaria o processo normal de atribuição, dependente de contexto, gerador da
saliência, levando à atribuição aberrante de relevância para alguns objetos externos
e representações internas. Os delírios neste quadro seriam uma explicação cognitiva
que o indivíduo impõe a estas experiências de saliência aberrante, em um esforço
para dar sentido a elas.
Nesse contexto, os antipsicóticos seriam eficazes na psicose por produzir um
amortecimento da relevância ou saliência induzida através de bloqueio de
receptores D2. Assim, os antipsicóticos forneceriam uma plataforma, reduzindo a
saliência aberrante, mas a melhora sintomática necessitaria de um processo mais
longo, com a reestruturação de representações internas. Em uma avaliação da
percepção dos paciente sobre a ação dos antipsicóticos, foi observado que estes
parecem agir preferencialmente reduzindo o nível de envolvimento com os sintomas
a fim de eliminá-los(293).
Três limitações foram propostas inicialmente para a teoria da saliência(58): 1)
não é uma hipótese etiológica; 2) explicar melhor sintomas positivos do que
negativos ou cognitivos; 3) não explicar como se dá a participação de outros
sistemas neurotransmissores na doenças.
Essa teoria é extremamente relevante ao fazer uma integração mais clara
entre os aspectos da neurobiologia e as manifestações sintomatológicos observados
na esquizofrenia.
69
3. JUSTIFICATIVA
A esquizofrenia é uma síndrome causada pela interação entre uma
vulnerabilidade genética e os fatores ambientais, de maneira fase-específica ao
longo do desenvolvimento, resultando em um cérebro alterado estrutural e
funcionalmente, o que propicia o início e manutenção de um conjunto de sintomas
característicos, mas heterogêneos quanto à intensidade e evolução. O diagnóstico e
o tratamento são amplamente baseados na avaliação clínica, sem auxílio de
exames. Uma maior compreensão da fisiopatologia da esquizofrenia se encontra
limitado pelo gap entre os estudos genômicos e a compreensão de mecanismos
secundários relacionados à progressão da doença.
As oligopeptidases foram relacionadas a diversas funções no organismo e a
NDEL1 foi especificamente associada a processos fundamentais para o
desenvolvimento cerebral. A NDEL1 também apresenta potencial para clivar uma
série de substratos peptídicos independentemente associados à esquizofrenia, como
substância P e a neurotensina, como já demonstrado em ensaios in vitro. No
entanto, o seu estudo é limitado por incertezas quanto a seus substratos endógenos
reais. A ECA, outra oligopetidase, atua sobre substratos em comum com a NDEL1 e
também foi relacionada a processos ligados ao neurodesenvolvimento e à
esquizofrenia. Apesar de serem definidas como oligopeptidases, poucos estudos
investigaram especificamente o papel da atividade enzimática destas enzimas em
pacientes com esquizofrenia.
Considerando a complexidade descrita acima, utilizamos uma abordagem
multimodal e translacional. Procuramos avaliar a associação das oligopeptidases
com diferentes métodos de investigação (genética, neuropsicologia, e marcadores
inflamatórios) em seres humanos, e buscamos a validação dos achados referentes à
cognição em um modelo animal.
70
4. OBJETIVOS
ESTUDO 1: Plasma NDEL1 enzyme activity is reduced in patients with schizophrenia - A potential biomarker? Primário: Investigar se há diferença nos níveis enzimáticos da NDEL1 no plasma de
controles saudáveis e portadores de esquizofrenia.
Secundários: Investigar se a medida se associa a dimensões sintomáticas ou ao
prejuízo funcional observado na esquizofrenia.
ESTUDO 2: Genome-Wide investigation of NDEL1 enzymatic levels in plasma of patients with schizophrenia and healthy controls reveals new putative risk genes for schizophrenia Primário: Investigar, usando uma abordagem de varredura genômica, quais
determinantes genéticos influenciam os níveis plasmáticos da atividade enzimática
da NDEL1, independente de pertencer ao grupo de portadores de esquizofrenia ou
controles saudáveis.
Secundário: Investigar, usando uma abordagem de varredura genômica, se
determinantes genéticos influenciam as diferenças observadas nos níveis
plasmáticos da atividade enzimática da NDEL1 entre portadores de esquizofrenia ou
controles saudáveis.
ESTUDO 3: ACE I/D genotype-related increase in ACE plasma activity is a better predictor for schizophrenia diagnosis than the genotype alone Primário: Investigar se há diferença nos níveis enzimáticos da ECA no plasma de
controles saudáveis e portadores de esquizofrenia.
Secundários: Investigar se a medida se associa a dimensões sintomatológics ou
prejuízo funcional.
71
ESTUDO 4: Angiotensin Converting Enzyme activity is positively associated with ILl-17 levels in patients with schizophrenia Primário: Investigar se os níveis enzimáticos da ECA no plasma de controles
saudáveis e portadores de esquizofrenia se correlacionam com marcadores
inflamatórios.
ESTUDO 5: Convergent evidences from human and animal studies implicate Angiotensin I-Converting Enzyme activity in cognitive performance in Schizophrenia
Primário: Investigar se os níveis enzimáticos da ECA no plasma de controles
saudáveis e portadores de esquizofrenia se correlacionam com o desempenho em
testes cognitivos e se um modelo animal para o número de genes da ECA
apresentam características comportamentais típicas da esquizofrenia.
72
5. MÉTODOS, RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. ESTUDO 1: Plasma NDEL1 enzyme activity is reduced in patients with schizophrenia – A potential biomarker?*
Authors: Ary Gadelha1, Mauricio F.M. Machado2, Camila M. Yonamine3, João R. Sato4,
Maria A. Juliano2, Vitor Oliveira2, Rodrigo A. Bressan1, Mirian A.F. Hayashi3,**
Affiliations: 1. Department of Psychiatry, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brazil. 2. Department of Biophysics, UNIFESP, São Paulo, Brazil. 3. Departament of Pharmacology, UNIFESP, São Paulo, Brazil. 4. Center of Mathematics, Computation and Cognition, Universidade Federal do ABC, Brazil.
** Corresponding author: Prof. Mirian A. F. Hayashi, Ph.D. Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua 3 de maio 100, Ed. INFAR, 3rd floor, CEP 04044-020, Tel +55-11-5576 4447/FAX +55-11-5576 4499, São Paulo, Brazil; e-mail: [email protected] or [email protected]
Abbreviations: SCZ, Schizophrenia; DISC1, Disrupted in schizophrenia 1; NDEL1, Nuclear-distribution element-like 1 or NudE-like 1; HCs, healthy controls; TR, treatment-resistant; NTR, non-treatment-resistant; CI, confidence interval; OR, odds ratio; endo A, endooligopeptidase A; endo B, endooligopeptidase B, POP, prolyl-oligopeptidase; ACE, angiotensin-converting enzyme; NT, neurotensin; BK, bradykinin; Dyn, dynorphin; FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer; PANSS, Positive and Negative Syndrome Scale; SCID, Structured Clinical Interview for DSM-IV CGI, Clinical Global Impression; GAF, Global Assessment of Functioning; IPAP, International Psychopharmacological Algorithm Project; LSD, Fisher’s Least Significant Difference; ROC, receiver operating characteristic; AUC, area under the curve; NOAB inhibitor, anti-catalytic anti-NDEL1 antibody; ZIP, Z-Pro-prolinal-insensitive peptidase; BD, bipolar disorder; FNDT, Fagerstrom Nicotine Dependence Test; BMI, body mass index.
Keywords: schizophrenia, biomarker, enzyme activity, oligopeptidase, plasma, neuropeptide.
* Publicado em Journal of Psychiatric Research sob a referência: Gadelha A, Machado MF,
Yonamine CM, Sato JR, Juliano MA, Oliveira V, et al. Plasma NDEL1 enzyme activity is reduced in patients with schizophrenia--a potential biomarker? J Psychiatr Res. 2013;47(5):657-63.
73
ABSTRACT
Background: NDEL1 oligopeptidase interacts with schizophrenia (SCZ) risk
gene product DISC1 and mediates several functions related to neurite outgrowth and
neuronal migration. NDEL1 also hydrolyses neuropeptides previously implicated in
SCZ, namely neurotensin and bradykinin.
Methodology: Herein, we compared the plasma NDEL1 enzyme activity of 92
SCZ patients and 96 healthy controls (HCs). NDEL1 enzyme activity was determined
by fluorimetric measurements of the FRET peptide substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp
hydrolysis rate.
Results: A 31% lower mean value for NDEL1 activity was observed in SCZ
patients compared to HCs (Student’s t = 4.36; p < 0.001; Cohen’s d = 0.64). The
Area Under the Curve (AUC) for the Receiver Operating Characteristic (ROC) curve
for NDEL1 enzyme activity and SCZ/HCs status as outcome was 0.70. Treatment-
resistant (TR) SCZ patients were shown to present a significantly lower NDEL1
activity compared to non-TR (NTR) patients by t-test analysis (t = 2.25; p = 0.027). A
lower enzymatic activity was significantly associated with both NTR (p = 0.002; B =
1.19; OR = 3.29; CI 95% 1.57-6.88) and TR patients (p < 0.001; B = 2.27; OR = 9.64;
CI 95% 4.12-22.54). No correlation between NDEL1 enzyme activity and
antipsychotic dose, nicotine dependence, and body mass index was observed.
Conclusion: This study is the first to show differences in NDEL1 activity in
SCZ patients compared to HCs, besides with a significant lower activity for TR
patients compared to NTR patients. Our findings support the NDEL1 enzyme activity
implications to clinical practice in terms of diagnosis and drug treatment of SCZ.
74
INTRODUCTION
The current body of evidence suggests that schizophrenia (SCZ) is a
multifactorial disease influenced by genetic and environmental factors (1, 2). The
identification of a balanced translocation that segregates with SCZ and affective
disorders in a large Scottish family has suggested DISC1 as a potential gene for
susceptibility to this major psychiatric disorder(3, 4). This gene product was proposed
to be a multifunctional protein that interacts with several proteins of centrosome and
cytoskeleton(5, 6). In fact, the function of DISC1 protein is mainly regulated by its
protein ligands(7).
Thus the identification of NDEL1 as the major ligand of DISC1 led to further
investigations on the interaction of DISC1 and NDEL1, and their involvement in
neurite outgrowth and, brain development and function(6, 8, 9). Disruption of the
DISC1/NDEL1 interaction may determine perturbations of key events (e.g., neurite
outgrowth, neuronal migration) that are essential to the formation of normal brain
structures(9-12), potentially increasing the vulnerability to SCZ.
Other research approaches to investigate NDEL1 was focused on its
oligopeptidase activity. Initially isolated from rabbit brain cytosol due to its ability to
degrade small peptides such as bradykinin (BK) and neurotensin (NT)(13), the study
of this peptidase, originally named as endo A, stimulated the development of the first
internally quenched fluorescent peptide designed to quantitatively measure
oligopeptidase activity(14). This fluorescent peptide was the precursor of the
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) substrates, largely used to
quantify peptidase activity in biological fluids and homogenates of tissue and cells(9,
10, 15).
NDEL1(9, 10, 16), is preferentially expressed in the brain(17-19). Interestingly, the
NDEL1 substrate NT has been implicated in the pathophysiology of SCZ, and NT
receptor agonists were also suggested to be potential antipsychotics(20-23). Increased
levels of NDEL1 substrates, e.g., NT and proenkephalin products(16), were observed
under antipsychotic treatment(24-26).
Lipska and colleagues(27) reported a significant reduction of NDEL1 in the
brain tissue of SCZ patients and also showed a significant epistatic interaction
between NDEL1 and DISC1 influencing the risk for SCZ(28, 29). Therefore we
75
hypothesized that NDEL1 enzyme activity would be reduced in SCZ patients. Thus,
our primary objective was to compare the NDEL1 enzyme activity levels of SCZ
patients and healthy controls (HCs). Secondly, we tried to correlate these values with
the clinical profile and response to treatment. This study is the first to measure
NDEL1 enzyme activity in human plasma.
MATERIALS AND METHODS Subject enrolment and psychiatric assessment
Patients with SCZ or schizoaffective disorder diagnoses and followed for at
least 1 year were consecutively recruited from an outpatient clinic, The
Schizophrenia Program (PROESQ) of the Federal University of São Paulo
(Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP). A total of 86 patients with SCZ and
6 with schizoaffective disorder diagnoses agreed to participate. 14 patients included
in this study were affected by a non-paranoid type of disease (9 disorganized, 1
catatonic, 1 residual, and 3 undifferentiated). The Structured Clinical Interview for
DSM-IV (SCID) applied by trained psychiatrists confirmed the diagnoses. The clinical
assessment also included the Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS),
Calgary Depression Scale(30), Global Assessment of Functioning (GAF), and Clinical
Global Impression (CGI)(31). For diagnosis, all available information, including medical
records, were used. Any doubt in the diagnosis, including the diagnostic subtype,
was solved by the review of the interview by two additional trained psychiatrists. The
exclusion criteria employed in this work were either the inability to diagnose SCZ or
schizoaffective disorder or inability to provide informed consent. None of the patients
assessed in this study were excluded.
To assess remission, we used the criteria proposed by Andreassen et al.(32),
with mild severity (score of 3 or lower) in eight items of the Positive and Negative
Syndrome Scale (PANSS) (e.g., delusions, unusual thought content, hallucinatory
behavior, mannerisms/posturing, blunted affect, social withdrawal, and lack of
spontaneity). There was also a minimum time threshold of 6 months, in which the
severe symptoms must be maintained. The duration was directly assessed with the
patient and, when in doubt, a companion or informant was questioned and/or the
76
information was recovered from the available clinical records. Treatment-resistant
(TR) status was defined following the International Psychopharmacological Criteria
(IPAP) [www.ipap.org] as a failure to respond to 4- to 6-week trials of monotherapy
with two different antipsychotics in adequate doses (equivalent to 5 mg of risperidone
or 400 mg of chlorpromazine).
Healthy control volunteers (HCs) were selected and paired by age, sex, and
educational level from a governmental unemployment agency. First, the HCs were
submitted to a checklist to screen for psychiatric diagnoses, and then they underwent
the SCID and a family history of mental disease questionnaire, adapted from the
SCID screening questions. Exclusion criteria were personal diagnosis of psychiatric
disease and any degree of a family history of psychosis. Even after the checklist,
nine HC candidates who fulfilled DSM-IV criteria for depression or substance
dependence were excluded. Ultimately, 96 HCs were studied. The Fagerstrom
Nicotine Dependence Test was used to evaluate smoking status in both groups.
The interviewers inferred ethnic background and four groups were considered:
Caucasian, African, Native American (in this group we included Chinese and
Japanese ancestry) and miscellaneous group (for the miscellany of Caucasian +
African, Native American + African, native American + Caucasian).
This study was approved by the Research Ethics Committee of UNIFESP
[CEP No. 1883/10], and a written informed consent was obtained from all recruited
participants. Clinical and laboratory investigations were strictly conducted according
to the principles expressed in the Declaration of Helsinki.
Blood samples Blood samples were collected from all subjects into heparin vacuum tubes (BD
Vacutainer®, BD, NJ, USA). The samples were kept at 4°C and they were
centrifuged at 1500-2000 × g for 10-15 min at room temperature to recover the
plasma, which was then stored at -20°C in sterile Eppendorf tubes (Axygen Inc., CA,
USA) until use.
77
Activity measurements NDEL1 enzyme activity of the SCZ patients and HCs plasma was measured
using the FRET peptide substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp [10 µM], following the
method previously described by the group(10, 18). Hydrolysis of the substrate at 37°C
was monitored by measuring the fluorescence in a Shimadzu RF-5301 PC
spectrofluorometer at λem = 420 nm and λex = 320 nm. The 1-cm path length cuvette
containing the substrate in 1 mL of buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, and 100 mM NaCl
buffer) was placed in a thermostatically controlled cell compartment for 5 min before
the addition of the plasma samples. The time course increase in fluorescence (AFU,
arbitrary fluorescence units) was continuously recorded for 5-10 min, either in the
absence or in the presence of 50 µL of a heat-inactivated NDEL1 antibody (NOAB
inhibitor). Since this antibody shows specific inhibitory activity against NDEL1, the
measured NDEL1 activity was defined as the rate of hydrolysis in the absence of
minus the rate determined in the presence of this specific antibody.
Both the storage and activity measurement procedures for HCs and SCZ
patients groups’ samples were exactly the same; the collection of these samples
were scheduled independently from the clinical condition. Furthermore, the NDEL1
enzymatic activity measurements were performed by someone kept blind to the
clinical condition.
No significant differences in the measurements were observed for triplicate
measurements of few samples (total of 5 samples), showing that the deviation was
smaller than 5% for these same samples, then the a duplicate measurement was
adopted here and the shown data represent the average of these measurements.
Data analysis The Student’s t-test was used to compare the differences in the NDEL1
enzyme activity mean values for the SCZ patients and HCs. The possible
associations of NDEL1 enzyme activity and variables that present non-parametric
distributions were investigated using non-parametric correlations (Spearman’s Rank
Correlation test).
78
The clinical usefulness of NDEL1 enzyme activity measurements to
discriminate SCZ patients and HCs was assessed by the generation of a Receiver
Operating Characteristic (ROC) curve for NDEL1 enzyme activity and SCZ
patient/HC status as the outcome. Then, NDEL1 was dichotomized into groups of
either high or low levels using the median value for the whole sample, and a logistic
regression model with clinical condition as the dependent variable with correction for
age and sex was generated.
Post-hoc power analysis was conducted to determine what was the statistical
power of our findings. We first estimated Cohen’s D effect size using our observed
means and standard deviations for patients with schizophrenia and healthy controls.
Then we used the effect size found at a 0.05 two-tailed significance threshold to
estimate the post-hoc statistical power for a Student’s t test.
Data analyses were performed using the Statistical Package for Social
Science (SPSS) Version 14.0.
RESULTS
Subjects description
In this study, 92 schizophrenia (SCZ) patients and 96 healthy controls (HCs)
from 16 to 68 years old were enrolled. There was no significant difference between
groups in terms of sex, age, educational level, and ethnic background (Table 1).
Enzymatic activity of SCZ patients and HCs
A mean value of 6.7 ± 4.2 and 9.6 ± 4.9 nM/min for the NDEL1 enzyme activity
of SCZ patients and HCs, respectively, was observed. The mean value for NDEL1
enzyme activity in SCZ patients was significant lower compared to HCs (Student’s t =
4.361; p < 0.001; Cohen’s d = 0.64) (Figure 1A and Supplemental Figure S1A).
Statistical and comparative analysis The statistical analysis was performed in two ways: for the whole sample and
also for the separated groups to determine the influence of age, sex, educational
79
level, and ethnic background on the measured enzymatic activity. However, no
significant differences were found in either analysis (Supplemental Figure S1). A
statistical power calculation considering our sample size was performed, and the
observed power for the two-tailed t-test was of 0.994.
Our study sample presented a predominance of chronic patients with a mean
duration of illness of 13 years (SD = 8). Attempts to correlate NDEL1 activity with the
duration of illness and age of onset, looking for a possible confounding effect, did not
show significant correlation with the duration of illness as indicated by the values for
Spearman’s rho = -0.27 (p = 0.098). The Spearman’s rho for age of onset was 0.171
(p = 0.100). Differences in lifestyle that might have influenced our results were also
addressed here. Smoking status was available for 182 out of 188 subjects enrolled in
this study. A total of 93 subjects reported they have never smoked, 33 have smoked
in the past but reported stopping, and 56 reported themselves as current smokers.
There was no significant difference in smoking status frequencies between SCZ
patients and HCs (p = 0.650). Also there was no significant difference between
groups for NDEL1 enzymatic activity (p = 0.301). Considering the group of former
and current smokers, there was a significant difference in Fagerstrom Nicotine
Dependence Test (FNDT) scores; SCZ patients had a higher total score compared to
HCs, but there was no significant correlation for the FNDT total score and NDEL1
enzyme activity (p = 0.200). There was no correlation between the mean NDEL1
enzyme activity and the reported number of cigarettes smoked per day (p = 0.665).
For 43 SCZ patients, Body Mass Index (BMI) values were also available since weight
and height were recorded for clinical evaluation in the same day of blood collection.
No correlation between BMI and NDEL1 enzyme activity could be observed
(Spearman’s rho = -0.147; p = 0.347).
NDEL1 enzyme activity and symptom severity
We then investigated the association of symptoms dimensions and severity
with NDEL1 enzyme activity. Utilizing the five dimensions proposed by Levine and
Rabinowitz(33), we performed a non-parametric correlation analysis in reference to
NDEL1 enzyme activity. A significant correlation was found only for the negative
dimension (Spearman’s rho = 0.218; p = 0.041). We also looked for a relationship
between NDEL1 enzyme activity and symptom severity using Clinical Global
80
Impression (CGI) and Global Assessment of Functioning (GAF) values, but no
correlation with NDEL1 enzyme activity or its mean differences were found when
categorizing patients by the median values for each scale.
The enzyme activity was also categorized as high or low by assessing the
whole sample median values. Then, a logistic regression was performed with clinical
condition (HC or SCZ) as the dependent variable, and the dichotomized enzymatic
activity, sex, and age as covariates. We observed that low activity could predict the
patient condition using this model (p < 0.001; B = 1.680; OR = 5.35, CI 95% = 2.27-
12.57; Nagelkerke R square = 0.23). We generated a Receiver Operating
Characteristic (ROC) curve to better estimate the usefulness of this measurement to
differentiate HCs from SCZ patients, and an Area under the Curve (AUC) of 0.703
was determined (Figure 2).
NDEL1 enzyme activity for patient subgroups based on treatment-resistant criteria
As a specialized clinic, severe cases are referred to us and 50% of patients in
this sample are treatment-resistant (TR) according to The International
Psychopharmacology Algorithm Project (IPAP) criteria [http://www.ipap.com], as
described in the Material and Methods section. Based on these criteria, the patients
were divided into two subgroups of TR and non-TR (NTR), and a t-test analysis to
identify differences between these groups was performed. The mean value for the
TR group was significantly lower compared to the NTR patients (t = 2.25; p = 0.027).
Overall, the highest mean value was observed for the HC group (9.6 nM/min), and
the lowest value was observed for the TR group (5.7 nM/min), with an intermediate
value for the NTR group (7.6 nM/min) of SCZ patients (Figure 1B and Supplemental
data S1B).
As this result could reflect the effects of antipsychotic treatment, especially
under use of clozapine, a possible correlation between the dose of clozapine and the
enzymatic activity values was also tested. From the 46 TR patients, 34 were under
treatment with clozapine. No significant correlation was observed for the dose of
clozapine and the levels of measured enzyme activity (Spearman’s rho = 0.021; p =
0.908). The mean values of enzymatic activity for TR patients under treatment with
81
clozapine or not were of 5.5 and 6.2 nM/min, respectively, and this difference was not
significant (z = -0.27; p = 0.790).
To evaluate the possible confounding effects of other antipsychotic drugs on
plasma NDEL1 enzyme activity of NTR patients, the correlation with other
antipsychotics was also examined. Among these patients, 30 patients were using
olanzapine, which is the second most commonly used antipsychotic drug in our
sample, after clozapine. These patients had a mean value of 7.2 nM/min for NDEL1
enzyme activity, with no significant correlation observed with dose (Spearman’s rho =
0.281; p = 0.130). Small numbers of patients were treated with other antipsychotic
drugs, including the following: risperidone (8 patients), haloperidol (4), quetiapine
(6), aripiprazole (6), or with paliperidone, consta, clopixol, sulpiride, or trifluoperazine
(1 patient for each drug). The mean value of NDEL1 activity for this group was 7.5
nM/min. For this heterogeneous group, a dose conversion to chlorpromazine
equivalents was performed, and then a dose correlation with NDEL1 enzyme activity
was also determined to be non-significant (Spearman’s rho = -0.2, p = 0.300).
To further address the clinical potential of NDEL1 enzyme activity analysis, we
performed a multinomial logistic regression with clinical condition (HCs, TR, and
NTR) as the dependent variable. The dichotomized enzymatic activity and sex were
fixed factors, and age was the covariate. The lower enzymatic activity was
significantly associated with both NTR (p = 0.002; B = 1.19; OR = 3.29; CI 95% 1.57-
6.88) and TR patients (p < 0.001; B = 2.27; OR = 9.64; CI 95% 4.12-22.54). The
Nagelkerke Pseudo R square for this model was 0.22.
DISCUSSION Considering the lack of definite results in genetic association studies, the
emergence of CNVs and the increasing number of studies investigating the
estimated role of rare variants in SCZ investigation(34-36), new approaches are sought.
This rationale led our team to direct our efforts towards protein function. More
specifically, we focused on NDEL1 enzyme activity. NDEL1 was chosen due to its
roles in the neuronal differentiation and migration processes(6, 9, 12, 16, 37), and due to
the evidence suggesting a direct correlation of NDEL1 enzyme activity and SCZ(10,
82
38). NDEL1 endooligopeptidase activity and some of its potential substrates, namely
bradykinin (BK), dynorphin (Dyn), and neurotensin (NT), have also been implicated in
SCZ(21,23, 25, 39). Alterations in plasma endopeptidase activity have been described for
psychiatric disorders such as bipolar disorder and SCZ(40, 41), and more recently,
some of these peptidases were also suggested as potential targets for the treatment
of several mental diseases, including SCZ(42, 43).
The thiol-activated NDEL1 endopeptidase is the responsible for more than
90% of the BK inactivation observed in rabbit brain cytosol(18). The biochemical and
enzymatic features of NDEL1 have been widely studied and characterized, and
although there is currently no specific chemical inhibitor for this enzyme, its activity
has been determined by using highly specific antibodies with anti-catalytic activity
(NOAB inhibitor) combined with the use of selective peptide substrates that allow the
specific measurement of NDEL1 enzyme activity(9, 10, 18). The internally quenched
fluorescent substrate, based on Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
used herein allowed a highly sensitive and quantitative monitoring of NDEL1 enzyme
activity in human plasma.
However, considering the previously demonstrated hydrolysis rates of the
NDEL1 oligopeptidase activity against this same FRET substrate(9,10), considering the
activity levels measured here, we could foresee that NDEL1 protein amount present
in the human plasma is significantly lower compared to that detected in homogenates
of PC12 cells or brain tissues. In fact, attempts to detect NDEL1 in human plasma by
Western blot, even after depletion of albumin, was unsuccessful (data not shown),
suggesting that only highly sensitive fluorimetric measurements(14), as the one
employed here, would allow a rapid, adequate, quantitative, and reliable comparative
evaluation of the NDEL1 levels in this type of biological material.
To our knowledge, this study is the first to investigate NDEL1 enzyme activity
in plasma. Our study reports a lower NDEL1 activity in chronic schizophrenia (SCZ)
patients compared to healthy controls (HCs). This finding is also in line with the
demonstration of a lower NDEL1 RNA expression in SCZ patients(27). We also found
that treatment-resistant (TR) patients have significantly lower enzyme activity levels
compared to non-TR (NTR) patients, although this difference was not of the same
magnitude as that observed between SCZ patients and HCs (Figure 1 and
Supplementary material S1). Indeed, the median values for Healthy Controls and
83
SCZ patients highlight the observed mean difference (respectively 8.9 and 5.6
nM/min), whereas suggest some caution interpreting the finding on the difference
observed TR and NTR means, as the median values were, respectively, 5.5 and 5.6
nM/min.
Diagnostic methods for SCZ have been described by others(35, 44). Although
these methods demonstrated higher AUC values, they employed a panel of genetic
or biochemical biomarkers that could introduce confounding factors and increase the
complexity of the interpretation of results. The observed AUC of 0.7 is promising
considering that is derived from one single measurement, but at this points it is still of
low to moderate clinical utility(45). Unfortunately, it is not possible to make a direct
comparison of our methods with those of other studies solely based on published
data, although our method described here is clearly easier to perform and interpret. A
side-by-side study using the same cohort would be necessary to evaluate the
comparative advantages and disadvantages of each method and to evaluate the
potential convenience of using them as complementary methods for diagnosis or
treatment follow-up.
Our results seem to point more towards the use of NDEL1 activity as a tracer
rather than as a state biomarker because the observed differences were more
strongly associated with diagnosis and treatment response, e.g., TR and NTR, than
to the severity of symptoms or the duration of illness. Another result that supports this
hypothesis is the fact that patients with disorganized SCZ, also called hebephrenia,
present a significantly lower NDEL1 enzyme activity level (t = 3.13; p = 0.005)
compared to paranoid patients. Especially interesting are the clear differences in the
mean values (7.1 nM/min for paranoid versus 4.5 nM/min for disorganized SCZ) and
the standard deviations (4.5 nM/min for paranoid versus 2.0 nM/min for disorganized
SCZ), suggesting that disorganized SCZ patients represent a distinct group in terms
of NDEL1 enzyme activity. However, this result should be cautiously considered due
to varying number of subjects in each group (73 in the paranoid group versus 9 in the
disorganized group). There was also a clear difference in treatment response status,
with 8 of 9 disorganized SCZ patients being diagnosed as TR and under use of
clozapine. Other point that must be addressed in future studies is the relation of
NDEL1 enzymatic activity and both duration of illness and age of onset, since their
correlation was only slightly above significance threshold (p-value of approximately
84
0.1 for each correlation). NDEL1 is related to several processes linked to
neurodevelopment, and thus, we could not exclude the possibility of some kind of
correlation based only on these preliminary results. Additionally, in opposition to
evidences towards a trait marker, at this moment it is not possible to rule out an
influence of factors associated to chronicity and severity in NDEL1 enzymatic
measure, i.e. the cumulative effect of antipsychotics. These points must be more
deeply evaluated in a prospective study for better clarification.
Despite these considerations, the treatment response analysis is quite
promising if we take into account that NDEL1 is a potential convergence point of the
DISC1 pathway and neuropeptidases. In addition, the putative physiological NDEL1
substrate NT has been proposed to mediate some actions of clozapine and other
atypical drugs(46, 47). The putative regulation of NT concentration by the action of
NDEL1 may help understanding the differences observed for the mean NDEL1
activity values of TR and NTR patients (Figure 1B). This result is especially
interesting if we consider that subjects from both groups are under antipsychotic
treatment. Therefore, the observed differences would reflect either native differences
between the groups or they may also be the result of a specific clozapine effect. In
either case, this investigation can shed further light on the underpinnings of TR
studies.
Of course, this study should be considered more as a proof-of-concept rather
than a validation study, and several study limitations must be taken in account, for
instance: (1) we do not know how stable these values are over time because these
data are transversal, and consequently, we cannot fully understand the role of the
progression of illness by this activity. The marginal non-statistical result for the age of
onset reinforces the necessity of investigating this measurement in larger samples in
prospective studies, keeping in mind that Lipska and colleagues(27) found a
correlation between NDEL1 expression and age. Although we tried to rule out the
possible confounding effects of antipsychotic use and/or its dosage (all results were
non-significant), this issue would be better clarified in a prospective study. (2) Since
this measurement is conducted using plasma, the true correspondence to brain
activity values and function is uncertain. Although several studies have shown that
NDEL1 is a key protein in different processes related to neurodevelopment, the
extension and ultimate mechanisms that determine its presence in blood still remain
85
to be clarified and are currently under assessment by our research group. (3) To
confirm the value of using the NDEL1 enzyme activity measurements as a diagnostic
method, we should also evaluate first episode SCZ patients who have not received
long-term treatment with several antipsychotic drugs. We are also currently studying
these patients. (4) Although we adopted standard operation procedures to reduce the
chances of storage and measurements differences influencing our result, we cannot
completely rule out this possibility. Otherwise, it remains to be clarified the effect of
diurnal variation, though storage delays did not affect the NDEL1 enzymatic activity
measured in these plasma samples up to one year later of storage at -20°C (data not
shown).
In conclusion, NDEL1 enzymatic activity is a potential convergence point of
the DISC1 pathway and neuropeptides, both of which have been linked to SCZ in
several studies. Further comprehension of the underlying factors associated with
NDEL1 plasma levels could be a useful tool to unravel NDEL1 and DISC1 complex
relationship. Our results also suggest that NDEL1 is a biomarker with potential
clinical use in supporting diagnosis and drug-choice, although the latter potential
application still needs to be further investigated. Filling in these gaps in knowledge
will result in a more robust and detailed understanding of the neuropathology of SCZ,
and further efforts to this highly desirable end are ongoing in many laboratories,
including ours.
FUNDING This work was supported by the São Paulo Research Foundation (Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP) [2008/57336-2 for
MFMM; 2010/01394-4 for JRS; 2011/50740-5 for RAB and 2009/17726-9 &
2003/00817-5 for MAFH] and the National Council of Technological and Scientific
Development (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -
CNPq) [477760/2010-4; 557753/2010-4; 508113/2010-5 for MAFH].
86
ACKNOWLEDGEMENTS We are greatly thankful to Prof. Maria Aparecida Juliano for the peptide
substrate used in this work. We also express our gratitude to Vanessa Kiyomi
Arashiro Ota and Bruno Andrade Costa for their assistance with blood collection,
identification and storage control.
CONFLICT OF INTEREST
The authors declare no conflicts of interest.
FINANCIAL DISCLOSURES Dr. A. Gadelha reports having received PhD fellowship from CAPES
(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), while Dr. MFM
Machado is receiving post-doctoral fellowship from FAPESP [No. 2008/57336-2] and
research funding from CNPq (National Counsel of Technological and Scientific
Development). C.M. Yonamine is currently supported by fellowship from CNPq. Dr.
JR Sato has research funding from FAPESP, while Drs. V Oliveira, RA Bressan and
Dr. MAF Hayashi are all supported by FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo), CAPES and CNPq. Dr. MAF Hayashi is also the recipient of a
fellowship from Fullbright and FAP/UNIFESP. Dr. RA Bressan has also received
lecture fees from Astra Zeneca, Bristol, Janssen and Lundbeck, with research grants
from private companies such as Jansse, Eli Lilly, Lundbeck, Novartis, and Roche,
and Fundação Safra and Fundação ABADS. Dr. Bressan is also a shareholder of
Radiopharmacus Ltda. and Biomolecular Technology Ltda. The data and methods
presented here are part of the patent [No. PI 1004231-8], with extension to PCT [No.
11/000417] registered in Nov 21st, 2011.
87
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TABLES
N % N % Test value pMale 60 59.2 61 63.5Female 32 32.8 35 36.5>10a 28 67.5 73.2 70.5<10a 64 24.5 26.8 25.5
Age mean Years-old 92 35.5 ± 10.3 96 34.2 ± 10.1 0.856 0.393Caucasian 61 66.3 61 63.5African 4 4.3 11 11.5Native American 10 10.9 5 5.2Miscellaneousb 17 18.5 19 19.8
Mean dose of antipsychotic Chlorpromazine equivalents (mg) 92 556.3 ± 400 - - - -Mean no. of hospitalizations 92 2.33 ± 3.2 - - - -
b Caucasian + African, Caucasian+ Native American, or African + Native American.
Table 1. Sociodemographic characteristics.Patients Healthy Controls Statistics
Educational level
Gender 0.058 0.810
0.024 0.877
(n=92) (n=97)
Ethnic background 4962 0.175
a Education years.
92
FIGURES
Figure 1. Scatter plot for NDEL1 enzymatic activity measurements. Scatter plot for NDEL1 enzymatic activity measurements of healthy controls (HCs) vs. SCZ patients (A), and of HCs vs. treatment-resistant (TR) and non-TR (NTR) SCZ patients (B). There is a significant difference between groups; with TR patients showing the lowest NDEL1 activity mean value.
Figure 2. Receiver operating characteristic (ROC) curve analyses. The area under the ROC curve (AUC) for NDEL1 enzyme activity and SCZ vs HCs status as outcome was determined as 0.703. This curve combines the information of the true positive rate and the true negative rate, and the AUC is a measure of the overall discriminative power.
93
SUPPLEMENTAL MATERIAL
Supplementary figure S1. Box plot for NDEL1 enzymatic activity measurements. Box plot for NDEL1 enzymatic activity measurements of healthy controls (HCs) vs. SCZ patients (A), and of HCs vs. treatment-resistant (TR) and non-TR (NTR) SCZ patients (B). There is a clear difference between the groups’ mean values, but there is an overlap between the distributions, and the median values of TR and NTR are very similar.
A B
SCZ
94
Supplemental table S1.
Correlation StatisticsAge vs Nde1l activity for the whole sample Spearman’s rho = 0.007, p = 0.920Age vs Ndel1 activity for HCs Spearman’s rho = -0.140, p = 0.890Age vs Ndel1 activity for SCZ patients Spearman’s rho = 0.099, p = 0.350
Male vs Female vs Ndel1 activity for HCs t = 0.372; p = 0.710Male vs Female vs Ndel1 activity for SCZ patients t = 0.123; p = 0.900Male vs Female vs Ndel1 activity for the whole sample t = 0.295; p = 0.770
>10 vs <10 years of education Ndel1 activity mean values for HCs t = -0.029; p = 0.977
>10 vs <10 years of education Ndel1 activity mean values for SCZ patients t = -0.392; p = 0.700
>10 vs <10 years of education Ndel1 activity mean values for the whole sample t = -0.245; p = 0.810
Suppl.Table 1. Evaluation of influences of gender, age and educational level on Ndel1 activity measure.
95
5.2. ESTUDO 2: Genome-Wide investigation of Ndel1 enzymatic levels in plasma of patients with schizophrenia and healthy controls reveal new putative risk genes for schizophrenia
Authors: Ary Gadelha1*, Jonathan Coleman2, Gerome Breen2, Diego Robles Mazzoti3,
Camila M. Yonamine1,4, Renata Pellegrino5, Vanessa Kiyomi Ota1,6, Sintia Iole Nogueira
Belangero1,6, Joseph Glessner5, Patrick Sleiman5,7,Hakon Hakonarson5,7, Mirian A. F.
Hayashi4*#, Rodrigo A. Bressan1*#
Affiliations: 1. Department of Psychiatry, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP/EPM), São Paulo, Brazil. 2. Medical Research Council Social Genetic and Developmental Psychiatry Centre, Institute of Psychiatry Psychology and Neuroscience, King’s College London, London, United Kingdom. 3. Department of Psychobiology, UNIFESP/EPM, São Paulo, Brazil. 4. Department of Pharmacology, UNIFESP/EPM, São Paulo, Brazil. 5. Center for Applied Genomics, The Children's Hospital of Philadelphia, Philadelphia, United States of America. 6. Morphology and Genetics Department, UNIFESP, São Paulo, Brazil. 7. Department of Pediatrics, The Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, US. 8. National Institute of Health Research Biomedical Research Centre for Mental Health, Maudsley Hospital and Institute of Psychiatry, Psychology and Neuroscience, King’s College London. # Joint contribution
* Corresponding authors: Mirian A. F. Hayashi, Ph.D. Ary Gadelha, M.D. Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP/EPM), Rua 3 de maio 100, Ed. INFAR, 3rd floor, CEP 04044-020, Tel +55-11-5576 4447/FAX +55-11-5576 4499, São Paulo, Brazil; e-mail: [email protected] or [email protected]
Abreviations: SCZ, Schizophrenia; HCs, Health Controls; GWAS, Genome-Wide Association studies; Ndel1, Nuclear Distribution Element-Like 1; DISC1, Disrupted in Schizophrenia-1; SCID, Structured clinical interview of DSM IV; SNP, Single Nucleotide Polymorphism; BMI, Body Mass Index; CAMK1D, Calcium/calmodulin-dependent protein kinase ID; MAGI2, Membrane-Associated Guanylate Kinase, WW And PDZ Domains-Containing 2; GABRG3, Gamma-Aminobutyric Acid Receptor, Gamma-3; CCDC25, Coiled-Coil Domain Containing Protein 25; ZNF536, Zinc Finger Protein 536; FRMPD2, FERM and PDZ domains-containing protein 2; IGF2BP3, Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3; THSD7A, Thrombospondin, Type I, Domain Containing 7A; RNF125, Ring Finger Protein 125; OSBPL1A, Oxysterol Binding Protein-Like 1A; H3F3C, H3 Histone, Family 3C.
Keywords: Ndel1, schizophrenia, GWAS, biomarker
96
ABSTRACT
Ndel1 is an oligopeptidase which cleaves neuropeptides, such as neurotensin and
bradykinin, and is also associated with neuronal migration and neurite outgrowth. We
previously reported that Ndel1 enzyme activity levels in plasma are lower in patients
with schizophrenia (SCZ) compared to healthy controls (HCs). Previous studies
investigated the impact of Ndel1 and Disc1 interactors pathways on SCZ
susceptibility and on Ndel1 mRNA levels. To our knowledge, no study has
investigated the genetic factors associated with Ndel1 enzymatic plasma activity or
with differences in the activity levels between SCZ patients and HC subjects. In the
current analyses, samples from 83 SCZ patients and 92 control subjects were
assayed for Ndel1 enzymatic plasma activity and genotyped on the Illumina Omni
Express array. A genetic relationship matrix using genome-wide information was
used for ancestry correction. Ndel1 enzyme activity was significantly lower in patients
with SCZ (t = 4.9; p < 0.001). CAMK1D, MAGI2, CCDC25, and GABGR3 were found
to be associated with Ndel1 enzyme activity (P<10-6), independent of the clinical
status. Investigating the observed differences for case/control measures, variants at
ZNF536 and FRMPD2 were closest to genome-wide significance, with p-values of
2.43 x 10-7 and 6.06 x 10-7, respectively. We conclude that Ndel1 activity is a
complex trait influenced by many different genetic variants that contribute to
schizophrenia physiopathology.
97
INTRODUCTION Schizophrenia (SCZ) is a neurodevelopmental disorder resulting from a
dynamic phase-specific interplays of genetic and environmental factors that lead to
disruption in normal brain assembly and function(1, 2). Heritability estimates are high,
i.e. at 73-90%(3), and, more recently, Genome-Wide Association studies (GWAS)
have inferred the implication of many genes and pathways contributing to SCZ
pathopysiology(4).
Nuclear-distribution element-like 1 (Ndel1) oligopeptidase belongs to a class of
enzymes that cleaves only peptides but not proteins(5, 6). This enzyme is also a
cytosolic protein able to bind and form complexes with several cytoskeleton proteins
with implication in neuronal migration and neuritogenesis(7-9). NDEL1 gene is located
at chromosome 17q13.1 comprising 10 exons, and encodes a coiled-coil protein with
oligopeptidase activity(10). Alternatively spliced transcript variants encoding multiple
isoforms have been observed for this gene (UCSC, RefSeq NM_001025579). Full
protein length is 345 amino acids with the enzymatic active site containing a reactive
cysteine residue at position 273(10). Both the active cysteine residue and terminal N-
terminal coiled-coil domain have been shown to be essential for Ndel1 function(7, 11,
12).
Several lines of evidence also support the role of Ndel1 in SCZ. Ndel1 was
shown to be the major ligand of Disc1, which is the product of the most studied
genetic liability genes for psychiatric disorders(9, 13). Disc1/Ndel1 interaction may
regulate neuronal morphogenesis and positioning during neuronal integration(14).
Ndel1 and Disc1 depletion in newly generated adult hippocampal neurons share a
number of characteristics including deficits in neuronal positioning(14-16). Knockdown
of Ndel1 expression prior to differentiation in PC12 cells results in inhibition of neurite
outgrowth, which was rescued by wild-type Ndel1, but not by a mutant Ndel1
(LE266/267AA) that cannot bind to Disc1(9) or mutant Ndel1 (C273A) that does not
have enzyme activity(7). Interestingly, the balanced translocation in DISC1 in the
original report by Millar et al.(17) leads to truncated protein disrupting the Disc1/Ndel1
binding site(11, 15, 18). Disc1/Ndel1 interaction competitively inhibits Ndel1
oligopeptidase activity(7). Therefore, Ndel1 activity appears to impact neurogenesis
98
and might be correlated with neuronal migration and positioning during
embryogenesis(19).
Previous studies that have investigated Ndel1 in SCZ, have largely focused on
its interaction with Disc1. Most genetic association studies found significant results
only when haplotypes or interactors of Disc1 pathway were analysed together(20, 21),
with mixed results for Ndel1 main effects(22, 23). In addition, Lipska et al.(24) reported
significantly reduced expression levels of Ndel1 in the hippocampus of patients;
furthermore, Ndel1 expression was significantly influenced by DISC1 risk genotypes.
Recently, our group showed that Ndel1 enzyme activity was significantly
reduced in the plasma of patients with SCZ compared to healthy controls (HCs)(25).
Additionally, lower range values were found in hebephrenic and treatment resistant
patients, which are groups usually regarded to have severe form of the disorder and
which are also associated with reduced cortical volumes(26). Little is known about the
determinants of Ndel1 plasma enzyme activity levels. Herein, our main objective is to
investigate which genomic variants analysed through GWAS are correlated with the
plasma measure and the observed difference in Ndel1 enzyme activity levels
between patients and HCs.
METHODS
Study participants
189 subjects, 87 patients with schizophrenia (SCZ) and 102 healthy controls
(HCs) were enrolled. Patients were recruited from an outpatient clinic, The
Schizophrenia Program (PROESQ) of Federal University of São Paulo (Universidade
Federal de São Paulo, UNIFESP). Structured Clinical Interview for Diagnosis on
DSM-IV (SCID) applied by trained psychiatrists confirmed the diagnoses. All study
participant signed informed consent for the study.
Inclusion criteria for patients were: 1) Age between 16 and 65 years-old; 2)
Fulfil SCZ or Schizoaffective Diagnoses; 3) At least one year of follow-up. Healthy
control volunteers were selected paired by age, gender and educational level from a
governmental unemployment agency. First they were submitted to a phone screening
99
for psychiatric diagnosis and then invited to full psychiatric interview. Inclusion criteria
were: 1) Age between 16 and 65 years old; 2) No current or lifetime psychiatric
diagnosis; 3) No known family history of psychosis at any degree.
For both groups exclusion Criteria were: 1) Diagnosis of Hypertension; 2) Use
of any anti-hypertensive medication, even those prescribed for other reasons, i.e.
propranolol for tremor; 3) Doubt or lack of consensus on diagnosis.
4 patients and 2 healthy controls were excluded due to arterial hypertension
diagnosis and/or use of anti-hypertensive drugs. 8 HCs did not provide blood for DNA
or the DNA quality was too low for GWAS and were excluded. At last, 83 patients
and 92 HCs were included.
Blood samples
Blood samples were collected from all subjects into heparin vacuum tubes BD
Vacutainer® (BD, NJ, USA). The samples were kept at 4°C, and they were
immediately centrifuged at 1500-2000 x g for 10-15 min at room temperature to
recover the plasma, which was then stored at -20°C in Eppendorf tubes (Axygen Inc.,
CA, USA) until use. The plasma was carefully removed with a transfer pipette to
avoid disturbing the white blood cells layer. Although the suggested procedure is to
fractionate the blood as soon as possible after collection, some samples were
centrifuged up to 24 h after blood collection with no detectable influence in the
measured enzymatic activity. The stored samples were defrosted placing the tubes in
wet ice soon before the activity measurements as follows.
Activity measurements
Ndel1-like activity in human plasma samples of normal volunteers and SCZ
patients were measured by a fluorimetric assay, using the FRET peptide substrate
Abz-GFSPFRQ-EDDnp [10 µM]. Hydrolysis of the substrate, at 37°C, was monitored
by measuring the fluorescence in a Shimadzu RF-5301 PC spectrofluorometer at λem
= 420 nm and λex = 320 nm. The 1 cm-path length cuvette containing 1 mL of
substrate solution (50 mM Tris-HCl pH 7.4 and 100 mM NaCl buffer) was placed in a
thermostatically controlled cell compartment for 5 min, before the addition of the
100
plasma samples. The increase in fluorescence (AFU, arbitrary fluorescence units)
with time was continuously recorded for 5-10 min, both in the absence and in the
presence of 50 µL of a heat-inactivated Ndel1 antibody (NOAB inhibitor), as
previously described(11). The measured Ndel1-like activity is the rate of hydrolysis in
the absence of the specific antibody minus the rate determined in the presence of the
antibody.
Genetic Procedures
All participants were genotyped using the Illumina Human Omni Express Bead
Chip (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA). All DNA samples underwent stringent
quality control including exclusion if sample genotype missing rate >1%, or if
abnormal heterozygosity, or unmatched sex assignment were observed. SNPs with
minor allele frequency <1% or showing departure from Hardy-Weinberg equilibrium
(p<1 × 10-5) were excluded. The 704,523 SNPs that passed quality control were
imputed to the December 2013 release from the 1000 Genomes project (1000
Genomes Consortium, 2012), using IMPUTE2(27), with concurrent phasing (no pre-
phasing). 8,793,001 SNPs with an info score > 0.8 and minor allele frequency >1%
were retained for analyses.
Statistical analysis We used GCTA (Yang et al.(28) to perform a genome wide analysis (GWAS)
using a mixed model approach that adjusts for population stratification while carrying
out association for each SNP. We derived a genetic relationship matrix (GRM)
between individuals using the genetic marker genotypes on the microarrays to
calculate pairwise genomic similarity. Individuals whose relationship to another
subject was greater than 0.025 (equal to a fourth cousin) were removed to avoid the
possible phenotypic similarity between close relatives being due to non-genetic
effects, such as common environmental effects(29). Then we used GCTA’s minimal
loco option to generate association results.
No available tool based on genetic related matrix is able to perform interaction
analyses for genome-wide driven data. Therefore to perform this analysis we used
101
PLINK v 1.7(30). To adjust for population stratification, we used a multidimensional
scaling approach implemented in PLINK that gives equivalent results to principal
components analysis(31). The model that corrected for the first 4 dimensions provided
the best estimates, considering agreement in the first 20 hits, yielded by the GCTA
major effect analyses. On this basis, we carried out the interaction with case status
association via a linear model, including an interaction term for case status and
genotype.
Genome-wide significance threshold was defined at p < 7.2 x 10-8 (32). For the
non-genetic test presented, the significance level for standard parametric and non-
parametric tests are given as corrected p-values.
RESULTS No significant difference was found for age, gender or educational level
between groups (Table 1). Ndel1 enzyme activity levels were significantly lower
among schizophrenic (SCZ) patients, compared to healthy controls (HCs) (t = 4.9;
p<0.001), as also described in our previous report(25). There was no significant effect
of age, gender, and educational level on Ndel1 enzyme activity.
Genomewide Analysis
In the first set of analyses, we searched for SNPs associated with Ndel1
enzyme activity levels, independent of the case status. Case status was then added
to the linear model as a covariate. In Table 2 we report the results of analyses with p
values <10-6, and in Fig. 1, the Manhattan and QQ plots for the results are depicted.
Taken together, no individual SNP was above the GWAS significance threshold. We
defined as suggestive significance p < 5x10-6, as the standard practise in the field.
The top ranked findings were at the gene CAMK1D, with two hits with p values in 10-
6. Other genes uncovered with P<10-6 threshold were MAGI2, GABGR3, and
CCDC25. The Ndel1 region was found to have very few SNPs and none have
reached close to significant or suggestive thresholds.
102
GWAS Interaction The results for the interaction term are in table 2 and they suggest the
involvement of ZNF536, FRMPD2, AK297683, RNF125, OSBPL1A, IGF2BP3, and
H3F3C. The most significant results were observed for the ZNF536 gene with p-
value of 2.34 x 10-7. The only other p-value in the 10-7 range was for the FRMPD2
gene (6.06 x 10-7). RNF125 was the only gene with two SNPs listed above 10-6
threshold. The Manhattan and QQ plots for the interaction term results are depicted
in Fig. 2.
DISCUSSION We sought to understand the genetic influences on Ndel1 enzyme activity, as
we recently found significantly lower Ndel1 enzyme activity levels in patients with
schizophrenia (SCZ)(25). In the current study, genes that potentially regulate Ndel1
enzyme activity levels were investigated. We also searched for genes that
significantly influenced the observed difference in Ndel1 plasma enzyme activity
levels between SCZ patients and HCs. We found no genome wide significant results,
although some suggestive hits were obtained (Defining as suggestive p-values <10-
6). We found evidence for 4 genes having effects on Ndel1 enzyme activity levels:
CAMK1D, MAGI2, GABGR3, and CCDC25. In our case status genotype interaction
analyses, ZNF536 SNPs achieved the most significant p-values and top hits were at
p-level of 10-7.
The CAMK1D gene, located at chromosome 10p13, encompassing the loci
with the lowest p-values had a number of suggestive association signals, not in
linkage disequilibrium, at p-values <10-6. CAMk1D is a Ca2+/calmodulin dependent
kinase predominantly expressed in polymorphonuclear cells, among hematopoietic
cell lines(33). In in vitro assays, CAMk1D phosphorylated several substrates, including
synapsin 1 and 2, and CREB(34, 35), which were previously associated with SCZ(36-38).
The binding of Ca2+ to calmodulin is a signal transducing mechanism of Ca2+ into
cellular responses that regulate many crucial processes(39). CAMKII is another
Ca2+/Calmodulin dependent kinase associated with SCZ. CAMKII was also showed
103
to interact with the product of CACNA1C gene(40, 41), which was associated with and
replicated in several genome-wide studies conducted on patients with SCZ and
bipolar disorder(4). Indeed, Ripke et al.(4) emphasized the potential role of Ca2+
neuronal signalling to SCZ. Independently, Kendrin, a calmodulin binding protein,
localized specifically at centrosome was demonstrated to co-localize with Disc1(42).
Moreover, Disc1 lacking the putative Kendrin binding site distributes diffusely
throughout cytoplasm, losing usual centrosomal localization(42, 43). Thus, disruption in
Disc1/Kendrin interaction could lead to abnormal neuronal development, a process
implicated in SCZ physiopathology. So, several independent pathways can lead
Ndel1 and CAMK1D to SCZ, but the putative relations mentioned above still need to
be confirmed in future studies.
CAMk1D has been reported to be associated in GWAS meta-analysis studies
with type II Diabetes(44) and was later shown to reduce glucose response(45), possibly
due to an effect on the localization of a mediator of both gluconeogenesis and
glycolysis(46). This raises question about the effect of metabolic process in Ndel1
measures and whether they converge to impact on SCZ pathophysiology or whether
Ndel1 would be only a biomarker of these processes. In our first study we did not
observe any association between Ndel1 enzyme activity and Body Mass Index (BMI)
in a subgroup of patients, nor with antipsychotic drug doses in chlorpromazine
equivalents(25). Although cannot rule out any of these possibilities, they should be
addressed in future studies.
The MAGI2 gene, located at chromosome 7q21.11, was found to be disrupted
by CNVs in SCZ and is a binding partner of neuroregulin(47). MAGI2 was implicated in
both glutamatergic(48) and GABAergic pathways(49). SNPs of MAGI2 have been
associated with performance in the Wisconsin Sorting Card Test (WCST) in patients
with SCZ(50), whereas in animal models it was shown to modulate long-term memory
and associative learning(51, 52).
The GABGR3 gene encodes a subunit of the GABA-A receptor and is located
at chromosome 15q12, inside a locus containing a cluster of other two GABA(A)
receptor subunit genes, GABRB3 and GABRA5. Despite substantive evidence of
impaired GABA neurotransmission in SCZ(53), no previous study has directly
associated GABGR3 to the disorder. In the latest PGC GWAS in SCZ, the GABRA5
locus was found to have suggestive evidence of association with SCZ (p = 4, 98e-
104
5)(54). The 15q11-13 locus has been identified in several CNV studies in SCZ as well
as in a familial SCZ linkage study(55, 56). GABGR3 has been shown to be associated
with autism(57) and alcoholism(58). Reinforcing a putative role in SCZ, Kohannim et
al.(59) discovered 22 genes that influenced temporal lobe volume and reached
genome-wide significance. Interestingly, among them were GABRG3 and MAGI2.
Finally, the Coiled-Coil Domain Containing Protein-25 (CCDC25) gene located at
8p21.1 encodes a human protein of unknown function and has been linked to
prediction of smoking cessation in a genome-wide study(60).
The results for the case control difference observed from the regression
model analysis with an interactome, underwent a less stringent ancestry correction
and should be interpreted with caution. The two major hits were in the same gene,
ZNF536, but they were in linkage disequilibrium. Zinc finger proteins are a large
family of transcription factors and play a critical role in the development and
differentiation of the nervous system(61). ZNF536 product is a protein recently
identified to be expressed at high levels in the brains of both developing mouse
embryos and adult mice, and to present a significant role in the regulation of Retinoic
Acid-induced P19 cell differentiation by negatively regulating downstream gene
transcription(62). Moreover, it showed specificity to neuronal tissues.
FRMPD2 encodes for a scaffolding protein found to impact cell-cell
junctions(63). Recently, FRMPD2 was associated with spatial assembly of NOD2-
signaling complex, which was reported to activate the transcription factor NF-κB,
restricting NOD2-mediated immune responses to the basolateral compartment(64).
Ring Finger Protein 125 (RNF125) gene, also known as T-Cell Ring Protein Identified
in activation screen (TRAC-1), encodes a ring finger E3 ubiquitin ligase found to be
involved in T-cell activation(65). RNF125 participate on a negative regulatory loop
circuit for IFN production(66). Other genes with SNPs identified at P value threshold of
<10-6 for the interaction analyses, included OSBPL1A, AK297683, IGF2BP3, and
H3F3C. Only IGF2BP3 may be linked easily to SCZ hence previous studies
suggested a role for Insulin-Growth Factor 2 in the disorder and IGF2BP3 was also
found to impact neuronal differentiation in mice(67, 68).
Considering both set of analyses, several of the genes we uncovered were
previously reported to be expressed or associated with immune cells (CAMK1D,
MAGI2, and FRMPD2), which possibly also suggests the origin of the Ndel1 found in
105
plasma(69). This can also potentially indicate that Ndel1 could be modulated by
inflammatory response, considering that Ndel1 was found altered in patients with
SCZ(70).
Our small sample size to perform GWAS analyses was expected to be the
major limitation of current work. However, enzyme levels may be a more robust
phenotype than psychiatric categorical phenotypes. For the Ndel1 results, the lack of
significant SNPs tagging the Ndel1 locus was not unexpected, as was the lack of
findings on Disc1 interacting partners. Ndel1 is essential for normal brain
development and severe disruption of the protein structure or reduction on its
physiological levels leads to intrauterine abortion(16). This could explain why effects
were largely attributable to the regulation by other genes or, rather, why Ndel1
enzyme levels appear to a more complex trait than, for example, angiotensin
converting enzyme (ACE), other oligopeptidase that share common peptide
substrates with Ndel1(71).
In a previous study, we worked on ruling out confounding factors, and showed
that Ndel1 levels were not correlated to the dose of antipsychotics, BMI or cigarette
smoking(25). Multiple ancestry admixture is a well know problem dealing with Brazilian
samples. For this reason, we used GCTA to generate kinship matrix using
information in the array to perform ancestry correction. It was not possible to apply
the same approach to the interactome analyses, but of note, our finding of best
correction to 4 principal components is in agreement with a report from Kang et
al.(29), where inclusion of 2 to 5 principal components had relevant impact on the
inflation factor and further augmenting did not result in better genomic control of
statistical measures. Finally, even with correction for clinical status and medication,
we also cannot rule out that some of the findings were driven by SCZ diagnosis.
Lastly, our genome-wide approach allowed us an unbiased investigation on
genetic influence on Ndel1 enzyme activity measures with new putative genes
possibly implicated in SCZ. Future larger studies focused on understanding the
involvement of such genes may help clarify the role of Ndel1 expression and action in
SCZ pathophysiology.
106
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TABLES
Male 56 (67.5) 60 (65.2)
>10a 24 (28.9) 27 (29.3)
Age, Mean Years 86 (34.92) 100 -34 -0.612 0.541
(32.5) 32 (34.8)
N (%) N (%)
Table 1. Sociodemographic characteristics.Patients(n=83)
Healthy Controls (n=92)
Statistics
Test value
0.011
a = years of education
Educational level <10a 59 (71.1) 65 (70.7)
0.753
0.004 0.950
Gender
p-value
Female 27
113
SNP Region Beta P-value Gene rs10184029 2p24 -0.535205 2.78 x 10-6 No geners4495787 10p13 -0.322829 2.88 x 10-6 CAMK1Drs63439260 10p13 -0.330936 2.91 x 10-6 CAMK1Drs1190669 18p11 -0.335355 3.37 x 10-6 No geners564499 18p11 -0.329733 3.46 x 10-6 No geners515503 18p11 -0.334274 4.39 x 10-6 No geners62111833 2p24 -0.642179 4.84 x 10-6 No geners72787916 2p24 -0.59675 5.39 x 10-6 No geners7902494 10p13 -0.307938 5.53 x 10-6 CAMK1Drs2704367 2q24.3 0.29847 5.69 x 10-6 No geners2615325 2q24.3 0.298237 5.79 x 10-6 No geners8041484 15q24 -0.36779 5.87 x 10-6 No geners17439060 7q21 0.3279 6.12 x 10-6 MAGI2rs2941397 6p21 -0.37646 6.30 x 10-6 No geners17439102 7q21 0.299595 6.69 x 10-6 MAGI2rs10906183 10p13 -0.31853 6.76 x 10-6 CAMK1Drs1075587 8p21 -0.344483 7.22 x 10-6 No geners59405048 15q12 -0.363503 7.23 x 10-6 GABRG3rs140459790 15q12 -0.354705 7.86 x 10-6 GABRG3rs35767880 8p21.1 -0.324939 9.17 x 10-6 CCDC25rs4887557 15q12 -0.365408 9.51 x 10-6 GABRG3
Table 2. Top Results for genome-wide investigation of Ndel1 plasma
114
SNP Region Beta P-value Geners4805560 19q12 -1.92 2.43 x 10-7 ZNF536rs7260487 19q12 -1.92 2.43 x 10-7 ZNF536rs4838399 10q11 -1.461 6.06 x 10-7 FRMPD2rs1326971 10p12 -1.103 1.36E x 10-6 AK297683rs156418 7p15 -1.172 1.90E x 10-6 IGF2BP3rs12477596 2q36 -1.159 1.99E x 10-6 No geners6972615 7p21 -1.269 2.09E x 10-6 THSD7Ars2006768 18q12 1.132 3.47E x 10-6 RNF125rs4800563 18q11 1.081 7.77E x 10-6 OSBPL1Ars336281 18q12 1.169 7.80E x 10-6 RNF125rs11051595 12p11 -1.009 9.06E x 10-6 H3F3Crs16948509 15q25 -1.039 9.48E x 10-6 No gene
Table 3. Top results for genome-wide results for Ndel1 plasma enzyme activity/clinical status interaction.
115
FIGURES
116
5.3. ESTUDO 3: ACE I/D genotype-related increase in ACE plasma activity is a better predictor for schizophrenia diagnosis than the genotype alone
Authors: Ary Gadelha1, Camila M. Yonamine2, Vanessa K. Ota3, Vitor Oliveira4, João
Ricardo Sato5, Sintia I. Belangero1,3, Rodrigo A. Bressan1, Mirian A.F. Hayashi2*
Affiliations: 1 Programa de Esquizofrenia (PROESQ) - Departamento de Psiquiatria, UNIFESP, São Paulo, Brazil 2 Departamento de Farmacologia, UNIFESP, São Paulo, Brazil 3 Departamento de Morfologia e Genética, UNIFESP, São Paulo, Brazil 4 Departamento de Biofísica, UNIFESP, São Paulo, Brazil 5 Center of Mathematics, Computation and Cognition, Universidade Federal do ABC, Santo André, Brazil. *Corresponding author: Mirian A. F. Hayashi, Ph.D. Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua 3 de maio 100, Ed. INFAR, 3rd floor, CEP 04044-020, Tel +55-11-5576 4447/FAX +55-11-5576 4499, São Paulo, Brazil; e-mail: [email protected] or [email protected] Abbreviations: SCZ, Schizophrenia; ACE, Angiotensin I-Converting Enzyme; RAS, Renin Angiotensin System; RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism; TR, treatment-resistant; non-TR, non-treatment-resistant; HCs, healthy controls; ROC, receive operating characteristic; FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer; BDs, bipolar disorders; ELISA, enzyme-linked immuno assay; PANSS, Positive and Negative Syndrome Scale; SCID, Structured Diagnostic Interview; CGI, Clinical Global Impression; GAF, Global Assessment of Functioning; IPAP, International Psychopharmacological Algorithm Project; LSD, Fisher’s Least Significant Difference; TR, treatment-resistant; non-TR, non-treatment-resistant; PCR, polymerase chain reaction; ROC, receive operating characteristic; AUC, area under the curve; BMI, Body Mass Index; SPSS, Statistical Package for the Social Sciences; CSF, cerebrospinal fluid. Keywords: schizophrenia, ACE, enzyme activity, oligopeptidase, genotype.
117
ABSTRACT Background: Angiotensin-I converting enzyme (ACE) is a key component of
the Renin Angiotensin System (RAS). Although the several contradictory data, ACE
has been associated with schizophrenia (SCZ) pathophysiology. Here the ACE
activity of SCZ patients and healthy controls (HCs), and its possible correlations with
the ACE polymorphism genotype and symptomatic dimensions, was investigated.
Methodology: ACE activity of 86 SCZ patients and 100 HCs paired by age,
gender and educational level was measured, using the FRET peptide substrate and
the specific inhibitor lisinopril. The ACE insertion/deletion (I/D) genotypes were
assessed by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) technique.
Results: Significant higher ACE activity was observed in SCZ patients
compared to HCs (t = -5.09; p < 0.001). The area under the receive operating
characteristic (ROC) curve was 0.701. Mean ACE activity levels were higher for the
D-allele carriers (F = 5.570; p = 0.005), but no significant difference was found
among SCZ patients and HCs for genotypes frequencies (Chi-squared = 2.08; df = 2;
p = 0.35). Interestingly, we found that the difference between the measured ACE
activity for each SCZ patient and the expected average mean value for each
respective genotype group (for control subjects) was a better predictor of SCZ than
the ACE dichotomized values (high/low) or ACE I/D.
Conclusion: Our results suggest that higher levels of ACE activity are
associated with SCZ with stronger impact when the genetic background of each
individual is considered. This may explain the heterogeneity of the results on ACE
previously reported.
118
INTRODUCTION
The Renin-Angiotensin System (RAS) was classically characterized as the
principal regulator of the systemic blood pressure(1). Angiotensin I-Converting
Enzyme (ACE) has a central role in this system by producing the angiotensin II, one
of the main effector of RAS. The interest in RAS, beyond its classical functions, was
renewed by the identification of several RAS effectors in different human tissues,
especially in the brain(2-4).
Brain RAS has been implicated in several functions, including regulation of
cerebral blood flow and cerebroprotection, stress, depression, seizure, alcohol
consumption, memory consolidation, and possible roles in the etiology of Alzheimer’s
and Parkinson’s diseases was also suggested (as reviewed by Wright and
Harding(5)). Both ACE and angiotensin receptors were identified in dopaminergic
neurons of basal ganglia(6). Significant decreased dopamine release determined by
ACE inhibitors was also demonstrated(7, 8). Therefore, the interaction with the
dopaminergic system suggests that RAS and ACE are both promising targets for
schizophrenia (SCZ) investigations.
The insertion/deletion (I/D) polymorphism in the 16th intron of ACE gene was
shown to influence ACE activity levels(9). In SCZ, genetic association studies with
ACE investigated mainly the I/D polymorphism, and only two out of ten studies
showed significant major effects of I/D ACE genotypes in SCZ diagnosis(10, 11). One
study suggested the D allele of ACE gene as a protective factor for SCZ in a Spanish
sample(10), while other proposed the I allele as protective against the development of
SCZ and bipolar disorders (BDs) in a Turkish sample(11), suggesting the potential
influence of population stratification on the reported results. Baskan et al.(12)
described significant higher levels of serum ACE protein concentrations, determined
by enzyme-linked immunoassay (ELISA), in SCZ patients, but with no association to
SCZ diagnosis or I/D polymorphism genotypes. In other words, no significant
difference in serum ACE concentration could be observed according to the
genotypes(12).
The few studies addressing the potential role of ACE protein levels or activity
in SCZ have yielded inconclusive results, with no robust replication(13-16). None have
119
used the current available and more sensitive FRET substrates to detect the ACE
activity(17).
Therefore, our main objective here is to investigate whether ACE enzymatic
levels are different between SCZ patients and HCs in the Brazilian admixture
population using FRET substrates. Secondarily, we also wanted to evaluate if this
measure correlates with the symptomatic dimensions and ACE I/D polymorphism
genotypes.
MATERIALS AND METHODS Study participants Patients were recruited from an outpatient clinic, The Schizophrenia Program
(PROESQ) of Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP/EPM). Inclusion criteria
were: 1) age between 18 and 65 years-old; 2) fulfill Schizophrenia (SCZ) or
Schizoaffective Diagnoses; 3) at least one year of follow-up. Healthy control (HC)
volunteers were selected paired by age, gender, and educational level from a
governmental unemployment agency. First they were submitted to a phone screening
for psychiatric diagnosis and then they were invited for full psychiatric interview.
Inclusion criteria were: 1) age between 18 and 65 years-old; 2) no current or lifetime
psychiatric diagnosis; and 3) no family history of psychosis of any degree.
For both groups exclusion criteria were: 1) diagnosis of hypertension; 2) use of
any anti-hypertensive medication 3) doubt or lack of consensus on diagnosis after full
psychiatric interview.
Trained psychiatrists applied the Structured Diagnostic Interview (SCID), to
assess the psychiatric diagnosis; clinical assessment also included Positive and
Negative Syndrome Scale (PANSS), Calgary Depression Scale, Clinical Global
Impression (CGI), and Global Assessment of Functioning (GAF). A questionnaire
adapted from SCID screening questions was used to investigate family history of
mental disease.
120
The criteria proposed by Andreassen et al.(18) were used to assess remission.
Treatment resistance (TR) was defined following the International
Psychopharmacological Criteria (IPAP) [www.ipap.org].
At first, 92 SCZ patients agreed to participate and were initially enrolled, 2
were out of age range and were excluded. 102 HCs were initially enrolled and all met
the inclusion criteria. 4 SCZ patients and 2 HCs were excluded due to hypertension
diagnosis and/or use of anti-hypertensive. None was excluded by doubt or lack of
consensus on diagnosis. Thus, 86 patients (80 with SCZ and 6 with schizoaffective
diagnoses) and 100 HCs were included in the analyses. All the patients were in use
of at least one antipsychotic medication. 24 SCZ patients and 18 HCs reported
previous cannabis use, 1 patient reported previous use of cocaine and 2 HCs
reported use of other drugs (cocaine and amphetamine). No subject in the HC group
fulfilled the criteria for alcohol or drug dependence. No one in either groups reported
drug use in the two weeks before blood collection.
The interviewer inferred ethnic background and four groups were considered:
Caucasian, African, Native American (in this group we included Chinese and
Japanese ancestry), and a miscellaneous group (for the combinations of Caucasian
+ African, Native American + African, Native American + Caucasian). We opted to
group the Native-Americans and Asian descendants because the South American
Amerindian population shares more SNPs with Eastern Asian populations than
European or African populations(19).
This study was approved by the Research Ethics Committee of UNIFESP
[CEP No. 1883/10]. We obtained written informed consent from all participants
recruited and, clinical and laboratory investigations were strictly conducted according
to the principles expressed in the Declaration of Helsinki.
Blood samples Blood samples from all subjects were collected into heparin vacuum tubes (BD
Vacutainer®, BD, NJ, USA) for ACE activity measurements, and into EDTA vacuum
tubes (BD Vacutainer®) for ACE genotypes analysis. All blood samples collected into
vacuum tubes were kept at 4ºC for up to 12 h, or they were immediately centrifuged
at 1,500-2,000 x g, for 10-15 min, at room temperature, to recover the plasma that
121
were stored at -80°C until use. The stored samples were defrosted in wet ice, soon
before use.
Enzyme activity measurements Angiotensin-converting enzyme (ACE) activity in human plasma samples of
HC volunteers and SCZ patients were measured by a fluorimetric assay, using the
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) peptide substrate Abz-
FRK(Dnp)P-OH essentially as previously described(17). The plasma sample was
handled and prepared as described in Gadelha et al.(20).
DNA extraction and genotyping DNA was isolated from whole blood white cells using Gentra Puregene
(Qiagen, Germantown, MD) according to the manufacturer’s instructions. I/D ACE
genotyping was performed using the restriction fragment length polymorphism
(RFLP) technique. Primers and polymerase chain reaction (PCR) conditions are
available upon request.
Statistical analysis Variables distribution was first checked for Gaussian distribution using
Kolmogorov-Smirnoff tests for the whole sample and in each comparison group. For
measuring the mean differences on ACE activity between SCZ patients and HC
groups, we employed the Student's t-test. The possible associations of ACE activity
and variables that present non-parametric distributions were investigated using non-
parametric correlations (Spearman’s).
In order to verify the clinical usefulness of ACE activity measurements to
discriminate SCZ patients and HCs, we built a Receiver Operating Characteristic
(ROC) curve for SCZ patients/HCs condition as the outcome. Aiming to further
evaluate the applicability of ACE activity to diagnosis, we dichotomized it using the
median value for the whole sample. Then logistic regression models were fitted
considering the clinical condition as the dependent variable, ACE activity
122
dichotomized as predictor and, age and sex as covariates. Nagelkerke R-square was
used to report overall model variance explained in the logistic regression model.
Significance was defined at p< 0.05.
RESULTS The distribution of patients according to age, gender, educational level or
ethnic background was comparable to that of the health controls (HCs, Table 1). ACE
activity levels did not deviate from normal distribution in the whole sample or in each
group (Kolmogorov-Smirnoff p-values > 0.05). ACE activity levels also did not
correlate to age (Spearman's Rho = 0.034; p = 0.65) nor differ between genders (t =
1.09; df = 184; p = 0.275), high/low educational level (t = 1.3; df = 184; p = 0.21), and
ethnic background (F = 0.545; df = 3; p = 0.652).
Patient's enzymatic mean values (0.0105 µM/min) were significantly higher
among patients compared to HCs (0.0078 µM/min) (t = -5.1; p < 0.0001) (Fig. 1). A
non-parametric correlation to ACE enzymatic activity showed no significant
correlation for any dimension (data not shown) in Positive and Negative Syndrome
Scale (PANSS) for a Brazilian sample(21). We also looked for relation to severity
using Clinical Global Impression (CGI) and Global Assessment of Functioning (GAF)
values, and no significant correlation to ACE activity was found. There were no
significant mean value differences between treatment-resistant (TR) and non-
treatment resistant (NTR) patients (Z = -0.359; p = 0.72), defined following the
International Psychopharmacological Criteria (IPAP) [www.ipap.org].
For the 24 HCs and 27 SCZ patients who reported current smoking, no
significant correlation was found between ACE activity levels and Fägerstron Nicotine
Dependence Scale total score (Spearman's rho = -0.131; p = 0.543, and Spearman's
rho = -0.173; p = 0.388, respectively). The Body Mass Index (BMI) values were
available for 42 patients, as they were also participating in a clinical genetics study at
the same day of blood collection. For them, no significant correlation between BMI
and ACE activity was observed (Spearman's rho = 0.134; p = 0.397). Using all
subjects, we additionally tested whether there were differences for ACE enzymatic
levels among the distinct ethnic groups and no significant difference was observed
123
(Kruskal-Wallis Chi-squared = 0.445; df = 3; p = 0.931). No significant correlation was
also found among the SCZ patients for duration of illness (Spearman's rho = 0.057; p
= 0.599), age of onset (Spearman's rho = 0.073; p = 0.506) or dose in
chlorpromazine equivalents (Spearman's rho = -0.089; p = 0.415).
Receive operating characteristic (ROC) curve showed a significant effect of
ACE activity levels on diagnosis (p = 0.000003) with an Area Under the Curve (AUC)
of 0.701 (Fig. 2). Higher levels of ACE activity significantly increased the risk of being
a patient, with an Exp(B) of 3.74 95% CI 2.02 - 6.9 (p = 0.000026), corrected for age
and gender. The Nagelkerke Pseudo R square for this model was 0.13.
Genetic results ACE I/D polymorphism genotypes were in Hardy-Weinberg equilibrium (p >
0.05). No significant difference was observed between groups for genotype
frequencies (Chi-squared = 2.08; df = 2; p = 0.35). There was a significant influence
of the genotypes on the mean ACE enzymatic levels, with a significant higher mean
values observed for D/D subjects (mean = 0.0101 µM/min) compared to I/I subjects
(mean = 0.0073 µM/min) (F = 5.570; p = 0.005), and with intermediary values for I/D
subjects (mean = 0.0089 µM/min). Using Bonferroni post hoc correction, only the
difference for D/D vs I/I genotype mean values was significant (p = 0.003), either for
the SCZ patients or HC groups. There was no significant difference between the I/D
polymorphism genotypes for age, gender, educational level or genetic ancestry.
The inclusion of genotypes in the logistic regression model changed the
results, and the I/I genotype was significantly associated to SCZ diagnosis (B = 1.19;
p = 0.019; Exp(B) = 3.3 95% CI 1.2 - 8.9). The Nagelkerke Pseudo R square for the
model was 0.166.
We observed that, considering each genotype group, the differences of ACE
activity between patients and control mean values were higher for I/I (0.0040 µM/min)
compared to D/I (0.0020 µM/min) and D/D (0.0036 µM/min) genotypes (Fig. 3). To
further understand these results, we created a variable, namely delta-ACE, in which
for each individual we subtracted from the observed value of ACE activity the mean
value of ACE activity for the respective genotype group (i.e. if the individual was D/D,
the measured ACE activity value was subtracted by the D/D mean value of ACE
124
activity determined for control subjects). A significant higher mean delta-ACE value
was observed in patients compared to HCs (t = -5.428, p < 0.00001). To allow the
employment of the logistic regression model, delta-ACE values were grouped in two
groups by the median value. We then tested whether the delta-ACE values were a
better predictor for diagnosis. In all tested models, the findings suggest that the delta-
ACE variable was a better predictor than either the dichotomized ACE value or the
I/D polymorphism genotype alone. We used forward and backward models (the
Conditional, LR and Wald methods of logistic regression in the Statistical Package for
the Social Sciences (SPSS)), and the delta-ACE value was in the final model in all
analysis, while the other variables were either excluded or they did not remain
significantly associated to SCZ diagnosis. In the delta-ACE model, the Nagelkerke
Pseudo R square for gender and age was 0.166, and the delta-ACE was significantly
associated to SCZ diagnosis (B = 1.505; p < 0.001; Exp(B) = 4.5 95% CI 2.3 - 8.6).
Then, the results of the Nagelkerke Pseudo R for delta-ACE variable alone were
similar to those obtained including both the dichotomized ACE values and ACE
genotypes. Despite a higher mean value for delta-ACE in I/I genotype subjects, for
both SCZ patients and HC groups, there was no significant difference in delta-ACE
values among the genotypes considering the whole sample (F = 1.31; dF = 2; p =
0.274), the patients group (F = 2.82; dF = 2; p = 0.66), or HCs group (F = 0.01; df =
2; p = 0.999).
DISCUSSION Hereby we aimed to investigate the Angiotensin I-Converting Enzyme (ACE)
with a focus on plasma enzyme activity levels and its relationship to
clinical/confounding variables and I/D ACE genotypes. Our main results were: 1)
higher plasma ACE activity levels was observed in patients with schizophrenia (SCZ)
compared to healthy controls (HCs); 2) no significant correlation was found between
ACE activity levels with the symptomatic dimensions or global severity; 3) genotypes
were shown to influence the enzyme activity levels, but they did not significantly
predict diagnosis alone; 4) considering the genetic background, higher ACE activity
values increase the predictive power to SCZ diagnosis.
125
Our results presented here (Fig. 1) complies with the increased ACE activity
levels described by others in both cerebrospinal fluid (CSF)(16) and serum(12) of SCZ
patients compared to HCs. In contrast, other previous studies described reduced
levels of ACE protein concentration in postmortem brain tissues(22), and also reduced
levels of ACE activity in CSF(13, 14). Wahlbeck et al.(14) found an association between
ACE activity levels in CSF, and the use of antipsychotics, although in our analysis, no
correlation between plasma ACE activity and the doses of antipsychotics used by our
patients was observed. In contrast to the report by others for the brain and CSF in
which a significant association was found between ACE plasma activity and the
length of illness or age of onset(15, 22), we could not observe any correlation in our
present study. This discrepancy could be for instance due to the differences in the
method employed for the measurements, as the Fluorescence Resonance Energy
Transfer (FRET) substrate is far superior compared to those previously employed to
measure the ACE activity(17).
On the other hand, our genetic results are in accordance to the previously
described effects of I/D ACE gene polymorphisms on ACE activity levels, in which
higher ACE activity was also observed in D-allele carriers compared to I-allele carries
in a dose-response fashion. Interestingly, 7 out of the 9 previous studies investigating
the I/D polymorphism correlation with SCZ were negative(12, 23-28), while one reported
significant lower D-allele frequency in SCZ(10) and other reported significant lower I/I
genotypes(11). Taken together, our results are consistent with the majority of previous
studies, as we also did not find any significant association between I/D genotypes
alone and SCZ diagnosis.
In summary, it seems that the several works published up to now on ACE are
mainly contradictory partly due to the technical limitations of the employed method,
as the determination of the amount of ACE protein not necessarily represents linearly
the total enzyme activity, as demonstrated for other oligopeptidases(29). On the other
hand, the effects of I/D ACE gene polymorphisms on ACE activity levels seem to be
more consistent, as many groups, including ours, consistently reproduced these
data, although any significant association between I/D genotypes alone and SCZ
diagnosis could be found.
Interestingly, the addition of dichotomized ACE enzyme activity and I/D
genotypes to the model revealed a significant effect of I/I genotypes on the risk for
126
SCZ. This would suggest at first, an effect in opposite directions, as I/I genotypes are
reported in the literature to be associated with lower ACE activity levels, in the same
way as observed in our sample here. However, further investigation suggested that
this effect was better explained by the higher increase in the gap between the
observed ACE activity levels and the expected mean values based on each genotype
subgroup for HC subjects (Fig. 3).
At this point, our results suggest that some factor is affecting ACE activity
levels beyond the I/D ACE polymorphism genotypes, if one considers that the
average ACE activity levels are increased for all genotypes and this gradient is
generally preserved. Additionally, it also seems that the I/I genotype is more
vulnerable to this effect (due to a statistically non-significant trend), although the non-
significant difference on delta-ACE distribution for genotypes among the SCZ
patients suggests some caution on this interpretation. A major question relies on the
origin of the observed differences between patients and HCs. It can be either a
genetic effect driven by other ACE gene polymorphism or by the polymorphisms of
other gene(s), or simply due to environmental effects associated to SCZ
development or progression.
Interestingly, several studies suggested an involvement of Renin-Angiotensin
System (RAS) and ACE on cognitive performance, as improved cognition and
delayed dementia progression were associated to the use of ACE inhibitors(30-33).
Thus, considering that cognitive impairments are central features of SCZ(34), these
results might direct future studies on the ACE roles on cognition in SCZ patients.
Several limitations must be considered in the current set of analysis. We tried
to rule out the possible confounding factors, but as ACE is part of a homeostatic
system, under influence of several internal and environmental factors, some non-
measured variable can be responsible for the observed differences. With our current
data, no association with Body Mass Index (BMI), nicotine dependence and ethnic
background could be observed. Although we did not observe significant correlations
with antipsychotic doses of chlorpromazine equivalents (since all patients were using
medications), this association can not be completely ruled out. One concern to be
considered in the blood analysis is whether it really represents the brain functioning
or if it is only representative of peripheral effects. In a previous study, Wahlbeck et
al.(14) reported no association for CSF and blood ACE activity levels. Even
127
considering that the serum ACE activity levels do not correspond to those found in
brain or CSF, the understanding of other factors influencing our results may give
some insights about the SCZ physiopathology and the underlying mechanisms. It is
also possible that the ACE activity levels in blood indeed correlate somehow to the
brain functions.
ACE is often considered in the context of RAS, specifically regarding water
balance and blood pressure regulation. In a broader context, both ACE and RAS can
be viewed as stress response mediators, which could explain their relationship to
immune and neuroendocrine response and anxiety-related behaviors(2). Another
relevant issue is that ACE has other potential substrates, some of which were also
independently associated with SCZ, as for instance, substance P(23) and
neurotensin(35).
Therefore, ACE activity levels can represent either a biomarker of several
different processes underlying SCZ risk, or it is actually involved in the cascade of
events associated with SCZ-related phenotypes. For both hypotheses, future studies
may shed some light on SCZ pathophysiology.
ACKNOWLEDGMENTS This work was supported by the Brazilian Agencies: Fundação de Amparo
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) and Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). CMY receives a fellowship from
FAPESP (2012/08941-6). We also thank Dr Richard Karpel for the final revision of
the grammar.
CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflict of interest.
128
FINANCIAL DISCLOSURES Dr A. Gadelha reports having received PhD fellowship from CAPES
(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), while C.M.
Yonamine is currently supported by fellowship from FAPESP [Proc. No 2012/08941-
6]. Dr. JR Sato has research funding from FAPESP, while Drs. V Oliveira, RA
Bressan and Dr MAF Hayashi are all supported by FAPESP (Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo), CAPES and CNPq. Dr MAF Hayashi was also
recipient of a fellowship from Fullbright and FAP/UNIFESP, and actually also from
CNPq [Productiviy Research Fellow No 311815/2012-0]. Dr. RA Bressan has also
received lecture fees from Astra Zeneca, Bristol, Janssen and Lundbeck, with
research grants from private companies as Janssen, Eli Lilly, Lundbeck, Novartis,
and Roche, and Fundação Safra and Fundação ABADS. Dr Bressan is also a
shareholder of Radiopharmacus Ltda and Biomolecular Technology Ltda.
REFERENCES
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132
TABLES
% N N (%) Test value p-valueMale 66.3 57 67 67Female 33.7 29 33 33
>10a 27.9 24 29 29<10a 72.1 62 71 71
Age, Mean Years 34.56 86 33.94 100 -0.443 0.658
DD 22.4 17 32 32DI 55.3 42 50 50II 22.4 17 22.4 18
Caucasian 65.1 56 61 61African 4.7 4 14 14Native American 10.5 9 5 5Miscellaneous 19.8 17 20 20
Mean dose of antipsychotic Chlorpromazine equivalents (mg) 543.3+-380 86
Mean no. of hospitalizations 2.2+-3.1 86a=year of education*=76 patients with valid genotype data
2.082 0.353
Table 1. Sociodemographic characteristicsPatients(n=86)
Healthy Controls (n=100)
Ethnic background
Genotype*
Statisticsa
Gender 0.011 0.917
Educational level 0.027 0.869
6.136 0.105
133
FIGURES
Figure 1. Scatter plot for ACE activity measurements. Scatter plot for ECA activity
measurements of healthy controls (HCs) vs. SCZ patients. Patients showed significantly
higher ACE activity levels compared to HCs (p <0.0001).
134
Figure 2. Receiver operating characteristic (ROC) curve analyses. The area under the
ROC curve (AUC) was determined as 0.701. This curve combines the information of the true
positive rate and the true negative rate, and the AUC is a measure of the overall
discriminative power of ACE activity (not delta-ACE).
135
Figure 3. ACE activity levels x ACE I/D genotypes. Higher average ACE activity was
observed among SCZ patients (solid symbols) compared to healthy controls (HC) subjects
(open symbols) for all ACE genotypes, e.g. D/D (cycles), I/D (squares), and I/I (triangles).
136
5.4. ESTUDO 4: Angiotensin Converting Enzyme activity is positively associated with IL-17 levels in patients with schizophrenia
Authors: Ary Gadelha1,2,*, Camila M. Yonamine1,3, Marcela Nering3, Lucas Bortolotto Rizzo1,
Cristiano Noto1,2, Hugo Cogo-Moreira1, Antônio Lúcio Teixeira4, Rodrigo Bressan1,2, Michael
Maes5,6, Elisa Brietzke1, Mirian A. F. Hayashi1,3,*
Affiliations: 1. Interdisciplinary Laboratory of Clinical Neurosciences (LiNC), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brazil. 2. Schizophrenia Program (ProEsq), Departament of Psychiatry, UNIFESP, São Paulo, Brazil. 3. Departamento de Farmacologia, UNIFESP, São Paulo, Brazil. 4. Translational Psychoneuroimmunology Group, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazil . 5. Department of Psychiatry, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand. 6. IMPACT Research Center, Deakin University, Geelong, Australia. * Corresponding authors: Mirian A. F. Hayashi, Ph.D. Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP/EPM), Rua 3 de maio 100, Ed. INFAR, 3rd floor, CEP 04044-020, São Paulo, SP, Brazil; Tel +55-11-5576 4447/FAX +55-11-5576 4499; e-mail: [email protected] or [email protected] or Ary A. Gadelha, Ph.D. Departamento de Psiquiatria, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP/EPM), Ed. Pesquisas II, Rua Pedro de Toledo, 669, 3rd floor, CEP 04039-032, São Paulo, SP, Brazil; Tel +55-11-5576 4447/FAX +55-11-5576 4499; e-mail: [email protected] or [email protected] Abbreviations: RAS, Renin-Angiotensin System; ACE, angiotensin-I converting enzyme; SCZ, schizophrenia; Ang-I, angiotensin-I; Ang-II, angiotensin-II; ACEi, ACE inhibitor; ARB, angiotensin receptor blocker; FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer; MCP-1, monocyte chemoattractant protein-1; NF-kB, Nuclear Factor Kappa-B; IL, interleukin; TNF, tumor necrosis factor; IFN, interferon; GWAS, Genome-Wide Association studies; PANSS, Positive and Negative Syndrome Scale; SCID, Structured Clinical Interview for DSM-IV CGI, Clinical Global Impression; GAF, Global Assessment of Functioning; CBA, cytometric bead array; Treg, antigen-specific regulatory T cells; BMI, body mass index. Keywords: Angiotensin Converting Enzyme (ACE), Interleukin-17 (IL-17), Schizophrenia, Inflammatory response, Inflammation, Cytokine, Biomarker.
137
ABSTRACT
Previous studies of our group showed increased plasmatic enzyme activity
levels of Angiotensin-I Converting Enzyme (ACE) in schizophrenia (SCZ) patients
compared to healthy controls, which were also associated to poor cognitive
functioning. The ACE main product angiotensin II (Ang-II) has well-known pro-
inflammatory properties. Activated immune-inflammatory responses in SCZ and their
association with disease progression and cognitive impairments are also well
described. Therefore, we examined here the ACE enzymatic levels association to
inflammatory mediators in SCZ patients. In this study, the ACE activity and immune-
inflammatory markers of 33 SCZ patients and 92 healthy controls were measured in
blood samples. Non-parametric correlations were used to investigate the association
of the enzyme activity and the peripheral levels of cytokines as interleukins, tumor
necrosis factor (TNF-α), and interferon (IFN-γ). Although no significant correlations
could be observed for ACE activity and measured cytokines levels in healthy
controls, a significant positive correlation for ACE enzymatic activity and IL-17a levels
was observed in SCZ patients. Correcting for gender did not change these results.
Moreover, a significant association for ACE activity and IFN-γ levels was also
observed. To our knowledge, this is the first study to show a significant association
between higher ACE activity and the levels of cytokines, namely IL-17a and IFN-γ, in
patients with s SCZ.
138
INTRODUCTION
Renin-Angiotensin System (RAS) was classically described in the context of
water and pressure homeostasis regulation(1). Angiotensin-converting enzyme (ACE)
is a zinc-dependent carboxydipeptidil peptidase responsible for the conversion of
angiotensin I (Ang-I) to the hypertensive peptide angiotensin II (Ang-II), and it was
therefore considered as the key element of RAS. More recently, some authors
proposed the redefinition of RAS as a stress-response system, as it is extremely
relevant to sustain homeostasis with actions on blood pressure, behavior and
immune-regulatory system(2).
The relevance RAS in brain has been recently underscored due the
association with neurodegenerative diseases, including Parkinson’s and Alzheimer’s
diseases. Several lines of evidence also support a role for RAS in schizophrenia
(SCZ), including the modulatory effects of RAS on brain dopamine pathways(3, 4), and
on neurodevelopment and synapse plasticity(5). The several studies addressed to
study the ACE role in SCZ produced conflicting results. Most of them suggested a
higher ACE levels in plasma and cerebrospinal fluid (CSF) of SCZ patients compared
to healthy controls(6, 7). Recently, we confirmed higher ACE activity levels in SCZ
patients compared to healthy controls and that this difference was better understood,
but not fully explained, when ACE gene Insertion/Deletion polymorphic genotypes
were considered, what can partially explain the previous apparent contradictory
findings(8). However, in which way this higher ACE level correlates to other processes
related to SCZ pathophysiology is still not clear.
There is now evidence that the activated immune-inflammatory pathways may
play a key role in the pathophysiology of SCZ(3-5). Cytokine levels abnormalities were
found in the peripheral blood and CSF of patients with SCZ(9, 10), and also in their
relatives(11). Additionally, Genome-Wide Association studies (GWAS) in SCZ have
consistently identified the polymorphisms of major histocompatibility complex genes
among the top hits for the comparison with control samples(12). Taken together, it
seems that patients with SCZ present a pro-inflammatory monocytic M1 profile, and
an imbalance in Th1 and Th2 cells.
Interestingly, besides its primary known hypertensive activity, Ang-II also plays
roles as endogenous pro-inflammatory molecule(13). In fact, Ang-II infusion elevates
139
the synthesis and concentrations of Tumor Necrosis Factor (TNF-α), interleukin-6 (IL-
6), and the chemokine named monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), which
elevates the tissue levels of Nuclear Factor Kappa-B (NF-kB) and the inflammatory
cell infiltration(13). On the other hand, the ACE inhibitor quinapril inhibits the renal
overexpression of TNF-α(14), which may be explained by the suppression of the Ang-
II production.
Therefore, our objective in the present work is to evaluate the possible
correlation between ACE activity and the immune-inflammatory mediators in patients
with SCZ. Our hypothesis is that there is a positive correlation between ACE levels
and the pro-inflammatory mediators in individuals with SCZ, which were shown to
have both imbalanced immune-inflammatory response and higher ACE activity levels
compared to healthy controls(3-5, 13).
MATERIAL AND METHODS This study was approved by Research Ethics Committee of UNIFESP [CEP
No. 1883/10]. Written informed consent was obtained from all participants recruited
and, clinical and laboratory investigations were strictly conducted according to the
principles expressed in the Declaration of Helsinki.
Study participants This sample is part of a larger sample enrolled to multimodal research on
Schizophrenia(8, 15). Patients were recruited from an outpatient clinic The
Schizophrenia Program (PROESQ) of Federal University of São Paulo (Universidade
Federal de São Paulo, UNIFESP). The inclusion criteria were: 1) aged between 18
and 65 years old; 2) a diagnosis of schizophrenia (SCZ) or schizoaffective disorder
according to DSM-IV criteria; and 3) at least one year follow-up. Healthy control
volunteers were selected from a governmental unemployment agency and were
matched for age, sex and educational level with the patients. The controls were first
submitted to interview by phone, which allowed the screening for psychiatric
diagnosis, and then they were invited to attend the research center for a full
140
psychiatric interview. The inclusion criteria for the healthy controls were: 1) aged
between 18 and 65 years old; 2) no current or lifetime psychiatric diagnosis
according to DSM-IV; 3) no family history of psychosis (first, second or third degree).
Additional exclusion criteria for both groups were: 1) diagnosis of arterial
hypertension; 2) use of any anti-hypertensive medication, even those prescribed for
other reasons, e.g. propranolol for tremor; 3) known acute and chronic medical
conditions associated with an imbalance in immune system, including infections (e.g.
HIV), allergic reactions, pregnancy, the postpartum period, rheumatic disorders, and
using medications with immunomodulatory effects such as non-steroidal anti-
inflammatory drugs, corticosteroids and immunosuppressants; 4) reported current
abuse of alcohol or use of any drug; 5) lack of consensus on the diagnosis. These
criteria led us to enroll 33 SCZ patients and 92 healthy controls. No patient or healthy
control with available measure on ACE activity or on immune-inflammatory
biomarkers was excluded by any of the above-mentioned criteria on current
analyses. The Structured Diagnostic Interview, according to DSM-IV diagnosis
(SCID), was applied by trained psychiatrists to assess axis I DSM-IV diagnosis. A
questionnaire adapted from SCID screening questions was used to investigate family
history of mental disease. The clinical assessment for patients also included Positive
and Negative Syndrome Scale (PANSS), Calgary Depression Scale (CDS)(16),
Clinical Global Impression (CGI)(17), and Global Assessment of Functioning (GAF).
For the diagnosis, we used all available information, including medical records. From
the total of included patients, 31 fulfilled criteria for SCZ and 2 for schizoaffective
disorders (both diagnosis were analyzed together). Considering mood disorders, 23
did not fulfill criteria for any disorder, 5 patients were currently depressed and other 5
fulfilled for at least one previous depression episode. Considering alcohol/drug abuse
or dependence, 1 patient fulfilled criteria for alcohol dependence in the past, and 3
for drug dependence in the past. For any doubt about the diagnosis, even for
subtypes, the interview was reviewed by 2 other trained psychiatrists. In all cases a
consensual diagnosis was achieved.
141
Blood samples
Blood samples were collected from all subjects into heparin vacuum or dry
tubes BD Vacutainer® (BD, NJ, USA). The samples were kept at 4ºC, and they were
immediately centrifuged at 1500-2000 x g for 10-15 min at room temperature to
recover the plasma or serum, which were then stored at -20°C or -80°C until use, for
enzyme activity and inflammatory markers measurements, respectively. The plasma
and serum were carefully removed with a transfer pipette for not disturbing the white
blood cells layer or the clot. Although the suggested procedure is to fractionate the
blood as soon as possible after collection, some samples were centrifuged up to 24 h
after blood collection with no detectable influence in the measured enzymatic activity.
The stored samples were defrosted placing the tubes in wet ice soon before the
activity measurements as follows.
ACE activity measurement Angiotensin-converting enzyme (ACE) activity in human plasma samples of
healthy control volunteers and SCZ patients were measured by a fluorimetric assay
using the Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) peptide substrate Abz-
FRK(Dnp)P-OH(18). Hydrolysis of the substrate [10 µM], at 37ºC, was monitored by
measuring the fluorescence in a Shimadzu F-7000 spectrofluorometer at λem = 420
nm and λex = 320 nm. A 96-wells plate containing 100 µL of substrate solution [50
mM Tris pH 7.4 and 100 mM NaCl buffer] in each well was placed in a
thermostatically controlled cell compartment for 5 min, before the addition of the
plasma samples. The increase in the fluorescence (determined as AFU, arbitrary
fluorescence units) with time was continuously recorded for 5-10 min, both in the
absence and in the presence of the ACE inhibitor lisinopril (Sigma Aldrich Corp., St.
Louis, MO, USA). The measured ACE activity is the rate of hydrolysis in the absence
of the specific inhibitor minus the rate determined in the presence of the inhibitor.
142
Immune-inflammatory markers measurement Human FlexSet kit for cytometric bead array (CBA) analysis (Becton &
Dickinson, San Jose, CA, USA) was used. We evaluated the cytokines IL-2, IL-4, IL-
6, IL-8, IL-10, IL-17a, IFN-γ and TNF-α, following the manufacturer’s instructions.
These biomarkers were selected considering our main hypothesis of association
between ACE activity and pro-inflammatory biomarkers, more pronounced among
patients. Considering our previous results and a review of the literature, those who
have been previously associated to SCZ or ACE were chosen(3, 19, 20).
Briefly, capture beads for each protein was centrifuged together (200 ×g for 5
min), re-suspended in plasma enhancement buffer and incubated for 30 min at room
temperature. After, 50 µL of this solution containing the capture beads was added to
the assay tubes. Lyophilized standards were reconstituted (15 min at room
temperature) for serial dilution. Individual samples from subjects or standards were
added (50 µL) to the assay tubes and incubated 1 h. Human PE detection reagent
(50 µL) was added to all assay tubes, which were incubated for 2 h at room
temperature. Then wash buffer (1 mL) was added to each assay tube, and
centrifuged at 200 ×g for 5 min. The supernatant was discarded, and 300 µL of wash
buffer was added to each assay tube again to re-suspend the bead pellet. Finally, all
samples and standards were acquired on the flow cytometer FACS CANTO II
(Becton & Dickinson - BD, Franklin Lakes, NJ, USA). The results were analyzed
using FCAP Array software (Becton & Dickinson).
Analysis of the data
Variables distributions were checked for normality using Kolmogorov-Smirnoff
test. None of the immune-inflammatory markers were in normal distribution and non-
parametric correlations (Spearman’s coefficient) were used. Chi-square tests were
used to compare categorical data. A corrected p-value for multiple comparisons was
calculated using Bonferroni correction and therefore analyses were carried out at p =
0.00625, considering the set of 8 biomarkers analyzed. Data analyses were
performed with the SPSS Version 20.0.
143
RESULTS In the current analyses 33 patients with schizophrenia (SCZ) and 92 healthy
controls were included. There were no significant differences in age, sex or
educational level between the two groups (Table 1). There were no significant
differences in angiotensin-I converting enzyme (ACE) activity or the immune-
inflammatory mediators levels for the comparison between males and females (data
not shown).
The correlations were run separately for each group (Table 2), showing that
the ACE enzymatic levels were not significantly correlated to any immune mediators
levels among the healthy control subjects. On the other hand, in the patient's group,
significant non-parametric correlations were found between ACE enzymatic and the
cytokines IL-17a (Spearman's rho = 0.502; p = 0.003) and IFN-γ levels (Spearman's
rho = 0.361; p = 0.039). For TNF-α levels (Spearman's rho = 0.341; p = 0.052), a
trend towards significance in the observed levels differences was noticed. Calculation
of partial correlation, with sex as covariate, did not change significantly the results for
controls or patients for IL17a (pcorr = 0.544; p = 0.001) and IFN-γ (pcorr = 0.408; p =
0.021) levels. Additionally, a linear regression model with ACE activity level as the
dependent variable and IL-17a and sex as predictors was performed. IL-17a levels
remained significantly associated to ACE levels (t = 3.54; p = 0.001), whereas sex
was not associated (t = -0.60; p = 0.555). The adjusted R square for this model was
0.25. Overall, only the correlation between ACE and IL-17 correlation in patients
survived to Bonferonni correction for multiple comparisons.
In order to further examine the results, we checked whether IL-17a was
correlated with other cytokines in each study group. In healthy controls, we found
significant correlations between IL-17 and IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-alpha, and IFN-
γ (supplemental material). In the patient group, correlations were found with IL-4
(Spearman's rho = 0.564; p = 0.001) and TNF-α (Spearman's rho = 0.395; p = 0.023)
levels. The multiple significant intercorrelations between the cytokines show that
using the p corrected value is over-conservative.
ACE activity and IL-17a levels were not significantly correlated to any
symptomatic dimension assessed through PANSS five-solution for a Brazilian
144
sample(21). Neither IL-17a nor ACE activity levels were significantly correlated to
Calgary Depression Scale total score.
Considering a non-parametric correlation, a power of 0.8 (Beta) and alpha of
0.05, our sample size could allow us to detect rho coefficients of 0.3. So the results
for IL-17a and IFN-gamma are in accordance to power estimates for our current
sample.
DISCUSSION
To the best of our knowledge, this is the first study to show a correlation
between plasma angiotensin-I converting enzyme (ACE) activity and the pro-
inflammatory cytokine IL-17a levels in patients with schizophrenia (SCZ), which was
not observed in healthy controls.
The Renin-Angiotensin System (RAS) is essential to maintain blood pressure
homeostasis. Both clinical and experimental studied have shown that pharmacologic
blockage of RAS has a protective effect on several organs, notably in heart and
kidneys(22). The product of the proteloytic cleavage of Angiotensin-I (Ang-I) by ACE is
the Angiotensin-II (Ang-II), which binds to type I Ang-II receptors to trigger
inflammatory response through activation of intracellular signaling cascade that up-
regulates the expression of several pro-inflammatory genes(23). Notably, ACE
inhibitors were shown to prevent immune-inflammatory response in vivo and in vitro,
decreasing the NF-kB activation and the secretion of cytokines by macrophages(24).
Naïve antigen-specific CD4+ T-cells differentiate into several subsets of T-
cells upon activation by antigen-presenting cells(25). T helper-17 (Th-17) cells have
been recently identified in addition to Th-1 and Th-2 cells as novel T-cell subsets
effector(26). Th-17 cells are characterized by production of the cytokines IL-17a and
IL-17f, and IL-21 and IL-22(27). IL-17 modulates the immune and autoimmune
responses by triggering the secretion of pro-inflammatory cytokines and
chemokines(28, 29). Th-1 and Th-17 cells responses usually develop simultaneously in
immune responses(30). Some evidences suggest that Th-17 can regulate the
induction and generation of Th-1 response through stimulation of IL-12 and IFN-γ
production(31).
145
Th-17 cells are activated, and with IL-17 plasma levels increased in a number
of autoimmune diseases(32, 33). Recent evidence suggests a role for Th-17/IL-17 in
immune-inflammatory responses in the brain, especially in the initial phases of
multiple sclerosis(34). In children with autism, a neuropsychiatric disorder with large
common genetic variance shared with SCZ(35), significant higher values of IL-17
concentration in serum compared to matched healthy controls were described(36).
Further, Th-17 cells have also been associated to other psychiatric conditions,
including depression(37) and generalized anxiety disorders(38).
Some recent studies showed an association, suggesting a putative role for Th-
17 response in SCZ. Ding et al.(39) reported increased Th-17 response in first episode
drug-naive patients with normal weight compared to health controls. In another study,
IL-17 was found significantly lower in patients in relapse(40). Based on results
obtained by a principal component analysis, Dimitrov et al.(41) suggested that the IL-
17 signaling pathway may play a central role for the observed correlation between
cytokines and the symptoms in SCZ. The finding that this correlation was only
significant in the patient group suggests that this association is only relevant in
conditions in which the immune system and RAS are dysregulated.
Interestingly, increased ACE activity levels are present in 75% of patients in
sarcoidosis, an autoimmune disease mediated by the imbalance Th-1/Th-17(42, 43).
However, there are only case reports linking sarcoidosis and SCZ(44, 45). Moreover,
another neuropsychiatric disease, namely Alzheimer's disease, the reported higher
ACE enzymatic levels, was also associated with increased Th-17 cell functions(46).
Drugs that limit Ang-II synthesis and/or its biological activity, such as the ACE
inhibitor (ACEi) lisinopril or angiotensin receptor blocker (ARB) candesartan,
respectively, result in the suppression of the Th-1 and Th-17 cytokine release, and in
the induction of antigen-‐ specific regulatory T-cells (Treg) by the modulation of the
NF-‐κB pathway(47).
Using partial correlation analyses, we also found that the IFN-γ was
significantly associated with ACE activity levels. This is of particular interest because
IFN-γ is a Th-1 marker and it is also part of the IL-17 signaling pathway.
Among the limitations to be considered, the small sample size could potentially
affect the replicability of our results. As this is a cross-sectional study, it is not
possible to determine whether the immune dysregulations induce the ACE induction
146
or that ACE activity level is able to affect the cytokine levels. Our healthy control
sample is not representative from Brazilian population or even the population of São
Paulo State. But the recruitment of unemployed volunteers was adopted to improve
the pairing with our sample of patients with SCZ. Efforts were done to exclude
potential confounders, but we cannot rule out the effect of potential biases, such as
nutritional or metabolic factors not appropriately measured or in which extend the
reduced sample size of the current study precluded additional analyses (e.g. caffeine
intake, physical activity levels, body mass index, cannabis use). In general, patients
were in use of 8 antipsychotics, most of them belonging to the second generation of
antipsychotics, and the small number of patients in use of each antipsychotic
precluded additional comparison. No significant correlation between antipsychotic
dose (in chlorpromazine equivalents) and ACE activity or immune-inflammatory
biomarkers was observed. However, to clarify the impact of antipsychotics on the
measures, additional studies on first-episode drug-naive patients should be
conducted. The differential pattern in the associations between IL-17 and other
cytokines also suggest that there are significant changes in the cytokine network
between patients and controls.
The findings of our study shed further light on potential new mechanisms that
may give novel insights into the pathophysiology of SCZ development and/or
progression, pointing out to the importance of immune-metabolic interactions in this
disease as widely explored also by others(48, 49).
In conclusion, further studies are needed to replicate the current findings in
larger samples in prospective design studies, and in different settings in order to
investigate the effects of IL-17a and ACE activity for disease progression.
ACKNOWLEDGEMENTS We are greatly thankful to the São Paulo Research Foundation (Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP) [2011/50740-5 for RAB and
2013/13392-4, 2009/17726-9 & 2003/00817-5 for MAFH, and 2009/51587-6 for both
RAB and MAFH] and the National Council of Technological and Scientific
Development (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -
147
CNPq) [477760/2010-4; 557753/2010-4; 508113/2010-5; 311815/2012-0;
475739/2013-2 for MAFH] for the financial support. We are also thankful to Robson
Lopes de Melo for the peptide substrate synthesis used in this work.
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Healthy Controls
N N Test value p-valueMale 27 60Female 6 32>10a 11 26<10a 22 66
Mean SDb Mean SD Test value p-valueAge, Mean Years 33 32.45 9.893 100 34.23 9.927 0.881 0.380ACE activity 33 0.0996 0.0039 92 0.00778 0.0035 -2.98 0.004Duration of disease Years 33 9.6 5.4GAF 33 49.87 16.5Total PANSS 33 63.74 16.7Antipsychotic dosec 33 542.93 361.54
Educational level
(n = 92)
3.163 0.075
0.3 0.584
Variables
Table 1. Sociodemographic and clinical characteristics
a=years of education; b=standard deviation; c=chlorpromazine equivalents; GAF=Global Assessment of Functioning
Patients(n = 33)
(%)(81.8)(18.2)(33.3)(66.7)
(%)
Statistics
(65.2)(34.8)(28.3)(70.3)
Sex
152
Spearman's rho p-value Spearman's
rho p-value
IL-2 0.259 0.146 0.059 0.575IL-4 0.178 0.322 0.082 0.436IL-6 0.299 0.092 0.070 0.510IL-8 0.253 0.163 -0.127 0.228IL-10 -0.228 0.203 -0.005 0.964IL-17 0.502* 0.003* 0.009 0.930TNF-α 0.341 0.052 0.039 0.710IFN-γ 0.361 0.039 0.119 0.260
Table 2. Non-parametric correlations between ACE enzymaticlevels and inflammatory markers.
MarkerHealthy Controls
* p-value < 0.05
Patients
Spearman's rho p-value Spearman'
s rho p-value
Positive .327 .084 .325 .086Negative .009 .963 .134 .489Excited .107 .581 -.034 .861Disorganization -.184 .340 -.017 .931Depression/Anxiet .308 .104 .149 .440
Table 3. Non-parametric correlations between IL-17 and ACE activity levels and PANSS symtpomatic dimension (df=29)
DimensionACE IL-17
Spearman's rho p-value Spearman'
s rho p-value
IL-2 0.269 0.131 0.365 <0.001IL-4 0.546 0.001 0.438 <0.001IL-6 0.078 0.666 0.280 0.007IL-8 0.231 0.204 -0.008 0.942IL-10 -0.016 0.931 0.433 <0.001TNF-α 0.395 0.023 0.429 <0.001IFN-γ 0.333 0.058 0.372 <0.001
Suppl. Table 1. Non-parametric correlations betweenIL-17 levels and inflammatory markers.
MarkerPatients Healthy Controls
* p-value < 0.05
153
5.5. ESTUDO 5: Convergent evidences from human and animal studies implicate Angiotensin I-Converting Enzyme activity in cognitive performance in Schizophrenia
Authors: Ary Gadelha1,#, Ana Maria Vendramini2,#, Camila M. Yonamine1,2, Marcela Nering2,
Arthur Berberian1, Mayra A. Suiama2, Vitor Oliveira3, Maria Teresa Lima-Landman2, Gerome
Breen4, Rodrigo A. Bressan1, Vanessa Abílio1,2, Mirian A. F. Hayashi1,2,*
Affiliations: 1. Integrated Laboratory of Clinical Neurosciences (LiNC) and Schizophrenia Program (ProEsq), Departamento de Psiquiatria, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brazil 2. Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brazil 3. Departamento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brazil 4. Medical Research Council Social, Genetic and Developmental Psychiatry Centre, Institute of Psychiatry, King's College London, London, United Kingdom. # both authors contributed equally to this work; *Corresponding author: Prof. Mirian A. F. Hayashi, Ph.D. Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Rua 3 de maio 100, Ed. INFAR, 3rd floor, CEP 04044-020, Tel +55-11-5576 4447/FAX +55-11-5576 4499, São Paulo, Brazil; e-mail: [email protected] or [email protected] Abbreviations: SCZ, Schizophrenia; NOR, novel object recognition; RAS, renin-angiotensin system; ACE, angiotensin I-converting enzyme; Ang I, angiotensin I; Ang II, angiotensin II; CSF, cerebrospinal fluid; FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer; HCs, healthy controls; CI, confidence interval; OR, odds ratio; PANSS, Positive and Negative Syndrome Scale; SCID, Structured Clinical Interview for DSM-IV; GAF, Global Assessment of Functioning; WCST, Wisconsin Card Sorting Task; SD, standard deviation; NIMH, National Institute of Mental Health; MATRICS, Measurement and Treatment Research to Improve Cognition in Schizophrenia. Keywords: angiotensin I-converting enzyme, schizophrenia, enzyme activity, plasma, memory impairment.
154
ABSTRACT
In schizophrenia (SCZ), higher angiotensin I-converting enzyme (ACE) levels
have been reported in patient’s blood and cerebrospinal fluid (CSF). Hereby, we
propose to explore whether the ACE activity levels are associated to cognitive
performance in SCZ. 72 patients with SCZ or schizoaffective disorder diagnosis, and
69 healthy controls (HCs) underwent a cognitive battery with parallel collection of
peripheral blood samples to measure ACE activity. Significant higher ACE activity
levels were confirmed in the plasma of SCZ patients compared to HCs (Student’s t =
-5.216; p < 0.001). ACE activity significantly correlated to Hopkins Delayed Recall
measures (r = -0.247; p = 0.004) and Hopkins Total (r = -0.214; p = 0.012). Subjects
grouped as high ACE activity (above average) had worse performance compared to
low ACE activity level group for Hopkins Delayed Recall measure, even after
correction for clinical condition, age, gender, and years of educations (p = 0.029).
The adjusted R squared for this final model was 0.343. Moreover, evaluation of the
cognitive performance of transgenic mice with three copies of ACE gene in novel
object recognition (NOR) test showed that animals with more copies of ACE gene
presented impairment in NOR (p < 0.05) compared to two copies wild-type animals.
The results observed in SCZ patients and animal model suggest both the association
of ACE to cognitive deficits in SCZ. This finding may support the evaluation of novel
treatment protocols and/or of innovative drugs for specific intervention of cognitive
deficits in SCZ envisioning concomitant ACE activity and behavior evaluations.
155
INTRODUCTION The renin-angiotensin system (RAS) is viewed as an important regulator of
blood pressure and body fluid balance, although many other functions in the central
nervous system have been related to RAS, including several associations with
psychiatric diseases and cognitive functions(1-6). Several lines of evidence support a
role for RAS in schizophrenia (SCZ). Firstly, the regulatory effects of RAS on brain
dopamine pathways(7, 8). Secondly, the specific activation of the Angiotensin Type 2
(AT2) receptor in neuronal cells is able to induce neurite outgrowth and elongation, to
modulate neuronal excitability and cellular migration, affecting therefore, the synapse
plasticity and neurodevelopment, as reviewed(9).Thirdly, the key component of RAS
that is the angiotensin I-converting enzyme (ACE), although primarily studied due to
its ability to convert angiotensin I (Ang I) into the hypertensive peptide angiotensin II
(Ang II)(10), is also capable to cleave peptides as neurotensin and substance P, which
were associated with SCZ, as independently reported by different groups(11-13).
The first study of ACE in SCZ reported a reduction in the enzyme activity in
the basal ganglia of post-mortem brain of SCZ patients compared to healthy controls
(HCs) that was not replicated later(14, 15). Also in studies of cerebrospinal fluid (CSF)
of patients, paradoxical findings can be found, as both reductions and increases in
ACE activity levels in CSF of SCZ patients were described(16, 17). Wahlbeck and
colleagues(18, 19) also suggested that ACE activity levels in CSF may be correlated to
the length of illness and to the use of antipsychotics. Finally, using a smaller sample,
Baskan et al.(20) reported a significant increase in ACE protein level in serum of SCZ
patients compared to HCs(18, 19).
The ACE gene, located on chromosome 17q23, has a well-studied
insertion/deletion (I/D) polymorphism resulting from the presence or absence of a
287-base pairs fragment in the 16th intron of ACE gene, in which the presence of D-
allele is associated with a higher ACE activity in serum(21, 22). In a recent report, we
showed that ACE activity levels in plasma were higher in patients with SCZ and the
differences between the observed ACE activity and the expected mean values of
each genotype groups were the best predictor for the clinical status (i.e. patient vs.
HCs)(23).
156
Interestingly, higher ACE activity levels were also previously reported in
Alzheimer's and Parkinson’s diseases, and several lines of evidence suggested a
role for RAS in cognitive functions, especially memory(1, 24, 25). Ang II administration
seems to interfere with cognitive performance in memory tests in animal models,
whereas ACE inhibitors and Angiotensin Type 1 (AT1) receptor antagonists improve
cognitive processing in both humans and animal models(24-27). There are several
evidences for the Ang II action in the CNS associated to cognitive functions, more
specifically to memory processing(28). However, the role of Ang II is still controversial,
with some studies suggesting an amnesic effect(29-31), while others propose that Ang
II is able to improve memory(32, 33).
Cognitive deficits are a central feature of SCZ and major determinants of
functional impairments, with more than 75% of patients depicting significant cognitive
impairment(34, 35). Several domains are affected, but the effects on executive function
and memory are usually the most prominent(36).
Therefore, in this study we aim to clarify whether ACE activity levels in plasma
of SCZ patients and HCs are associated to cognitive performance in a
neuropsychological battery. In addition, we also conducted behavioral evaluations of
cognitive function of transgenic mice carrying three copies of the ACE gene(37),
aiming to verify the influence of higher expression levels of the ACE in cognitive
processing, and ultimately aspiring the comparison of the data from human and
animal models.
MATERIALS AND METHODS
Study in patients with schizophrenia (SCZ) Study participants In this study, 72 patients with SCZ or schizoaffective disorder diagnosis and
69 healthy controls (HCs), aged from 18 to 65 years-old fulfilling the inclusion and
exclusion criteria and that completed the neurocognitive battery, were enrolled. All
patients were enrolled in the SCZ Community Treatment Program (PROESQ) run by
157
the Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) for at least one year. The
inclusion criteria were the diagnosis for SCZ or schizoaffective disorder according to
DSM-IV. This sample is part of a larger sample enrolled to multimodal research on
Schizophrenia. All the subjects that fulfilled inclusion and exclusion criteria for the
current analyses were included.
HCs volunteers were selected, matching by age, gender and educational level,
from a governmental unemployment agency. Controls were first screened by
telephone for psychiatric diagnosis and then invited to a face-to-face, full psychiatric
interview. Inclusion criteria were no current or lifetime psychiatric diagnosis, and
absence of family history of psychosis in first and second-degree relatives.
Exclusion criteria for both groups were a diagnosis of arterial hypertension,
use of any anti-hypertensive medication, e.g. propranolol, or lack of consensus
diagnosis.
The Structured Clinical Interview for DSM-IV (SCID) was performed by trained
psychiatrists to assess the psychiatric diagnosis. A questionnaire adapted from the
SCID screening questions for each diagnosis was used to investigate family history
of mental disease in first and second-degree, information was collected by patient
and accompanying relative. The clinical assessment for patients also included the
Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS) and Global Assessment of
Functioning (GAF). For the diagnosis, we used all available information including
medical records.
This study was previously approved by the Research Ethics Committee of
UNIFESP [CEP No. 1883/10]. Written informed consent was obtained from all
participants recruited and, clinical and laboratory investigations were strictly
conducted according to the principles expressed in the Helsinki Declaration.
Neuropsychological tests Eight tests, assessing different aspects of executive functions, working
memory, and verbal memory, were administered. IQ was also measured for all
subjects. In a previous study, the differences observed in the performance of these
tasks allowed a good discrimination between subjects with SCZ and HCs(38).Well-
158
established and widely used neuropsychological tests used in SCZ research were
employed here and they are listed and shortly described below:
Working memory / updating:
- Letter memory Task [adapted from Morris and Jones(39)] - single letters are
presented serially to the participants who are instructed to create a new string of
letters by mentally adding the most recently presented letter, dropping the 3rd letter
back, and then reciting the new string of 2 letters aloud. This instruction was given
and doubled-checked for understanding to guarantee the participants continuous
updating;
- Keep Track Task [adapted from Yntema(40)] - Initially, several target
categories are shown to the participants on the computer screen. Fifteen words,
including two or three examples from each of the target categories (animals, colors,
countries, distances, metals, and relatives) are verbally presented in both serial and
random orders, while the target categories remain at the bottom of the computer
screen. The subject is first asked to remember the last word presented in each of the
target categories, and then to say his/her answers aloud at the end of the trial;
Inhibition:
- Victoria Computerized Stroop Test(41) - the test is composed by three parts,
each comprising 24 stimuli. In the first part, the subject is asked to read the word that
appears in the computer display and the stimuli are the name of one of four chosen
colors (i.e. yellow, blue, green or red) written in capital black font. In the second part,
colored circles are displayed in the screen for 40 ms, and the participants has to
name the color of the circle as fast as they can, aiming to provide a baseline
measure for the analysis of errors and reaction times. In the third part, the subjects is
asked to read the color name, but the stimuli are divergent, i.e. the word is displayed
for 40 ms in a color different from the color names. The scores for reaction time and
for the number of correct answers are based on the subtraction between the mean
results obtained in the third and second parts of this test;
159
Set-Shifting Tasks
- Trail Making Test(42) - participants are asked to complete two tasks, one
requiring to draw lines to connect in a numerical sequence circled numbers, and the
other requiring to connect circled letters in alphabetical order. The outcome variable
was the mean of the total time taken to complete the two conditions minus the total
time taken to complete the last phase of the task;
- Plus-Minus Task [adapted from Jersild(43)] - three lists of 30 two-digits
numbers are presented. On the first, participants need to add 3 to each number. On
the second, they had to subtract 3. On the third, they are required to alternate
between adding and subtracting 3. The outcome is the mean of the total time taken
to complete the two first phases minus the total time taken to complete the third
phase;
- Letter-number Task [adapted from Rogers and Monsell(44)] – a letter-number
pair was presented in one of four quadrants on the computer screen. Subjects had to
indicate whether the number was odd or even, when the pair was presented in any of
the top two quadrants. Then, they had to indicate whether the letter presented in the
bottom two quadrants was a consonant or a vowel. Finally, stimuli were presented in
all the four quadrants, and the participants had to shift between these two types of
operations. The outcome measure was the mean of the total time taken to complete
two first phases minus the total time taken to complete the last phase;
Verbal learning and memory
- Hopkins Verbal Learning Task Revised (HVLT-R)(45) or Hopkins Delayed
Recall – participants were requested to read the same list of words three times, and
each time they were asked to repeat as many words as they could recall. In this
study we used only the word-list learning score. After 30 min, they were asked to
recall the list again; allowing the delayed recall or evocation measure;
Complex Executive Functions
- The Wisconsin Card Sorting Task (WCST) with 64 trials(46) – participants
were requested to match cards presented with any one of four reference cards
shown on a table. They were instructed to sort the cards into piles under the
reference cards, according to categories that must be perceived by them. Response
160
cards could be matched on color, shape, or number. Once the participant made 10
consecutive correct sorts, the sorting principle changed. The score of interest was
the number of the perseverative errors;
Non-verbal Intelligence Test
- The non-verbal intelligence task (R-1)(47) was developed to allow
measurement of intelligence in low literacy populations. This test is highly correlated
with the Raven's Progressive Matrices Test (r = 0.76, p = 0.001) and was chosen due
to the high frequency of illiteracy found in the population of Brazilians with SCZ.
Direction of Results
For Hopkins measures, higher values indicate better verbal learning and
memory retrieval. For all other tests, higher values indicate worse performance.
Blood samples Blood samples were collected from all subjects into sodium heparin vacuum
tubes BD Vacutainer® (BD Medical - Pharmaceutical Systems, Franklin Lakes, NJ,
USA). The samples were then centrifuged at 1,500-2,000 x g for 10-15 min, at room
temperature, to recover the plasma, which was then stored at -20°C in
microcentrifuge plastic tubes (Axygen Inc., Union City, CA, USA) until use. The
plasma was carefully removed with a transfer pipette for not disturbing the white
blood cells layer. Although the suggested procedure is to fractionate the blood as
soon as possible after collection, some samples were kept at 4°C up to 24 h after
blood collection and then centrifuged for plasma recovery, with no detectable
influence in the measured enzymatic activity (data not shown). The stored plasma
samples were defrosted in wet ice soon before the activity measurements as follows.
Activity measurements Angiotensin I-converting enzyme (ACE) activity in human plasma samples of
HC volunteers and SCZ patients were measured by fluorometry, using the FRET
peptide substrate Abz-FRK(Dnp)P-OH(48). The researcher responsible for the
161
measures was blinded for the group of the sample. Hydrolysis of the substrate [10
µM], at 37°C, was monitored by measuring the fluorescence in a Shimadzu F-7000
spectrofluorometer at λem = 420 nm and λex = 320 nm. A 96-wells plate containing
100 µL of substrate solution (50 mM Tris-HCl pH 7.4, and 100 mM NaCl buffer) in
each well was placed in a thermostatically controlled cell compartment for 5 min,
before the addition of the plasma samples. The increase in fluorescence (AFU,
arbitrary fluorescence units) with time was continuously recorded for 5-10 min, both
in the absence and in the presence of the ACE inhibitor lisinopril (Sigma Aldrich
Corp., St. Louis, MO, USA). The measured ACE activity is the rate of hydrolysis in
the absence of the specific inhibitor minus the rate determined in the presence of the
inhibitor. The average ACE activity in the human plasma was determined by
averaging the ACE activities of 3 (triplicate) measurements for each sample, and
then if these values variations were higher than 5% from each other, new
measurements (at least two more measures, e.g. duplicates) were performed to
assure that the final average for all samples used in the experiment were not due to
any technical influence.
Animal study Animals To investigate the role of ACE, adult male C57BL/6J mice genetically
engineered carrying a duplication of the ACE locus on chromosome 11 were used.
These mice carry three functional ACE gene copies (+/++ or 3-copies). Control
animals consisted of wild-type C57BL/6J mice (+/+or 2-copies). Identification of
genetically modified offspring was performed at 21 days of age, by PCR amplification
of DNA isolated from ear biopsies. All animals were housed under conditions of
controlled temperature (20-23°C) and lighting (12 h light/12 h dark cycle, lights on at
07:00 am). Food and water were available ad libitium throughout the experiments. No
randomization was used. All experiments were performed in accordance with the
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the USA National Institutes of
Health (Bethesda, MD, USA). All experiments with animals were approved by the
162
ethical committee of the Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), CEP No.
0336/12.
Behavioral tests Aiming to provide convergent evidences from both human patients and animal
model studies for the association between ACE activity and cognitive deficits, we
elected to the novel object recognition (NOR) test(49), which is a widely used model
for the investigation of short- and long-term memory performance.
This test is based on the spontaneous tendency of rodents to spend more time
exploring a novel object than a familiar one(50-52). The choice to explore the novel
object reflects the use of learning and memory recognition. During habituation, the
animals are allowed to explore an empty arena. Twenty-four hours after habituation,
the animals are exposed for 5 min to the familiar arena with two identical objects (A +
A) placed at an equal distance. After 1 h, the animal is returned to the apparatus,
which now contains the familiar object and a novel object (A + B) to test short-term
recognition memory. The next day, the mice are allowed to explore the open field in
the presence of the familiar object and a novel object (A + C) to test long-term
recognition memory. Animals were recorded by a video camera placed above the
apparatus and the time spent exploring each object was registered using the animal
video-tracking software Anymaze (Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA). The
researchers were blind to the genetic background of the animals.
Randomization was not performed since the animals with different genetic
background were not further divided into groups submitted to any additional
intervention.
Analysis of the data For measuring the mean differences between SCZ patients and HC groups, a
two independent samples t-test was used. No significant difference on variance was
found for the following measures between groups: ACE activity, Hopkins Total,
Hopkins Delayed Recall, Keep track test. Significant differences on variance were
observed for the other cognitive tasks (data not shown). For this reason, we choosed
163
non-parametric correlations (Spearman’s coefficient) to investigate the possible
associations of ACE activity and cognitive tests.
The whole sample was grouped based on the ACE activity levels in 3 groups
with similar number of subjects as: high (13.7 ± 2.0 nM/min), intermediate (9.9 ± 0.8
nM/min) and low ACE (5.4 ± 2.0 nM/min). We performed a General Linear Model to
compare the high and low groups, for age, sex, and IQ as covariates. The choice for
three groups was to allow the comparisons between the extreme groups(53). One
advantage for comparing extreme groups is that the overlap between the measures
can be reduced, and this would be inevitable if one employs two samples divided by
the whole sample median. Aiming to avoid the final result represents solely an effect
of distribution of case and control in the groups, clinical status was used as covariate.
In all adjusted models, we first included age, sex and IQ as covariates, and
then, the clinical condition was included to clarify whether the effects could be better
explained by the ACE activity levels or by case/control associated differences.
For the animal model results, normal distribution was confirmed by the
Kolmogorov-Smirnov test and the homogeneity of variance was revealed by the
Levene’s test. A repeated measures ANOVA was performed for the NOR (within
factor = object 1 and 2, and between factor = genetic background) followed by paired
sample T-test. The sample size estimation considered the following parameters:
under a ANOVA (repeated measures, within-between interaction [F-distribution], alfa
error probability, power (1 - β error probability), total sample size of 24 allocated in
two different groups (N=12), correlation among repeated measures at least equal 0.5
and nonsphericity correction equal 1 result to a minimum detectable effect size of
0.299. Such effect size is considered by Cohen(54) as moderate.
The p < 0.05 was used as a criterion for statistical significance. Sidak
procedure was adopted to estimate the corrected p-value for multiple comparisons.
Data analyses were performed with the Statistical Package for Social Science
(SPSS) Version 20.0
164
RESULTS Human study Subjects' description The mean age of the whole sample was 33.7 years-old (SD = 9.3). No
differences were observed for sex, age or educational level between Schizophrenia
(SCZ) patients and healthy control (HC) groups (Table 1). Mean duration of illness for
patients was 12.4 years-old (SD = 7.1).
Enzymatic activity of SCZ patients and HCs
ACE activity mean value was significantly higher for SCZ patients (11.0 ± 3.4
nM/min) compared to HCs (7.9 ± 3.7 nM/min) (Student’s t = -5.216; p < 0.001). No
significant correlation was observed between enzymatic levels and total PANSS
(Spearman's Rho = -0.92; p = 453) or global functioning (Spearman's Rho = 0.31; p =
801). No correlations in enzymatic levels were observed in the whole sample with
age (Spearman's rho = 0.057; p = 0.504), gender (t = 1.87; p = 0.064), years of
education (Spearman's rho = -0.056; p = 0.509). No significant difference on ACE
activity level was observed for smoking or number of cigarettes/day (Chi-squared =
4.9; p = 0.179).
Cognitive performance differences between SCZ patients and HCs Patients had non-significant lower IQ mean level. Most cognitive measures
showed significant better results for subjects from the HC group, with the exception
for the Letter Memory Test (which allow evaluating the updating) (Table 2).
Cognitive performance and ACE activity association Aiming to determine the influence of the measured enzymatic activity on the
cognitive performance, the statistical analysis was performed for both the whole
165
sample and for the separated groups. Considering the whole sample, significant
correlations for memory (Hopkins Delayed Recall; pcorr = -0.25; p = 0.003), verbal
learning (Hopkins Total; pcorr = -0.219; p = 0.010) and inhibition (Stroop; pcorr =
174; p = 0.042) correcting for age, gender and IQ were found. Only Hopkins Delayed
Recall remained significant considering p-value corrected for multiple testing (Sidak
method; p-value threshold 0.006). After addition of clinical condition (patient or HCs)
as covariate, the result was no longer significant (r = -0.76; p = 0.377) (results are
shown in Table 3). When performing correlations for each group separately, we did
not find any significant result (data not shown). The scatter plots of Hopkins Delayed
Recall and ACE activity clearly show marked differences in the pattern of distribution
between SCZ patients and HCs, which may explain the results for correlations
considering the whole sample and each group separately (Fig. 1).
Therefore, the sample was divided in 3 groups composed by similar number of
subjects as high, medium, and low ACE activity categories. Then we performed a
general linear model comparison between the extreme groups (high vs. low ACE
activity groups) for each cognitive test using IQ, gender, clinical status (patient or HC)
and age as covariates. In this set of analyses only Hopkins Delayed Recall remained
significant (p = 0.029), although a trend was observed for inhibition (p = 0.084). The
adjusted R squared for the final model with Hopkins Delayed Recall was 0.343. This
final result would not be considered significant considering the threshold for multiple
comparisons (p = 0.006). Therefore, at this point, aiming to better understand our
preliminary data in humans, we looked for data on an ongoing animal study
validation.
Animal study For novel object recognition (NOR), repeated measures ANOVA showed a
significant effect of novel objects (within subject) [F (1.22) = 11.692; p < 0.05] and an
interaction between this factor and the genetic background (between factor) [F (1.22)
= 12.166; p < 0.05]. Paired-samples T test showed that transgenic mice did not
preferentially explore the novel object in either sessions (at 1 and 24 h after
familiarization), whereas control group spent more time exploring the novel object at
166
1 h (Fig. 2A) and 24 h (Fig. 2B) after the training session [t (11) = -7.152, -4.485; p <
0.05, respectively]. During the training session, with two identical objects, no
significant difference in the time of exploration was observed (Fig. 2C).
DISCUSSION Our results suggest that angiotensin I-converting enzyme (ACE) may play a
role in cognitive deficits observed in patients with schizophrenia (SCZ). First, we
found higher ACE activity levels associated to a worse performance in verbal
memory test for a sample comprising patients with SCZ and healthy controls (HCs).
In parallel, we showed that mice with three copies of ACE genes displayed
impairment in one cognitive test associated to short and long-term memory.
Additionally, there was a significant difference on ACE activity and cognitive
performance on several tests between SCZ patients and HCs.
Cognitive functioning is a core feature of SCZ. Approximately 80% of patients
are clinically impaired in at least one cognitive domain(55). Cognitive performance was
the best predictor of functional outcome for patients with SCZ(56). Moreover, cognitive
decline starts before the onset of psychosis(57), suggesting that cognitive impairments
might reflect the neurodysfunction process that underlies SCZ development rather
than only disease progression processes(58, 59). Almost all cognitive functions are
impaired at heterogeneous levels in different studies for each cognitive domain, in
part by methodological issues, but most probably also due for true differences
between the patients(60). In such context, verbal memory is among the most impaired
cognitive domains in SCZ and unaffected siblings(36, 61). As expected, differences in
cognitive performance between SCZ patients and HCs were observed for most tests
employed here.
Hopkins Verbal Learning Test or Hopkins Delayed Recall is a three-trial list
learning, and free recall task comprising 12 words, in which 4 words are from
different semantic categories(45). The immediate recall can be considered a test for
verbal learning or short-term memory, whereas the later free recall is a long-term
verbal memory test, in which the information, after being out of consciousness flow
167
need to be retrieved. In our sample, the association of ACE was stronger for later
recall, suggesting an association to long-term memory.
The first issue to be considered is that ACE activity and Hopkins Delayed
Recall measures were both highly different between SCZ patients and HCs (Fig. 1).
Therefore the significant correlation observed between them can reflect a statistical
artifact. Nonetheless, the differences on cognitive tests performance of patients and
HCs, considering Hopkins Delayed Recall (t = -5.585) as parameter, were higher for
the Hopkins Total measure (t = -6.422) and similar to the Letter-number task (t = -
5.494). Thus, the results are not fully explained by the observed difference between
patients and controls. Furthermore, there is a known previous specific association
between ACE and memory(25). To better understand whether this was an effect of
being a patient of having higher ACE levels, the sample was divided in groups based
upon ACE activity levels, and we found that the Hopkins was significantly different
between high and low activity groups, even correcting for case status (p = 0.029).
The scatter plots of Hopkins vs ACE measures suggest that the marked difference
between patients and HC explain why the correlation is significant only with the
whole sample, whereas the extreme group comparison reinforce a true association of
ACE and memory, irrespective of clinical status. At this point, however, the results
with humans must be considered with caution, because some did not survive
considering the multiple comparison-adjusted p-value, what suggest not enough
power to detect true effects.
The novel object recognition (NOR) test is based on the spontaneous
tendency of rodents to spend more time exploring a novel object than a familiar one.
The choice to explore the novel object reflects the use of learning and recognition
memory(49). Transgenic animals with 3-copies showed a deficit in the recognition test
performed at 1 and 24 h after the training session, indicating short- and long-term
memory deficits (Fig. 2). It has been previously described that ACE activity in these
animals are increased to 144% compared to animals with 2 copies(37). This increase
is not accompanied by changes in blood pressure(37, 62). Our animal model adds
novelty to the current literature, as it shows that differences in ACE availability can
induce cognitive effects, what it is in good agreement with the results on ACE and
cognition in other neuropsychiatric diseases and different animal models. In fact,
treatment with ACE inhibitors, specially using centrally active compounds (i.e.
168
perindopril or captopril), reduced the risk to develop both Alzheimer's disease and
vascular dementia in patients(27, 63, 64), and this effect was significantly independent of
the indication due to hypertension(65). In Alzheimer's disease animal model,
perindopril, but not imidapril or enalapril (non-centrally active ACE inhibitors) reduced
the cognitive impairment, independently of its anti-hypertensive effects(66, 67). Using
the same NOR test, Yamada et al.(26) found that perindopril improves the cognitive
impairment in animal model of vascular dementia.
The precise mechanisms underlying the impaired cognition observed for 3-
ACE copy mice are not completely clear at this point. However, one might consider
the ACE roles in RAS, in which an increase in ACE activity could lead to an increase
of Ang II which, in turn, was associated in several studies to impairments in learning
and memory(29, 30, 68). The injection of Ang II in rat hippocampus inhibits the
enhancement of long term memory(69). In another study, the Ang II caused
impairment in spatial memory, affecting the acquisition, consolidation and recall of
memory, and significantly reduced acetylcholine levels without affecting the levels of
acetylcholinesterase(68).Furthermore, the use of AT1 blockers or ACE inhibitors were
shown to improve memory and reverse cognitive deficits in animals(29, 67). However,
as we did not measure the angiotensin compound levels, we cannot state that the
observed results are only attributable to RAS. In fact, ACE is a ubiquitously
expressed enzyme that can catalyze the cleavage of several other substrates known
to impact the cognitive performance, such as the substance P(70) and neurotensin(71).
Furthermore, animal studies have shown that ACE inhibition improves memory
function and prevents the impairment associated with cholinergic hypofunction,
oxidative stress and the deposition of β-amyloid(68, 72-74). One additional possibility is
through the association between ACE and dopaminergic neurotransmission. Indeed,
acute and chronic cocaine administration induced a significant increase of ACE
activity and gene expression in the rat prefrontal cortex and striatum, whereas ACE
inhibitors showed to decrease dopamine release(1, 2). Furthermore, both striatal and
prefrontal function have been associated to performance on Hopkins Delayed
Recall(75). Dopamine and glutamate systems manipulations can generate robust
impairments in NOR(52). So, the dopamine-RAS(76) interplay could explain ACE link to
SCZ and cognitive deficits, representing is a promising target to further investigation.
169
Overall, the different described pathways can link ACE and cognition, but how this
truly happens for SCZ needs to be further investigated.
Whenever investigating animal models, one major issue is whether the results
of the tests can be considered a correct approximation to the human behavior and
cognitive performance. At this point, the translational approach suggesting
convergence to memory impairments with higher ACE activity levels reinforce our
findings, although with some cautions. Otherwise, the National Institute of Mental
Health (NIMH) Measurement and Treatment Research to Improve Cognition in
Schizophrenia (MATRICS) proposed both the Hopkins Verbal Learning - Immediate
recall and NOR as part of consensual batteries, respectively in humans and animals,
for the cognitive investigation in SCZ(77, 78). Whereas the tests are suggested to
investigate SCZ, they do not measure exactly the same construct (verbal memory in
humans vs recognition memory in animals) and there are differences on timing of
outcome measures (30 min for Hopking Delayed Recall vs 24 h for NOR). So, there
are some limitations on the translational approach adopted that prevent us to
conclude, but not to suggest the association of ACE and memory in SCZ.
In conclusion, our study demonstrates a previously unreported association
between ACE and cognitive measures in patients with SCZ. We show then that the
modulation of ACE gene load is associated with cognitive performance in mice. While
previous studies have focused on Ang II, we provide here evidences that ACE can,
by itself, contribute to cognitive phenotypes. These results are especially relevant
considering that until now, there is no effective pharmacological treatment to
cognitive deficits in SCZ. Future studies would clarify whether centrally active ACE
inhibitors could be an add-on strategy on SCZ.
ACKNOWLEDGEMENTS We are greatly thankful to Prof. Eduardo Krieger for kindly providing the ACE
transgenic mice and we are also thankful to Robson Lopes de Melo for the peptide
substrate synthesis used in this work. We also express our gratitude to Vanessa
Kiyomi Arashiro Ota and Edna Lotess for their assistance with blood collection,
identification and storage control.
170
CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflicts of interest.
FUNDING This work was supported by the São Paulo Research Foundation (Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP) [2011/50740-5 for RAB
and 2013/13392-4 for MAFH, and 2009/51587-6 for both RAB and MAFH] and the
National Council of Technological and Scientific Development (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq) [477760/2010-4; 557753/2010-4;
508113/2010-5; 311815/2012-0; 475739/2013-2 for MAFH].
FINANCIAL DISCLOSURES Dr. A. Gadelha received PhD fellowship from CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), while Ana Maria Vendramini was a
recipient of a fellowship from CNPq. Mayra A. Suiama and C.M. Yonamine are
recipient of a fellowship from FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo). Drs. V Oliveira, Vanessa Abilio, RA Bressan and Dr. MAF Hayashi
are all supported by FAPESP, CAPES and CNPq. Dr. MAF Hayashi is also the
recipient of a fellowship from CNPq [311815/2012-0]. Dr. RA Bressan has also
received lecture fees from Astra Zeneca, Bristol, Janssen and Lundbeck, with
research grants from private companies such as Janssen, Eli Lilly, Lundbeck,
Novartis, and Roche, and Fundação Safra and Fundação ABADS. Dr. Bressan is
also a shareholder of Radiopharmacus Ltda. and Biomolecular Technology Ltda.
Marcela Nering, Arthur Berberian and Maria Teresa Lima-Landman have nothing to
declare.
171
REFERENCES:
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178
TABLES
N (%) N (%) Test value p-value
Male 50 (69.4) 44 (63.8)Female 22 30.6 25 31.2
Educational level
Years 72 (11.11) 69 (11.33) 0.478 0.634
Age, Mean Years 72 (33.19) 69 (34.22) -0.656 0.513
Gender 0.511 0.475
Table 1. Sociodemographic characteristicsPatients Healthy Controls Statistics(n=72) (n=69)
Cognitive Domain Test-value p-valueWorking memory / updating Letter memory Task -1.784 0.0740 Keep Track Task -4.117 <0.0001Inhibition Stroop -4.008 <0.0001Set-shifting tasks Trail Making Test -3.828 0.0002 Letter-number Task -5.494 <0.0001Verbal Learning/Memory Hopkins Total -6.422 <0.0001 Hopkins Delayed Recall -5.585 <0.0001Complex Executive Function WSCT -1.600 0.1100
Table 2. Differences in tests performance between patientsand healthy controls
Cognitive Domain Test-value p-value Test-value p-value
Working memory / updating Letter memory Task -0.035 0.682 0.026 0.767 Keep Track Task -0.138 0.108 0.000 0.998Inhibition Stroop 0.174 0.042 0.042 0.627Set-shifting tasks Trail Making Test 0.010 0.906 -0.086 0.318 Letter-number Task 0.118 0.169 -0.067 0.437Verbal Learning/Memory Hopkins Total -0.218 0.010 -0.008 0.925 Hopkins Delayed Recall -0.250 0.003 -0.076 0.377Complex Executive Function WSCT 0.021 0.803 -0.049 0.569
Corrected for Clinical Status
Table 3. Correlation between ACE enzymatic level and Results of Cognitive Tests (adjusted for age, sex and IQ)
179
FIGURES
Figure 1. Correlations for memory (evaluated by Hopkins measures) and ACE
activity in schizophrenia (SCZ) patients (A) and health controls (HCs) group (B). The
Hopkins plot with patients and HCs together allow to observe a clear trend for lower
Hopkins Delayed Recall and higher ACE activity in SCZ patients compared to HCs
(C).
180
Figure 2. Novel object recognition test. % of time spent exploring the familiar (object
A) and the novel objects (object B and C) for control (+/+) and transgenicmice for the
ACE gene (+/++).Object recognition after 1 (A) and 24 h (B) after training (C). As
appropiate, repeated measures ANOVA followed by paired sample T-test were
performed. Data are reported as mean ± SEM. * p <0.05 compared to the time
exploring the familiar object.
181
6. CONCLUSÕES
Os avanços na compreensão da esquizofrenia ainda não foram
acompanhados de impactos significativos nas taxas de prevalência e incapacidade
funcional(48). Grande parte dos estudos realizados investigaram aspectos isolados da
doença, dificultando a sua compreensão como um todo coerente. A pesquisa de
biomarcadores proteicos e genéticos buscando a integração de diferentes métodos
de investigação é considerada uma etapa fundamental para o avanço do campo(26).
Partindo desses princípios, foram investigados nos estudos apresentados o papel
das endopeptidases NDEL1 e ECA na esquizofrenia.
No Estudo 1, o objetivo foi investigar se a atividade enzimática da NDEL1
medida no plasma se apresentava diferente entre pacientes com esquizofrenia e
controles saudáveis. Foi observada uma redução significativa da atividade
enzimática da NDEL1 em pacientes, com menores valores para aqueles
identificados como resistentes ao tratamento com antipsicótico. O valor preditivo
para testes com utilidade diagnóstica ou prognóstica é promissor, mas ainda não
aplicável diretamente à clínica.
No Estudo 2, através de uma abordagem de varredura genômica, buscou-se
identificar quais genes poderiam estar associados à medida de atividade enzimática
da NDEL1. Considerando os resultados sugestivos (valor de p<10(-6), a análise de
varredura genômica sugeriu a associação de genes relacionados à resposta imune
(CAMK1D, CCDC25) e desenvolvimento cerebral (GABGR3, MAGI2 e ZNF536). Os
resultados implicam genes não previamente relacionados à NDEL1 e à esquizofrenia
e sugerem o potencial de utilizar medidas de biomarcadores periféricos nos estudos
de varredura genômica.
O Estudo 3 investigou se os valores da atividade enzimática da ECA e/ou os
genótipos para I/D do gene da ECA estavam associados ao diagnóstico de
esquizofrenia. Foi observado que o aumento da atividade enzimática da ECA esteve
associado ao diagnóstico de esquizofrenia e que os genótipos ,isoladamente, não.
Ao fazer uma avaliação conjunta das duas variáveis, pudemos observar que o
aumento da atividade enzimática em relação ao valor esperado para cada genótipo
do polimorfismo I/D foi um melhor preditor do que cada variável isoladamente. Esses
resultados sugerem que uma análise integrada de um biomarcador em sangue
182
periférico em relação à carga genética individual pode ser uma estratégia válida de
melhorar os valores preditivos para testes diagnósticos.
Como a Ang II foi associada em estudos prévios como indutor de resposta
inflamatória em condições não psiquiátricas, como a hipertensão, no Estudo 4,
investigamos se haveria uma associação entre mediadores inflamatórios e a medida
da atividade enzimática no sangue. As associações foram significativas apenas para
o grupo de pacientes, mas não entre controles saudáveis,. Os achados mais
consistentes foram para a IL-17. A via de resposta Th-17 foi apenas recentemente
caracterizada e foi associada a doenças autoimunes, como a sarcoidose, em que
também foi verificado aumento da atividade periférica da ECA. Esses resultados
sugerem uma nova via para a investigação da atividade da ECA e esquizofrenia.
A Doença de Alzheimer foi outra condição neuropsiquiátrica na qual o papel
da ECA foi amplamente estudado. De modo interessante, estudos independentes
demonstraram efeitos da modulação da função da ECA e Ang II em testes de
memória. No estudo 5 foi investigado usando uma abordagem translacional, a
associação entre atividade da ECA e cognição em esquizofrenia. Na amostra de
pacientes e controles foi observada uma correlação entre a atividade da ECA e o
desempenho em testes de memória; Camundongos com maior número de cópias do
gene da ECA também apresentaram pior desempenho em um teste que avalia
memória, mas não houve diferença para o teste de inibição pré-pulso, considerado
um paradigma importante em modelos animais para esquizofrenia. Esse resultado
pode sugerir que a ECA está relacionada mais especificamente a processos
associados ao declínio cognitivo observado em pacientes, mas não à doença como
um todo.
Aspectos relevantes podem ser ressaltados dos estudos realizados e do
trabalho associado à tese: 1) Patente depositada da medida de atividade enzimática
da NDEL1 como teste diagnóstico para esquizofrenia; 2) Indicação de novos genes
relacionados à função da NDEL1; 3) Primeira demonstração da associação da
atividade ECA e marcadores inflamatórios; 4) Primeira indicação da possível
associação da atividade da ECA e prejuízo de memória em pacientes com
esquizofrenia.
183
Os estudos apresentados também apresentam diversas limitações que foram
especificamente abordadas no texto correspondente. Como um todo, as limitações
estão relacionadas ao caráter exploratório das análises realizadas.
É importante ressaltar que considerando o caráter exploratório e as limitações
mencionadas, as conclusões devem ser compreendidas como preliminares e devem
ser replicadas em estudos desenhados especificamente para investigá-las. Por outro
lado, acreditamos que a investigação desses resultados contribuirá para uma maior
compreensão da fisiopatologia da esquizofrenia e esperamos que esse
conhecimento possa resultar na melhora da qualidade de vida de portadores da
doença e seus familiares.
184
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289. Friston KJ, Frith CD. Schizophrenia: a disconnection syndrome? Clin Neurosci. 1995;3(2):89-97. Epub 1995/01/01. 290. Pooresmaeili A, Bach DR, Dolan RJ. The effect of visual salience on memory-based choices. J Neurophysiol. 2014;111(3):481-7. Epub 2013/11/08. 291. Berridge KC, Robinson TE. What is the role of dopamine in reward: hedonic impact, reward learning, or incentive salience? Brain Res Brain Res Rev. 1998;28(3):309-69. Epub 1998/12/22. 292. Grace AA. Phasic versus tonic dopamine release and the modulation of dopamine system responsivity: a hypothesis for the etiology of schizophrenia. Neuroscience. 1991;41(1):1-24. Epub 1991/01/01. 293. Mizrahi R, Bagby RM, Zipursky RB, Kapur S. How antipsychotics work: the patients' perspective. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2005;29(5):859-64. Epub 2005/05/24.
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8. ANEXOS
8.1. Produção científica durante o doutorado
PUBLICAÇÕES
Artigos publicados ou aceitos em periódicos (artigos completos, brief reports e cartas ao editor)
1. GADELHA, ARY; MACHADO, MAURICIO F.M. ; YONAMINE, CAMILA M. ; SATO, JOÃO R. ; JULIANO, MARIA A. ; OLIVEIRA, VITOR ; BRESSAN, RODRIGO A. ; HAYASHI, MIRIAN A.F. . Plasma NDEL1 enzyme activity is reduced in patients with schizophrenia - A potential biomarker? Journal of Psychiatric Research, v. 47, p. 657-663, 2013. 2. GADELHA, ARY; OTA, VANESSA KIYOMI ; CANO, JOSE PAYA ; MELARAGNO, MARIA ISABEL ; SMITH, MARILIA A. C. ; DE JESUS MARI, JAIR ; BRESSAN, RODRIGO A. ; BELANGERO, SINTIA IOLE ; BREEN, GEROME . Linkage Replication for Chromosomal Region 13q32 in Schizophrenia: Evidence from a Brazilian Pilot Study on Early Onset Schizophrenia Families. Plos One, v. 7, p. e52262, 2012. 3. GADELHA, ARY; NOTO, CRISTIANO SOUZA ; DE JESUS MARI, JAIR . Pharmacological treatment of schizophrenia. International Review of Psychiatry (Print), v. 24, p. 489-498, 2012. 4. ARARIPE NETO, ARY GADELHA DE ALENCAR; BRESSAN, RODRIGO AFFONSECA ; BUSATTO FILHO, GERALDO . Fisiopatologia da esquizofrenia: aspectos atuais. Revista de Psiquiatria Clínica (São Paulo. Impresso), v. 34, p. 198-203, 2007. 5. HIGUCHI CH, ORTIZ B, BERBERIAN AA, NOTO C, CORDEIRO Q, BELANGERO SI, PITTA JC, GADELHA A, BRESSAN RA. Factor structure of the Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS) in Brazil – convergent validation of the Brazilian version. Rev Bras Psiquiatr. 2014; ahead of print. 6. PAN PM, SALUM GA, GADELHA A, MORYIAMA T, COGO-MOREIRA H, GRAEFF-MARTINS AS, ROSÁRIO MC, POLANCZYK GV, STRINGARIS A, GOODMAN R, LEIBENLUFT E, BRESSAN RA. Manic Symptoms in Youth: Dimensions, Latent Classes, and Associations with Parental Psychopathology. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry, 2014 (epub ahead of print). 7. VIEIRA MA, GADELHA AA, MORIYAMA TS, BRESSAN RA, BORDIN IA. Evaluating the effectiveness of a training program that builds teacher's capability to identify and appropriately refer middle and high school students with mental health problems in Brazil: an exploratory study. BMC Public Health 2014; 1-12. 8. ASEVEDO E, RIZZO LB, GADELHA A, MANSUR RB, OTA VK, BERBERIAN AA, SCARPATOL BS, TEIXEIRA AL, BRESSAN RA, BRIETZKE E. Peripheral interleukin-2 level is associated with negative symptoms and cognitive performance in schizophrenia. Physiol Behav 2014 (epub ahead of print).
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9. OTA VK, BELLUCCO FT, GADELHA A, SANTORO ML, NOTO C, CHRISTOFOLINI DM, ASSUNÇÃO IB, YAMADA KM, RIBEIRO-DOS-SANTO AK, SANTOS S, MARI JJ, SMITH MA, MELARAGNO MI, BRESSAN RA, SATO JR, JACKOWSKI AP, BELANGERO SI. PRODH polymorphisms, cortical volumes and thickness in schizophrenia. PLOS ONE 2014 (epub ahead of print). 10. ORTIZ BB, PITTA JC, GADELHA A, MATTOS NF, CUNHA JY, DE ARAÚJO FILHO GM, CORDEIRO Q, BELANGERO SI, BRESSAN RA. Comparing PANSS scores and corresponding CGI scores between stable and acute schizophrenic patients. Schizophr Res 2014; 152: 307-308 11. ORTIZ BB, DE ARAÚJO FILHO GM, ARARIPE NETO AG, MEDEIROS D, BRESSAN RA. Is disorganized schizophrenia a predictor of treatment resistance? Evidence from an observational study. Rev Bras Psiquiatr 2013; 35: 432-4. 12. SILVA L, RAMALHO DA SILVA PFR, GADELHA A, CLEMENT S, THORNICROFT G, MARI JJ, BRIETZKE E. Adaptation of the barriers to access to care evaluation (BACE) scale to the Brazilian social and cultural context. Trends Psychiatry Psychother 2013; 35: 287-291. 13. PAN PM, JESUS DR, GADELHA A, BRESSAN RA, CORRELL CU, MANSUR RB, ZUGMAN A, NOTO C, ASEVEDO EM, BRIETZKE E. Translation and adaptation of the Bipolar Prodrome Symptom Scale-Retrospective - Patient Version to Brazilian Portuguese. Trends Psychiatry Psychother 2013; 35: 62-75. 14. OTA VK, NOTO C, GADELHA A, SANTORO ML, SILVA PN, MELARAGNO MI, SMITH MD, CORDEIRO Q, BRESSAN RA, BELANGERO SI. Neurotransmitter receptor and regulatory gene expression in peripheral blood of Brazilian drug-naive first-episode psychosis patients before and after antipsychotic treatment. Psychiatry Res 2013, 30:1290-2. 15. COGO-MOREIRA H, CARVALHO CA, DE SOUZA BATISTA KIDA A, DE AVILA CR, SALUM GA, MORIYAMA TS, GADELHA A, ROHDE LA, DE MOURA LM, JACKOWSKI AP, DE JESUS MARI J. Latent class analysis of reading, decoding, and writing performance using the Academic Performance Test: concurrent and discriminating validity. Neuropsychiatr Dis Treat 2013; 9: 1175-85. 16. ASEVEDO E, GADELHA A, NOTO C, MANSUR RB, ZUGMAN A, BELANGERO SI, BERBERIAN AA, SCARPATO BS, LECLERC E, TEIXEIRA AL, GAMA CS, BRESSAN RA, BRIETZKE E. Impact of peripheral levels of chemokines, BDNF and oxidative markers on cognition in individuals with schizophrenia. J Psychiatr Res 2013; 47: 1376-82. 17. ASSUNÇÃO LEME IB, GADELHA A, SATO JR, KIYOMI OTA V, DE JESUS MARI J, MELARAGNO MI, DE ARRUDA CARDOSO SMITH M, NOGUEIRA BELANGERO SI, BRESSAN RA, JACKOWSKI AP. Is there an association between cortical thickness, age of onset, and duration of illness in schizophrenia? CNS Spectr 2013 Jun 6:1-7 [Epub ahead of print]. 18. ZUGMAN A, GADELHA A, ASSUNCÃO I, SATO J, OTA VK, ROCHA DL, MARI JJ, BELANGERO SI, BRESSAN RA, BRIETZKE E, JACKOWSKI AP. Reduced dorso-lateral prefrontal cortex in treatment-resistant schizophrenia. Schizophr Res 2013; 148(1-3): 81-6. 19. OTA VK, BERBERIAN AA, GADELHA A, SANTORO ML, OTTONI GL, MATSUZAKA CT, MARI JJ, MELARAGNO MI, LARA DR, SMITH MA, BELANGERO SI, BRESSAN RA.
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Polymorphisms in schizophrenia candidate gene UFD1L may contribute to cognitive deficits. Psychiatry Res 2013; 209(1): 11-3. 20. OTA, VANESSA K.; BERBERIAN, ARTHUR A. ; GADELHA, ARY ; OTTONI, GUSTAVO L. ; MATSUZAKA, CAMILA T. ; MARI, JAIR J. ; MELARAGNO, MARIA I. ; LARA, DIOGO R. ; SMITH, MARÍLIA A.C. ; BELANGERO, SINTIA I.; BRESSAN, RODRIGO A. Polymorphisms in schizophrenia candidate gene UFD1L may contribute to cognitive deficits. Psychiatry Research (Print), 2013. 21. SALUM GA ; SERGEANT J ; SONUGA-BARKE E ; VANDEKERCKHOVE J ; GADELHA A ; PAN PM ; MORIYAMA TS ; GRAEFF-MARTINS AS ; DE ALVARENGA PG ; ROSARIO MC ; MANFRO GG ; POLANCZYK G ; ROHDE LA . Specificity of basic information processing and inhibitory control in attention deficit hyperactivity disorder. Psychological Medicine (Print), 2013. 22. KIYOMI OTA, VANESSA; GADELHA, ARY; PELLEGRINO, RENATA; LEITE SANTORO, MARCOS; TEIXEIRA BELLUCCO, FERNANDA; MARIA CHRISTOFOLINI, DENISE; LIMA OTTONI, GUSTAVO; RIZZATO LARA, DIOGO; RIBEIRO-DOS-SANTOS, ÂNDREA KELY; SANTOS, SIDNEY; JESUS MARI, JAIR; BREEN, GEROME; CARDOSO SMITH, MARÍLIA ARRUDA; AFFONSECA BRESSAN, RODRIGO; ISABEL MELARAGNO, MARIA; IOLE BELANGERO, SINTIA . Candidate genes for schizophrenia in a mixed Brazilian population using pooled DNA. Psychiatry Research (Print), 2013. 23. KRIEGER, FERNANDA VALLE; POLANCZYK, VANONI GUILHERME ; ROBERT, GOODMAN ; ROHDE, LUIS AUGUSTO ; GRAEFF-MARTINS, ANA SOLEDADE ; SALUM, GIOVANNI ; GADELHA, ARY ; PAN, PEDRO ; STAHL, DANIEL ; STRINGARIS, ARGYRIS . Dimensions of Oppositionality in a Brazilian Community Sample: Testing the DSM-5 Proposal and Etiological Links. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry, v. 52, p. 389, 2013. 24. OTA, VANESSA K.; GADELHA, ARY ; ASSUNÇÃO, IDAIANE B. ; SANTORO, MARCOS L. ; CHRISTOFOLINI, DENISE M. ; BELLUCCO, FERNANDA T. ; SANTOS-FILHO, AIRTON F. ; OTTONI, GUSTAVO L. ; LARA, DIOGO R. ; MARI, JAIR J. ; MELARAGNO, MARIA I. ; SMITH, MARÍLIA A.C. ; BRESSAN, RODRIGO A. ; BELANGERO, SINTIA I. ; JACKOWSKI, ANDREA P. ZDHHC8 gene may play a role in cortical volumes of patients with schizophrenia. Schizophrenia Research (Print), v. 145, p. 33, 2013. 25. NOTO, CRISTIANO ; GADELHA, ARY ; BELANGERO, SÍNTIA I. ; SPINDOLA, LETÍCIA M. ; ROCHA, NATÁLIA PESSOA ; DE MIRANDA, ALINE SILVA ; TEIXEIRA, ANTÔNIO LÚCIO ; CARDOSO SMITH, MARÍLIA ARRUDA ; DE JESUS MARI, JAIR ; BRESSAN, RODRIGO AFFONSECA ; BRIETZKE, ELISA . Circulating levels of sTNFR1 as a marker of severe clinical course in schizophrenia. Journal of Psychiatric Research, v. 47, p. 467-471, 2013. 26. ZUGMAN, ANDRE ; PAN, PEDRO M. ; GADELHA, ARY ; MANSUR, RODRIGO B. ; ASEVEDO, ELSON ; CUNHA, GRACCIELLE R. ; SILVA, PAULA F.R. ; BRIETZKE, ELISA ; BRESSAN, RODRIGO A. . Brain tumor in a patient with attenuated psychosis syndrome. Schizophrenia Research (Print), v. 144, p. 151-152, 2013. 27. SALUM, G. A. ; MOGG, K. ; BRADLEY, B. P. ; GADELHA, A. ; PAN, P. ; TAMANAHA, A. C. ; MORIYAMA, T. ; GRAEFF-MARTINS, A. S. ; JARROS, R. B. ; POLANCZYK, G. ; DO ROSÁRIO, M. C. ; LEIBENLUFT, E. ; ROHDE, L. A. ; MANFRO, G.
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G. ; PINE, D. S. . Threat bias in attention orienting: evidence of specificity in a large community-based study. Psychological Medicine (Print), v. 43, p. 733-745, 2013. 28. BORDINI, DANIELA ; GADELHA, ARY ; PAULA, CRISTIANE SILVESTRE ; BRESSAN, RODRIGO AFFONSECA . School Referrals of Children and Adolescents to CAPSi - the Burden of Incorrect Referrals. Revista Brasileira de Psiquiatria (São Paulo. 1999. Impresso), v. 34, p. 493-496, 2012. 29. OTA, VANESSA KIYOMI ; SPÍNDOLA, LETÍCIA NERY ; GADELHA, ARY ; SANTOS FILHO, AIRTON FERREIRA DOS ; SANTORO, MARCOS LEITE ; CHRISTOFOLINI, DENISE MARIA ; BELLUCCO, FERNANDA TEIXEIRA ; RIBEIRO-DOS-SANTOS, ÂNDREA KELY ; SANTOS, SIDNEY ; MARI, JAIR DE JESUS ; MELARAGNO, MARIA ISABEL ; BRESSAN, RODRIGO AFFONSECA ; SMITH, MARILIA DE ARRUDA CARDOSO ; BELANGERO, SINTIA IOLE . DRD1 rs4532 polymorphism: A potential pharmacogenomic marker for treatment response to antipsychotic drugs. Schizophrenia Research (Print), v. 142, p. 206-208, 2012. 30. BRIETZKE, ELISA ; Araripe Neto, Ary Gadelha ; DIAS, ÁLVARO ; MANSUR, RODRIGO BARBACHAN ; BRESSAN, RODRIGO AFFONSECA . Early intervention in psychosis: a map of clinical and research initiatives in Latin America. Revista Brasileira de Psiquiatria (São Paulo. 1999. Impresso), v. 33, p. s213-s224, 2011. 31. NOTO, CRISTIANO SOUZA ; GADELHA, ARY ; BELANGERO, SÍNTIA IOLE ; SMITH, MARÍLIA ARRUDA CARDOSO ; DE AGUIAR, BIANCA W. ; PANIZZUTI, BRUNA ; MARI, JAIR DE JESUS ; GAMA, CLARISSA SEVERINO ; BRESSAN, RODRIGO AFFONSECA ; BRIETZKE, ELISA . Association of biomarkers and depressive symptoms in schizophrenia. Neuroscience Letters (Print), v. 505, p. 282-285, 2011. 32. CHRISTOFOLINI, DENISE M. ; BELLUCCO, FERNANDA T. ; OTA, VANESSA K. ; BELANGERO, SINTIA I. ; CERNACH, MIRLENE C.P. ; GADELHA, ARY ; MARI, JAIR ; BRESSAN, RODRIGO A. ; SMITH, MARILIA A.C. ; MELARAGNO, MARIA I. . Assessment of 22q11.2 copy number variations in a sample of Brazilian schizophrenia patients. Schizophrenia Research (Print), v. 132, p. 99-100, 2011. 33. SANTOS ANDRADE, ELVIS HENRIQUE ; PAN, PEDRO MARIO ; DA SILVA, PAULA F. RAMALHO ; GADELHA, ARY . New Insights in the Management of Antipsychotics in the Treatment of Schizophrenia in a Patient with Prolactinoma: A Case Report and Review of the Literature. Case Reports in Medicine (Print), v. 2010, p. 1-3, 2010. 34. OTA, VANESSA KIYOMI ; BELANGERO, SINTIA IOLE ; GADELHA, ARY ; BELLUCCO, FERNANDA TEIXEIRA ; CHRISTOFOLINI, DENISE MARIA ; MANCINI, TATIANE IRIS ; RIBEIRO-DOS-SANTOS, ÂNDREA KELLY ; SANTOS, SIDNEY EMANUEL ; DE JESUS MARI, JAIR ; BRESSAN, RODRIGO AFFONSECA ; MELARAGNO, MARIA ISABEL ; DE ARRUDA CARDOSO SMITH, MARILIA . The UFD1L rs5992403 polymorphism is associated with age at onset of schizophrenia. Journal of Psychiatric Research, v. 44, p. 1113-1115, 2010. 35. ANDREOLI, SÉRGIO ; RIBEIRO, WAGNER ; QUINTANA, MARIA ; GUINDALINI, CAMILA ; BREEN, GEROME ; BLAY, SERGIO ; COUTINHO, EVANDRO SF ; HARPHAM, TRUDY ; JORGE, MIGUEL ; LARA, DIOGO ; MORIYAMA, TAIS S ; QUARANTINI, LUCAS C ; GADELHA, ARY ; VILETE, LILIANE ; YEH, MARY SL ; PRINCE, MARTIN ; FIGUEIRA, IVAN ; BRESSAN, RODRIGO A ; MELLO, MARCELO F ; DEWEY, MICHAEL E ; FERRI, CLEUSA P ; MARI, JAIR . Violence and post-traumatic stress disorder in Sao Paulo and Rio
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de Janeiro, Brazil: the protocol for an epidemiological and genetic survey. BMC Psychiatry (Online), v. 9, p. 34, 2009. RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS
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39. OTA, V. K. ; GADELHA, A. ; PELLEGRINO, R ; SANTORO, M.L. ; BELLUCCO, F.T. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; LARA, D. R. ; OTTONI, G.L. ; MARI, J.J. ; BRESSAN, R.A. ; MELARAGNO, M.I. ; SMITH, M.A.C. ; BELANGERO, S. I. N. . Investigação de variações no número de cópias em genes candidatos para a esquizofrenia em uma população brasileira utilizando pools de DNA. In: XIV Congresso do Programa de Pós-Graduação em Morfologia, UNIFESP, 2011, São Paulo. XIV Congresso do Programa de Pós-Graduação em Morfologia, 2011. p. 64. 40. SANTORO, M.L. ; SANTOS, C. ; DIANA, M. C. ; OTA, V. K. ; GADELHA, A. ; MRAD, V. C. ; SPINDOLA, L. M. N. ; BRESSAN, R.A. ; MARI, J.J. ; ABILIO, V ; SMITH, M.A.C. ; BELANGERO, S. I. N. . Expressão de genes receptores e reguladores de neurotransmissores no córtex pré-frontal e no nucleo accumbens de um novo modelo animal para esquizofrenia: Spontaneously Hypertensive Rats (SHR). In: XIV Congresso do Programa de Pós-Graduação em Morfologia, UNIFESP, 2011, São Paulo. XIV Congresso do Programa de Pós-Graduação em Morfologia, UNIFESP, 2011. p. 58-58. 41. MRAD, V. C. ; SANTOS FILHO, A. F. ; GADELHA, A. ; OTA, VANESSA KIYOMI ; SANTORO, M.L. ; BELLUCCO, FERNANDA T. ; SPINDOLA, L. M. N. ; ROCHA, D.M.L.V. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; MARI, J.J. ; MELARAGNO, M.I. ; SMITH, M.A.C. ; BRESSAN, R.A. ; BELANGERO, S. I. . CNR1 and DGCR2 genes interaction may have an effect upon pathogenesis and response in schizophrenia. In: Amrican Society of Human Genetics / ICHG 2011 Meeting, 2011, Montreal. ICHG/ASHG 2011 Meeting, 2011. 42. OTA, V. K. ; BELANGERO, S. I. ; GADELHA, A. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; BELLUCCO, F.T. ; MATSUZAKA, C.T. ; ROCHA, D.M.L.V. ; ASSUNÇÃO, I.B. ; JACKOWSKI, A.P. ; BRESSAN, R.A. ; MARI, J.J. ; MELARAGNO, M.I. ; SMITH, M.A.C. . Onset of schizophrenia and brain morphology are associated with UFD1L rs5992403 polymorphism. In: Sao Paulo School of Advanced Science - Advaced Topics of Human Molecular Genetics, 2011, Campinas. Sao Paulo School of Advanced Science - Advaced Topics of Human Molecular Genetics, 2011. 43. OTA, V. K. ; GADELHA, A. ; BELANGERO, S. I. N. ; CHRISTOFOLINI, DENISE MARIA ; BELLUCCO, F.T. ; MATSUZAKA, C.T. ; ROCHA, D.M.L.V. ; ASSUNÇÃO, I.B. ; JACKOWSKI, A.P. ; BRESSAN, R.A. ; MARI, J.J. ; MELARAGNO, M.I. ; SMITH, M.A.C. . Age at Onset of Schizophrenia and Volume Reduction in Orbitofrontal Gyrus are Associated with UFD1L Polymorphism. In: 65th Annual Meeting of the Society of Biological Psychiatry, 2010, New Orleans. Biological Psychiatry, 2010. v. 67. p. 161S. 44. SANTORO, M.L. ; BELANGERO, S. I. ; OTA, V. K. ; GADELHA, A. ; CALZAVARA, M ; SANTOS, CM ; BRESSAN, R.A. ; MARI, J.J. ; ABILIO, V ; SMITH, M.A.C. . Análise da expressão de genes de receptores e reguladores de neurotransmissores em modelo animal para esquizofrenia. In: XIII Congresso do Programa de Pós-graduação em Morfologia, UNIFESP, 2010, São Paulo. XIII Congresso do Programa de Pós-graduação em Morfologia, UNIFESP, 2010. p. 80. 45. GADELHA, A. ; OTA, V. K. ; BELANGERO, S. I. ; ROCHA, D.M.L.V. ; ASSUNÇÃO, I.B. ; JACKOWSKI, A.P. ; BRESSAN, R.A. ; MELARAGNO, M.I. ; SMITH, M.A.C. . Associação de polimorfismo do gene UFD1L com a idade de inicio da esquizofrenia e volume do giro orbitofrontal. In: XXVIII Congresso Brasileiro de Psiquiatria, 2010, Fortaleza. XXVIII Congresso Brasileiro de Psiquiatria, 2010. 46. ASSUNÇÃO, I.B. ; OTA, V. K. ; BELANGERO, S. I. ; GADELHA, A. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; BELLUCCO, F.T. ; MATSUZAKA, C.T. ; ROCHA, D.M.L.V. ; BRESSAN, R.A. ; MARI,
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J.J. ; MELARAGNO, M.I. ; SMITH, M.A.C. ; JACKOWSKI, A.P. . Associação entre gene UFD1L e a idade de início da esquizofrenia e da redução de volume no giro orbitofrontal.. In: XXXIV Congresso da SBNec, 2010, Caxambu. XXXIV Congresso da SBNec, 2010. 47. OTA, V. K. ; BELANGERO, S. I. ; GADELHA, A. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; BELLUCCO, F.T. ; ASSUNÇÃO, I.B. ; MARI, J.J. ; JACKOWSKI, A.P. ; BRESSAN, R.A. ; MELARAGNO, M.I. ; SMITH, M.A.C. . Investigação do polimorfismo rs5992403 do gene UFD1L na idade de acometimento da esquizofrenia e na morfologia cerebral. In: XIII Congresso do Programa de Pós-graduação em Morfologia, UNIFESP, 2010, São Paulo. XIII Congresso do Programa de Pós-graduação em Morfologia, UNIFESP, 2010. 48. BELLUCCO, FERNANDA TEIXEIRA ; BELANGERO, S. I. ; GADELHA, A. ; OTA, V. K. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; SANTORO, M.L. ; MARI, J.J. ; SMITH, M.A.C. ; BRESSAN, R.A. ; MELARAGNO, M.I. . Participação do gene PRODH na patogênese da esquizofrenia.. In: XIII Congresso do Programa de Pós-graduação em Morfologia, UNIFESP, 2010, São Paulo. XIII Congresso do Programa de Pós-graduação em Morfologia, UNIFESP, 2010. 49. BELLUCCO, FERNANDA TEIXEIRA ; BELANGERO, S. I. ; GADELHA, A. ; OTA, V. K. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; SANTORO, M.L. ; ROCHA, D.M.L.V. ; MARI, J.J. ; SMITH, M.A.C. ; BRESSAN, R.A. ; MELARAGNO, M.I. . Participação do PRODH na patogênese da esquizofrenia.. In: 56o Congresso Brasileiro de Genética, 2010, Guarujá. 56o Congresso Brasileiro de Genética, 2010. p. GH248. 50. BELANGERO, S. I. ; GADELHA, A. ; OTA, V.K. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; BELLUCCO, F.T. ; SANTORO, M.L. ; MAZZOTTI, DR ; ASSUNÇÃO, I.B. ; ROCHA, D.M.L.V. ; BRESSAN, R.A. ; MELARAGNO, M.I. ; SMITH, M.A.C. ; JACKOWSKI, A.P. ; MARI, J.J. . Polimorfismos funcionais do gene DGCR2 e sua possível relação com reduções no córtex insular e temporal em pacientes com esquizofrenia. In: 56o. Congresso Brasileiro de Genetica, 2010, Guarujá. 56o. Congresso Brasileiro de Genetica, 2010. 51. BELANGERO, S. I. ; OTA, V. K. ; BELLUCCO, F.T. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; CERNACH, MC ; MARI, J.J. ; BRESSAN, R.A. ; MELARAGNO, M.I. ; GADELHA, A. ; SMITH, M.A.C. . Associação de polimorfismo do gene UFD1L com idade de acometimento da esquizofrenia.. In: 55º Congresso Brasileiro de Genética, 2009, Águas de Lindóia. 55º Congresso Brasileiro de Genética, 2009. p. GH148. 52. OTA, V. K. ; BELANGERO, S. I. ; BELLUCCO, F.T. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; MELARAGNO, M.I. ; CERNACH, MC ; DINIZ, MJA ; GADELHA, A. ; BRESSAN, R.A. ; MARI, J.J. ; SMITH, M.A.C. . Estudo de polimorfismos dos genes UFD1L e ZDHHC8 em esquizofrenia.. In: 10º Simpósio Nacional de Biologia Molecular Aplicada à Medicina, 2009, Ribeirão Preto. 10º Simpósio Nacional de Biologia Molecular Aplicada à Medicina, 2009. p. 77-78. 53. OTA, V. K. ; BELANGERO, S. I. ; BELLUCCO, F.T. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; MELARAGNO, M.I. ; CERNACH, MC ; DINIZ, MJA ; GADELHA, A. ; BRESSAN, R.A. ; MARI, J.J. ; SMITH, M.A.C. . Estudo de polimorfismos dos genes UFD1L e ZDHHC8 em esquizofrenia.. In: XII Congresso do Programa de Pós-graduação em Morfologia, UNIFESP, 2009, São Paulo. XII Congresso do Programa de Pós-graduação em Morfologia, UNIFESP, 2009. p. 30. 54. BELLUCCO, F.T. ; MELARAGNO, M.I. ; SMITH, M.A.C. ; MARI, J.J. ; CARVALHO, A.C. ; BRESSAN, R.A. ; CERNACH, MC ; BELANGERO, S. I. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; GADELHA, A. ; OTA, V. K. ; YAMADA, K.M. . Investigação da região cromossômica 22q11.2
220
na patogênese da esquizofrenia. In: XII Congresso do Programa de Pós-Graduação em Morfologia, UNIFESP, 2009, Sao Paulo. XII Congresso do Programa de Pós-Graduação em Morfologia, UNIFESP, 2009. 55. BELLUCCO, F.T. ; BELANGERO, S. I. ; CHRISTOFOLINI, D.M. ; OTA, V. K. ; GADELHA, ARY ; BRESSAN, R.A. ; MARI, J.J. ; CERNACH, MC ; CARVALHO, A.C. ; SMITH, M.A.C. ; MELARAGNO, M.I. ; MORAES, DA . Investigação da região cromossômica 22q11.2 na patogênese da esquizofrenia. In: XI Congresso do Programa de Pós-Graduação em Morfologia, UNIFESP, 2008, São Paulo. XI Congresso do Programa de Pós-Graduação em Morfologia, UNIFESP, 2008. p. 11. 56. SILVA, P.F.R.; GADELHA, A.; MELCOP, A.C.; PAN NETO, P.M.; MORIYAMA, T.S.; GRAEFF-MARTINS, A.S.; BORDIN, I.A.; BRESSAN, R.A. Validation of the Portuguese version of the Comprehensive Assessment of At-Risk Mental States (CAARMS). 7th biennial conference of the International Early Psychosis Association – 29th November to 1st December 2010, Amsterdan. 57. MELCOP, A. C.; GADELHA, ARY ; SILVA, P. F. R. ; PAN NETO, P. M. ; MORIYAMA, T. S. ; GRAEFF-MARTINS, A. S. ; BORDIN, ISABEL ; BRESSAN, R. A. The Portuguese version of the Y-PARQ as a screening instrument in prodromal research. 2010. 7th biennial conference of the International Early Psychosis Association – 29th November to 1st December 2010, Amsterdan. 58. GADELHA, A.; SILVA, P.F.R.; MELCOP, A.C.; PAN NETO, P.M.; MORIYAMA, T.S.; GRAEFF-MARTINS, A.S.; BORDIN, I.A.; BRESSAN, R.A. The PRISMA clinic – A Brazilian initiative for detection and follow-up of individuals at risk for psychosis - Description of the clinical protocol. 7th biennial conference of the International Early Psychosis Association – 29th November to 1st December 2010, Amsterdan. 59. GADELHA A, CHRISTOFOLINI DM, ROCHA DML, NOGUEIRA, SI, BRESSAN V, BELLUCO FTS, MELARAGNO MISA, MARI, JJ, SMITH MAC, BRESSAN RA. Interaction of COMT Val108/158Met genotype and treatment-resistance in patients with schizophrenia. Abstract accepted to the 64th Annual Scientific Convention & Meeting of The Society of Biological Psychiatry - May 14-16, 2009 Vancouver, Canada. PRÊMIOS
• Melhor Apresentação Oral em Pesquisa Translacional/Modelos Animais no congresso: YMIND São Paulo School of Advanced Science for Prevention of Mental Disorders, 2013. GADELHA, ARY ; MACHADO, MAURICIO F.M. ; YONAMINE, CAMILA M. ; SATO, JOÃO R. ; JULIANO, MARIA A. ; OLIVEIRA, VITOR ; BRESSAN, RODRIGO A. ; HAYASHI, MIRIAN A.F. • 2o Lugar Sessão de Pôsteres, XXVIII Congresso Brasileiro de Psiquiatria, categoria POECRS: Associação de polimorfismo do gene UFD1L com idade de início da esquizofrenia e volume do giro orbitofrontal. Fortaleza-CE, 27-30 de outubro 2010. Gadelha A, Ota VK, Belangero SI, Rocha DMLV, Assunção IB, Jackowski AP, Bressan RA, Melaragno MI, Smith MAC.
221
APRESENTAÇÃO ORAL EM CONGRESSO INTERNACIONAL
1. GADELHA A, YONAMINE CM, VENDRAMINE A, MACHADO M, NERING M, OLIVEIRA V, LOPES R, ABÍLIO V, BRESSAN RA, HAYASHI MAF. The role of oligopeptidases in schizophrenia – translational evidence from human to animal research. Biennial Schizophrenia International Research Society; Florença, Itália;5-9 de Abril. 2. GADELHA A, MACHADO M, YONAMINE C, OLIVEIRA V, BRESSAN RA, HAYASHI. "Plasma Oligopeptidase Activity is lower in Schizophrenic patients compared to healthy controls”. Schizophrenia International Research Society South America; São Paulo, 5-7 de agosto de 2011. 3. NOGUEIRA SI, GADELHA A, OTA V, MARI JJ, BRESSAN RA, SMITH MAC, JACKOWSKI A. Functional polymorphisms of DGCR2 gene may be associated to schizophrenia pathogenesis and play a role in neurodevelopment. 13th International Congress on Schizophrenia Research; Colorado Springs, USA; 2-6 de Abril. Obs: a Dra. Sintia Iole submeteu o trabalho, mas eu fiz a apresentação oral por ela não poder comparecer ao congresso. 4. GADELHA A, YONAMINE CM, VENDRAMINE A, NERING M, OLIVEIRA V, LOPES R, ABÍLIO VC, BRESSAN RA, HAYASHI MAF. INSIGHT INTO THE ROLES OF OLIGOPEPTIDASES IN SCHIZOPHRENIA – TRANSLATIONAL EVIDENCE FROM HUMAN TO ANIMAL RESEARCH. World Congress On Brain, Behavior And Emotions; Montreal, Canada; 7-9 De Abril De 2014. Obs: Como o congresso aconteceu no mesmo período do SIRS Florença, a Dra. Mirian Hayashi fez a apresentação oral no congresso. APRESENTAÇÃO ORAL EM CONGRESSO NACIONAL
1. I Congresso Nacional VIII Simpósio Nacional "Modernidade, Ciência e Mitos em Psiquiatria da Infância e Adolescência", palestrante do tema: Sinais Precoces na Esquizofrenia da Infância e Adolescência, Rio de Janeiro-RJ; 6-7 de dezembro de 2013. 2. XXXI Congresso Brasileiro de Psiquiatria "A Psiquiatria e os avanços da Neurociência": relator do tema: Esquizofrenia. Subtema: Diagnóstico Diferencial das Psicoses. Curitiba-PR; 23-26 de outubro de 2013. 3. XXIX Congresso Brasileiro de Psiquiatria "Acesso a Tratamento e Justiça Social."; relator do tema: Esquizofrenia hoje: cem anos do conceito de Bleuler; Rio de Janeiro-RJ; 2-5 de novembro de 2011. 4. XXIX Congresso Brasileiro de Psiquiatria "Acesso a Tratamento e Justiça Social."; relator do Simpósio so Depto de Psiquiatria Biológica, mesa redonda: Dicotomia Krapeliniana baseado em achados atuais: transtorno bipolar e esquizofrenia, um contínuo de um mesmo transtorno ou duas entidades nosológicas distintas? subtema: Um continuum? Rio de Janeiro-RJ; 2-5 de novembro de 2011. 5. XXI Congresso Brasileiro e I Congresso Internacional da ABENEPI "A Criança e o Adolescente na Pos-Modernidade; palestrante do tema: Herdabilidade dos Transtornos Mentais, São Paulo-SP; 22-25 de junho de 2011.
222
6. XXI Congresso Brasileiro e I Congresso Internacional da ABENEPI "A Criança e o Adolescente na Pos-Modernidade; palestrante do tema: Estado Mentais de Risco para Psicose, Resultados Preliminares, São Paulo-SP; 22-25 de junho de 2011. 7. XXVIII Congresso Brasileiro de Psiquiatria "Ciência e Compromisso Social"; docente do curso: Avanços no tratamento multidisciplinar da esquizofrenia. Fortaleza-CE, 27-30 de outubro 2010. 8. XXVIII Congresso Brasileiro de Psiquiatria "Ciência e Compromisso Social"; relator da mesa redonda: Estados Prodrômicos nas Psicoses. subtema: Estados Mentais de Risco para Esquizofrenia: É possível a prevenção? Fortaleza-CE, 27-30 de outubro 2010. 9. XXVIII Congresso Brasileiro de Psiquiatria "Ciência e Compromisso Social"; relator do Simpósio do Depto de Psiquiatria Biológica. Subtema: Associação de polimorfismos do gene UFD1L e idade de início de doença em portadores de Esquizofrenia. Fortaleza-CE, 27-30 de outubro 2010. PATENTE
1. Registro no Brasil: HAYASHI, M. A. F., BRESSAN, R. A., OLIVEIRA, V., ARARIPE NETO, A. G. A., MACHADO, M. F. Método e kit de diagnóstico de condições neuropsiquiátricas, método para avaliação de tratamento de condições neuropsiquiátricas, 2010.
223
8.2. Análises em andamento relacionadas à tese
Algumas análises relacionadas à tese ainda estão em andamento, mas os resultados são preliminares e não foram incluídos na forma de artigo.
Correlação entre as medidas de atividade enzimática da NDEL1 e ECA
Uma correlação negativa significativa entre NDEL1 e ECA foi observada
(Pearson's r=-159; p=0.03). Essa correlação não se mantem quando é feita uma
correlação parcial, covariando o estado clínico (caso ou controle) (pcorr=-0.34;
p=.643). Esse resultado sugere que ambas as medidas podem estar sendo
influencidas por um fator em comum, associado ao diagnóstico de esquizofrenia.
Estamos agora investigando o quanto essa correlação está associada a outras
medidas, como testes neuropsicológicos, marcadores inflamatórios e alterações de
volume cerebral encontradas em pacientes.
Estudo de varredura genômica da atividade enzimática da ECA
Fizemos uma análise semelhante a apresentada para a NDEL1 no Estudo 2.
O resultado inicial para análise de efeito principal identificou SNPs do próprio gene
da ECA como principais fatores genéticos associadas à medida no sangue. Esse
dado vai ao encontro de estudos anteriores que sugeriam que a ECA está sobre
forte controle genético. Inicialmente, por esse resultado confirmar o de outros
estudos não havíamos planejado uma publicação específica. No entanto, esse
resultado se tornou o padrão-ouro para as análises do melhor modelo para correção
para estrutura populacional. Observamos que algumas correções bem estabelecidas
podem gerar um modelo ajustado quanto ao parâmetros estatísticos, mas com
grande variação no resultado final considerando os principais achados. Além disso,
os achados para a análise da ECA de SNPs da ECA estiveram na ordem de 10-6 , o
que fortalece os achados da análise principal para a NDEL1.
Após esses resultados, decidimos escrever um artigo focado em questões
metodológicas usando esse parâmetro. Mudamos também a perspectiva de ordem
224
de publicação, uma vez que esses dados, uma vez publicados, fortaleceriam os
achados para a análise da NDEL1.
Estudo da correlação de medidas de atividade enzimática da ECA e volume de regiões cerebrais
No último mês rodamos uma análise de correlação entre os valores da
atividade enzimática da ECA no plasma e volumes de regiões corticais e
subcorticais adquiridas em scanner Siemens de 1,5T, segmentadas através do
software Freesurfer image analysis suite.
Analisando a amostra total (pacientes + controles), observamos correlações
significativas para lobo temporal médio e superior (valores corrigidos de p<0.05). Ao
separar os grupos caso e controle ou controlar para o estado clínico, nenhuma
região permanece correlacionada com valor estatisticamente significativo. O
resultado é interessante, pois parece seguir o mesmo padrão dos resultados do
estudo de cognição e parece indicar que a ECA, direta ou indiretamente, funciona
como um marcador para alterações tipicamente encontrada em estudos que
investigam a fisiopatologia da esquizofrenia.