Universidade Estadual de Maring DEPARTAMENTO DE ANLISES CLNICAS

Curso de Farmcia

MMaannuuaall ddee

TTccnniiccaass HHeemmaattoollggiiccaass

Profa Eliana Litsuko Tomimatsu Shimauti Profa Juliana C. Martinichen Herrero

Profa Eliana Valria Patussi Profa Fabiana Nabarro Ferraz

2010

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BIOSSEGURANA 1. Boas Prticas Individuais A norma ABNT NBR 14785/2001 trata dos Requisitos de Segurana no Laboratrio Clnico aplicveis a todo o territrio nacional. Com base nela, recomendam-se as seguintes precaues universais: proibir alimentos, bebidas ou fumo na rea tcnica do laboratrio; armazenar alimentos exclusivamente em reas de alimentao, em locais adequados, sendo proibido alimentos ou bebidas nos armrios, gavetas, refrigeradores e freezers utilizados para o armazenamento de reagentes, amostras biolgicas, materiais e insumos para coleta; no colocar na boca quaisquer materiais ou objetos empregados no ambiente de trabalho, tais como: canetas, lpis, etiquetas, selos e envelopes; jamais pipetar com a boca, devendo-se empregar pipetas automticas, sempre que necessrio; no fazer a aplicao de cosmticos e maquiagens na rea de coleta; evitar o manuseio de lentes de contato na rea de coleta do laboratrio; prender/proteger cabelos e barbas durante a jornada de trabalho no laboratrio, a fim de evitar contato com materiais e superfcies contaminados. Estes devem ser mantidos distantes de equipamentos como centrfugas e/ou bicos de Bunsen. Pode-se utilizar tocas descartveis com esta finalidade; limpar e aparar as unhas e caso sejam utilizados esmaltes, preferir os de cor clara; evitar o uso de correntes compridas no pescoo, brincos grandes ou braceletes soltos; lavar as mos aps o manuseio de qualquer material biolgico. 2. Equipamentos de Proteo Individual (EPI) Utilizar o uniforme recomendado pelo empregador, na rea de coleta, cobrindo adequadamente as partes do corpo. Na ausncia de um uniforme padro, recomendvel sobrepor vestimenta um avental de tecido lavvel ou descartvel, longo e de mangas compridas, que alcance o nvel do joelho. As boas prticas de segurana recomendam que este avental deva sempre ser retirado ao sair da rea de coleta do laboratrio, no sendo correto seu uso nas reas de alimentao e descanso. No se recomenda o uso dos equipamentos de proteo individual fora do permetro onde seu uso est indicado. Recomenda-se sempre a utilizao de luvas pelo flebotomista durante o ato da coleta. As trocas necessitam ser efetuadas quando houver qualquer contaminao com material biolgico. Sempre que for necessrio, lavar as mos e, em seguida, colocar luvas novas. No manusear objetos de uso comum (telefone, maanetas, copos, xcaras etc.) enquanto estiver usando luvas. No descartar as luvas nas lixeiras de uso administrativo. Utilizar mscaras quando o ato da coleta do material biolgico sugerir risco de contaminao pela formao de gotculas ou aerossis. Utilizar sapatos confortveis com solado antiderrapante e de saltos no muito altos, para que se minimizem os riscos de acidentes. Na rea de coleta, no se recomenda o uso de sandlias, chinelos ou outros calados abertos. 3. Cuidados na Sala de Coleta Desinfetar imediatamente as reas contaminadas. Comunicar ao superior imediato os acidentes com material infectante.

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A sala deve ser utilizada exclusivamente para coleta e apenas o paciente e o flebotomista devem permanecer no local. Excees a essa regra so as situaes em que houver necessidade de um acompanhante para auxiliar na execuo do procedimento.

RECOMENDAES PARA COLETA DE SANGUE VENOSO 1. Procedimentos de Coleta de Sangue Venoso

A venopuno um procedimento complexo, que exige conhecimento e habilidade. Quando uma amostra de sangue for colhida, um profissional experiente deve seguir algumas etapas: - verificar a solicitao do mdico e o cadastro do pedido; - apresentar-se ao paciente, estabelecendo comunicao e ganhando sua confiana; - explicar ao paciente ou ao seu responsvel o procedimento ao qual o paciente ser submetido, para a obteno de consentimento para o procedimento; - realizar a identificao de pacientes: - conscientes: confirmar os dados pessoais, comparando-os com aqueles do pedido. Havendo discrepncias entre as informaes, estas devero ser resolvidas antes da coleta da amostra; - verificar se as condies de preparo e o jejum do paciente.

1.1 Locais de Escolha para Venopuno A escolha do local de puno representa uma parte vital do diagnstico. Existem diversos

locais que podem ser escolhidos para a venopuno. O local de preferncia para as venopunes a fossa antecubital, na rea anterior do brao em frente e abaixo do cotovelo, onde est localizado um grande nmero de veias (ceflica, ceflica mediana, baslica mediana e baslica), relativamente prximas superfcie da pele. Embora qualquer veia do membro superior que apresente condies para coleta possa ser puncionada, as veias cubital mediana e ceflica so as mais freqentemente utilizadas.

Ateno: punes arteriais no devem ser consideradas como uma alternativa venopuno pela dificuldade de coleta e riscos de infeco.

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1.2 reas a serem evitadas para a venopuno: Preferencialmente amostras de sangue no devem ser coletadas nos membros onde estiverem instaladas terapias intravenosas. Evitar locais que contenham extensas reas cicatriciais de queimadura. Um mdico deve ser consultado antes da coleta de sangue ao lado da regio onde ocorreu a mastectomia, em funo das potenciais complicaes decorrentes da linfostase. reas com hematomas podem gerar resultados errados de exames, qualquer que seja o tamanho do hematoma. Se outra veia, em outro local, no estiver disponvel, a amostra deve ser colhida distalmente ao hematoma. Fstulas arteriovenosas, enxertos vasculares ou cnulas vasculares no devem ser manipulados por pessoal no autorizado pela equipe mdica, para a coleta de sangue. Evite puncionar veias trombosadas. Essas veias so pouco elsticas, assemelham-se a um cordo e tm paredes endurecidas. 1.3 Tcnicas para evidenciao da veia: Observao de veias calibrosas. Movimentao: pedir para o paciente abaixar o brao e fazer movimentos de abrir e fechar a mo. Os movimentos de abertura das mos reduzem a presso venosa, com o relaxamento muscular. Massagens: massagear suavemente o brao do paciente (do punho para o cotovelo). Palpao: realizada com o dedo indicador do flebotomista. No utilizar o dedo polegar devido baixa sensibilidade da percepo da pulsao. Esse procedimento auxilia na distino entre veias e artrias pela presena de pulsao, devido maior elasticidade e maior espessura das paredes dos vasos arteriais. Fixao das veias com os dedos, nos casos de flacidez. 1.4 Uso Adequado do Torniquete:

O torniquete empregado para aumentar a presso intravascular, o que facilita a palpao da veia e o preenchimento dos tubos de coleta ou da seringa. No ato da venopuno devem estar disponveis torniquetes ou produtos utilizados como tal. Eles incluem: Torniquete de uso nico, descartvel, preferencialmente livre de ltex. Manguito inflado do esfigmomanmetro a at 40 mmHg para adultos. Deve-se evitar o uso de torniquetes de tecidos emborrachados, com fechamento em grampo plstico, fivela ou com tipos similares de fixao. Caso o torniquete tenha ltex em sua composio, deve-se perguntar ao paciente se ele tem alergia a esse componente. Caso o paciente seja alrgico a ltex, no efetuar o garroteamento com esse material. Os torniquetes devem ser descartados imediatamente quando forem contaminados com sangue ou fluidos corporais. possvel que, sem a aplicao do torniquete, o flebotomista no seja capaz de priorizar a veia antecubital com a segurana requerida.

1.4.1 Precaues no uso de torniquete: muito importante fazer uso adequado do torniquete (Figuras 3, 4 e 5). Quando a sua aplicao excede um minuto, pode ocorrer estase localizada, hemoconcentrao e infiltrao de sangue para os tecidos, gerando valores falsamente elevados para todos os analitos baseados em medidas de protenas, alterao do volume celular e de outros elementos celulares. O uso inadequado pode levar situao de erro diagnstico (como hemlise, que pode tanto elevar o nvel de potssio como alterar a dosagem de clcio etc.), bem como gerar complicaes durante a coleta (hematomas, formigamento , etc.). Havendo leses de pele no local pretendido, deve-se considerar a possibilidade da utilizao de um local alternativo ou aplicar o torniquete sobre a roupa do paciente.

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1.4.2 Procedimentos Uso do torniquete: Posicionar o brao do paciente, inclinando-o para baixo, a partir da altura do ombro. Posicionar o torniquete com o lao para cima, a fim de evitar a contaminao da rea de puno. No aplicar, no momento de seleo venosa, o procedimento de bater na veia com dois dedos. Esse tipo de procedimento provoca hemlise capilar e, portanto, altera o resultado de certos analitos. Se o torniquete for usado para seleo preliminar da veia, faz-lo apenas por um breve momento, pedindo ao paciente para fechar a mo. Localizar a veia e, em seguida, afrouxar o torniquete. Esperar 2 minutos para us-lo novamente. O torniquete no dever ser usado em alguns testes como lactato ou clcio, para evitar alterao no resultado. Aplicar o torniquete de 7,5 a 10,0 cm acima do local da puno, para evitar a contaminao do local. No usar o torniquete continuamente por mais de 1 minuto. Ao garrotear, pedir ao paciente que feche a mo para evidenciar a veia. No apertar intensamente o torniquete, pois o fluxo arterial no deve ser interrompido. O pulso deve permanecer palpvel. Trocar o torniquete sempre que houver suspeita de contaminao.

1.5 Posies do paciente para coleta de sangue A posio do paciente tambm pode acarretar erros em resultados. O desconforto do paciente, agregado ansiedade do mesmo, pode levar liberao indevida de alguns analitos na corrente sangunea. A seguir, sero apresentadas algumas recomendaes que facilitam a coleta de sangue e promovem um perfeito atendimento ao paciente neste momento.

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1.5.1 Procedimentos em paciente sentado Pedir ao paciente que se sente confortavelmente em uma cadeira prpria para coleta de sangue. Recomenda-se que a cadeira tenha apoio para os braos e previna quedas, caso o paciente venha a perder a conscincia. Cadeiras sem braos no fornecem o apoio adequado para o brao, nem protegem pacientes em casos de desfalecimento. Recomenda-se que, no descanso da cadeira, a posio do brao do paciente seja inclinada levemente para baixo e estendida, formando uma linha direta do ombro para o pulso. O brao deve estar apoiado firmemente pelo descanso e o cotovelo no deve estar dobrado. Uma leve curva pode ser importante para evitar hiperextenso do brao. 1.5.2 Procedimento em paciente em leito Pedir ao paciente que se coloque em uma posio confortvel. Caso esteja em posio supina e um apoio adicional for necessrio, coloque um travesseiro debaixo do brao em que a amostra ser colhida. Posicione o brao do paciente inclinado levemente para baixo e estendido, formando uma linha direta do ombro para o pulso. Caso esteja em posio semi-sentada, o posicionamento do brao para coleta torna-se relativamente mais fcil.

2. COLETA DO SANGUE 2.1 Antissepsia do local da puno O procedimento de venopuno deve ser precedido pela higienizao do local para prevenir a contaminao microbiana de cada paciente ou amostra. Antisspticos Para a preparao da pele, o uso de antisspticos necessrio. Dentre eles, citamos: lcool isoproplico 70% ou lcool etlico, iodeto de povidona 1 a 10% ou gluconato de clorexidina para hemoculturas, substncias de limpeza no-alcolicas (como clorexidina, sabo neutro). Procedimento Recomenda-se usar uma gaze ou algodo umedecido com soluo de lcool isoproplico ou etlico 70%. Limpar o local com um movimento circular do centro para fora. Permitir a secagem da rea por 30 segundos para prevenir hemlise da amostra e reduzir a sensao de ardncia na venopuno. No assoprar, no abanar e no colocar nada no local. No tocar novamente na regio aps a antissepsia. Se a venopuno for difcil de ser obtida e a veia precisar ser palpada novamente para efetuar a coleta, o local escolhido deve ser limpo novamente.

2.2 Condies Necessrias para a Coleta: - Sala bem iluminada e ventilada; - Lavatrio; - Cadeira reta com braadeira regulvel ou maca; - Garrote ou torniquete; - Algodo hidrfilo; - lcool etlico a 70%; - Agulha descartvel; - Seringa descartvel; - Sistema a vcuo: suporte, tubo e agulha descartvel; - Tubos com e sem anticoagulante; - Etiquetas para identificao de amostras; - Recipiente rgido e prprio para desprezar material perfurocortante; - Avental e mscara; - Luvas descartveis; - Estantes para os tubos.

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2.3 Procedimentos de Coleta de Sangue com Seringa e Agulha 1. Verificar se a cabine de coleta est limpa e guarnecida para incio dos procedimentos.

2. Solicitar ao paciente que diga seu nome completo para confirmao do pedido mdico e etiquetas. 3. Conferir e ordenar todo o material a ser usado no paciente, de acordo com o pedido mdico (tubo, gaze, torniquete, etc.). A identificao dos tubos deve ser feita na frente do paciente. 4. Informar ao paciente como ser realizado o procedimento. 5. Abrir a seringa na frente do paciente. 6. Higienizar as mos. 7. Calar as luvas. 8. Posicionar o brao do paciente, inclinando-o para baixo, na altura do ombro. 9. Se o torniquete for usado para seleo preliminar da veia, pedir para que o paciente abra e feche a mo; em seguida, afrouxar o instrumento e esperar 2 minutos para utiliz-lo novamente. 10. Fazer a antissepsia. 11. Garrotear o brao do paciente. 12. Retirar a proteo da agulha. 13. Fazer a puno numa angulao oblqua de 30graus, com o bisel da agulha voltado para cima, se necessrio, para melhor visualizar a veia, esticar a pele com a outra mo, longe do local onde foi feita a antissepsia. 14. Desgarrotear o brao do paciente assim que o sangue comear a fluir dentro da seringa. 15. Aspirar devagar o volume necessrio, de acordo com a quantidade de sangue requerida na etiqueta dos tubos a serem utilizados (respeitar, ao mximo, a exigncia da proporo sangue/aditivo). Aspirar o sangue, evitando bolhas e espuma, com agilidade, pois o processo de coagulao do organismo do paciente j foi ativado no momento da puno. 16. Retirar a agulha da veia do paciente. 17. Exercer presso no local, em geral, de 1 a 2 minutos, evitando, assim, a formao de hematomas e sangramentos. Se o paciente estiver em condies de faz-lo, oriente-o para que faa a presso at que o orifcio da puno pare de sangrar. 18. Tenha cuidado com a agulha para evitar acidente s perfurocortantes. 19. Descartar a agulha imediatamente aps sua remo o do brao do paciente, em recipiente adequado, sem a utilizao das mos (de acordo com a normatizao nacional no desconectar a agulha no reencapar). Caso esteja usando agulha com dispositivo de segurana, ativar o dispositivo e descartar a agulha no descartador para objetos perfurocortantes, de acordo com a NR32. Ateno: totalmente contraindicado perfurar a rolha do tubo, pois esse procedimento pode causar a puno acidental, alm da possibilidade de hemlise. 20. De acordo com o CLSI, deve-se utilizar, aps a coleta com seringa e agulha, um dispositivo de transferncia de amostra. 21. Conectar o dispositivo de transferncia na seringa, introduzir os tubos a vcuo e aguardar o sangue parar de fluir em direo ao interior do tubo. Realizar a troca dos tubos sucessivamente.

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22. Homogeneizar o contedo imediatamente aps a retirada de cada tubo, invertendo-o suavemente de 5 a 10 vezes. 23. Descartar o dispositivo de transferncia de amostra (transfer device) e a seringa. 24. Fazer curativo oclusivo no local da puno. 25. Orientar o paciente a no dobrar o brao, no carregar peso ou bolsa a tiracolo no mesmo lado da puno por, no mnimo, 1 hora, e no manter a manga dobrada, pois pode funcionar como torniquete. 26.Verificar se h alguma pendncia, dando orientaes adicionais ao paciente, se necessrio. 27. Certificar-se das condies gerais do paciente perguntando se est em condies de se locomover sozinho. Em caso afirmativo, entregar o comprovante de retirada do resultado ao paciente para, em seguida, liber-lo. 28. Colocar as amostras em local adequado ou encaminh-las imediatamente para processamento. 2.4 Cuidados para uma Puno Bem-sucedida

O ideal que a puno seja nica, proporcionando, assim, conforto e segurana ao paciente. Para se obter uma puno de sucesso, vrios fatores devem ser observados antes de iniciar o procedimento. Aps avaliar o acesso venoso, escolher os materiais compatveis. Por exemplo, em caso de paciente com acesso venoso difcil, valer-se do uso de agulhas de menor calibre, escalpes ou tubos de menor volume.

Sempre puncionar a veia do paciente com o bisel voltado para cima. Respeitar a proporo sangue/anticoagulante no tubo. Introduzir a agulha mais ou menos 1 cm no brao. Respeitar a angulao de 30o (ngulo oblquo), em relao ao brao do paciente. O ngulo oblquo de 30 da agulha em relao ao b rao do paciente foi respeitado; a agulha penetrou centralmente na veia e o bisel da agulha foi inserido voltado para cima.

ANTICOAGULANTES

Anticoagulantes so substncias usadas para impedir a coagulao e retardar a deteriorao do sangue. Devem interferir o mnimo possvel com as caractersticas das clulas e estar contido em pouco volume para evitar diluio do sangue. A escolha correta do tipo e quantidade de anticoagulante importante. Uma quantidade insuficiente pode permitir a coagulao sangunea e o excesso pode interferir nos exames. 1. Anticoagulantes mais usados em Hematologia - EDTA 10% (cido Etilenodiaminotetractico) - Citrato de Sdio 3,8%

2. Preparo de Anticoagulantes:

1) Soluo de EDTA 10% EDTA (K2) --------------------------------10,0 g gua destilada -----------------------------100,0 ml necessrio dissolver o EDTA (K2) a quente. Usar 0,05 ml (1 gota) para cada 5 ml de sangue. Conservar a temperatura ambiente, esta soluo no altera com o tempo. 2) Citrato de Sdio 3,8% (Na 3C6H5O7.2H2O) Na3C6H5O7.2H2O ---------------------------3,8 g gua destilada -----------------------------100,0 ml

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Dissolver e completar o volume com gua destilada Usar na proporo 1 parte de anticoagulante para 9 partes de sangue (0,5 ml de anticoagulante para 4,5 ml de sangue)

Exames Realizados com Amostras de Sangue Colhido com EDTA 10%

- Hemograma - VHS (Velocidade de Hemosedimentao) - Contagem de Reticulcitos - Teste de Falcizao - Eletroforese de Hemoglobina - Teste de fragilidade osmtica

Exames Realizados com Amostras de Sangue Colhido com Citrato de Sdio a 3,8% Coagulograma - Tempo de Protrombina (TAP) - Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (TTPa) - Tempo de Trombina e outros.

TCNICA PARA CONFECO DO ESFREGAO SANGUNEO Realizar os esfregaos em lminas de vidro de 24x76 mm, perfeitamente limpas e

desengorduradas. Utilizar para extenso, uma lmina mais estreita, chamada lmina extensora (apresenta bordas recortadas e polidas).

Colocar uma gota de sangue recm coletada (da ponta da agulha, desprezando as primeiras gotas, sem anticoagulante) e cerca de 1 cm do incio da lmina.

Colocara a lmina extensora, segurando com dois dedos, com uma inclinao de 45 em relao primeira, alguns milmetros diante da gota. Recuar a lmina at encostar na gota e por capilaridade deixar o sangue se distribuir homogeneamente por toda a largura da extensora.

Fazer o esfregao deslizando com movimento suave e contnuo a outra extremidade, sem

alterar o ngulo inicial.

Secar o esfregao a temperatura ambiente. A identificao da lmina feita sobre o prprio sangue distendido, na cabea do esfregao

com lpis. Devem ser feitos trs esfregaos para cada paciente.

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OBS:

O bom esfregao deve ser fino e homogneo e ocupar da lmina O esfregao pode ser mais curto ou mais longo:

>ngulo extenso mais curta < ngulo extenso mais longa.

* A qualidade do esfregao influi muito na distribu io das clulas. Os resultados s sero comparveis se obtidos em esfregaos da mesma espes sura e colhidos rigorosamente dentro das mesmas condies. Finalidade do Esfregao Sanguneo:

* Avaliao morfolgica de eritrcitos, leuccitos e plaquetas (alterao de forma, tamanho, cor...); * Avaliao quantitativa de leuccitos (contagem diferencial). * Avaliao e quantificao de clulas imaturas quando presentes.

COLORAES USUAIS EM HEMATOLOGIA

1. Aplicao Clnica A colorao realizada sobre o esfregao sanguneo, feito no momento da coleta, para

que se possa proceder anlise morfolgica qualitativa e quantitativa das clulas sanguneas.

2. Princpio do Teste Romanowsky idealizou um mtodo em que uma soluo de corantes poderia corar

diferentes estruturas. Misturas dos corantes eosina e azul de metileno so preparadas segundo a proposio de vrios autores: Leishman, May-Grunwald, Giemsa, Wright e outros.

Estes corantes so dissolvidos em lcool, em geral metanol. Na soluo envelhecida, o azul de metileno se oxida em gradaes diferentes, originando diversos azures de metileno. Teremos ento uma soluo alcolica de um complexo eosinato de azul e azures de metileno. Tratada pelos corantes, a clula evidencia estruturas acidfilas, basfilas e neutrfilas, conforme a reteno do corante cido, bsico ou neutro, respectivamente. O ncleo celular cido pela presena de cido desoxirribonuclico (DNA), cora-se pelo azul de metileno, enquanto o citoplasma alcalino cora-se pela eosina. *Corantes cidos coram estruturas bsicas EOSINA cora eritrcitos e grnulos de eosinfilos. *Corantes bsicos coram estruturas cidas AZUL DE METILENO cora os ncleo dos leuccitos, citoplasma de linfcitos e moncitos, grnulos dos basfilos e fracamente os grnulos dos neutrfilos. O mtodo da colorao de May-Grunwald-Giemsa, associa o corante de May-Grunwald, pouco especfico para o ncleo, com o Giemsa que apresenta afinidade nuclear.

3. AMOSTRAS - Preparo prvio do paciente: no h necessidade de se colher sangue para o hemograma em jejum nos casos de dietas leves, contudo, em casos de refeies completas, deve-se aguardar pelo menos 3 horas.

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- Tipo de amostra: esfregao sanguneo, feito no momento da coleta, sem anticoagulante. - Estabilidade e armazenamento: quanto antes for realizada a colorao, melhor ser o resultado. - Critrio de aceitao e rejeio do material cole tado: o esfregao sanguneo dever ser feito preferencialmente com sangue sem anticoagulante. 4. Materiais, reagentes e equipamentos. - Esfregaos sanguneos secos - Suporte para colorao - Frascos conta-gotas - Relgio despertador (Timer) Corante de May-Grunwald - Eosina azul de metileno segundo May-Grunwald ------- 3,0g - Metanol -------------------------------------------------------------- 1.000ml Dissolver o corante no metanol e deixar em banho-Maria 37 oC por algumas horas, mexendo de vez em quando para uma completa dissoluo. Deixar envelhecer por no mnimo uma semana, em frasco escuro e filtrar antes do uso. A validade de 6 meses temperatura ambiente. Corante de Giemsa Soluo concentrada de azur-eosina azul de metileno adquirida comercialmente. Deve ser filtrada para o uso e diluda em gua tamponada na hora de usar, na proporo 1 gota para 1 ml de gua tamponada. Lote e prazo de validade encontram-se impressos na embalagem. A conservao a temperatura ambiente. gua Tamponada -Fosfato Monopotssico (KH2PO4) ---------------------------------1,0g -Fosfato Dissdico (Na2HPO4.2H2O) ----------------------------- 3,0g -gua destilada q.s.p --------------------------------------------------1.000 ml Dissolver completamente os sais na gua destilada, conferir o pH, que deve estar na faixa de 7, guardar em um frasco mbar. A validade de 3 meses a temperatura ambiente.

5. PROCEDIMENTO PARA A COLORAO DE MAY-GRUNWALD-GIEMSA - Colocar as lminas sobre o suporte com o esfregao voltado para cima - Cobrir toda a extenso das lminas com soluo do corante May-Grunwald. - Deixar por 5 minutos e ento escorrer o corante

- Cobrir as lminas com o corante de Giemsa recm diludo (1 gota de corante para 1 ml de gua tamponada) e deixar por 10 minutos.

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- Lavar a preparao abundantemente com gua corrente e retirar o excesso de corante aderido ao verso da lmina com algodo ou gaze embebido em lcool. - Deixar as lminas secar naturalmente em posio vertical, posicionando a cabea do esfregao para baixo.

6. LIMITAES DO MTODO - Os esfregaos devero estar perfeitamente secos. - A colorao dever ser realizada distante dos vapores cidos ou alcalinos para evitar variaes de pH, as quais iro influenciar na obteno de uma boa colorao. - Os tempos de colorao podem variar de acordo com as condies ambientais e qualidade do corante.

7. DETECTANDO ERROS NA COLORAO

O segredo de uma boa colorao est em descobrir o pH ideal e o tempo apropriado de fixao e colorao para a partida de corante. Dependendo de cada tipo de corante e de cada fabricante, o pH ideal muda.

O EXAME MICROSCPICO

O exame microscpico das extenses de sangue tem como objetivo: - Confirmar as contagens de hemcias, leuccitos e plaquetas; - identificar eventuais clulas anormais presentes no sangue; - realizar a contagem diferencial de leuccitos.

A inspeo da extenso feita em menor aumento (objetiva 10X). A qualidade da extenso e da colorao verificada. Devem ser pesquisados os microcogulos, responsveis por erros de contagens e a aglomerao de leuccitos maiores na ponta da extenso, responsvel por erros na contagem diferencial. A distribuio das clulas pela extenso deve ser sempre homognea, sem agrupamentos.

Os agrupamentos mais comuns so: - aglutinao de hemcias; - empilhamento ou rouleaux de hemcias; - agrupamento dos leuccitos; - agregados plaquetrios; - satelitismo plaquetrio ao redor dos neutrfilos. A identificao inicial das clulas feita no aumento maior (objetiva de 40X). Se realizada aps a contagem diferencial automatizada, deve confirmar a contagem e pesquisar a presena de clulas anormais. A contagem diferencial manual feita tradicionalmente em 100 leuccitos, deve ser feita em pelo menos 200 leuccitos para melhorar a preciso. Por exemplo: 50% de linfcitos contados em 100 leuccitos podem corresponder de 39,8 a 60,2%; em 200 leuccitos, de 42,9 at 57,1%; em 500 leuccitos, de 45,5 at 54,5%; e em 1.000 leuccitos, de 46,9 at 53,1%. A identificao final e contagem diferencial das clulas feita no aumento de imerso (objetiva de 100X). So achados importantes:

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- a variao da forma das hemcias (pecilocitose), a presena de hemcias macrocticas policromticas, eritroblastos e materiais remanescentes nas hemcias (corpsculos de Howell-Jolly e pontilhados basfilos); - nos neutrfilos jovens, alteraes txicas degenerativas (granulaes txicas) e os linfcitos atpicos reacionais; - as clulas neoplsicas (clulas anormais, blastos); - anomalias leucocitrias, hemoparasitas etc... fundamental correlacionar os achados do exame microscpico com os resultados: - extenses curtas com aproximao das hemcias esto relacionadas com policitemia, e extenses longas com afastamento das hemcias e anisopecilocitose esto relacionadas com anemia; - a variao do tamanho das hemcias, a anisocitose, est relacionada com aumento do RDW; a presena de microcitose, com diminuio do VCM e a presena de macrcito, com aumento do VCM; - as hemcias hipocrmicas esto relacionadas com a diminuio do CHCM e os esfercitos com o aumento do CHCM; - a policromasia est relacionada com aumento do VCM e de reticulcitos; - o nmero de leuccitos presentes em mdia nos campos de 400X quando multiplicado por 2.000 aproximadamente a leucometria; - o nmero de plaquetas presentes em 10 campos de imerso quando multiplicado por 13.000, aproximadamente a contagem de plaquetas.

CLULAS SANGUNEAS MORFOLOGIA

1 - Reconhecimento e Identificao Citomorfologia

Plaquetas Eritrcitos normais Leuccitos

o Neutrfilos Bastonete Segmentado

o Eosinfilo o Basfilo o Moncito o Linfcito

Plaquetas: So clulas pequenas e incompletas (3 a 4 m de tamanho(dimetro maior)

por 1 m de espessura, pois no tem material nuclear).

plaquetas

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Eritrcitos normais: Disco bicncavo anucleado (quando visto lateralmente) e forma circular (visto sobre a lmina de vidro), dimetro 6-9 m, apresentam halo central.

Leuccitos

Neutrfilos Bastonete Segmentado

Eosinfilo Basfilo Moncito Linfcito

Citomorfologia dos Leuccitos

500 X

Perguntar: A clula granulcito?

NO SIM

eosinfilo basfilo neutrfilo

Mononuclear

moncito linfcito

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1. GRANULCITOS (neutrfilos, eosinfilos e basfilos) Bastonete

Segmentado

Eosinfilo

Tamanho:14-20 m formato:oval/redondo cor do citoplasma: rseo granularidade:granulaes puntiformes (neutras) forma do ncleo:semi-circular Tipo de cromatina:condensada relao n/c:baixa nuclolo: no visvel ocorrncia sangue:

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Basfilo

RESUMINDO: GRANULCITOS (neutrfilos, eosinfilos e basfilos)

Ncleo: mesma forma de ncleo (cromatina condensada)

o Quando neutrfilo (bastonete/segmentado)

Citoplasma: abundante, a diferena est nas granulaes; o Eosinfilo: granulaes globosas (vermelha alaranjada) o Basfilo: granulaes grosseiras sobre o citoplasma e ncleo (azul-preta) o Neutrfilo: granulaes puntiformes (colorao neutra).

2. MONONUCLEARES

Linfcitos: Pequeno, mdio e grande

Linfcito grande

Tamanho:12-18 m formato:oval/redondo cor do citoplasma: rseo plido, coberto por grnulos. granularidade: granulaes grosseiras de tamanho varivel (prpura/negra)sobre citoplasma e ncleo. forma do ncleo: lobulado (pouco visvel) Tipo de cromatina:condensada relao n/c:baixa nuclolo: no visvel ocorrncia sangue:

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Linfcito pequeno Moncito

Mos obra: Identificao dos elementos figurados do sangue

*Material: Esfregao Sanguneo *Colorao: May-Grunwald-Giemsa (MGG) *Objetivo: Identificar os elementos figurados do sangue hemcias, neutrfilos (segmentados e bastonetes), linfcitos, moncitos, eosinfilos, basfilos e plaquetas. - Focalize a lmina

Objetiva 100X leo de imerso Condensador levantado e diafragma aberto.

- Esquematize os diferentes tipos celulares. - Observe detalhadamente:

a colorao das clulas, forma do ncleo, condensao da cromatina, presena de granulaes relao ncleo/citoplasma.

MGG 1000X

MGG 1000X

Tamanho:15-25 m formato:oval/redondo ou irregular cor do citoplasma:cinza-azul granularidade: ausentes forma do ncleo: irregular Tipo de cromatina: delicada, fina, com espaos claros e pontos de condensao relao n/c:moderada ou baixa nuclolo: no visvel ocorrncia sangue: 4-8% ocorrncia medula:

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Movimento em zigue-zague, at totalizar 100 leucci tos.

A microscopia deve ampliar com nitidez a imagem das clulas em campos adequados ,

prximos ao final da extenso de sangue, onde as clulas se encontram lado a lado, sem sobreposio conforme figura acima.

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CONTAGEM DAS CLULAS SANGUNEAS

Cmara de Neubauer (Hemocitmetro) A cmara consiste em uma lmina retangular de vidro espesso, contendo dois retculos na

poro central, separados longitudinalmente por um sulco profundo sobre a lmina. Transversalmente, quatro sulcos limitam trs plataformas. A central onde esto os retculos encontra-se deprimida 0,1 mm em relao s laterais, dando a profundidade da cmara, limitada superiormente por uma lamnula especial adaptada firmemente sobre as plataformas laterais. A lamnula opticamente plana e sem defeitos.

O retculo, na cmara de Neubauer, um quadrado de 3 mm de lado e 9 mm2 de superfcie dividido em nove reas de 1 mm2. O volume total da cmara de 0,9 mm3. Cada um dos 9 quadrados subdividido. Os quatro quadrados laterais so divididos em 16 pequenos quadrados, de 1/16 mm2. O quadro central est dividido em 25 quadros de 1/25, sendo cada um destes subdivididos em 16 quadrinhos de 1/400 mm2, totalizando 400 quadrinhos e 0,1 mm3 na rea central do retculo.

Preenchimento da Cmara Para conter o sangue diludo que ser depositado sobre o retculo a lamnula dever ser

fixada s plataformas da cmara. Isso ser conseguido umedecendo levemente as extremidades da lamnula que sero comprimidas com os polegares sobre a plataforma. O material diludo ser agora colocado, atravs da micropipeta entre o retculo e a lamnula. As caractersticas de um bom enchimento no permitem excessos, falta de lquido ou bolhas de ar na preparao, conforme ilustrado na figura abaixo.

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Distribuio das Clulas Sobre o Retculo

Sistematizao da Contagem

Aquelas clulas que tocam as linhas divisrias do quadro esquerda e superiormente so contadas para este quadro, enquanto os que tocam as linhas direita e inferiormente so contadas nos quadros respectivos ou desprezadas, se esto no limite extremo da rea a ser contada.

Uso correto da cmara de Neubauer nas contagens globais

A contagem manual em hemocitmetro ainda til para contagens de leuccitos, plaquetas (quando solicitadas separadamente, pois torna-se invivel inclu-la no hemograma automatizado) e eritrcitos (em anmicos) em laboratrios sem automao. Ela indispensvel para plaquetopenias graves (< 40.000 plaquetas/mm3) como forma de liberar resultados confiveis em contagens nas quais h discrepncias entre o resultado automatizado e a estimativa no esfregao. Para obter contagens reprodutveis, no conveniente que o nmero de clulas contadas no retculo (cmara) seja superior a 1.000 e inferior a 100. Casos em que a contagem da clula em questo, em seu local apropriado para contagem, seja maior que 1.000 merecem diluies elevadas. Contagens inferiores a 100 clulas merecem diluies menores e/ou maior rea do retculo analisada.

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HEMOGRAMA

O hemograma corresponde a um conjunto de testes lab oratoriais que estabelece os aspectos quantitativos e qualitativos dos eritrcit os (eritrograma), dos leuccitos (leucograma) e das plaquetas (plaquetograma) no san gue. I - Eritrograma : inclui os testes laboratoriais que determinam o perfil hematolgico da srie vermelha no sangue perifrico. constitudo por: - Contagem de eritrcitos; - Dosagem de Hemoglobina; - Hematcrito; - ndices Hematimtricos (VCM, HCM, CHCM, RDW); - Avaliao da morfologia eritrocitria (esfregao sanguneo corado). II - Leucograma: engloba os testes laboratoriais que determinam o perfil hematolgico da srie branca (leuccitos) no sangue perifrico. constitudo por: - Contagem Global e Diferencial de Leuccitos - Anlise morfolgica no esfregao sanguneo. III - Plaquetograma: Envolve a contagem de plaquetas e a avaliao da sua morfologia feita por microscopia no esfregao sanguneo.

Tanto o eritrograma, o leucograma e o plaquetogram a podem ser determinados por tcnicas manuais e automatizadas.

TCNICAS MANUAIS

A Homogeneizao do Sangue A sedimentao ocorre espontaneamente nos tubos de coleta mantidos nas estantes. Inicialmente, a parte superior fica mais diluda e a parte inferior mais concentrada. Se analisadas, resultaro em uma falsa anemia e uma falsa policitemia, respectivamente. Posteriormente, com a deposio das hemcias no fundo do tubo de coleta, o plasma fica visvel na parte superior do tubo. A homogeneizao do sangue necessria antes de qualquer procedimento e realizada com movimentos que deslocam uma bolha de ar por todo o tubo, do topo at o fundo, promovendo a mistura entre o plasma e as clulas. Essa pode ser feita manual ou em homogeneizadores mecnicos de bancada. Independente do modo, a homogeneizao deve ter a eficincia documentada por testes de reprodutibilidade de resultados. Os tubos de coleta preenchidos at quase o topo e as amostras com hematcrito elevado demoram mais para atingir a homogeneizao correta.

Forma correta de homogeneizao

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ERITROGRAMA

1 - CONTAGEM DE HEMCIAS

AMOSTRA Sangue total em EDTA 10% MATERIAL - Pipeta graduada de 5 ml - Micropipeta 20l - Ponteiras - Tubo de hemlise - Cmara de Neubauer - Microscpio ptico REAGENTES Lquido de Hayem Sulfato de Sdio ..................................................................................... 2,5 g Cloreto de Sdio .....................................................................................0,5 g Bicloreto de Mercrio ............................................................................. 0,25 g gua destilada q.s.p. ...............................................................................100,0 ml Filtrar e conservar a temperatura ambiente PROCEDIMENTO TCNICO - Em um tubo de hemlise pipetar 4 ml de lquido diluidor; - Transferir para o tubo contendo o lquido diluidor 20 l de sangue homogeneizado; - Agitar suavemente com o auxlio de uma micropipeta e homogeneizar por inverso; - Preencher o retculo da cmara evitando o excesso de lquido e bolhas de ar; - Fazer a contagem com objetiva de 10X, no retculo central da cmara, nos cinco quadrados indicados na figura com a letra H; - Sistematizar a contagem; - Calcular o nmero de eritrcitos/ mm3 (L)

Clculo do nmero de hemcias/mm 3 de sangue

Hemcias/mm3 de sangue = Y x 5 x 10x 200 Hemcias/mm3 de sangue = Y x 10.000

Onde: Y = nmero de hemcias contadas (80 quadradinhos) 5 = fator de converso para 1 mm2 (rea) 10 = fator de converso para 1 mm (altura) e 200= fator de converso da diluio

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O erro permitido varia entre 200.000 a 300.000 hem cias/mm 3, ou em torno de 12% quando a contagem feita vrias vezes na mesma pre parao. OBSERVAES

*Apesar de trabalhosa, a contagem manual de eritrcitos em cmara de Neubauer (em triplicata) ainda utilizada em laboratrios de pequeno porte e sem automao.

*Pelo fato de os leuccitos no serem lisados nos procedimentos de diluio, esto

presentes na contagem dos eritrcitos. Em casos de hiperleucocitoses, a experincia em diferenciar leuccitos de eritrcitos no hemocitmetro importante.

Valores de Referncia Homem 4,5 a 6,0 milhes /mm3 Mulher 4,0 a 5,5 milhes /mm3

Recm-nascidos 4,0 a 6,0 milhes /mm3

2 - DETERMINAO DO HEMATCRITO

MTODO Micromtodo microhematcrito Corresponde ao volume compacto das hemcias em relao ao volume total de sangue. AMOSTRA Sangue total em EDTA 10% MATERIAL - Tubos capilares resistentes e de dimetro uniforme - Grfico de leitura - Bico de gs - Centrfuga para microhematcrito PROCEDIMENTO TCNICO - Preencher com sangue o tubo capilar de 75 mm de comprimento at cerca de 2/3 do seu volume, limpar o capilar com papel absorvente. - Selar a extremidade vazia,(parte oposta que foi utilizada para aspirao do sangue) do tubo na chama (Bico de Bunsen). Mant-lo horizontalmente e perpendicular chama. - Colocar o tubo capilar na centrfuga de microhematcrito com a parte selada voltada para fora, equilibrando-o com outro tubo. Observar a numerao evitando a troca de amostras. - Centrifugar por 11.000 rpm, por 5 minutos. - Leitura feita atravs de escala prpria. - Colocar o tubo sobre a escala, fazendo coincidir o menisco inferior das hemcias com linha zero e o menisco superior do plasma com a linha 100 e fazer a leitura ao nvel da separao entre plasma e hemcias sedimentadas, desprezando-se a camada leucocitria.

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Recomenda-se uma segunda centrifugao para hematcrito acima de 50%. O microhematcrito at 3% maior que o hematcrito calculado (automatizado), devido ao

plasma retido entre as hemcias compactadas aps a centrifugao.

VALORES DE REFERNCIA

Homem 40 a 54% Mulher 37 a 47% Recm-nascidos 44 a 64% Crianas (at 3 meses) 32 a 44% Crianas (at 1 ano) 30 a 40% Crianas (3 a 6 anos) 36 a 44% Crianas (10 a 12 anos) 37 a 45%

DACIE e LEWIS

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3 - DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FUNDAMENTO Tem por princpio bsico a oxidao do on ferroso (divalente), da hemo, da oxi e da carboxihemoglobina a ferro frrico (trivalente), pelo ferricianeto, com formao de metahemoglobina, que se combina com o cianeto de potssio para produzir cianometahemoglobina (cor vermelho - alaranjada), medida fotocolorimetricamente em 540 nm. MTODO Cianometahemoglobina AMOSTRA Sangue total em EDTA 10% MATERIAL - Micropipeta 20l - Pipeta de 5 ml - Ponteiras - Tubo de hemlise - Espectrofotmetro - Soluo padro de hemoglobina REAGENTES Drabkin Modificado K3Fe (CN)3 ........................................................................ 200 mg KCN .....................................................................................50 mg KH2PO4 ...............................................................................140 mg STEROX SE ........................................................................ 0,5 mg gua destilada q.s.p. ............................................................ 1.000 ml Acondicionar em frasco de vidro escuro e conservar a temperatura ambiente. PROCEDIMENTO TCNICO - Em um tubo de hemlise pipetar 5 ml de lquido diluidor; - Transferir para o tubo contendo o lquido diluidor 20 l de sangue homogeneizado; - Agitar suavemente com o auxlio de uma micropipeta e homogeneizar por inverso, aguardar 5 minutos para a leitura; - A leitura feita em espectrofotmetro calibrado em 540 nm; - Fazer o mesmo com o sangue padro com concentrao conhecida. O branco ser a prpria soluo de Drabkin; a cor estvel por 72 horas; o procedimento de diluio do padro o mesmo da amo stra. CLCULO

Concentrao de hemoglobina = D.O x Fator

O fator dever ser obtido a partir da soluo padro, baseado no seguinte procedimento: - Inicialmente transformar o valor do padro, expresso no rtulo em mg/dl para g/dl, dividindo por 1.000 e multiplicando pelo fator de diluio (250). Ex: Soluo padro da BIOLAB-HEMATROL Concentrao do Padro = 60mg/dL Conc. Padro = 60 x 250/1.000 Conc. Padro = 15 g/dL Em seguida preparar uma srie de 06 tubos com diferentes pontos de diluio. Exemplo:

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TUBOS

Soluo Padro

de Hb (mL)

Soluo Drabkin

modificado (mL)

[ ] Hb (g/dL)

D.O

FATOR

01 5 0 15,0 29,0 0,51

02 4 1 12,0 23,0 0,52

03 3 2 9,0 18,0 0,50

04 2 3 6,0 12,0 0,50

05 1 4 3,0 6,0 0,50

06 0 5 -------- ------- ---------

(FATOR MDIO = 0,50)

F = [ ]/D.O [ ]HB = F x D.O

Fator de correo extremamente importante dosar em triplicata, uti lizando a mdia das absorbncias para o clculo do fator de correo . Comentrios

Determinaes em duplicata no devem ter diferena superior a 0,3g/dl; nas determinaes manuais, ter sempre o cuidado de usar tubos limpos e apropriados para o espectrofotmetro.

Valores de Referncia

Homens 14 a 18 g/dl Mulheres 12 a 16g/dl

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4 - NDICES HEMATIMTRICOS

Relacionando-se os resultados da contagem de hemcias, da dosagem de hemoglobina e das determinaes do hematcrito, obtm-se os ndices hematimtricos, que so de grande importncia na avaliao da srie vermelha. Os principais ndices hematimtricos usados na rotina so:

VCM (Volume Corpuscular Mdio)

VCM = Ht / No de hemcias (milhes) x 10

HCM (Hemoglobina Corpuscular Mdia)

HCM = Hb / No de hemcias (milhes) x 10

CHCM (Concentrao de Hemoglobina Corpuscular Mdia)

CHCM = Hb/Ht x 100

Valores de Referncia

VCM: 80 a 96 fL VCM < 80 MICROCITOSE VCM > 94 MACROCITOSE

HCM: 27 a 32 pg HCM < 27 HIPOCROMIA E MICROCITOSE HCM > 32 MACROCITOSE

CHCM: 32 a 36 % CHCM < 32 HIPOCROMIA CHCM > 36 ESFEROCITOSE

Definies

*Anisocitose: o aumento da variabilidade do tamanho das hemcias. *Microcitose: a diminuio do tamanho mdio das hemcias. *Macrocitose: o aumento do tamanho mdio das hemcias. *Hipocromia: a diminuio da colorao das hemcias com conseqente aumento da regio de palidez central das mesmas. *Policromasia: descreve as hemcias que tem colorao rseo-azulada ou rseo acinzentada. *Pecilocitose ou poiquilocitose: refere-se presena significativa de hemcias de forma anormal.

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LEUCOGRAMA 1 - CONTAGEM GLOBAL DE LEUCCITOS

AMOSTRA Sangue total em EDTA 10% MATERIAL - Pipeta com divises de 0,01ml - Micropipeta 20l - Tubo de hemlise - Cmara de Neubauer - Microscpio ptico REAGENTES Lquido de Turk cido actico glacial .....................................................................................3,0 ml Violeta de Genciana ou Azul de metileno (sol. Aquosa 1%).........................1,0 ml gua destilada q.s.p. ....................................................................................100,0 ml PROCEDIMENTO TCNICO - Em um tubo de hemlise pipetar 0,4 ml de lquido diluidor; - Transferir para o tubo contendo o lquido diluidor 20 l de sangue homogeneizado; - Agitar suavemente com o auxlio de uma micropipeta; - Preencher o retculo da cmara evitando o excesso de lquido e bolhas de ar; - Deixar sedimentar por 3 minutos; - Fazer a contagem com objetiva de 10X, nos quatro retculos laterais da cmara; - Sistematizar a contagem; - Calcular o nmero de leuccitos/ mm3

A contagem dos leuccitos realizada nos quatro re tculos laterias da cmara de Neubauer, indicados na figura com a letra L.

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CLCULO

Leuccitos/mm3 de sangue = Y x 20 x10/ 4

Leuccitos/mm 3 de sangue = Y x 50

Onde: Y = nmero de leuccitos contados 20 = fator de converso da diluio 10 = fator de converso da altura da cmara 4 = fator de converso da rea.

Valores de Referncia

Adultos 5.000 a 10.000/mm3

Recm-nascidos 10.000 a 25.000/mm3 Crianas at 1 ano 6.000 a 18.000/mm3

Crianas de 4 a 7 anos 6.000 a 15.000/mm3 CARVALHO

OBSERVAES Interferncia dos Eritroblastos na Contagem Global de Leuccitos como clulas nucleadas, os eritroblastos no so lisados pelo lquido de Turk e so contados indistintamente como leuccitos na cmara de Neubauer. Desse modo, sua presena em sangue perifrico ocasiona um aumento do nmero real de leuccitos. CORREO Durante a contagem diferencial, enumerar separadamente o total de eritroblastos (esses no so includos entre os 100 leuccitos da contagem diferencial).

Leuccitos corrigidos = 100 x No de leuccitos/ 100 + No de eritroblastos em 100 leuccitos

* Colocar no hemograma a observao: presena de X er itroblastos em 100 leuccitos.

2 - CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCCITOS

realizada em esfregaos de sangue (os valores porcentuais obtidos so inteiros, pois so determinados com base na contagem de 100 clulas) corados pelos derivados de Romanowsky por meio de microscopia ptica. Os valores absolutos de cada subtipo leucocitrio so estabelecidos por regra de trs simples, baseada na contagem global e nos valores relativos (percentual) de cada subtipo de leuccito observado ao esfregao. Para amostras normais ela menos precisa que a automatizada, pois os contadores estabelecem os valores relativos aps contagem de um nmero muito maior de clulas. A contagem diferencial por microscopia inadequada para determinar eosinopenia, basopenia e/ou monocitopenia. Para amostras alteradas, entretanto, o mtodo de referncia, pois no h exatido na contagem automatizada quando clulas imaturas ou clulas anmalas esto presentes na amostra.

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So atribuies especficas da microscopia: - Escalonar os neutrfilos em segmentados, bastonetes, metamielcitos, mielcitos e promielcitos e mieloblastos. - Forma correta de avaliar, com segurana se h ou no alteraes diplsicas eritrides e leucocitrias, hipo ou hipergranulao neutroflica, hipo ou hipersegmentao neutroflica. - Forma mais til de descrever os tipos de atipias leucocitrias e eritrocitrias - nica forma de descrever morfologia dos blastos no sangue.

PROCEDIMENTO

Objetiva 100X leo de imerso Condensador levantado e diafragma aberto. A microscopia deve ampliar com nitidez a imagem das clulas em campos adequados, prximos ao final da extenso de sangue, onde as clulas se encontram lado a lado, sem sobreposio.

PLAQUETOGRAMA

CONTAGEM DE PLAQUETAS

MTODO Mtodo Direto AMOSTRA Sangue total em EDTA 10% MATERIAL - Tubo de plstico 12X75 mm - Micropipeta 20l - Pipeta de vidro de 1 ml - Cmara de Neubauer - Placa de Petri - Microscpio REAGENTES Soluo de Oxalato de amnio a 1% Oxalato de amnio .......................................1,00g gua destilada qsp ......................................... 100 ml Azul de metileno a 1% ..................................... 2 gotas EDTA a 1%....................................................... 2 gotas Guardar em geladeira PROCEDIMENTO TCNICO - Pipetar 0,4 ml de soluo diluidora no tubo de plstico; - Transferir 20l de sangue para o tubo com a soluo diluidora (1:20) - Homogeneizar suavemente sem formar espuma e aguardar 5 minutos; - Homogeneizar novamente e encher a cmara de Neubauer; - Colocar a cmara numa placa de petri contendo algodo mido, deixando a preparao por 20 minutos, para sedimentao das plaquetas; - Fazer a contagem microscpica com aumento de 200X ou 400X em 1/5 de mm2 (5 quadrados do quadro central). Sistematizar contagem!

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CLCULO

Nmero de plaquetas/mm3= N X 20X 10 X 5 Nmero de plaquetas/mm 3= N X 1000

N= nmero de plaquetas contadas 20= ttulo de diluio 10= fator de converso da profundidade da cmara 5= fator de converso da rea da cmara

Valor de Referncia

150.000 a 400.000/mm3

OBSERVAES: - Um bom critrio de qualidade para obteno de resultados reprodutveis obter a contagem de pelo menos 150 (200) plaquetas ao final da contagem dos cinco quadrantes do quadrado central. - Para amostras plaquetopnicas, podero ser utilizados os protocolos que incluam diluies de 1:10 ( 20l sangue para 180l do diluente). Nmero de plaquetas/mm3= N X 500 - Casos gravemente plaquetopnicos em que, mesmo com a utilizao da diluio 1:10, no seja possvel contar pelo menos 150 plaquetas, fazer contagem em todo o retculo central. Nmero de plaquetas/mm3= N X 100 Estimativa grosseira do n de plaquetas no esfrega o sanguneo

- Contar 10 campos do esfregao corado - Multiplicar por 13.000 = n de plaquetas / l

VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAO (VHS) Mtodo de Westergreen

AMOSTRA Sangue total em EDTA 10% MATERIAL - Pipetas de Westergreen - Relgio marcador de tempo - Suporte apropriado para as respectivas pipetas PROCEDIMENTO TCNICO - Homogeneizar o sangue e encher a pipeta de Westergreen com o mesmo at a marca zero. - Colocar a pipeta na posio vertical, fixando-a no suporte apropriado. - Marcar o tempo.

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- Aps 1 hora, ler a coluna de plasma formada, desde a marca zero at o nvel de encontro com as hemcias. - Expressar o resultado em mm OBSERVAO:

O teste dever ser realizado at 6 horas aps a colheita do sangue A conservao do sangue aps o perodo preconizado retarda a hemossedimentao

Valores de Referncia (Segundo MOURA 1977) Sexo masculino 0-15 mm Sexo feminino 0-20 mm Crianas 0-10 mm

Suporte com pipetas de Westergreen para VHS

A verificao da sedimentao das hemcias atravs da velocidade de

hemossedimentao (VHS) pode ser clinicamente til em algumas doenas com atividade inflamatria. Nos processos inflamatrios, as globulinas aumentadas no plasma, principalmente o fibrinognio, interferem diminuindo a repulso entre as hemcias e favorecendo a aproximao.

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TESTE DE FALCIZAO

FUNDAMENTOS Entre lmina e lamnula lacrada por meio de esmalte e em presena de um agente redutor (Metabissulfito de sdio), as hemcias que contm Hb S se cristalizam e adquirem a configurao peculiar de foice, enquanto as hemcias normais no se falcizam. A falcizao se explica pela polimerizao de desoxiemoglobina S. Um teste positivo necessrio para confirmar se uma hemoglobina que migra ao nvel de S, por eletroforese alcalina, realmente esta hemoglobina. MTODO Daland e Castle AMOSTRA Sangue total em EDTA 10% MATERIAL - Microscpio - Lminas e lamnulas - Pipetas de Pasteur - Placas de Petri - Esmalte de unhas REAGENTES Soluo de Metabissulfito de Sdio a 2% Metabisulfito de sdio ............................ 20mg gua destilada ......................................... 1,0 ml Esta soluo deve ser preparada no momento de realizar o teste PROCEDIMENTO TCNICO - Misturar em uma lmina de microscopia uma gota de sangue colhido em EDTA e uma da soluo de metabisulfito de sdio a 2%. - Cobrir a preparao com lamnula, vedando-a com esmalte de unha, para impedir a entrada de oxignio. Deve-se tambm evitar a formao de bolhas de ar. - Conservar a preparao em cmara mida (placa de petri com algodo embebido em gua) - Observar em microscpio com 400X de aumento, aps 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas de incubao. EXPRESSO DO RESULTADO dado como positivo ou negativo Precaues

A cmara mida deve ser colocada em lugar fresco, temperatura ambiente; A vedao da lmina e lamnula fundamental A concentrao do metabisulfito, bem como sua preparao no momento de uso so

pontos crticos.

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TESTE POSITIVO DE FALCIZAO

RELATRIO DE RESULTADOS A falcizao se explica pela polimerizao de desoxihemoglobina S. Um teste positivo necessrio para confirmar se uma hemoglobina que migra ao nvel da S, por eletroforese alcalina, realmente esta hemoglobina. O fenmeno da falcizao (teste positivo) ocorre em portadores de Hb S, com variao de tempo entre os diferentes tipos: HbSS (1 a 3 horas); Hb SC e HbSD (6 a 12 horas); Hb S/talassemia beta (12 a 24 horas); Hb AS (12 a 24 horas). Entretanto esta relao falcizao / gentipo / tempo no constante e tambm no serve para caracterizar gentipo. Aps 24 horas, na ausncia de eritrcitos falcizado s, o resultado ser dado como negativo. LIMITAES DO MTODO - A hemoglobina fetal aumentada, em associao com hemoglobina S, prejudica a falcizao.

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CONTAGEM DE RETICULCITOS

FUNDAMENTOS

Os reticulcitos so hemcias jovens que, quando coradas com corantes supravitais, esses se agregam aos ribossomos remanescentes da hemcia, formando um precipitado na forma de uma rede. Os reticulcitos compreendem uma fase intermediria das hemcias entre a perda do ncleo pelos eritroblastos, ainda na MO (permanecendo ainda ali por trs dias) e um dia no sangue circulante, onde os ribossomos remanescentes vo diminuindo, at o estgio de hemcias maduras. Heilmeyer classificou os retculcitos em quatro grupos I a IV, de acordo com a agregao do corante. Normalmente, cerca de 1% das hemcias no sangue so reticulcitos, principalmente dos tipos III e IV com menos precipitados. Nos processos de aumento da eritropoese, a porcentagem de reticulcitos no sangue aumenta e surgem os reticulcitos dos tipos I e II com mais precipitados, chamados de reticulcitos desviados, associados com a presena de macrcitos policromticos e eventuais eritroblastos.

MTODO Colorao Supra Vital AMOSTRA Sangue total em EDTA 10% MATERIAL - Tubo de hemlise - Lminas para microscopia - Pipetas de Pasteur - Microscpio - leo de imerso REAGENTE * Soluo Corante de Azul de Cresil Brilhante Azul de cresil brilhante .................................1g Citrato de sdio ............................................... 0,4g Cloreto de sdio ............................................... 0,85g gua destilada q.s.p. ....................................... 100 ml Filtrar antes do uso. Renovar a soluo a cada 3 a 6 meses. PROCEDIMENTO TCNICO - Colocar 3 gotas da soluo corante num tubo de hemlise - Adicionar 6 a 9 gotas de sangue,dependendo do hematcrito do paciente - Agitar suavemente e incubar por 1 hora em banho-Maria a 370C - Homogeneizar suavemente e fazer os esfregaos - Secar os esfregaos e proceder a contagem com objetiva de imerso. Se preferir, corar os esfregaos com o corante de Leishman ou Giemsa - Contar 1.000 hemcias, anotando o nmero de reticulcitos encontrados - Expressar o resultado em porcentagem.

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CALCULOS O nmero de reticulcitos no sangue pode ser relatado de modo relativo:

% de reticulcitos= No de reticulcitos / No de hemcias X 100

VALORES DE REFERNCIA Adultos - 0,5 a 1,5% (2,0%) Recm nascido at 10%

Ou preferencialmente de modo absoluto:

Reticulcitos/l = % de reticulcitos/100 x No de hemcias

VALORES DE REFERNCIA Adultos 25.000 a 85.000/ mm3

Recm nascido 100.000 a 300.000 mm3 Clinicamente, pode ser de interesse a correo dos reticulcitos: 1) Para a anemia: Reticulcitos corrigidos (%) = % de reticulcitos x hematcrito do paciente/hematcrito normal 2) Para os reticulcitos desviados: ndice reticulocitrio (IR) = reticulcitos corrigidos (%)/ dias em circulao OBS os dias em circulao so estimados em relao ao hematcrito:

Hematcrito

Dias

45% 1 dia

35% 1 dia e

25% 2 dias

15% 2 dia e

O IR se correlaciona com o nmero de eritroblastos na MO com resposta adequada, isto ,

com a eritropoese eficaz. IRou igual 3 indica aumento da produo eritride medular suficiente para o grau de

hemlise ou resposta apropriada das anemias por baixa produo em tratamento.

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COAGULOGRAMA

Consiste em uma srie de exames de triagem utilizad os para avaliar a hemostasia.

Tempo de coagulao (TC) Tempo de sangramento (TS) Prova do lao (PL) Retrao do cogulo (RC) Tempo de protrombina (TAP ou TP) Tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPA) Avaliao de plaquetas

Cuidados na coleta e realizao dos exames:

Informao sobre medicaes; Coleta do sangue em tubos adequados; Coleta do sangue por pessoas experientes; Coleta do sangue usando o anticoagulante adequado; As provas devem ser realizadas at 2 horas aps a c oleta;

Tempo de coagulao (TC) o tempo que o sangue leva para coagular em um tubo de ensaio a 37C, o TC mede a

via intrnseca da coagulao sangnea.

Mtodo Lee e White VR: 4 a 10 minutos

Valor interpretativo do tempo de coagulao:

O TC um teste bastante grosseiro e sujeito a muitas interferncias, como: dimetro do tubo, comprimento deste tubo, o ngulo de inclinao que dado ao tubo quando se verifica a formao do cogulo, temperatura do banho-maria e tem influncia da coleta.

Coletas traumticas ou garroteamento prolongado, interferem no TC. Hemoflicos leves e moderados no apresentam alterao nos valores do TC. um erro bastante grave adotar um procedimento cirrgico baseado apenas no TC

e TS.

Tempo de sangramento (TS) o tempo necessrio para estancar uma hemorragia provocada por um estilete nos vasos

de pequeno calibre. O teste fornece dados relativos funo e nmero de plaquetas e a resposta da parede capilar leso. Ao praticar a leso em um capilar, h de imediato o fenmeno de contrao e agregao de plaquetas no local do vaso lesado, estas iro formar um tampo plaquetrio obstruindo a parede lesada fazendo com que o sangramento seja estancado.

MTODO Duke

MATERIAL - Lancetas para puno digital; - Papel de filtro com 5 cm de dimetro; - Cronmetro; - Algodo embebido com lcool 70%;

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PROCEDIMENTO - Fazer anti-sepsia do lbulo da orelha com lcool 70%; - Fazer uma inciso no lbulo da orelha com a lanceta suficientemente funda para que o sangue flua sem presso; - Quando aparecer a primeira gota de sangue disparar o cronmetro; - A cada 30 segundos remover o sangue com auxlio de um papel de filtro sem tocar na leso; - Quando o sangue deixar de manchar o papel, parar o cronmetro; - Anotar o tempo.

VALORES DE REFERNCIA Normal 1 a 3 minutos

OBSERVAES

O TS um teste bastante importante porque mede a hemostasia primria "in vivo" e por isto deve ser feito com bastante rigor tcnico.

Os profissionais que realizam o TS devem ser treinados e reciclados periodicamente. O TS particularmente sensvel as alteraes plaquetrias tanto quantitativas como

qualitativas. O TS especfico para a hemostasia primria, no mede, portanto, nenhuma via da

coagulao. O TS importante no coagulograma seja com finalidade pr-operatria ou diagnstica,

quando realizado do modo correto. O tempo de sangria avalia a interao da plaqueta com a parede do vaso sanguneo e a

formao subsequente do cogulo hemosttico de modo independente da cascata da coagulao.

Existe uma relao quase linear entre a contagem de plaquetas e o tempo de sangria. Utiliza-se como teste de rastreio para a Doena de vW e para Disfunes Plaquetrias

(congnitas ou adquiridas). No discrimina defeitos vasculares de trombocitopenia ou de disfuno plaquetria. No se correlaciona com a perda de sangue durante a cirurgia nem com a necessidade de

transfuses.

Prova do lao (PL) A Prova do Lao ou Prova de Fragilidade Capilar, um teste que procura avaliar a capacidade

dos vasos de resistirem a uma presso. A prova avalia uma das funes pertinentes parte vascular da hemostasia.

MTODO Rumpel e Leed

MATERIAL - Esfgnomanmetro; - Caneta; - Cronmetro. PROCEDIMENTOS - Observar o antebrao verificando a presena de possveis petquias, caso existam contorn-las com caneta. - Adaptar o esfgnomanmetro ao brao do paciente por 5 minutos a presso entre 9-10 mmHg; - Aps a retirada do aparelho aguardar 10 a 2 minutos at que a circulao normalize, em seguida observar as petquias formadas na regio do antebrao, pulso e mos. RESULTADO

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dado como positivo ou negativo, considerado normal o aparecimento de no mximo 5 petquias.

OBSERVAES: -Antes de se iniciar o teste deve-se observar a rea abaixo da dobra do cotovelo, para ver se no existe alguma mancha, pintas ou pequenas leses que posteriormente possam ser confundidas com petquias. -Recomenda-se que seja aguardado um tempo de pelo menos 1-3 minutos, aps a retirada da presso, para que se faa a leitura do teste.

Retrao do cogulo (RC) A retrao do cogulo fornece dados relativos atividade plaquetria. Uma retrao pequena corresponde a um nmero de plaquetas abaixo de 100.000/mm3 de sangue. Nas deficincias funcionais das plaquetas a prova pode estar alterada em presena de um nmero normal de plaquetas. MATERIAL - Tubo de hemlise; - Rolha de borracha ou papel parafilme; - Banho Maria 37 C; - Relgio. PROCEDIMENTOS - Colher 4 ml de sangue venoso e imediatamente aps, distribuir em 2 tubos de hemlise; - Cobrir os tubos com parafilme ou tampar com rolha de borracha e coloc-los em banho Maria a 37 C. Observar a retrao do cogulo aps 2 horas. OBSERVAES

Aps a coagulao do sangue, o cogulo formado retrai-se ou mais precisamente, retrai-se a rede de fibrina, retendo os elementos figurados do sangue e liberando a parte lquida, o soro.

A retrao do cogulo devida liberao de substncias, pelas plaquetas nos pontos de interseco das malhas da rede de fibrina.

A retrao de cogulo est relacionada diretamente ao nmero e funcionalidade das plaquetas e inversamente proporcional ao grau de anemia.

Mede especificamente a hemostasia primria. RESULTADO

A retrao do cogulo poder ser completa (total), parcial ou nula No caso da retrao total , o cogulo dever ter se desprendido circularmente das paredes

do tubo, bem como do fundo, ficando preso a superfcie circular, o que se observa pela transparncia do soro entre o cogulo central e a parede do tubo.

No caso da retrao parcial , o cogulo no se desprende totalmente das paredes e fundo do tubo e sim somente de parte dele.

No caso de retrao nula , no ocorre nenhuma retrao do cogulo.

CUIDADOS

Quando no ocorre retrao do cogulo nas duas horas, deve-se deixar o tubo em banho-maria at 24 horas, para ento liberar o resultado de cogulo no retrtil (irretrtil).

Deve-se ter a certeza de que os tubos utilizados neste teste esto limpos.

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Realiza-se o teste em duplicata para evitar erros que podem ocorrer em funo de resduos de material de limpeza imperceptveis que podem afetar o resultado. Pode acontecer de a retrao ser total em um tubo e nula em outro, o que demonstra que no tubo em que no houve retrao havia algum interferente. Mesmo assim se a dvida persistir, deve-se repetir a coleta e realizar novamente o teste.

Tempo de Protrombina (TAP ou TP) O teste tempo de protrombina a prova de escolha para a investigao do sistema extrnseco

da coagulao, permitindo revelar deficincias dos fatores que tomam parte deste sistema (I,II,V, VII e X) e via comum .O teste de TAP mede o tempo necessrio para um cogulo de fibrina se formar em uma amostra de plasma citratado aps a adio de ons de clcio e tromboplastina de tecido (fator III).

MTODO Quick

utilizado principalmente para:

Monitorar a terapia com anticoagulantes orais, Triagem para distrbios da coagulao, Prova de funo heptica Pr-operatrio

AMOSTRA - A agulha deve penetrar diretamente a veia e na primeira tentativa. No se deve realizar os testes em amostra cuja puno foi difcil (traumtica); - Misturar cuidadosamente o sangue por inverso (juntamente com o citrato de sdio), centrifugar o mais rpido possvel por 10 minutos a 3.000 rpm. Separar o plasma e deixar a temperatura de 20-25 C at a realizao do teste. MATERIAIS - Pipeta de Pasteur plstica; - Tubos de hemlise de plstico; - Crnometro; - Pipetas de preciso de 100 e 200l; - Cubetas plsticas para coagulmetro Quick Timer Drake; - Coagulmetro Quick Timer- Drake. REAGENTES - Tromboplastina clcica liofilizada: deve ser diluda com gua deionizada e incubada segundo as recomendaes da bula do reagente; - Plasmas controle normal e anormal ou pool de plasmas coletados no prprio laboratrio e imediatamente centrifugados e aliquotados em amostras que devem ser congeladas, tendo validade de 30 dias. PROCEDIMENTOS - Uma vez ligado o Quick Timer entra em aquecimento, permanecendo assim at que o bloco atinja temperatura mnima de trabalho (36,2 C). Com exceo da tecla RES, que permite consultar resultados anteriores, todas as outras ficaro desabilitadas durante o aquecimento. Aps o aquecimento pressione a tecla test e aparecer no visor o menu de testes. Selecione o TP.

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- Coloque 100l de plasma de controle e de cada paciente respectivamente, em uma cubeta plstica de leitura contendo uma barrinha metlica. Incube por exatamente 1 min cada amostra. Coloque ento a primeira amostra no poo de leitura e adicione 200 l de tromboplastina clcica preparada de acordo com as recomendaes do fabricante. Ao final da reao aparecer no visor o resultado em segundos e porcentagem de atividade. Apertar a tecla INR para obter o resultado em INR. Repetir o procedimento para as amostras de cada paciente. - Os resultados alterados devero ser repetidos para confirmao. Se houver alguma dvida em relao ao resultado ou incoerncia com relao ao uso de medicamentos pelo paciente, deve-se solicitar uma nova coleta do material.

Como expressar o resultado? Tempo em segundos (VR 10-14s depende do kit) % de atividade (VR 70-100%) INR (relao normatizada internacional): (Tempo do paciente\tempo do pool 100%) ISI Quanto mais baixo o ISI (International Sensitivity Index), maior a sensibilidade da tromboplastina (qto mais perto de 1,0 melhor) (VR at 1,2)

Plasma (100 l)

37C/2 + Tromboplastina clcica 200 l

Tempo de formao do cogulo (s)

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REFERENCIAIS DE ALVOS TERAPUTICOS Maioria das situaes com indicao de anticoagulao 2.0-3.0 Preveno e tratamento de trombose venosa Embolia pulmonar, sistmica Embolia arterial ps-operatria Infarto agudo do miocardio Doena de vlvula cardaca Fibrilao atrial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Prtese cardaca 2.5-3.5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Formas recidivantes de trombose venosa profunda 3.0-4.0 Formas recidivantes de embolia pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPA)

o tempo de coagulao do plasma aps recalcificao na presena de um substituto

plaquetrio (cefalina) e de um ativador (derivado do cido elgico). Pesquisa os fatores da coagulao do sistema intrnseco e comum (I,II,V, VIII, IX, X, XI, XII)

Utilizado para: Testes de triagem; Deteco de deficincia de fatores da coagulao da via intrnseca ou comum; Deteco de inibidores dos fatores das vias comum e intrnseca; Monitorar a anticoagulao com heparina (1,5 a 2,5 VR); Screening do anticoagulante lpico

MTODO Bell-Alton AMOSTRA - A agulha deve penetrar diretamente a veia e na primeira tentativa. No se deve realizar os testes em amostra cuja puno foi difcil (traumtica); - Misturar cuidadosamente o sangue por inverso (juntamente com o citrato de sdio), centrifugar o mais rpido possvel por 15minutos a 3.000 rpm para obter um plasma deficiente de plaquetas. Separar o plasma e deixar em tubo plstico a temperatura de 20-25 C at a realizao do teste. - O teste dever ser realizado at 3 horas aps a coleta. No caso de superviso de tratamento heparina, a centrifugao e o teste devem ser realizados na hora seguinte coleta. MATERIAIS - Pipeta de Pasteur de plstico; - Tubos de hemlise de plstico; - Cronmetro; - Pipetas de preciso de 100l; - Cubetas plsticas para coagulmetro Quick Timer Drake; - Coagulmetro Quick Timer- Drake.

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REAGENTES - Soluo tamponada de cefalina e ativador do cido elgico. Conservar a 2-8 C at a data do vencimento indicada na embalagem; - Cloreto de clcio 0,025 mol/L; - Quando o cloreto de clcio no acompanha o Kit de reagentes para a realizao do TTPa, o cloreto de clcio 0,025 mol/L pode ser praparado no laboratrio; - Plasmas controle normal e anormal ou pool de plasmas coletados no prprio laboratrio e imediatamente centrifugados e aliquotados em amostras que devem ser congeladas, tendo validade de 30 dias. PROCEDIMENTOS - Uma vez ligado o Quick Timer entra em aquecimento, permanecendo assim at que o bloco atinja temperatura mnima de trabalho (36,2 C). Com exceo da tecla RES, que permite consultar resultados anteriores, todas as outras ficaro desabilitadas durante o aquecimento. Aps o aquecimento pressione a tecla test e aparecer no visor o menu de testes. Selecione o TTPa. - Coloque 100l de plasma, do controle e de cada paciente respectivamente, e 100l de cefalina ativada em uma cubeta plstica de leitura contendo uma barrinha metlica. Incube por exatamente 3 min cada amostra nos orifcios existentes no bloco aquecido do Quick timer. Coloque ento a primeira amostra no poo de leitura e adicione 100l de cloreto de clcio 0,025mol/L previamente aquecido a 37 C. Ao final da reao aparecer no visor o resultado em segundo. - Os resultados alterados devero ser repetidos para confirmao. Se houver alguma dvida em relao ao resultado ou incoerncia com relao ao uso de medicamentos pelo paciente, deve-se solicitar uma nova coleta do material.

RESULTADO: 22-35 segundos

Referncias Bibliogrficas

1. OLIVEIRA, R.A.G. Hemograma: Como Fazer e Interpretar . 1a ed. So Paulo: LMP, 2007. 2. ROSENFELD, R. Fundamentos do Hemograma do laboratrio Clnica . 1a ed Rio de Janeiro : Ganabara Koogar, 2007

3 Recomendaes da Sociedade Brasileira de Patologia Clnica/Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso - (2 edio) Editora Manole Ltda, 2009.

Plasma (100 l)

+ Cefalina-slica micronizada 100 l

3/37C

CaCl2 100 l

Tempo de formao do cogulo (s)