apostila de práticas de microbiologia professor sandro gazzinelli (1).doc

IFSP - Campus São Roque

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICASDISCIPLINA: MICROBIOLOGIA

PROF.: Sandro Gazzinelli

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

Nome do aluno: _____________________________________________________________

Período: _________

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Normas de segurança e recomendações que deverão ser observadas no laboratório de aulas práticas de Microbiologia

1.É obrigatório o uso de avental e deve permanecer abotoado.

2.Não é permitido comer, beber ou fumar no laboratório.

3.O material pessoal (bolsas, livros, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho.

4.Não inicie uma prática sem que tenha lido cuidadosamente as instruções e compreendido os objetivos e modo de

execução das experiências.

5.Manter qualquer líquido inflamável longe da lamparina.

6.Em caso de acidentes (derramamento de culturas, quebra de placas, respingo de cultura, ferimentos, etc):

Comunicar imediatamente o professor responsável pela aula prática.

Colocar papel toalha com álcool sob o material contaminado.

7. Descarte do material:

Material contaminado (pipetas e lâminas preparadas pelos alunos, devem ser colocados nos recipientes próprios

para descarte).

Lâminas e tubos com cultura fornecidos pelos professores deverão ser deixados sobre a bancada e nas estantes,

respectivamente.

Material para incubação, previamente identificado, por grupo, serão colocados em recipientes próprios.

Fósforo riscado, algodão e papel utilizado, colocar nas caixas de lixo.

9. A bancada deve ser desinfetada com álcool 70% antes e após o experimento.

10. Lavar bem as mãos antes e após a realização do trabalho em bancada.

11. Culturas, lâminas, reagentes e outros materiais não devem ser removidos do laboratório sem a autorização do

responsável.

12. Não inalar qualquer substância diretamente.

13. A alça de inoculação deverá ser flambada antes e depois de ser utilizada, para isso, aquecer até o rubro e deixar

resfriar mantendo próxima à chama.

14. O microscópio é um instrumento valioso e deve ser manipulado e usado cuidadosamente. Qualquer dano ou

defeito deve ser comunicado ao professor. No fim de cada aula, limpar a lente ocular e as objetivas com papel macio.

15. Identificar todo o material com o número do grupo e data e anotar cuidadosamente os resultados de ser trabalho.

Essa anotações servem de base para o aprendizado

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AULA PRÁTICA Nº 1

PARTE 1ASSUNTO- Normas de Biossegurança, identificação e manipulação de materiais para as aulas práticas de microbiologia

OBJETIVOS- Reconhecer os procedimentos que devem ser adotados para biossegurança no laboratório - Identificar os materiais utilizados nas práticas de microbiologia

PROCEDIMENTO- Fazer a identificação de materiais no laboratório de Microbiologia- Manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais freqüente em microbiologia.

MATERIAIS- Meios de cultura- VidrariaTubos de ensaio Placas de PetriErlenmeyersPara transferência e inoculação de microrganismosAlças de inoculaçãoSwab Equipamentos do Laboratório de MicrobiologiaAutoclaveEstufaFonte de chama

QUESTÕES

1. Identifique as funções dos seguintes materiais utilizados em laboratório de microbiologia:a) Agar bacteriológico b) Tubos de ensaio c) Erlenmeyers e balõesd) Placas de Petrie) Alça de inoculaçãof) lamparina g) Lâminas2. Qual a função da autoclave? Por que ela é um equipamento indispensável ao laboratório de Microbiologia?3. Por que é necessário a utilização da estufa no laboratório de Microbiologia?4. Como os meios de cultura são classificados de acordo com o seu estado físico? 5. Qual a diferença dos meios de cultura básicos e especiais? Classifique os meios utilizados nesta prática de acordo com este item. 6. O que é um meio de cultura seletivo? E diferencial? 7. Qual a diferença na verificação do crescimento de cultura bacteriana em meio sólido e meio líquido?

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PARTE 2 ASSUNTOManobras assépticas e Técnicas de Semeadura

OBJETIVOS- Conhecer as manobras utilizadas com os materiais utilizados nas práticas de microbiologia- Aprender as técnicas para inoculação de microrganismos em meios de cultura sólidos e líquidos sem que ocorra contaminação

MATERIAIS- Alça de inoculação- Placas de petri com meio de cultura sólido (Agar + Caldo de Carne) - Tubos de ensaio com meio líquido

PROCEDIMENTOS

Manobras assépticas e Técnicas de semeaduras

São técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são desejados, ou seja, garantem uma boa assepsia. Assim as manobras assépticas vão impedir que microrganismos presentes no ar, ou depositados sobre as várias superfícies junto com a poeira, venham contaminar materiais estéreis do laboratório tais como os meios de cultura, soluções e equipamentos ou, ainda, culturas puras de microrganismos. Por outro lado impedem também que os microrganismos com os quais estamos trabalhando nos contaminem ou ao ambiente. As manobras assépticas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente o uso de um bico de Bunsen ou lamparina e a realização de toda a manipulação dentro da chamada “zona de segurança”, que nada mais é do que a região ao redor da chama, a mais próxima possível sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras. Toda vez que se fizer uma semeadura siga as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura pelos microrganismos ambientais.

1) Tanto a alça como o fio de platina deve ser flambado antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto, devem ser passada na chama de 2 a 3 vezes. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45°C em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen ou lamparina. Para retirar o material, quer seja para a feitura de um esfregaço, quer para semeadura, esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri.

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2) Toda vez que se fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente à retirada do tampão de algodão. Este deverá ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão que está segurando a alça. Após a retirada do material com a alça, flambar a alça, após o uso.

3) As placas de Petri deverão ser abertas próximas ao bico de Bunsen ou lamaprina para evitar contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas, as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.

5) Para a cultura de microrganismos em meio sólido, deve-se seguir o método de semeadura mostrado abaixo:

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AULA PRÁTICA Nº 2

Assunto: Observação de microrganismos do ambiente e da microbiota natural do corpo

Introdução:Os microrganismos se encontram praticamente em todos os ambientes. No ar, água e principalmente no solo. Destes locais podem ser arrastados por partículas de poeira e aerossóis. Do ar, passam para nossa superfície contaminando ainda a água e alimentos. Uma vez que as condições que favorecem a sobrevivência e o crescimento de muitos microrganismos (nutriente, umidade e temperatura adequada) são as mesmas sob as quais vivem as populações humanas, é inevitável que vivamos entre grande quantidade de germes. O nosso corpo é habitado por milhares de microorganismos que, quando são inofensivos, são chamados de microbiota ou flora normal.

Materiais:- Placas de Petri contendo meio sólido (Agar + Caldo de Carne) - Tubos de ensaio com caldo nutritivo - Swab

Metodologia:- Retirar a tampa de placas contendo Nutriente Agar e deixar abertas no ambiente durante 15 minutos em diferentes ambientes.- Coletar com swab estéril material de partes do corpo de alunos da turma. Através do procedimento de manobras assépticas, inocular o material coletado pelo swab no meio de cultura líquido. - Incubar as placas e tubos de ensaio por 3 a 5 dias a 37ºC em estufa. - Após o período de incubação analisar macroscopicamente as colônias de bactérias e fungos que se desenvolveram.

Resultados:- Descrever em termos gerais a aparência das colônias crescidas e meio de cultura sólido (tamanho, textura, cor, etc.). - É possível estimar quantas colônias cresceram nas placas do seu experimento? Enumere se possível.- Como você classifica os ambientes utilizados para o experimento? Justifique.- De todos os locais analisados qual obteve o maior número de colônias bacterianas? E o menor? (Colete informações dos outros grupos para responder a esta questão) - No seu experimento houve crescimento de fungos? Qual a diferença entre a colônia de bactérias e fungos? - Quais as precauções que devem ser tomadas para controlar os contaminantes do local que foi verificado pelo seu grupo?

Obs: Bactérias geralmente formam colônias circulares, ou com aspecto de creme (sem forma definida) e os fungos muitas vezes formam esporos e tem colônias mais desorganizadas (exceto leveduras, que formam colônias circulares como a de muitas bactérias). Isso não é uma regra, mas ajuda a separar a maioria das colônias. Além disso, o crescimento das bactérias é favorecido em temperaturas acima de 30 graus Celsius (estufas) enquanto os fungos se desenvolvem bem na temperatura ambiente (15 a 25 graus Celsius).

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ANEXO: PRODUÇÃO DE MEIO DE CULTURA PARA BACTÉRIAS - CALDO DE CARNE

Material utilizado:- Balões de Erlenmeyer;- Filtro de papel para café;- Funil;- Água destilada;- Fita adesiva;- Vareta de vidro;- Placas de Petri;- Agar – agar;- Caldo de carne;- Autoclave;- Algodão cardado;- Papel de Kraft;- Estufa;Protocolo experimental:Preparação do meio de cultura:1 – Colocou-se um caldo de carne num litro de água destilada a ferver. Deixou-se ferver durante 5 minutos;2 – Filtrou-se e juntou-se, cuidadosamente, 20g de Agar – Agar;3 – Baixou-se a temperatura e deixou-se ferver durante algum tempo, mexendo sempre com a vareta de vidro;Preparação das placas:1 – Tapou-se o erlenmeyer com uma rolha de algodão cardado e protegeu-se com papel de Kraft;2 – Embrulhou-se as placas de Petri em papel Kraft;3 – Colocou-se as placas de Petri na autoclave a 1atm. durante 15 minutos (em alternativa esterilizar as placas de Petri em estufa, a 160ºC durante 2horas ou 170ºC durante 1hora);4 – Distribuiu-se o meio de cultura, ainda quente pelas placas de Petri esterilizadas: para o efeito levanta-se ligeiramente a tampa, de modo a ficar destapado só o espaço necessário á colocação do meio de cultura;5 – Manteve-se as placas tapadas e deixou-se arrefecer até o meio de cultura solidificar;

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AULA PRÁTICA Nº 3

Assunto: Observação de bactérias presentes no iogurte

Introdução:As bactérias do iogurte medeiam a transformação do leite em iogurte. Utilizam a lactose como fonte de carbono e de energia, levando a cabo uma fermentação láctica, como principal processo gerador de energia. São eubactérias Gram positivas. Os iogurtes devem conter quantidades aproximadamente iguais de Streptococcus e de Lactobacillus.

Parte 1: OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA DAS BACTÉRIAS DO IOGURTE

Material:- Iogurte magro natural;- Alça;- Lâminas- Lamínulas- Azul de metileno- Óleo de imersão;- Vela- Microscópio óptico

Metodologia:- Mergulhar a alça no iogurte.- Fazer um esfregaço fino numa lâmina limpa.- Observar ao microscópio, começando pela objetiva de menor ampliação.- Tentar distinguir os dois tipos de bactérias lácticas.Obs: Procurar bactérias redondas (Streptococcus) e bactérias alongadas (os mais raros Lactobacillus).Obs: Pode corar-se com uma gota de azul de metileno para facilitar a visualização caso não seja possível observar adequadamente as bactérias.

PARTE 2: ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO IOGURTEMaterial:- Iogurte magro natural- Alça- Placas com meio sólido- Parafilme ou película aderente- Chama- Placas de petri com meio de cultura sólido (Agar + Caldo de Carne)- Estufa a 37ºC, ou iogurteira

Metodologia: (Trabalhar junto à chama)- Abrir o iogurte perto da chama.- Esterilizar a alça à chama (deixar ir ao rubro).- Deixar arrefecer e mergulhar no soro do iogurte.- Fazer um riscado numa placa contendo meio sólido.- Selar a placa com tiras de parafilme ou película aderente.- Colocar na estufa a 37ºC.- Alguns dias depois tentar observar os 2 tipos de colônias:a) Colônias muito transparentes em forma de flor (Lactobacillus)b) Colônias brancas, pequenas e redondas (Streptococcus)- Retirar, junto à chama, uma porção de células dum tipo de colônia isolada, com uma alça. Depositar essas células numa gota de água, colocada sobre uma lâmina. Cobrir com lamínula. - Observar ao microscópio, tentando identificar os microrganismos.

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Observação microscópica a partir de colônias isoladas

- Retirar, junto à chama, com uma alça de repicagem, uma porção pequenina de células duma colônia isolada de uma placa de isolamento ou de individualização.- Depositar essas células numa gota de água, colocada sobre uma lâmina.- Cobrir com uma lamínula.- Observar ao microscópio óptico.

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AULA PRÁTICA Nº 4

Assunto: Arqueas presentes em cortes de bacalhau

Introdução:As halobactérias são contaminantes habituais do bacalhau seco salgado. Crescem à sua superfície, como manchas avermelhadas, e exalam um cheiro característico a bacalhau podre, mesmo quando o bacalhau está em perfeitas condições de utilização.

Material:- Bacalhau que apresente zonas vermelhas e cheiro intenso.- Tubo de ensaio- Água destilada- Sal- Alça de repicagem- Lâmina- Lamínula- Microscópio óptico

Metodologia:- Retirar ou raspar um pedaço pequeno de bacalhau duma zona que esteja vermelha.- Colocar num tubo de ensaio contendo 1 a 2 ml de solução salina de NaCl (20%)- Agitar bem.- Mergulhar a alça na solução.- Colocar uma gota numa lâmina limpa.- Colocar lamínula.- Observar ao microscópio, começando pela objetiva de menor ampliação.

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AULA PRÁTICA Nº 5

ASSUNTOAnálise da ação de anti-sépticos

OBJETIVO- Verificar a ação de anti-sépticos sobre a microbiota das mãos

MATERIAIS- Placas de petri com meio de cultura sólido (Agar + Caldo de Carne);- Sabonete;- Antisépticos diferentes;- Gaze estéril.

PROCEDIMENTO- Dividir uma placa de Petri contendo os meios de cultura em 4 quadrantes- Fazer a semeadura do 1º quadrante utilizando a ponta do polegar (fazer a impressão digital suavemente para nãoferir a camada do meio de cultura);- Um segundo aluno lava seu polegar com sabão e água por 1 minuto, seca com gaze estéril e inocula o segundo quadrante fazendo a impressão do dedo;- Um terceiro aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 1º antisséptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estéril e faz depois a impressão no terceiro quadrante;- Um quarto aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 2º antisséptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estéril e faz depois a impressão no quarto quadrante.- Incubar a placa a 37º C por 24 horas e analisar o crescimento.

RESULTADOS E QUESTÕES

1. Faça uma representação esquemática dos resultados obtidos na avaliação da microbiota das mãos. Anote os dados referentes a mais 4 grupos além do seu, para comparação.

Símbolos: Pouco Contaminada + Mais ou menos contaminada +++ Muito contaminada +++++ Não contaminou -

2. Como você interpreta os resultados obtidos? 3. Qual a importância da assepsia das mãos? 4. Qual a diferença entre anti-sepsia e assepsia?5. Qual o modo de ação do calor seco? E do calor úmido? Qual o mais eficaz?6. Qual é o tipo de calor mais utilizado para a indústria de alimentos? Por quê?7. Por que o álcool etílico utilizado como desinfetante e anti-séptico deve ser hidratado?8. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou estufas de esterilização, também possuem ação esterilizante?

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AULA PRÁTICA Nº 6

ASSUNTOEstudo de microrganismos presentes no solo e na água

MATERIAIS- Placas de Petri contendo meio sólido (Agar + Caldo de carne) - Diferentes amostras de solo- Recipiente contendo água coletada de lagoa, represa, rio ou outro curso d’água - Swab estéril- Lâmina- Lamínula- Microscópio óptico

PROCEDIMENTO

Preparação das culturas- 1 placa com Agar deve ser dividida em 4 quadrantes- Em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente utilizando swab estéril.- Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 a 48 horas.

Observação microscópica a partir de colônias isoladas- Verificar o número de colônias de fungos e bactérias desenvolvidas em cada quadrante.- Retirar, junto à chama, com uma alça de repicagem, uma porção pequena de células de colônias originadas de cada material inoculado;- Depositar essas células em uma gota de água, colocada sobre uma lâmina;- Cobrir com uma lamínula;- Observar ao microscópio óptico.- Registrar as observações

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AULA PRÁTICA Nº 7

ASSUNTOVerificação da ação de antibióticos – Análise de Antibiogramas

Introdução:

Antibiótico: Agente bacteriano produzido por biossíntese, obtido a partir do microrganismo, sendo que algumas substâncias podem também ser produzidas por síntese in vitro (sintobióticos). Pode ser classificado de acordo com seu espectro de atividade e natureza química:

a) Antibióticos que atuam predominantemente sobre bactérias Gram (+)b) Antibióticos que atuam predominantemente sobre bactérias Gram (-)c) Antibióticos de largo espectrod) Antibióticos de ação antimicobacterianae) Antibióticos de ação antimicótica

Alguns antibióticos podem ser utilizados apenas em aplicações tópicas, quer porque sejam tóxicos à administração parenteral, quer porque não se absorvem pela via oral. Os antibióticos atuam sobre os microrganismos de diversas maneiras:- Inibem a síntese do peptideoglicano da parede celular bacteriana, fazendo com que a célula morra por absorção de água, aumento do volume e conseqüentemente rompimento. - Lesam a membrana citoplasmática, destruindo a permeabilidade da membrana e causando morte celular. - Interferem na síntese de ácido nucléico e proteínas. O aparecimento inicial de uma bactéria resistente em uma população sensível é muitas vezes causado pela mutação em um único gene bacteriano. A freqüência de mutação inicial é baixa. Entretanto, outra bactéria pode se tornar resistente ao antibiótico em uma freqüência muito maior, simplesmente adquirindo um gene de uma bactéria que já é resistente. O desenvolvimento da resistência pode ser minimizado dos seguintes modos:- Evitar o uso indiscriminado de antibióticos. - Utilizar dosagens suficientemente altas de um antibiótico apropriado para dominar uma infecção rapidamente.- Utilizar uma combinação de antibióticos de eficiência comprovada para dominar uma infecção rapidamente (é mais difícil um microrganismo tornar-se resistente contra dois antibióticos do que apenas contra um).

OBJETIVOS- Verificar a ação dos antibióticos em bactérias- Verificar a presença de bactérias resistentes ou sensíveis à ação dos antibióticos- Analisar antibiogramas

MATERIAL- Placas de petri com meio de cultura- Discos de antibióticos- Alça de inoculação- Cultura de bactérias

PROCEDIMENTO:- Flambar a alça de platina no fogo, até que sua coloração se torne vermelha;- Abrir o tubo de ensaio, com a colônia de bactérias perto da lamparina ou do bico de bunsen- Esfriar a alça de platina nas bordas do tubo de ensaio;- Colher a cultura com a ponta da alça de platina;- Flambar o tubo de ensaio três vezes e tampa-lo novamente;- Abrir a placa de Petri contendo ágar, perto da chama, para evitar contaminação;- Estriar a cultura de bactérias na placa contendo ágar da seguinte maneira:

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Com alça de platina, distribuir a cultura pelo ágar, conforme o desenho abaixo;

Fechar a placa de Petri e flambar novamente a alça de platina, até que ela fique vermelha; Pegar uma rodela de antibiótico e colocá-la no centro da placa; Levar para uma estufa, a 37ºC, por aproximadamente 48 horas.

RESULTADOS

Fazer o desenho dos resultado observado.

a) Qual antibiótico foi utilizado no experimento? ______________________________________________________________________b) Após observação, você verificou que as bactérias são sensíveis ou resistentes ao antibiótico testado?______________________________________________________________________

QUESTÕES

a) Quais são os maiores motivos para o aparecimento destas superbactérias?____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________b) Como os antibióticos conseguem interferir na morte da célula bacteriana?____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________c) Em qual grupo de seres vivos está presente o organismo que é responsável pela produção da penicilina?___________________________________________________________________________________________

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AULA PRÁTICA Nº 8

Assunto: Isolamento e identificação de fungos anemófilos

Material:- Placas de Petri contendo meio sólido (BDA) - Lâmina- Lamínula- Microscópio óptico

Metodologia:- Escolher um ambiente para investigar a presença de fungos anemófilos. Neste local, as placas de Petri contendo os meios de cultura deverão ser abertas e expostas ao ar, por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, as placas serão fechadas, identificadas e incubadas à temperatura ambiente.- Os alunos deverão retornar ao laboratório todos os dias para acompanhar o experimento e verificar se está havendo crescimento de colônias de fungos na superfície dos meios de cultura. Anotar o tempo de crescimento, o número e variedade de colônias. Comparar com a de outros colegas e tentar determinar possíveis diferenças ou semelhanças.- Após o desenvolvimento dos fungos no meio de cultura, escolher uma colônia e descrever a sua macromorfologia.- A colônia de fungo anemófilo escolhida será agora analisada sob o aspecto microscópico, utilizando a técnica de fragmento de colônia. Com a agulha de platina flambada e fria, raspar a superfície da colônia escolhida para obter pequenos fragmentos. Estes serão colocados sobre uma lâmina, juntamente com 1 gota de lactofenol e cobertos por lamínula. Em seguida, observar ao microscópio no menor, médio e maior aumento.

Resultados:- No seu experimento houve crescimento de Bactérias? Caso positivo, cite 3 explicações para seu surgimento em um meio de cultura que favorece o desenvolvimento de fungos. - Anotar (ou desenhar) as características observadas. Estes dados poderão permitir a identificação do fungo escolhido.- Baseando-se na análise da macro e micromorfologia do fungo por sua equipe escolhido, dê sua descrição final, e se possível, o gênero a que este fungo pertence.- Preencher a tabela no anexo 2 para auxiliar na identificação do fungo analisado

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ANEXO 1: PREPARAÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA FUNGOS, O EXTRATO BDA (BATATA – DEXTROSE – AGAR).

MATERIAIS- Batata;- Água destilada;- Açúcar;- Àgar;- Erlenmeyer;- Algodão;- Gaze;- Autoclave;

METODOLOGIA – preparo do meio de cultura BDA.- 200 g/L de batata picada com casca;- 1 litro de água destilada;- 4 g de Açúcar;- 4 g de Agar;Após o cozimento da batata em água destilada descartou-se a batata, e filtrou-se o liquido. Depois foram adicionados os demais reagentes. O volume foi completado para um litro com água destilada, e depois foi colocado no erlenmeyer, fechado com algodão e gaze e autoclavado a 121°C por 20 minutos.

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ANEXO 2: Tabela para identificação macromorfológica dos fungos

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AULA PRÁTICA Nº 8

Assunto: Observação de ascósporos de Saccharomyces cerevisiae

Material:- Fermento fresco- Agar- Ácido acético laboratorial ou vinagre de cozinha- Hidróxido de potássio (ou potassa cáustica - KOH)- Saquetas de açúcar (sacarose) para adoçar café- Extracto de levedura- Água destilada- Medidor de pH- Caixas de Petri, de preferência esterilizadas- Copo de vidro com vareta de vidro dobrada em L- Álcool- Espátula ou ansa de repicagem- Balança- Copos de vidro de 100 e 250ml- Pipetas de 0,5ml- Chama- Placa de aquecimento

Metodologia:- Preparar uma suspensão espessa de fermento fresco: suspender 1g de fermento fresco em 1ml de água.- Colocar, utilizando uma pipeta, 0,2ml da suspensão de células para o meio contido numa placa contendo meio de cultura BDA- Espalhar com a vareta de vidro dobrada em L.- Deixar à temperatura ambiente.- Após pelo menos 1 dia, retirar, junto à chama, uma porção de células, com uma espátula ou uma ansa de repicagem.- Suspender essas células numa gota de água, colocada sobre uma lâmina.- Cobrir com lamela.- Observar ao microscópio óptico.- Registrar o que foi observado.

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AULA PRÁTICA Nº 9

ASSUNTOMétodo de coloração de Gram

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista holandês Hans Cristian Gram. Esta coloração é uma das mais importantes e é rotineiramente utilizada no laboratório de Microbiologia. Ela divide as bactérias em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas, além de permitir o estudo da célula bacteriana quanto à sua morfologia (cocos ou bacilos) e arranjo. Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo), enquanto as que não retém o complexo cora-se em vermelho (Gram negativo). A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente, frente ao Gram, é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias Gram (+) e Gram (-). Bactérias Gram (+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram (-). Quando aplicado em células Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente, e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CV-Iodo, que é maior que a molécula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das células de Gram (+) pelo álcool e então estas células permaneceram coradas pelo CV e aparecem azuis. Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptídeoglicano, que não consegue reter o complexo. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e aparecem em vermelho. A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular, mas sim com sua estrutura física, o que confere a característica de positividade ao Gram. Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil, quando corretamente realizada e interpretada.

OBJETIVOS- Aprender a técnica utilizada para a classificação das eubactérias em grupos- Compreender como a técnica funciona para a coloração das eubactérias em todas as fases do procedimento- Verificar ao microscópio a diferença existente entre bactérias Gram Positivas e Gram Negativas

MATERIAL- Cultura de bactérias- Alças de inoculação- Bateria de Gram: Picetas com corantes Cristal Violeta, Solução de Lugol, Álcool 70%, Fucsina ou Safranina- Água- Lãminas de microscópio- Microscópio- Óleo de imersão

PROCEDIMENTO Sobre uma lâmina de vidro, colocar uma gota de água. Com a alça de platina tocar levemente na superfície da

colônia e emulsionar o material na gota de água (caso o microrganismo seja fornecido em suspensão, colocar uma gota desta sobre a lâmina). Deixar secar.

Passar o esfregaço na chama da lamparina três vezes a fim de fixar o material. Cobrir o esfregaço seco com violeta genciana e deixar por 1 minuto. Lavar a lâmina com água e cobrir com solução de lugol e deixar 1 minuto. Lavar a lâmina a lâmina e, mantendo a mesma inclinada, pingar gotas de álcool até que não se desprenda mais

corante da preparação. Lavar com água. Cobrir a lâmina com solução de fucsina e deixar por 30 segundos. Lavar a lâmina e deixar secar ao ar livre. Examinar ao microscópio com a objetiva de imersão.

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Observar ao microscópio, com objetiva de imersão, as preparações indicadas. Desenhar e identificar, nos espaços abaixo, as observações microscópicas

Aumento do microscópio: ______________

Forma da bactéria: ______________________________________Arranjo (se possuir): _____________________________________Cor: _____________________________________________________Classificação quanto ao método de Gram: _____________________________

Aumento do microscópio: ______________

Forma da bactéria: ______________________________________Arranjo (se possuir): _____________________________________Cor: _____________________________________________________Classificação quanto ao método de Gram: _____________________________

Questões1) Como você explica o comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram?2) As bactérias do gênero Mycobacterium não se coram pelo método de Gram. Qual seria uma explicação para esse fato?3) Sabe-se que se ocorrer um aquecimento exagerado no momento da fixação do material, as bactérias G+ passam a se comportar como G-. Qual seria uma explicação para esse fato?

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ANEXO: TÉCNICA PARA COLORAÇÃO DE GRAM

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