EMENTA DO CURSO

1- ASPECTOS GERAIS DA CORMATOGRAFIA;

2- CROMATOGRAFIA EM PAPAEL;

3- CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA;

4- CRMATOGRAFIA EM COLUNA;

5- CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA;

6- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA.

*Livro: cromatografia: princípios básicos e técnicas afins.

*Autor: Francisco Rolder de Aquino Neto

Denise da Silva e Souza Nunes

*Editora: Interciência.

CROMATOGRAFIA

A cromatografia em coluna foi desenvolvida primeiramente pelo químico de petróleo- M.S. Tswett.

A sensibilidade, velocidade, exatidão e simplicidade para separação, identificação e

determinação de substâncias resultam em um grande desenvolvimento deste método.

As diferentes modalidades de cromatografia são responsáveis por mais de 70% da química

analítica.

A cromatografia está baseada na repartição dos “analitos” , entre duas fases, uma

estacionária, e a outra móvel.

A distribuição, exclusão, partição ou adsorção seletiva dos componentes é um processo de

equilíbrio dinâmico e as moléculas dos “analitos” ora estão retidas na fase estacionária, ora

deslocam-se com a fase móvel.

A separação entre dois, ou mais componentes resultará da diferença de suas constante de

equilíbrio de distribuição entre as duas fases simplificando quando mais tenazmente um

componente é preso pela fase estacionária, mais alta é a porcentagem das moléculas

daquele componente que ficam retidos provocando um retardamento na migração das

mesmas.

Um segundo componente menos retido na fase estacionária terá uma porcentagem mais alta

na fase móvel em relação ao primeiro componente. Assim, o conjunto de moléculas deste

componente se moverá em direção ao fluxo mais rapidamente.

OBS: A IDENTIFICAÇÃO NA CROMATOGRAFIA SOMENTE OCORRERÁ SE FOR

CONFRONTADO COM O TIPO DE PADRÃO.

ANALITOS SÃO OS COMPONENTES DE UMA MISTURA DE DOIS OU MAIS

SUBSTÂNCIAS.

1) CLASSIFICAÇÃO DA CORMATOGRAFIA DE ACORDOCOM O SISTEMA

CROMATOGRÁFICO:

Em coluna:Cromatografia líquida clássica (CLC)

Cromatografia em fase gasosa (CG)

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC)

Planar: Cromatografia em papel;

Cromatografia em camada delgada.

2) De acordo com a fase móvel:

Fase móvel: Gás (He, H2, Ar, N2)

Cromatografia em fase gasosa.

Fase móvel: Líquido

Cromatografia líquida clássica

Cromatografia líquida de alta eficiência

3) De acordo em a fase estacionária:

Líquida

Sólida

Líquido pouco volátil

4) De acordo com o modo de separação:

Por adsorção

Por partição

Por troca iônica

5) PRINCIPAIS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS:

A) CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO: A fase estacionária é um sólido e a fase móvel

pode ser líquido ou gás.

B) CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO: A fase estacionária é um líquido e a fase móvel

também é um líquido.

C) CROMATOGRAFIA PLANAR: Nesta caso a fase estacionária é suportada sobre uma placa

(CCD) ou nos poros de um papel (CP).A fase móvel se movimenta através da fase estacionária por

ação de capilaridade ou por ação da gravidade.

CROMATOGRAFIA EM PAPEL

Tira de papel-celulose;

Câmara (cuba) cromatográfica;

Capilares;

Fase móvel;

Mistura a ser preparada

È um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, em função do

deslocamento diferencial dos solutos arrastados por uma fase móvel, sendo retidos por uma fase

estacionária líquida (água) na cromatografia normal.

É considerada, comumente, uma técnica de partição. A fase móvel migra por capilaridade e os

componentes movem-se a diferentes velocidades.

Técnica: uma mancha de amostra é depositada perto da base de um pedaço de papel de filtro e o

papel é colocado numa câmara de desenvolvimento . Nesta técnica os compostos hidrossolúveis

são separados.

Como preparar a tira de papel?

1) Cortar uma tira de papel num tamanho apropriado;

2) Marcar as duas, de partida e chegada com um lápis;

3) Aplicar na linha de partida as amostras e os padrões;

4) Colocar na câmara uma quantidade de fase móvel;

5) Molhar a tira de papel com água;

6) Colocar a tira dentro da câmara em contato com a fase móvel;

7) Deixar o processo ocorrer até a chegada da fase móvel a linha de chegada;

8) Fazer a revelação.

AM↔FE↔FM

OBS: Cromatografia em papel: fase normal: a fase estacionária é a água ou um

composto polar.

COEFICIENTE DE RETENÇÃO: RF

RFa = dra

Dm

RFb = drb

Dm

RFc = drc

Dm

Dm= 10cm; Dra= 8 cm; Drb= 5 cm; Drc= 2,5 cm

DM: É a distância da linha de partida até a linha de chegada.

DRa: É a distância da linha de partida até o meio da mancha de A.

Drb→ DRc→ Dra

O RF varia de 0 a 1.

A medida de RF não é considerada uma propriedade físico-química da substância, pois

este pode variar dependendo das condições do laboratório.

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DOS ANALITOS ( REVELAÇÃO)

1. Método físico;

2. Método químico;

3. Método biológico

1. Método físico- A revelação é feita com uma lâmpada de ultra- violeta. Este

método é um método seletivo, pois nem todos os analitos conseguem absorver

este tipo de luz. Este método é não destrutivo.

Espectroscopia na Região da Ultra- violeta é visível:

200nm→ 400nm (U.V)

400nm→ 800nm (U.V)

2. Método químico- Uma substância reveladora é borrifada sobre a tira de papel.

3. Método biológico- A localização de uma mistura de antibióticos baseia-se na

inibição do crescimento de certos microorganismos.

SOLVENTES DA FASE MÓVEL CONSTANTE DIELÉTRICA

1) Éter de petróleo 1,84

2) hexano1,84

3) Clorofórmio 4,80

4) Acetato de etila 6,02

5) Diclorometano 10,5

6) Acetona 21,05

7) Etanol 24,06

8) Metanol 33,4

9) H2O 80,4

TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIA NA CP:

FASE NORMAL: Neste tipo de fase estacionária pode ser usado a água ou outro solvente

polar. Já a fase móvel deve ser moderadamente polar.

FASE REVERSA: A tira de papel é molhada com óleo de silicone ou parafina. Nesse caso

utiliza-se fase móvel polar. Os compostos hidrofóbicos.

ANÁLISE QUALITATIVA: É realizada conforme a cor, se os analitos forem coloridos, ou por

comparação dos RF de um padrão com o RF de um analito.

ANÁLISE QUANTITATIVA:

1. Uma análise direta da intensidade da cor da mancha de um padrão com a mancha

de um analito.

2. Cortando o papel e pesando. Comparar com um pedaço de papel sem a mancha.

3. Análise densitométrica.

PREPARO DE UMA CUBA CROMATOGRÁFICA

1. Coloque cerca de 1cm de altura da mistura de solvente, água e etanol(1:1), em um béquer

de 300mL.

2. Água e etanol é a fase móvel; fase móvel polar; o béquer é a cuba cromatográfica. Revista

as laterais do béquer com papel de filtro. Tampe com uma placa de Petri e deixe a cuba

saturar por 5 minutos.

3. O papel de filtro tem a função de saturar o ambiente e a placa de Petri impede que o

solvente escape. Corte um pedaço de papel de filtro e faça um traço a lápis a cerca de

1,5cm da base que encostará no solvente. Após secar, coloque o papel na cuba

cromatográfica, feche e deixe diluir.

4. O papel cortado é o suporte da fase estacionária.

5. Duas maneiras de formar a fase estacionária é molhar o papel, em que será colocado a

amostra com água, ou usar a água da fase móvel (ou seja, no caso acima a água é

utilizada como fase móvel e estacionária).

CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA (CCD)

A CCD é um tipo de cromatografia líquido-sólido, em que a fase estacionária é fixada

como uma película sobre uma placa.

A fase estacionária mais comumente utilizada é a sílica gel. Como fase móvel (ou

eluente) mais comumente são usados etanol, clorofórmio, metanol, acetato de etila, hexano

ou misturas desses líquidos.

A partir do valor de RF, é possível identificar uma substância, pois ele é característico

da mesma. ( comparar o RF de uma substância com o Rf padrão).

Existem inúmeras aplicações da CCD nas áreas de medicina, química, biologia,

agronomia, farmácia, entre outros.

EXEMPLO: A medicina legal faz uso da cromatografia para investigar casos de

envenenamento; a medicina emprega na identificação de estimulantes ingeridos por atletas.

( mais utilizado por cromatografia gasosa ou HPLC).

MATERIAIS DAS PLACAS:

Vidro;

Alumínio;

Plástico

MECANISMO DE SEPARAÇÃO

ADSORÇÃO:

Fase móvel – líquida

Fase estacionária – sólida

Óxido de alumínio: utilizado como fase estacionária, pode apresentar as seguintes

características (ácida, básica e neutra).

MÉTODOS DE REVELAÇÃO:

1. FÍSICO: lâmina de UV.

Câmara de iodo

2. QUÍMICO: Interage com a solução.

3. BIOLÓGICO:

APLIACAÇÃO DAS AMOSTRAS:

Afastadas uma das outras;

Ângulo de 90º.

TIPOS DE AMOSTRAS QUE PODEM SER PREPARADAS:

Sólidas e líquidas (aldeídos, cetonas, aminoácidos, etc).

OBS: Todas dissolvidas em solvente volátil (o solvente evapora e a amostra fica).

ANÁLISE QUALITATIVA:

Comparação de cor ou RF das substâncias com os padrões.

ANÁLISE QUANTITATIVA:

1. Raspar;

2. Extrair;

3. Filtrar;

4. Evaporar;

5. Pesar.

EXERCÍCIO: Calcule os Rfs das substâncias abaixo.

Dra= 2,5cm RFa= 2,5= 0,36

Drb= 6cm 7

Dm= 7cm RFb= 6 = 0,86

7

SINTESE DA ACETANILINA

PROCEDIMENTO:

1. Preparar a fase móvel hexanoacetato de etila 30%( de acetato)

2. Preparar as seguintes soluções:

anilina em acetato de etila;

produto obtido em acetato de etila;

padrão acetanilina em acetato de etila

cortar uma placa 4x7cm;

marcar as linhas de partida e chegada;

aplicar as três soluções, uma separada da outra;

correr a placa (eluir) e depois revelar.

CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO

CROMATOGRAFIA EM COLUNA:

Fase móvel;

Areia;

Fase estacionária “adsorvente”;

Torneira de Teflon;

Algodão

Neste tipo de cromatografia, o mecanismo de separação é adsorção. Neste caso a fase estacionária

é um sólido (adsorvente) e a fase móvel é líquida (mistura de dois ou mais solventes).

PROCESSO DE FLUIÇÃO:

OBSERVAÇÕES:

1. Este tipo de cromatografia pode ser usado tanto na separação de substâncias

orgânicas como para uma simples purificação;

2. Este tipo de cromatografia é bastante utilizado em laboratório de pesquisa,

principalmente em laboratórios de produtos naturais;

3. As dimensões desse tubo de vidro (coluna) vão depender da quantidade de amostra

que se quer separar. A relação amostra/solvente é 1:50 mínimo;

4. A fase estacionária ou adsorvente deve preencher no máximo 2/3 da coluna;

5. Na maioria das vezes a sílica gel é utilizada como fase estacionária;

6. Esta camada de areia serve para diminuir o impacto da fase móvel na fase estacionária

(2cm) esta areia deve ser tratada;

7. Neste tipo de cromatografia a fase móvel é empurrada para dentro da coluna por

gravidade porque este tubo é aberto;

8. Toda coluna de cromatografia é precedida de uma análise criteriosa de cromatografia

de camada delgada (CCD);

9. Toda parte de investigação e identificação das reações é por CCD.

PREENCHIMENTO DA COLUNA COM A FASE ESTACIONÁRIA:

1. Preenchimento a seco: Neste caso a fase estacionária é colocada no tubo, coluna

e com um bastão de vidro é feita uma vibração para que haja o perfeito depósito da

fase estacionária:

2. Fazer uma suspensão da fase móvel com a fase estacionária. Depois, preencher a

coluna na altura de 1/4 com a fase móvel. Finalmente, verter a suspensão sobre

esta fase móvel.

CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)

1. Uma amostra líquida volátil ou gasosa é injetada através de um septo para dentro de

uma câmara de vaporização aquecida, no qual ela se evapora rapidamente. O vapor é

arrastado na coluna pelo gás de arraste (fase móvel) H2, N2, He ou Argônio; os

constituintes fluem após serem separados. Depois disso, chegam ao detector, cuja

resposta é mostrada no registrador.

2. A CG também realiza análises de amostras sólidas, no entanto essas amostras devem

ser solubilizadas em um solvente volátil (alta pressão de vapor).

3. A coluna deve estar aquecida o bastante para proporcionar uma pressão de vapor

suficiente para que os constituintes eluidos num tempo razoável. O detector é mantido

numa temperatura superior a da coluna, logo todos os constituintes serão gasosos.

ESQUEMA DE UM CROMATÓGRAFO A GÁS:

1. O maior pico é o solvente. Os outros 4 são outras substâncias;

2. O requisito mais importante para uma amostra ser analisada por CG é a sua volatilidade;

sendo assim, esta é a grande limitação da CG.

3. Se o forno não estiver aquecido a coluna estará fria. Com isso, a amostra condensará. A

temperatura desse forno pode variar desde a temperatura ambiente até 400ºC;

4. A CG tem este nome porque a fase móvel é um gás.

Fase móvel: “gás de arraste”

Deve-se usar sempre gás de arraste com pureza de 99,9%. O gás de arraste mais usado

é o gás hélio. No entanto, H2, Ar e N2 podem também ser utilizados.O gás de arraste deve ser

escolhido conforme o tipo de detector.

Injetores: Folhas na técnica de injeção podem causar assimetria nos picos

cromatográficos, vaporização da área, alargamento dos picos, etc...

Tipos de injetores:

1. Injetor Split; (com divisão de fluxo)

2. Injetor Split-Less;(sem divisão de fluxo)

3. Injetor On- Column; (direto na coluna)

1. Injetor Split: Vazão da coluna 100:1, é um processo de eliminação de

parte da amostra gasosa evitar saturação da coluna. Neste tipo de injetor, quando 100 partes

da amostra são injetadas, apenas 1 parte da amostra entra na coluna, ou seja, os centros

ativos percam sua eficiência na separação. Todavia, a injeção com divisão de fluxo pode levar

a descriminação de um tipo de amostra.

2. Injetor Split-Less: Sem divisão de fluxo; isso aumenta a sensibilidade da

coluna, mas pode haver saturação da mesma.

3. Injetor On- Column: Usa-se quando a diferença de peso molecular entre

os componentes mais leve e o mais pesado é superior a 40 carbonos. Este tipo de injetor é

utilizado quando se tem amostras pesadas possuindo baixa pressão de vapor. Então essas

amostras dificilmente vaporizam na câmara de vaporização. Essa técnica de injeção é bastante

difícil e poucas pessoas sabem utilizar.

Colunas empacotadas: Neste tipo de colunas utiliza-se tubos de aço –inox, recheados

com sílica gel (fase estacionária).

Colunas capilares: A coluna capilar é constituída por um tubo de grande comprimento

(10-100m) e pequeno diâmetro (0,01-0,53m). A fase estacionária líquida se deposita sob

forma de uma película (0,5-1,0µm) nas paredes internas da coluna. O gás de arraste tem

caminho livre e a queda de pressão é muito pequena.

Tipos de colunas capilares:

Tipos de fase estacionária:

Denominação

Genérica

Constituição Limite de trabalho

Silicones (Se, DC, SP,

OV, SF).

Polisoloxana,

substituídas com

metil, vinil, fenil, etc

20-350ºC

Poliéster Poliésteres fenílicos 100-400ºC

Forno de colunas: As colunas estão num forno com controle termostático de modo que a

sua temperatura seja reprodutível.

Tipos de análises:

1. Análise isoterma: Nesta análise a temperatura da coluna permanece constante

durante o processo cromatográfico. Aplicação: análise de misturas contendo

componentes com pressões de vapor próximos.

2. Análise por temperatura programada: A análise é realizada com variação de

temperatura durante o processo cromatográfico. Aplicação: análise de misturas

contendo pressão de vapor diferentes.

EX: Ti = 50ºC Tf =

50ºC →10ºC/min→ 150ºC →5ºC/min→250ºC

OBS: Este tipo de análise é utilizada quando se tem numa mistura substâncias leves e mais

pesadas. Em temperatura mais baixas, os componentes mais voláteis irão separar e, depois, em

temperatura mais altas os componentes mais pesados serão separados.

DETECTORES:

Situados na saída da coluna, a sua função é medir quantidades pequenas dos componentes

separados, presentes na corrente do gás de arraste que elui da coluna. O sinal de saída do detector

é enviado a um registrador, integrador ou computador que, finalmente traça o cromatograma.

A temperatura do detector deve ser 50ºC acima da temperatura final da coluna para que os

componentes, não condensem.

TIPOS DE DETECTORES:

1. DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT): Neste detector existe um filamento

aquecido que pode ser refrigerado com a chegada de um componente da amostra. Este

resfriamento gera um pico no cromatograma. Este detector é muito sensível a variação de

temperatura, logo é pouco utilizado. ( O componente está dentro da coluna, não chegou ao

detector).

2. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC) OU NO INGLÊS (FID):

Os íons gerados durante a queima dos componentes em uma chama de Ar (ar comprimido) mais

H2, chegam em uma placa, gerando picos no cromatograma. Temperatura da coluna: acima de

100ºC. ( A amostra começou a chegar no detector).

3. DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE):

Neste detector acontece uma suspensão da corrente causada por absorção, de elétrons por um

componente altamente eletrofílico. Este detector é altamente seletivo pois só detecta espécies

que são capazes de capturar elétrons (halogenetos). (O componente já passou pelo detector e já

foi detectada).

4. DETECTOR DE NITROGÊNIOE FÓSFORO (DNP):

Este detector é seletivo para componentes que possuem nitrogênio e fósforo.( Este detector é

muito pouco utilizado por ser de difícil estabilização.

PARÂMETROS FUNDAMENTAIS DA CG:

1. RETENÇÃO:

Retenção na CG, é definido como o tempo transcorrido entre a injeção da amostra e o

máximo do pico cromatográfico.

TM= tempo morto

TR= tempo de retenção

Tr’= tempo de retenção ajustada (corrigido)

OBS: Mesmo que uma substância não interaja com a fase estacionária o seu tempo de

retenção não será nulo. Este tempo que o gás de arraste demora para percorrer a coluna é

chamado de tempo morto.

OBS TR’= Sendo assim, o parâmetro que realmente reflete as características físico-químicas

de retenção é chamado de tempo ajustado.

TR’=tr-tm α= t’r2

T’r1

SELETIVIDADE:

Seletividade é a capacidade de um sistema diferenciar dois compostos.É uma característica da

cromatografia gasosa que está associado à coluna cromatográfica.( α > 1).

Não confundir seletividade com resolução. Sendo assim, dois picos podem apresentar uma ótima

seletividade, ao mesmo tempo que uma péssima resolução.

α=3/2 = 1,5 ( maior seletividade,

muito boa).

α=4/3,5 = 1,14(seletividade é

boa).

OBS: Nesse caso, os picos apresentaram uma boa seletividade, mas não separaram na linha

base. Portanto a coluna utilizada é seletiva para os dois componentes apesar de não

apresentar uma boa resolução. Sendo assim, deve-se mudar as condições de análise e, caso

não dê certo, trocar a coluna.

RESOLUÇÃO DA COLUNA:

Quer dizer separação na linha da base.

Rs ≥ 1,5

Quando α=1 quer dizer que não houve separação dos componentes.

Rs= 2(t’r1+t’r2)

Wb1 + wb2

Wb= largura do pico na linha da base.

TEORIA DOS PRATOS TEÓRICOS:

Durante a passagem da substância pela coluna, o equilíbrio é rompido pelo efeito de transporte que

deve ser restabelecido consecutivamente. Do ponto de vista teórico considerar o processo em vários

estágios de equilíbrio é dividir a coluna em número de seções iguais entre si e, em cada dessas

seções o equilíbrio vapor-líquido deve ser restabelecido.

N = 16 (t’r)2

(wb)

ANÁLISE QUALITATIVA:

O parâmetro utilizado é o tempo de retensão que é o tempo transcorrido desde a injeção do analito

ao máximo do pico gerado: Como fazer isso:

a) Comparação com padrões puros;

b) Adição de padrão ( coluição)

ANÁLISE QUANTITATIVA:

INTEGRAÇÃO DO SINAL: Transforma a intensidade do sinal fornecida pelo detector em uma

medida relacionada com a quantidade de substância analisada na amostra.

ÁREA DO PICO:

A = a

Wb x 2 a= altura do pico

Wb= largura do pico

Existem três maneiras de realizar a análise quantitativa:

1. Normalização:

% A = área do pico x 100

Área total

Ex: 1- 10.000

2- 12.000

3- 6000

4- 8000 área total = 36000

% A3 = área do pico 3 x 100 = 6000 = 16,67%

Área total 36000

% A1 = 10000 x 100 = 27,78%

36000

CALIBRAÇÃO INTERNA:

Faz-se uma solução mãe de um padrão e dilui-se em 10 concentrações conhecidas e diferentes.

Depois injeta-se cada uma destas amostras. Para cada concentração terá uma integração podendo

então traçar uma curva de calibração.

PADRONIZAÇÃO INTERNA:

Adiciona-se uma quantidade de uma substância conhecida à amostra a ser analisada e compara as

duas áreas.

EX: P. 1mg ─ 20000 integração

X ─ A: 18000 integração de A

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC OU CLAE):

É um método de separação mais importante e bastante sofisticado. Utiliza-se pequenas colunas

recheadas, onde o pré requisito mais importante é a solubilidade da amostra na fase móvel. Sendo

assim, o uso desta técnica é vasto.

Nesta técnica de separação utiliza-se a fase móvel sobre pressão (sistema fechado). Isto torna a

análise reprodutível.

CONSTITUINTES DE UM CROMATÓGRAFO- LÍQUIDO:

Sistema de solvente→ bombas→ injetor→ coluna→ detector→ aquisição de dados

CG X HPLC

FATOR CG HPLC

1) REQUISITOS PARA

AMOSTRA

VOLÁTIL SOLÚVEL

2) TIPOS DE AMOSTRAS G,L,S , PM = 2 A 1200 L,S , PM = 32 A 400.000

3) TEMPO DE ANÁLISE MINUTOS ATÉ HORAS MINUTOS ATÉ MUITAS

HORAS

4) QUANTIDADE MÍNIMA 10-12 G 10-9 G

5) PRATOS TEÓRICOS 200-300.000 500-25000

6) TEMPO DE TREINAMENTO 3 MESES 6 MESES

7) TAMANHO DA COLUNA 3 A 100m 10 A 50m

FUNCIONAMENTO DA VÁLVULA DE INJEÇÃO:

TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAS PARA HPLC:

Existem 5 mecanismos:

1. cromatografia por adsorção:

fase estacionária: sólida (sílica gel)

fase móvel: liquida (mistura de até 4 solventes)

2. cromatografia por partição:

fase estacionária: líquida

fase móvel: líquida

3. cromatografia fase ligada ou fase reversa:

Fase estacionária: sílica gel + C18Cl ou + C8Cl

Fase móvel:

4. cromatografia por exclusão:

Fase estacionária contendo poros de tamanhos controlados. As moléculas pequenas

podem entrar nos poros aumentando o tempo de retenção. Este tipo é específico para

a separação de polímeros. Muito utilizado na fabricação de vacinas.

5. cromatografia por troca iônica:

Fase estacionária: sólida (resinas catiônicas ou aniônicas)

Fase móvel: líquida

Este tipo de cromatografia é usada para separar compostos (espécies) contendo carga

positiva ou negativa.