apostila de cromatografia

29
EMENTA DO CURSO 1- ASPECTOS GERAIS DA CORMATOGRAFIA; 2- CROMATOGRAFIA EM PAPAEL; 3- CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA; 4- CRMATOGRAFIA EM COLUNA; 5- CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA; 6- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA. *Livro: cromatografia: princípios básicos e técnicas afins. *Autor: Francisco Rolder de Aquino Neto Denise da Silva e Souza Nunes *Editora: Interciência.

Upload: janaina-leitinho

Post on 09-Sep-2015

220 views

Category:

Documents


6 download

DESCRIPTION

apostila de cromatografia

TRANSCRIPT

EMENTA DO CURSO

1- ASPECTOS GERAIS DA CORMATOGRAFIA;

2- CROMATOGRAFIA EM PAPAEL;

3- CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA;

4- CRMATOGRAFIA EM COLUNA;

5- CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA;

6- CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA.

*Livro: cromatografia: princpios bsicos e tcnicas afins.

*Autor: Francisco Rolder de Aquino Neto

Denise da Silva e Souza Nunes

*Editora: Intercincia.

CROMATOGRAFIA

A cromatografia em coluna foi desenvolvida primeiramente pelo qumico de petrleo- M.S. Tswett.

A sensibilidade, velocidade, exatido e simplicidade para separao, identificao e determinao de substncias resultam em um grande desenvolvimento deste mtodo.

As diferentes modalidades de cromatografia so responsveis por mais de 70% da qumica analtica.

A cromatografia est baseada na repartio dos analitos , entre duas fases, uma estacionria, e a outra mvel.

A distribuio, excluso, partio ou adsoro seletiva dos componentes um processo de equilbrio dinmico e as molculas dos analitos ora esto retidas na fase estacionria, ora deslocam-se com a fase mvel.

A separao entre dois, ou mais componentes resultar da diferena de suas constante de equilbrio de distribuio entre as duas fases simplificando quando mais tenazmente um componente preso pela fase estacionria, mais alta a porcentagem das molculas daquele componente que ficam retidos provocando um retardamento na migrao das mesmas.

Um segundo componente menos retido na fase estacionria ter uma porcentagem mais alta na fase mvel em relao ao primeiro componente. Assim, o conjunto de molculas deste componente se mover em direo ao fluxo mais rapidamente.

OBS: A IDENTIFICAO NA CROMATOGRAFIA SOMENTE OCORRER SE FOR CONFRONTADO COM O TIPO DE PADRO.

ANALITOS SO OS COMPONENTES DE UMA MISTURA DE DOIS OU MAIS SUBSTNCIAS.1) CLASSIFICAO DA CORMATOGRAFIA DE ACORDOCOM O SISTEMA CROMATOGRFICO:

Em coluna:Cromatografia lquida clssica (CLC)

Cromatografia em fase gasosa (CG)

Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE ou HPLC)

Planar: Cromatografia em papel;

Cromatografia em camada delgada.

2) De acordo com a fase mvel:

Fase mvel: Gs (He, H2, Ar, N2) Cromatografia em fase gasosa.

Fase mvel: Lquido

Cromatografia lquida clssica

Cromatografia lquida de alta eficincia

3) De acordo em a fase estacionria:

Lquida Slida Lquido pouco voltil 4) De acordo com o modo de separao:

Por adsoro Por partio Por troca inica 5) PRINCIPAIS TCNICAS CROMATOGRFICAS:

A) CROMATOGRAFIA POR ADSORO: A fase estacionria um slido e a fase mvel pode ser lquido ou gs.

B) CROMATOGRAFIA DE PARTIO: A fase estacionria um lquido e a fase mvel tambm um lquido.

C) CROMATOGRAFIA PLANAR: Nesta caso a fase estacionria suportada sobre uma placa (CCD) ou nos poros de um papel (CP).A fase mvel se movimenta atravs da fase estacionria por ao de capilaridade ou por ao da gravidade.

CROMATOGRAFIA EM PAPEL

Tira de papel-celulose;

Cmara (cuba) cromatogrfica;

Capilares;

Fase mvel;

Mistura a ser preparada

um mtodo fsico-qumico de separao dos componentes de uma mistura, em funo do deslocamento diferencial dos solutos arrastados por uma fase mvel, sendo retidos por uma fase estacionria lquida (gua) na cromatografia normal.

considerada, comumente, uma tcnica de partio. A fase mvel migra por capilaridade e os componentes movem-se a diferentes velocidades.

Tcnica: uma mancha de amostra depositada perto da base de um pedao de papel de filtro e o papel colocado numa cmara de desenvolvimento . Nesta tcnica os compostos hidrossolveis so separados.

Como preparar a tira de papel?

1) Cortar uma tira de papel num tamanho apropriado;

2) Marcar as duas, de partida e chegada com um lpis;

3) Aplicar na linha de partida as amostras e os padres;

4) Colocar na cmara uma quantidade de fase mvel;

5) Molhar a tira de papel com gua;6) Colocar a tira dentro da cmara em contato com a fase mvel;

7) Deixar o processo ocorrer at a chegada da fase mvel a linha de chegada;

8) Fazer a revelao.

AMFEFM

OBS: Cromatografia em papel: fase normal: a fase estacionria a gua ou um composto polar.

COEFICIENTE DE RETENO: RF

RFa = dra

Dm

RFb = drb

Dm

RFc = drc Dm

Dm= 10cm; Dra= 8 cm; Drb= 5 cm; Drc= 2,5 cm

DM: a distncia da linha de partida at a linha de chegada.

DRa: a distncia da linha de partida at o meio da mancha de A.

Drb DRc Dra O RF varia de 0 a 1.

A medida de RF no considerada uma propriedade fsico-qumica da substncia, pois este pode variar dependendo das condies do laboratrio.

MTODO DE IDENTIFICAO DOS ANALITOS ( REVELAO)1. Mtodo fsico;2. Mtodo qumico;3. Mtodo biolgico1. Mtodo fsico- A revelao feita com uma lmpada de ultra- violeta. Este mtodo um mtodo seletivo, pois nem todos os analitos conseguem absorver este tipo de luz. Este mtodo no destrutivo.

Espectroscopia na Regio da Ultra- violeta visvel:

200nm 400nm (U.V)

400nm 800nm (U.V)

2. Mtodo qumico- Uma substncia reveladora borrifada sobre a tira de papel.

3. Mtodo biolgico- A localizao de uma mistura de antibiticos baseia-se na inibio do crescimento de certos microorganismos.SOLVENTES DA FASE MVELCONSTANTE DIELTRICA

1) ter de petrleo1,84

2) hexano1,84

3) Clorofrmio4,80

4) Acetato de etila6,02

5) Diclorometano10,5

6) Acetona21,05

7) Etanol24,06

8) Metanol33,4

9) H2O80,4

TIPOS DE FASES ESTACIONRIA NA CP:

FASE NORMAL: Neste tipo de fase estacionria pode ser usado a gua ou outro solvente polar. J a fase mvel deve ser moderadamente polar.

FASE REVERSA: A tira de papel molhada com leo de silicone ou parafina. Nesse caso utiliza-se fase mvel polar. Os compostos hidrofbicos. ANLISE QUALITATIVA: realizada conforme a cor, se os analitos forem coloridos, ou por comparao dos RF de um padro com o RF de um analito.

ANLISE QUANTITATIVA:

1. Uma anlise direta da intensidade da cor da mancha de um padro com a mancha de um analito.2. Cortando o papel e pesando. Comparar com um pedao de papel sem a mancha.3. Anlise densitomtrica.PREPARO DE UMA CUBA CROMATOGRFICA

1. Coloque cerca de 1cm de altura da mistura de solvente, gua e etanol(1:1), em um bquer de 300mL.2. gua e etanol a fase mvel; fase mvel polar; o bquer a cuba cromatogrfica. Revista as laterais do bquer com papel de filtro. Tampe com uma placa de Petri e deixe a cuba saturar por 5 minutos.3. O papel de filtro tem a funo de saturar o ambiente e a placa de Petri impede que o solvente escape. Corte um pedao de papel de filtro e faa um trao a lpis a cerca de 1,5cm da base que encostar no solvente. Aps secar, coloque o papel na cuba cromatogrfica, feche e deixe diluir.4. O papel cortado o suporte da fase estacionria.5. Duas maneiras de formar a fase estacionria molhar o papel, em que ser colocado a amostra com gua, ou usar a gua da fase mvel (ou seja, no caso acima a gua utilizada como fase mvel e estacionria).CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA (CCD)

A CCD um tipo de cromatografia lquido-slido, em que a fase estacionria fixada como uma pelcula sobre uma placa.

A fase estacionria mais comumente utilizada a slica gel. Como fase mvel (ou eluente) mais comumente so usados etanol, clorofrmio, metanol, acetato de etila, hexano ou misturas desses lquidos.

A partir do valor de RF, possvel identificar uma substncia, pois ele caracterstico da mesma. ( comparar o RF de uma substncia com o Rf padro).Existem inmeras aplicaes da CCD nas reas de medicina, qumica, biologia, agronomia, farmcia, entre outros.

EXEMPLO: A medicina legal faz uso da cromatografia para investigar casos de envenenamento; a medicina emprega na identificao de estimulantes ingeridos por atletas.( mais utilizado por cromatografia gasosa ou HPLC).

MATERIAIS DAS PLACAS:

Vidro; Alumnio; Plstico MECANISMO DE SEPARAO

ADSORO:

Fase mvel lquida Fase estacionria slida xido de alumnio: utilizado como fase estacionria, pode apresentar as seguintes caractersticas (cida, bsica e neutra).MTODOS DE REVELAO:

1. FSICO: lmina de UV. Cmara de iodo

2. QUMICO: Interage com a soluo.3. BIOLGICO: APLIACAO DAS AMOSTRAS:

Afastadas uma das outras; ngulo de 90.TIPOS DE AMOSTRAS QUE PODEM SER PREPARADAS:

Slidas e lquidas (aldedos, cetonas, aminocidos, etc). OBS: Todas dissolvidas em solvente voltil (o solvente evapora e a amostra fica). ANLISE QUALITATIVA:

Comparao de cor ou RF das substncias com os padres.ANLISE QUANTITATIVA:

1. Raspar;2. Extrair;3. Filtrar;4. Evaporar;5. Pesar.EXERCCIO: Calcule os Rfs das substncias abaixo.

Dra= 2,5cm RFa= 2,5= 0,36

Drb= 6cm 7

Dm= 7cm RFb= 6 = 0,86

7

SINTESE DA ACETANILINA

PROCEDIMENTO:

1. Preparar a fase mvel hexanoacetato de etila 30%( de acetato)2. Preparar as seguintes solues: anilina em acetato de etila; produto obtido em acetato de etila; padro acetanilina em acetato de etila cortar uma placa 4x7cm; marcar as linhas de partida e chegada; aplicar as trs solues, uma separada da outra; correr a placa (eluir) e depois revelar.CROMATOGRAFIA POR ADSORO

CROMATOGRAFIA EM COLUNA:

Fase mvel; Areia; Fase estacionria adsorvente; Torneira de Teflon; AlgodoNeste tipo de cromatografia, o mecanismo de separao adsoro. Neste caso a fase estacionria um slido (adsorvente) e a fase mvel lquida (mistura de dois ou mais solventes).

PROCESSO DE FLUIO:

OBSERVAES:

1. Este tipo de cromatografia pode ser usado tanto na separao de substncias orgnicas como para uma simples purificao;2. Este tipo de cromatografia bastante utilizado em laboratrio de pesquisa, principalmente em laboratrios de produtos naturais;3. As dimenses desse tubo de vidro (coluna) vo depender da quantidade de amostra que se quer separar. A relao amostra/solvente 1:50 mnimo;4. A fase estacionria ou adsorvente deve preencher no mximo 2/3 da coluna;5. Na maioria das vezes a slica gel utilizada como fase estacionria;6. Esta camada de areia serve para diminuir o impacto da fase mvel na fase estacionria (2cm) esta areia deve ser tratada;7. Neste tipo de cromatografia a fase mvel empurrada para dentro da coluna por gravidade porque este tubo aberto;8. Toda coluna de cromatografia precedida de uma anlise criteriosa de cromatografia de camada delgada (CCD);9. Toda parte de investigao e identificao das reaes por CCD.PREENCHIMENTO DA COLUNA COM A FASE ESTACIONRIA:

1. Preenchimento a seco: Neste caso a fase estacionria colocada no tubo, coluna e com um basto de vidro feita uma vibrao para que haja o perfeito depsito da fase estacionria:2. Fazer uma suspenso da fase mvel com a fase estacionria. Depois, preencher a coluna na altura de 1/4 com a fase mvel. Finalmente, verter a suspenso sobre esta fase mvel.CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)

1. Uma amostra lquida voltil ou gasosa injetada atravs de um septo para dentro de uma cmara de vaporizao aquecida, no qual ela se evapora rapidamente. O vapor arrastado na coluna pelo gs de arraste (fase mvel) H2, N2, He ou Argnio; os constituintes fluem aps serem separados. Depois disso, chegam ao detector, cuja resposta mostrada no registrador.2. A CG tambm realiza anlises de amostras slidas, no entanto essas amostras devem ser solubilizadas em um solvente voltil (alta presso de vapor).3. A coluna deve estar aquecida o bastante para proporcionar uma presso de vapor suficiente para que os constituintes eluidos num tempo razovel. O detector mantido numa temperatura superior a da coluna, logo todos os constituintes sero gasosos. ESQUEMA DE UM CROMATGRAFO A GS:

1. O maior pico o solvente. Os outros 4 so outras substncias;2. O requisito mais importante para uma amostra ser analisada por CG a sua volatilidade; sendo assim, esta a grande limitao da CG.3. Se o forno no estiver aquecido a coluna estar fria. Com isso, a amostra condensar. A temperatura desse forno pode variar desde a temperatura ambiente at 400C;4. A CG tem este nome porque a fase mvel um gs. Fase mvel: gs de arraste Deve-se usar sempre gs de arraste com pureza de 99,9%. O gs de arraste mais usado o gs hlio. No entanto, H2, Ar e N2 podem tambm ser utilizados.O gs de arraste deve ser escolhido conforme o tipo de detector.

Injetores: Folhas na tcnica de injeo podem causar assimetria nos picos cromatogrficos, vaporizao da rea, alargamento dos picos, etc...

Tipos de injetores:1. Injetor Split; (com diviso de fluxo)

2. Injetor Split-Less;(sem diviso de fluxo)

3. Injetor On- Column; (direto na coluna)

1. Injetor Split: Vazo da coluna 100:1, um processo de eliminao de parte da amostra gasosa evitar saturao da coluna. Neste tipo de injetor, quando 100 partes da amostra so injetadas, apenas 1 parte da amostra entra na coluna, ou seja, os centros ativos percam sua eficincia na separao. Todavia, a injeo com diviso de fluxo pode levar a descriminao de um tipo de amostra.2. Injetor Split-Less: Sem diviso de fluxo; isso aumenta a sensibilidade da coluna, mas pode haver saturao da mesma.

3. Injetor On- Column: Usa-se quando a diferena de peso molecular entre os componentes mais leve e o mais pesado superior a 40 carbonos. Este tipo de injetor utilizado quando se tem amostras pesadas possuindo baixa presso de vapor. Ento essas amostras dificilmente vaporizam na cmara de vaporizao. Essa tcnica de injeo bastante difcil e poucas pessoas sabem utilizar.

Colunas empacotadas: Neste tipo de colunas utiliza-se tubos de ao inox, recheados com slica gel (fase estacionria). Colunas capilares: A coluna capilar constituda por um tubo de grande comprimento (10-100m) e pequeno dimetro (0,01-0,53m). A fase estacionria lquida se deposita sob forma de uma pelcula (0,5-1,0m) nas paredes internas da coluna. O gs de arraste tem caminho livre e a queda de presso muito pequena.

Tipos de colunas capilares: Tipos de fase estacionria:

Denominao GenricaConstituioLimite de trabalho

Silicones (Se, DC, SP, OV, SF).Polisoloxana, substitudas com metil, vinil, fenil, etc20-350C

PolisterPolisteres fenlicos100-400C

Forno de colunas: As colunas esto num forno com controle termosttico de modo que a sua temperatura seja reprodutvel. Tipos de anlises:1. Anlise isoterma: Nesta anlise a temperatura da coluna permanece constante durante o processo cromatogrfico. Aplicao: anlise de misturas contendo componentes com presses de vapor prximos.2. Anlise por temperatura programada: A anlise realizada com variao de temperatura durante o processo cromatogrfico. Aplicao: anlise de misturas contendo presso de vapor diferentes. EX: Ti = 50C Tf =

50C 10C/min 150C 5C/min250C

OBS: Este tipo de anlise utilizada quando se tem numa mistura substncias leves e mais pesadas. Em temperatura mais baixas, os componentes mais volteis iro separar e, depois, em temperatura mais altas os componentes mais pesados sero separados.

DETECTORES:

Situados na sada da coluna, a sua funo medir quantidades pequenas dos componentes separados, presentes na corrente do gs de arraste que elui da coluna. O sinal de sada do detector enviado a um registrador, integrador ou computador que, finalmente traa o cromatograma.

A temperatura do detector deve ser 50C acima da temperatura final da coluna para que os componentes, no condensem.

TIPOS DE DETECTORES:

1. DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT): Neste detector existe um filamento aquecido que pode ser refrigerado com a chegada de um componente da amostra. Este resfriamento gera um pico no cromatograma. Este detector muito sensvel a variao de temperatura, logo pouco utilizado. ( O componente est dentro da coluna, no chegou ao detector).

2. DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC) OU NO INGLS (FID):

Os ons gerados durante a queima dos componentes em uma chama de Ar (ar comprimido) mais H2, chegam em uma placa, gerando picos no cromatograma. Temperatura da coluna: acima de 100C. ( A amostra comeou a chegar no detector).

3. DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE):

Neste detector acontece uma suspenso da corrente causada por absoro, de eltrons por um componente altamente eletroflico. Este detector altamente seletivo pois s detecta espcies que so capazes de capturar eltrons (halogenetos). (O componente j passou pelo detector e j foi detectada).

4. DETECTOR DE NITROGNIOE FSFORO (DNP):Este detector seletivo para componentes que possuem nitrognio e fsforo.( Este detector muito pouco utilizado por ser de difcil estabilizao.

PARMETROS FUNDAMENTAIS DA CG:1. RETENO:

Reteno na CG, definido como o tempo transcorrido entre a injeo da amostra e o mximo do pico cromatogrfico.

TM= tempo morto

TR= tempo de reteno

Tr= tempo de reteno ajustada (corrigido)

OBS: Mesmo que uma substncia no interaja com a fase estacionria o seu tempo de reteno no ser nulo. Este tempo que o gs de arraste demora para percorrer a coluna chamado de tempo morto.

OBS TR= Sendo assim, o parmetro que realmente reflete as caractersticas fsico-qumicas de reteno chamado de tempo ajustado.

TR=tr-tm = tr2

Tr1

SELETIVIDADE:

Seletividade a capacidade de um sistema diferenciar dois compostos. uma caracterstica da cromatografia gasosa que est associado coluna cromatogrfica.( > 1).

No confundir seletividade com resoluo. Sendo assim, dois picos podem apresentar uma tima seletividade, ao mesmo tempo que uma pssima resoluo.

=3/2 = 1,5 ( maior seletividade, muito boa).

=4/3,5 = 1,14(seletividade boa).

OBS: Nesse caso, os picos apresentaram uma boa seletividade, mas no separaram na linha base. Portanto a coluna utilizada seletiva para os dois componentes apesar de no apresentar uma boa resoluo. Sendo assim, deve-se mudar as condies de anlise e, caso no d certo, trocar a coluna.RESOLUO DA COLUNA:

Quer dizer separao na linha da base.

Rs 1,5

Quando =1 quer dizer que no houve separao dos componentes.

Rs= 2(tr1+tr2) Wb1 + wb2 Wb= largura do pico na linha da base.

TEORIA DOS PRATOS TERICOS:

Durante a passagem da substncia pela coluna, o equilbrio rompido pelo efeito de transporte que deve ser restabelecido consecutivamente. Do ponto de vista terico considerar o processo em vrios estgios de equilbrio dividir a coluna em nmero de sees iguais entre si e, em cada dessas sees o equilbrio vapor-lquido deve ser restabelecido.

N = 16 (tr)2 (wb)ANLISE QUALITATIVA:O parmetro utilizado o tempo de retenso que o tempo transcorrido desde a injeo do analito ao mximo do pico gerado: Como fazer isso:

a) Comparao com padres puros;

b) Adio de padro ( coluio)

ANLISE QUANTITATIVA:

INTEGRAO DO SINAL: Transforma a intensidade do sinal fornecida pelo detector em uma medida relacionada com a quantidade de substncia analisada na amostra.REA DO PICO:

A = a

Wb x 2 a= altura do pico

Wb= largura do pico

Existem trs maneiras de realizar a anlise quantitativa:

1. Normalizao:

% A = rea do pico x 100

rea totalEx: 1- 10.000

2- 12.000

3- 6000

4- 8000 rea total = 36000

% A3 = rea do pico 3 x 100 = 6000 = 16,67%

rea total 36000

% A1 = 10000 x 100 = 27,78%

36000

CALIBRAO INTERNA:Faz-se uma soluo me de um padro e dilui-se em 10 concentraes conhecidas e diferentes. Depois injeta-se cada uma destas amostras. Para cada concentrao ter uma integrao podendo ento traar uma curva de calibrao.

PADRONIZAO INTERNA:

Adiciona-se uma quantidade de uma substncia conhecida amostra a ser analisada e compara as duas reas.

EX: P. 1mg 20000 integrao

X A: 18000 integrao de A

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (HPLC OU CLAE):

um mtodo de separao mais importante e bastante sofisticado. Utiliza-se pequenas colunas recheadas, onde o pr requisito mais importante a solubilidade da amostra na fase mvel. Sendo assim, o uso desta tcnica vasto.Nesta tcnica de separao utiliza-se a fase mvel sobre presso (sistema fechado). Isto torna a anlise reprodutvel.

CONSTITUINTES DE UM CROMATGRAFO- LQUIDO:

Sistema de solvente bombas injetor coluna detector aquisio de dados

CG X HPLC

FATOR CG HPLC

1) REQUISITOS PARA AMOSTRAVOLTILSOLVEL

2) TIPOS DE AMOSTRASG,L,S , PM = 2 A 1200L,S , PM = 32 A 400.000

3) TEMPO DE ANLISEMINUTOS AT HORASMINUTOS AT MUITAS HORAS

4) QUANTIDADE MNIMA10-12 G10-9 G

5) PRATOS TERICOS200-300.000500-25000

6) TEMPO DE TREINAMENTO3 MESES6 MESES

7) TAMANHO DA COLUNA3 A 100m10 A 50m

FUNCIONAMENTO DA VLVULA DE INJEO:

TIPOS DE FASES ESTACIONRIAS PARA HPLC:

Existem 5 mecanismos:

1. cromatografia por adsoro:

fase estacionria: slida (slica gel)

fase mvel: liquida (mistura de at 4 solventes)

2. cromatografia por partio:

fase estacionria: lquida

fase mvel: lquida

3. cromatografia fase ligada ou fase reversa:

Fase estacionria: slica gel + C18Cl ou + C8Cl

Fase mvel:

4. cromatografia por excluso:

Fase estacionria contendo poros de tamanhos controlados. As molculas pequenas podem entrar nos poros aumentando o tempo de reteno. Este tipo especfico para a separao de polmeros. Muito utilizado na fabricao de vacinas.5. cromatografia por troca inica:

Fase estacionria: slida (resinas catinicas ou aninicas)

Fase mvel: lquida

Este tipo de cromatografia usada para separar compostos (espcies) contendo carga positiva ou negativa.