apostila biotecnologia de alimentos (1)

UNIJUI UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RS DBQ DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA E QUMICA CURSO - QUMICA INDUSTRIAL DE ALIMENTOS

INDICE

APRESENTAO........................................................................................................................... 1 INTRODUO A TECNOLOGIA DE FERMENTAES........................................................... 2 MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL ....................................................................... 9 18

ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR.....................................

CRESCIMENTO CELULAR ........................................................................................................... 27 CLASSIFICAO DOS PROCESSOS............................................................................................ 37 EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES STARTERS........................................................... 40 SISTEMAS DE FERMENTAO.................................................................................................. 48 INTRODUO AO ESTUDO DA FERMENTAO ALCOLICA........................................... 54 SEPARAO DOS PRODUTOS DE FERMENTAO.............................................................. 66 SEPARAO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM LEVEDURAS....... 73 PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM BACTRIAS.......................................... 77 DIGESTO ANAERBICA (FERMENTAO METANOGNICA)......................................... 79 TECNOLOGIA DE PRODUO E UTILIZAO DE ENZIMAS.............................................. 89

APRESENTAO

A Biotecnologia um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da transformao ou tratamento de materiais de origem biolgica. Spinks (1980) define Biotecnologia como a utilizao de organismos vivos ou sistemas biolgicos para a produo industrial e seu uso em servios de saneamento. A tendncia atual de incluir no termo Biotecnologia, em seu aspecto mais essencial, a Microbiologia Industrial, que trata do aproveitamento dos microrganismos como agentes de degradao e sntese. Por semelhana dos conceitos fundamentais que regem o tratamento biolgico de efluentes, o cultivo de clulas animais e vegetais e a produo de certos medicamentos. Assim, tambm devido ao seu amplo significado, pode englobar tambm aspecto igualmente importante da Cincia, Tecnologia e Engenharia de Alimentos. De certa forma, os processos de fermentao representa uma elo que liga as antigas artes de elaborao de alimentos (queijo, vinho, ...), mediante o uso de uma flora microbiana natural com a moderna industria de fermentao de alimentos que utilizava cultivos puros e sofisticados equipamentos de controle do processo. A produo em larga escala de protenas de organismos unicelulares, produo de antibiticos, produo de clulas animais e vegetais e a produo compostos qumicos a partir de matrias-primas renovveis em substituio aos combustveis fsseis, so exemplos de outras reas onde os processos fermentativos podem ser utilizados. O componente curricular Biotecnologia de Alimentos pretende tem como objetivo principal estudar alguns elementos essenciais e bsicos dos processos fermentativos: introduo a microbiologia industrial, sistemas de fermentaes, desenho de fermentadores, cintica de crescimento, metabolismo microbiano, esterilizao na indstria fementativa, produo de enzimas, cultivos starters. Objetiva, tambm, abordar de forma mais detalhada alguns tipos de fermentao: alcolica, lctica, actica, metanognica.

Prof. Raul Vicenzi

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Introduo biotecnologia de alimentos

INTRODUO A TECNOLOGIA DE FERMENTAES O termo Fermentao deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das bolhas devido a produo de dixido de carbono pela ao das leveduras sobre o extrato de frutas ou gros de malte;

Significado bioqumico: relata a gerao de energia pelo catabolismo de compostos orgnicos; Produo de vinho: 10.000 a.C. - provavelmente o vinagre foi descoberto na mesma poca e as bebidas alcolicas destiladas surgiram a mais de 10.000 a.C. na China; Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egpcios deixavam a cevada germinar em potes de barro, aps estrusavam e amassavam os gros lavando-os aps para obter a bebida, ainda, utilizavam as leveduras da cerveja produzir CO2 para o crescimento de pes; Leite e derivados lcteos: dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite quando retido no estmago de terneiros jovens coagulava-se (ao enzimtica); Produtos crneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem j sabia que a carne finamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne era seca e enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como um flavor agradvel Este produto foi o precursor da lingia fermentada produzida atualmente. O nome salame provm da cidade de Salamis, destruda a mais de 2000 anos, situada na costa oeste da ilha Grega de Cypros. Exame microscpico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440 a.C. demonstram claramente que na maioria das vezes continham leveduras, observando-se uma pureza maior nos sedimentos mais recentes. A necessidade de preservar a carne da caa e de animais domsticos abatidos durante o inverno e consumidos no vero (summer sausage), fizeram com que o homem procurasse solues para a preservao do produto. Assim, os produtos crneos fermentados tornaram-se de grande importncia no mercado alimentar permitindo preservar a carne e atribuir a ela sabor e aroma caractersticos da tecnologia usada. Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscpio, foi o primeiro a examinar em 1680 gotas de cerveja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida...... 1856-1857: Louis Pasteur, aps investigaes detalhadas sobre as leveduras da cerveja e do vinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o acar em etanol e CO2 quando em anaerobiose. Pateur tambm observou muitas outras fermentaes: Ex.: observou provavelmente um Penicillium que fermentava D-tartarato de amnio em uma mistura racmica de D e L-tartarato (tartarato de Na, K); Observou tambm como uns microrganismos cilndricos produziam cido butrico somente em condies anaerbias e investigou a produo de cido actico por fermentao; 1870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de um microrganismo frente a outros e previram suas aplicaes teraputicas;Prof. Raul Vicenzi 2


1881 - Robert Kock estudou e desenvolveu tcnicas de cultivo puro assim como outros mtodos bacteriolgicos clssicos utilizados at hoje; Dois elementos vitais deram inicio a era moderna da tecnologia de fermentaes industriais: Emprego de fungos e leveduras na modificao de alimentos e bebidas e os estudos microbiolgicos pioneiros de Pasteur e Kock. Desenvolvimento de fermentaes em superfcie ou semi-slidas surgiu com o desenvolvimento de alimentos orientais e durante as grandes navegaes; Capacidade hidroltica de determinados fungos em hidrolisar o amido e protenas na produo de molho de soja, este foi o inicio das fermentaes industriais. Cultivo de algas e fungos deu inicio ao processo industrial de obteno de protenas alimentcias microbianas (SCP - protenas de organismos unicelulares) e de inculos de microrganismos Produo de vinagre e os estudos de Pasteur sobre a produo de cidos prepararam o caminho para o desenvolvimento de fermentaes que produzissem cidos orgnicos; O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros por Kock proporcionou o surgimento de tcnicas que permitiram estudar as aplicaes industriais de espcies microbianas individuais, iniciando-se o emprego de cultivos puros, meios esterilizados e condies asspticas nas fermentaes industriais. FERMENTAO DE ALIMENTOS Fermentao de po, queijo e cerveja bem como bebidas alcolicas desenvolveram-se para satisfazer as exigncias comerciais modernas de produo em grande escala, com qualidade elevada e constante, custos competitivos e variedade de produtos. Produo de cultivos Starters para produtos lcteos e o emprego de enzimas industriais melhoraram a eficincia dos processos, assim como a automao e controle da qualidade na produo de po e produtos lcteos. Fermentao de po em temperaturas mais elevadas e com maior quantidade de inoculo; Uso de amilases microbianas na produo de acares fermentescveis a partir de gros de amido, proporcionando acares as leveduras para que fermentem liberando CO2 (crescer a massa de po e produzir textura caracterstica). Tcnicas de Pasteurizao: permitiram a produo de cerveja em escala industrial fazendo com que industrias artesanais de cerveja, vinhos, licores passassem rapidamente a grandes complexos produzindo em grande escala. Tcnicas de controle de processo como: (Para garantir maior vida-de-prateleira aos alimentos) Controle da velocidade de inoculao; Viabilidade e condies de armazenamento das leveduras; Controle das condies de oxignio dissolvido; Controle da concentrao de Nitrognio solvel e de acares fermentescveis no lcool; Controle da temperatura do processo; Fermentao em processos contnuos;Prof. Raul Vicenzi 3


Introduo de inovaes tecnolgicas como: Obteno de cerveja com elevadas concentraes de mosto; Emprego de cereais no malteados e enzimas microbianas Produo de cervejas com baixos nveis de carboidratos Aplicao de tcnicas genticas convencionais para melhorar a qualidade das leveduras e eliminar caractersticas indesejveis. LEVEDURAS DE PANIFICAO Sculo XVII os padeiros obtinham suas leveduras nas cervejarias locais; Devido ao seu sabor amargo e atividades de fermentao variveis, foram gradualmente sendo substitudas por leveduras procedentes de fbricas de bebidas alcolicas. 1781 obtm-se as primeiras leveduras de panificao prensadas, obtidas atravs do processo Holands e posteriormente em 1846 mediante o processo denominado Viena Ambos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% respectivamente referente a matria-prima e 30% de lcool. 1879-1919 - avanos substanciais nos processos fermentativos com uso de biomassa permitindo a obteno industrial de leveduras para panificao de forma independente de bebidas alcolicas; 1879 - Marquardt introduziu a aerao no processo fermentativo de cereais permitindo aumentar o rendimento e diminuindo a produo de lcool a 20%. INOVAES TECNOLGICAS: Adio gradual de acar Surge o primeiro processo de retro-alimentao Permite elevar a eficincia do processo ate prximo do mximo terico sem a formao conjunta de lcool.

Durante a Primeira Guerra Mundial a Alemanha desenvolve a produo de leveduras de panificao usando melao (todo resduo dos processos industriais da poca) como substrato, com a finalidade de produzir protena para o consumo humano - Primeiro processo moderno para produo de SCP. Durante a Segunda Guerra Mundial, tambm na Alemanha, inicia-se a produo de SCP para consumo humano e animal a partir de Candida utilis, utilizando melao procedente da produo de papel e polpa de celulose, obtendo-se os acares (substrato) a partir da hidrlise cida da madeira. USA, Sua, Taiwan e Rssia passam tambm a utilizar este processo. CIDOS ORGNICOS 1881 inicia-se a produo comercial de cidos orgnicos sendo que at hoje 50% do cido lctico utilizado a nvel industrial produzido via fermentao usando Lactobacil1us delbrueckii.Prof. Raul Vicenzi 4


cido Ctrico extrado inicialmente a partir do suco de limo e posteriormente sintetizado a partir do glicerol. 1923 - inicia-se a produo de Citrato via fermentao industrial, atualmente estima-se uma demanda aproximada de 450.000 toneladas/ms produzidas exclusivamente por fermentao, inicialmente: Empregava-se cultivo em superfcie de Aspergilius niger como organismo produtor (citrato). Aps a 2 Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submerso. Entretanto em 1977 desenvolve-se o processo que utiliza Candida, muito mais eficiente. Outros cidos orgnicos so produzidos de forma econmica e rentvel por fermentao: Ex.: produo de Acido Glucnico e Acido Actico, este obtido pela oxidao do etanol utilizando Acetobacter aceti. Entretanto, o cido Actico em escala industrial produzido somente por via qumica. LCOOL E CETONAS Durante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar azeites vegetais utilizados na produo de glicerol, componente para produo de explosivos, desenvolve a primeiro processo fermentativo de produo de glicerol, produzido por leveduras a partir do etanol em presena de bissulfito de sdio; Durante a Primeira Guerra na Inglaterra desenvolvido o processo de fermentao acetonabutanol por via anaerbia, utilizando Clostridium acetobutylicum, este foi o primeiro processo em grande escala que necessitava mtodos de cultivos puros para prevenir a contaminao. Aps a Guerra a demanda deste produto diminuiu, entretanto aumentou a procura por n-butanol, produzido por fermentao at os anos 50, sendo substitudo pelo n-butanol produzido a partir do petrleo, cujo preo era mais baixo que o preo do amido e dos substratos a base de acar utilizados no processo fermentativo. 1941 - Inicia-se a implementao da indstria da fermentao alcolica nos USA, aps revogarse a proibio da produo de lcool por bioprocessos, sendo responsvel ento por 77% do lcool industrial produzido 1973 - A crise do petrleo faz surgir projetos para produo de combustveis alternativos. Surge o PROLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhes de gales de etanol/ano, a partir da cana-de-acar. Nos USA inicia-se o Gasohol Program que destinava-se a produzir lcool a partir do milho, adicionando cerca de 10% na gasolina. Este projeto fez surgir um nmero muito grande de plantas industriais de pequena e grande escala utilizando processos contnuos e descontnuos. AMINOCIDOS Glutamato Monosdico e a Lisina so os que se produzem em maiores quantidades, cerca de 500.000 e 80.000 toneladas/ms, respectivamente. A produo de aminocidos resultado do trabalho de pesquisa sobre os mecanismos bioqumicos que regulam a biosntese destes compostos por microrganismos, obtendo-se superprodues a partir de mutaes e do controle do processo de fermentao.Prof. Raul Vicenzi 5


As novas tcnicas passam a: Estimular as clulas para que usem substratos alternativos; Preveno ou impedimento de reaes laterais; Induo e ativao de enzimas biosintticas; Reduo ou inibio de atividades enzimticas que poderiam degradar o produto e, finalmente facilitar a excreo do aminocido pelo microrganismo. As pesquisas que culminaram com o desenvolvimento do processo de fermentao para produo de cido glutmico foram as responsveis pelo grande avano na produo de aminocidos por fermentao. Hoje a maioria dos aminocidos comerciais so produzidos por fermentao. Assim como a de monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencializadores de sabor. BIOPOLIMEROS Goma Xantana - biopolmero mais importante atualmente em funo do volume de produo, utilizada como gelificante ou estabilizante de suspenses. Produzido por fermentao utilizando a bactria Xanthomonas campestris. Outras gomas: Alginato produzido pelo Azetobacter vinelandii; Pululano produzido pelo Aureobasidium pullulans; Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum; Gelano produzido pela Pseudomonas elodea Gomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades causando problemas nos processos de mistura, transferncia de massa e calor em fermentadores. Estes aspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenhar um aparelho de fermentao. POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) : polister termoplstico acumulado intracelularmente em alguns tipos de bactrias ( Bacillus subtilis, Pseudomonas oleovorans, Alcaligenes eutrophus, entre outras) at um nvel de 80% da massa seca celular, sua produo permite a fabricao de plsticos biodegradveis. VITAMINAS A maioria das vitaminas produzida por mtodos qumicos. Entretanto algumas vitaminas podem ser produzidas por fermentao. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina, cido flico, cido pantotnico, piridoxamina, vitamina B12 e riboflavina. A sntese qumica da vitamina B12 muito complexa sendo que sua produo comercial s vivel por via fermentativa utilizando Pseudomonas. Riboflavina: sua produo por fermentao compete eficazmente com os mtodos de sntese e semi-sntese, sendo que 30% da demanda mundial produzida por fermentao.

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Recentemente uma cepa recombinante de Bacillus subtilis foi patenteada, sendo capaz de produzir 4,5g de riboflavina em 24 horas de fermentao, perodo muito inferior aos 5 dias necessrios quando se utiliza Ascomycetes.

ANTIBITICOS Pasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgou que poderiam ter efeito teraputico. 1928 - Alexander Fleming observou que Penicillium notatum, contaminante dos cultivos de Staphylococcus aureos, matava as bactrias, identificando o ingrediente ativo, a Penicilina, podia inibir outras bactrias. Aps a penicilina ter sido isolada na sua forma ativa, em 1940 nos USA, Florey e Chain demonstraram sua destacada atividade antibacteriana desenvolvendo-se ento um processo fermentativo comercial para sua produo. Este fato marcou o incio da indstria de antibiticos. Seguiu-se ento a descoberta de Estreptomicina a partir de espcies de Streptomyces Cefalosporinas a partir de Cephalosporium acremonium Com o desenvolvimento a partir de 1940 de tcnicas de gentica microbiana que implicaram em tcnicas de mutao e seleo de microrganismos, permitiu aumentar muito o rendimento da produo de penicilina de poucas mg/L para at 20g/L de cultivo. Iniciam-se tambm, nesta poca, os estudos sobre a produo de metablitos secundrios, pequenas molculas como os antibiticos que no tm papel importante no crescimento e manuteno das clulas. TRANSFORMAES DE ESTERIDES O uso de microrganismo, o domnio das tcnicas microbiolgicas e fermentativas permitiu fazer transformaes enzimticas altamente seletivas e especificas, representando um grande avano na produo de frmacos, como os hormnios esterides. 1940 - descobriu-se que a cortisona, esteride secretado pela glndula adrenal, aliviava a dor de pacientes com artrite reumtica, o que fez desenvolver-se um processo de sntese qumica para sua produo que requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g; 1952 - cientistas descobrem que uma cepa de Rhizopus arrhizus hidroxilava a progesterona, produzindo 11-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da sntese de cortisona casse para 11 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g. 1980 - Introduziram-se modificaes no processo e os custos foram diminuindo gradativamente de forma que hoje estes custos esto prximos de U$ 0,46/g. Tcnicas semelhantes de biotransformao microbiana permitiram a sntese de outros esterides como a aldosterona, prednisona e prednisolona, assim como de outros frmacos importantes na medicina.

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ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATIVO 1) Formulao do meio de cultura a ser usado no processo; 2) Esterilizao do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares; 3) Produo de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador; 4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condies timas para a formao do produto 5) Extrao do produto e sua purificao; 6) Disposio dos efluentes produzidos no processo. REAS DE APLICAO DA FERMENTACO INDUSTRIAL A) ALIMENTOS v Massas fermentadas (po, panetone); v Carnes fermentadas (salame, lingia); v Bebidas fermentadas (cerveja, vinho ...); v Bebidas destiladas (conhaque, aguardente ...); v Leite fermentado (iogurte, queijo ...); v Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase ...); v Condimentos (vinagre, glutamato...) v Aminocidos (lisina, cido glutmico); v Polissacardeos (dextrano) B) PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS v lcool (industrial e carburante); v Antibiticos de uso veterinrio; v Biogs; v Hormnios de crescimento vegetal. C) MEDICAMENTOS v Antibiticos; v Vacinas; v Vitaminas; v Hormnios de consumo humano (insulina); v Aminocidos. D) CIDOS ORGNICOS E SOLVENTES v cido ctrico; v cido actico; v Etanol; v Propanol; v Butanol; v cido lctico.Prof. Raul Vicenzi 8

Microbiologia industrial

INTER-RELAES ENTRE MICRORGANISMOS E ENZIMAS As relaes existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos so muito importantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reaes qumicas especificas. As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimtica pode convenientemente ser manipulada em bio-reatores apropriados. Por outro lado as clulas microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporte slido, atuam como catalizadores que levam a reaes qumicas concretas, da mesma maneira que as enzimas isoladas, o que denota menos trabalho preparativo. Desta maneira uma grande parte da tecnologia de fermentaes se refere ao cultivo de microrganismos em grande escala. A seleo e aplicao dos princpios da engenharia gentica aplicada a microrganismos apropriados permitem manipular o contedo enzimtico destes em determinadas condies. Tambm o crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocar a induo da enzima necessria para a degradao desse substrato de crescimento dentro da clula. Ex.: o cultivo de levedura sobre maltose induzir a biossntese da enzima maltase, (uma glucosidase) que degrada maltose a glicose, que necessria para a produo de energia qumica em forma de ATP dentro da levedura. MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL Introduo Os produtos comercialmente importantes das fermentaes industriais so de 4 categorias: clulas microbianas, molculas grandes como enzimas e polissacardeos, produtos bsicos e metablitos secundrios que no so necessrios para o crescimento celular. A produo comercial dos produtos de fermentao tem utilizado principalmente diversas espcies de bactrias, leveduras e fungos, ainda que os avanos recentes no desenvolvimento de tcnicas de cultivos tm permitido utilizar clulas mais complexas nos processos de fermentao. Microrganismos Industriais Na natureza existem duas classes principais de clulas, ambas utilizadas nos processo de fermentao industrial: procariontes - clulas bacterianas; eucariontes -leveduras, fungos, clulas animais e vegetais. Os microrganismos tambm se diferenciam em funo de suas exigncias de oxignio, podendo dividir-se em estritamente aerbias, como os Streptomyces e a maioria dos fungos filamentosos, que podem desenvolver-se unicamente em presena de O2 e os estritamente anaerbios, como os Clostridios, que unicamente podem crescer na ausncia de O2 e os microorganismos facultativos, entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situao de aerobiose e anaerobiose. As bactrias utilizadas nos processos fermentativos so principalmente quimiorganotrficos, isto , podem obter sua energia e seu carbono por oxidao dos compostos orgnicos. As bactrias podem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em funo de suas resposta a colorao de Gram. A reproduo se d por diviso assexuada. Os esporos so produzidos usualmente em respostaProf. Raul Vicenzi 9


as condies adversas do meio, porque so mais resistentes ao calor e aos compostos txicos que as clulas vegetativas e posteriormente germinam em condies apropriadas. As bactrias so desprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos fotossintticos Os fungos (bolores) tambm so quimiorganotrficos e os mais importantes utilizados nas fermentaes se classificam principalmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dos gneros Mucor e Rhizophus e os Deuteromycotina, septados dos gneros Thicotherma, Aspergillus, Penicillium Fusarium e Aureobasidium. Os fungos so desprovidos de clorofila ou outros pigmentos fotossintticos. Sua reproduo pode ser assexuada (esporulao) ou sexuada. As leveduras so fungos geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada (por gemao ou diviso binria) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos fementativos industriais a Saccharomyces cerevisiae, principalmente para produo de lcool e nas panificaes. Esta levedura no degrada a lactose, por isso para produzir lcool e biomassa a partir de soro de leite utilizada Kluyveromyces lactis, que possuem as enzimas necessrias para degradar lactose. Outras leveduras importantes so: Candida utilis e Endomycopsis fibuliger Os vrus no tm estrutura celular alguma, possui o material gentico (DNA ou RNA) contido por uma camada de protena. No possuem atividade metablica e, portanto, no sintetizam protoplasma nem crescem. Em conseqncia disto sua multiplicao no pode ser feita por um processo de diviso, como nos microrganismos celulares. Novos vrus so produzidos pelas clulas nas quais penetram, de acordo com as informaes contidas no seu cido nuclico. So agentes submicroscpicos que infecta as plantas, animais e bactrias. Os vrus bacterianos (bacterifagos) infectam os processos de fermentao de cepas microbianas e causa srios problemas, particularmente nos cultivos starter utilizados no processamento de alimentos. Clulas animais e clulas vegetais tambm podem ser utilizadas nos processos fermentativos industriais, principalmente para a produo de antibiticos e hormnios vegetais. Necessitam de um meio muito nutritivo e so sensveis a flutuaes de fatores externos como temperatura, pH, O2 e CO2 dissolvidos. FONTES NUTRICIONAIS PARA OS MICRORGANISMOS Basicamente as necessidades nutricionais dos microorganismos so as mesmas de todos os seres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes de energia e fonte de material plstico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos nutritivos: a) os vegetais so fotossintticos (obtm energia da luz solar) e autotrficos, se nutrem exclusivamente de substncias inorgnicas; b) os animais so quimiotrficos, pois obtm energia as custas de reaes qumicas e heterotrficos, por exigirem fontes orgnicas de carbono. Entre os microrganismos h uma grande variedade de tipos intermedirios. FONTES DE ENERGIA a) Algumas bactrias realizam fotossntese, porm no produzem oxignio. Podem utilizar fontes inorgnicas (liotrficas) ou compostos orgnicos (organotrficas) como doadores de eltrons. b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das bactrias so quimiossintticas, obtendo energia asProf. Raul Vicenzi 10


custas de reaes qumicas, nas quais substratos adequados so oxidados com desprendimento de energia. Estes substratos podem ser inorgnicos (litotrficos) ou orgnicos (organotrficos). No primeiro grupo encontramos apenas bactrias, como por exemplo, Thiobacillus, capazes de oxidar enxofre, produzindo cido sulfrico, podem ser utilizados na lixiviao de metais, como cobre e urnio. A grande maioria das bactrias e a totalidade de fungos, leveduras e, tambm, os protozorios so quimiorganotrficos. FONTES DE MATERIAL PLSTICO MATRIASPRIMAS COMO FONTE DE CARBONO Para os autotrficos a nica fonte de carbono necessria o CO2 . Para os heterotrficos, h necessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintticas: Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose (alto custo), leos, Metanol, Etanol; Melao de cana-de-acar Composio varivel (rico em aminocidos, vitaminas, minerais, vrios acares); corrigir deficincias (N, P, S); Extrato de Malte cevada malteada; 90-95% de CHO; rico em aminocidos. MATRIASPRIMAS COMO FONTE DE NITROGNIO Quanto s necessidades de nitrognio h trs categorias principais de microrganismos: Alguns microrganismos, especialmente bactrias, retiram o nitrognio diretamente da atmosfera e o converte em nitrognio orgnico. Muitos fungos e quase totalidade das bactrias utilizam compostos inorgnicos de nitrognio, como amnio e nitratos. Algumas bactrias exigem fontes orgnicas de nitrognio. De um modo geral, adicionar aminocidos ou hidrolisados de protenas favorece o crescimento da maioria dos heterotrficos. o Sais de Amnio, Sais (nitratos); Uria o Lquido da macerao do milho ( 4% N); o Extrato de levedura e Peptonas (laboratrio) o Ar atmosfrico ONS INORGNICOS ESSENCIAIS Alm de nitrognio, os microrganismos exigem uma srie de outros elementos, sob a forma de compostos inorgnicos, alguns em quantidade bem maiores que outros. o Macronutrientes P, S, K, Mg, Ca, Fe o Micronutrientes Cu, Zn, Co, B, ... FATORES DE CRESCIMENTO So os compostos orgnicos indispensveis a um determinado microorganismo, que ele no consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminocidos, nucleotdios, cidos graxos, entre outros. Aspecto importante dessa exigncia resulta do fato que, quando um microrganismo exige um determinado fator, seu crescimento ser limitado pela quantidade desse fator presente no meio.Prof. Raul Vicenzi 11


Dentro de certos limites, o crescimento ser proporcional ao teor do composto limitante. Isso permite a elaborao de um mtodo de dosagem de certos compostos, baseados na medida do crescimento microbiano. Essa a base da dosagem microbiana de uma srie de substncias, principalmente aminocidos e vitaminas. AGUA A gua no constitui um nutriente, mas absolutamente indispensvel para o crescimento dos microrganismos. Seu papel mltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de substncias em soluo atravs da membrana citoplasmtica. Exerce funo na regulao da presso osmtica e regulao trmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecao, a no ser quando esta precedida pelo congelamento brusco (liofilizao) OXIGNIO ATMOSFRICO Como a gua o oxignio no um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrognio nos processos de respirao aerbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em presena de O2 livre: Aerbios exigem oxignio livre; alguns, porm, em pequenas quantidades no tolerando as presses normais de O2 atmosfrico; Anaerbios no toleram a presena de O2 livre; Facultativos crescem na presena ou ausncia de O2 . Entre as bactrias encontra-se os trs tipos de comportamento. Os fungos (bolores) so estritamente aerbios, enquanto as leveduras so aerbias ou facultativas. CLASSIFICAO DOS MOSTOS SINTTICO: composio conhecida quantitativamente e qualitativamente usado em pesquisas quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentao. O objetivo saber a rota de fermentao, saber quanto e quando e quais os substratos que esto sendo utilizados pelos Microorganismos. Tem um alto custo. COMPLEXO: composio no bem definida, esto enquadrados os meios naturais tais como: caldo de cana, melao, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais. CARACTERISTICAS DO MOSTO Requerimentos bsicos: 1) Proporcionar o mximo rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado; 2) Produzir a mxima concentrao de biomassa ou produto; 3) Permitir o mximo rendimento na formao do produto; 4) Produzir o mnimo de subprodutos indesejveis; 5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponvel durante o ano todo 6) No sofrer degradao durante a esterilizao 7) No dever causar problemas em outras etapas do processo fermentativo particularmente: aerao, agitao, extrao, purificao e tratamentos dos efluentes.Prof. Raul Vicenzi 12


SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAO ALCOLICA a) Aucaradas: neste grupo temos as diretamente fermentescveis (contm monossacardeos: Ex.: glicose, frutose, suco de uva, ma, pra, etc.). Principal substrato um monossacardeo (glicose) e este metabolizado diretamente at piruvato. As matrias-primas indiretamente fermentescveis so aquelas que contm dissacardeos, predominando a maltose e sacarose. Ex.: caldo de cana-de-acar e melao. A composio do melao de cana-de-acar varia em funo de fatores como: qualidade da matria-prima (variedade, idade, sanidade, maturao, queimada ou no, etc); mtodos de extrao do acar (moagem, clarificao, cozimento, etc); condies tcnicas das regies aucareiras; condies e tempo de armazenamento. b) Amilceas: contm em sua composio polissacardeos (amido) utilizada para produo de vodka, rum, whisky (tem que sofrer sacarificao). PREPARO DA MATRIA-PRIMA a) Melao: deve sofrer uma preparao prvia (de 82 Brix 18 -20 Brix) CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para calcular os volumes para diluio do melao. B M - b = Quantidade de melao em peso d = volume litros) M b B - M = Quantidade de gua em peso d = volume (litros) B = Brix do melao b = Brix da gua (zero) M = Brix desejado (18 20) d = densidade Ex.: melao: 80 Brix gua; 0 Brix M = 20 Brix dmelao = 1,6284 dgua = 1,0000 80 20 0Prof. Raul Vicenzi

20 0 = 20 Kg melao = 12,31 Litros 1,6284 80 20 = 60 kg de gua = 60 litros 1,000013


No tanque de diluio controla-se: pH: entre 4,5 5,5 Nutrientes: Sulfato de amnio (1 g/L); fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimtico} b) Caldo de cana-de-acar: no necessita diluio pois a cana sofre adio de gua por asperso na moenda para extrao do acar, neste ponto o brix deve ficar entre 18-20 D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma de H2 O a ser adicionada Brix desejado Ex.: Brix do caldo = 20 Volume = 50.000 L Brix desejado = 16 D = 20 x 50.000 50.000 = 12.500 L de H2 O a ser adicionada para ter 16 Brix 16 Aps fazer a diluio corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando cido sulfrico, ctrico ou ainda suco de limo (caseiro) e colocam-se os nutrientes. DETERMINAO DE SLIDOS SOLVEIS TOTAIS POR REFRATOMETRIA 1) Preparo do mosto: a) Determinao de slidos solveis por refratometria - Para cada grau acima de 20 C subtrai-se 0,06 por grau; - Para cada grau abaixo de 20 C soma-se 0,06 por grau: Ex.: 20 Brix a 25C 20 Brix a 15C 5 x 0,06 = 0,3 5 x 0,06 = 0,3 20 Brix 0,3 = 19,7 Brix 20 Brix + 0,3 = 20,3 Brix

Um mosto inicialmente com 76 Brix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST. 100 g melao -------- 76 g SST X g --------------------- 16 g SST X = 21,05 g/100mL Para 300 mL = 63,15 g de mosto + 236,85 g de gua RELACO ENTRE DIFERENTES GRAUS DE MEDIDA. 1 Brix corresponde a 0,54 Baum 1 Baum corresponde a 1,8 Brix 1 Brix corresponde a 0,85 Babo BRIX = % de slidos solveis existentes em uma soluo de sacarose quimicamente pura.Prof. Raul Vicenzi 14

Fermentadores

ELEMENTOS DE UM FERMENTDOR (BIOREATOR) O corao de qualquer processo fermentativo sem dvida o fermentador. Uma definio funcional para um fermentador seria dizer que consiste em um recipiente em que se mantm um ambiente favorvel para que se desenvolva um determinado processo biolgico. A palavra fermentador nos faz visualizar um recipiente de grande tamanho de ao inoxidvel brilhante e com uma instrumentao muito sofisticada. Ainda que muitos fermentadores industriais so assim, outros importantes processos biolgicos industriais, desenvolvidos em grande escala, so conduzidos em equipamentos muito menos sofisticados. Em alguns processos um fermentador pode consistir em um simples recipiente aberto, embora para processos cujas condies so muito sensveis ser necessrio um sistema fechado e muito bem controlado capaz de manter um ambiente favorvel. MEIO AMBIENTE As condies ambientais existentes dentro de um fermentador podem considerar-se sob trs aspectos diferentes: condies biolgicas, qumicas e fsicas. MEIO BIOLGICO Unicamente os microrganismos que contribuem para o processo em questo encontram-se presentes, enquanto que os no produtivos, destrutivos ou no desejveis estejam excludos do processo. Do ponto de vista de produo importante tambm que os microrganismos desejados estejam presentes em quantidades suficientes para que o processo se desenvolva a um ritmo rentvel. Um sistema que contenha somente o microrganismo desejado diz-se um sistema assptico. A assepsia consegue-se, primeiro, esterilizando o meio, eliminando todos os organismos vivos, diz-se ento esterilizado, segundo introduzindo o microrganismo desejado. O ato de introduzir o microrganismo desejado denomina-se inoculao. MEIO QUMICO Implica na composio do meio de crescimento microbiano, que dever conter as concentraes adequadas de substratos ou nutrientes microbiolgicos, assim como dos precursores sintticos, livres de substncias inibidoras e mantidas a um pH adequado. MEIO FSICO Refere-se fundamentalmente a temperatura do sistema cujo controle muito importante quando se projeta um fermentador. Este parmetro e a necessidade de manter a uniformidade das condies ao longo da fermentao, exigem um bom sistema de agitao, o que pode provocar por sua vez a ruptura dos organismos e de seus agregados. Quando se mantm um ambiente favorvel os parmetros ambientais no tm que necessariamente permanecerem constantes ao longo do tempo.Prof. Raul Vicenzi 15

Fermentadores

Fermentao por batelada - caractersticas: v Diferentes fases de crescimento; v Diferentes condies timas; v Fermentao parece estar programada de acordo com a disponibilidade de nutrientes; v pH e temperatura oscilam ao longo do tempo, para que apaream de acordo com estas trocas as sucessivas fases de crescimento PRINCIPAIS TIPOS DE FERMENTADORES Os fermentadores classificam-se em dois grandes grupos:v Fermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrganismos esto imersos no meio

de cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes lquidos. O fermentador mais simples consiste em um tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio lquido. Estes fermentadores forma utilizados de gerao em gerao com muito xito na indstria cervejeira j que ao formar-se na fase anaerbica da fermentao, uma capa de espuma que contm CO2 e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a temperatura durante a fermentao se pode colocar tubos refrigerantes. So muito utilizados no tratamento biolgico de guas residuais em fluxo lento, onde a superfcie do lquido permite que se dissolva o O2 do ar e libere o CO2 . Estes efeitos podem ser acelerados com a agitao do lquido que aumenta a transferncia de gases e mantm a homogeneidade. Nos sistemas anaerbios os prprios gases da fermentao podem proporcionar a agitao, atravs do desenho do fermentador (cnico/cerveja) ou por meio mecnico (bombas de recirculao).v Fermentadores de cultivo imobilizado: nos sistemas imobilizados o microrganismo se

desenvolve sob forma de uma lmina ou capa disposta sobre uma superfcie que est em contato com o meio nutritivo. Em laboratrios se utiliza o cultivo em superfcie (placas). Inicialmente a produo de penicilina era feira em garrafas que eram introduzidas em uma incubadora. Atualmente se utilizada o cultivo em superfcie na fermentao do cido ctrico (Aspergillus niger), que se cultiva em uma superfcie com um meio adequado contendo melao em bandejas de pouca profundidade, colocadas em estantes temperatura constante e com circulao de ar freqente. Tambm e pode desenvolver pelculas microbianas sobre uma superfcie de meio slida adequada. Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plstico particulado, lminas de plstico onduladas, atravs dos quais se faz passar o meio lquido sobre a capa de microbiana da superfcie.v Na prtica, porm, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso tambm aparece uma capa sobre

a superfcie do recipiente, e no cultivo imobilizado existe um certo numero de microrganismos dispersos no meio de cultivo.

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Fermentadores

Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra de recuperao do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo: Armazena,mento de Matrias-primas Inculo Volume: 1 a 2 litros

gua do Processo

Ar Estril

Vapor

Energia

Inculo Preparado 1:10

Preparao de Meios

Esterilizador

Fermentador de produo Refrigerao

Tanque de Semeadura (p-de-cuba)

- gua - ar - vapor

Separao de clulas Com ou sem ruptura celular

Utilizao de Subprodutos

Etapas de Recuperao do Produto

Tratamento de Efluentes

PRODUTO

Formulao

Envasamento e Armazenamento

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Esterilizao na indstria fermentativa

ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E ARIntroduo A esterilizao implica a destruio, inativao ou remoo de toda forma de vida microbiana. Isso quer dizer que a esterilizao provoca nos microrganismos uma perda irreversivel da capacidade de reproduo no ambiente considerado. No implica, entretanto, a inativao total das enzimas celulares, toxinas, etc. Antes de entrarmos na discusso dos mtodos, conveniente fazermos algumas consideraes em torno dos mecanismos de esterilizao e das caractersticas das populaes microbianas. O mecanismo letal varia conforme o processo de esterilizao empregado. O efeito final, entretanto, o mesmo. Deve ocorrer a destruio e/ou inativao da(s) enzimaas) envolvida(s) em processos vitais para o microrganismo. Teoricamente, basta que o agente esterilizante bloqueie uma reao enzimtica essencial ou destrua uma molcula vital. Na prtica, entretanto, agentes com ao to especifica no encontram aplicao como esterilizantes, por vrios motivos: A heterogeneidade da populao microbiana; a possibilidade da existncia de microrganismos com capacidade de utilizar outras rotas metablicas para vencer o bloqueio estabelecido; a dificuldade do agente em atingir um alvo muito especfico; etc., podem ser mencionados como fatores que justificam a utilizao de agentes capazes de atingir o microrganismo de um modo mais grosseiro e inespecfico. Principalmente no caso da esterilizao de equipamentos industriais, procura-se utilizar processos capazes de danificar generalizadamente a clula, em vez de se procurar um ponto especfico de sua estrutura metablica. Outra considerao importante, no caso da esterilizao de equipamentos, a cessao do efeito esterilizante no final do processo de esterilizao. Em outras palavras, o agente ou condio esterilizante deve atuar eficientemente durante o processo de esterilizao. Terminada a esterilizao, no deve haver ao residual. No caso de fermentao industrial, por exemplo, uma possvel ao residual pode ser to ou mais prejudicial que a presena de certos contaminantes. Essas consideraes ajudam a apontar os processos fsicos como os mtodos de escolha na esterilizao de equipamentos. MTODOS DE ESTERILIZAO Fsicos Qumicos Calor: Lquidos, Gases e vapores - Seco: Flambagem ; ar quente Esterilizantes gasosos: xido de etileno (mais - mido: vapor fluente, vapor sob presso; eficiente que os demais; utilizado em cmaras tindalizao. de esterilizao) Radiao: Formaldedo mais comum - Ultravioleta -propiolactona- carcinogncia - Ionizantes (RX e ) cido peractico Filtrao : MembranasProf. Raul Vicenzi 18


A escolha do mtodo depende das caractersticas dos produtos a serem esterilizado e do custo do processo. Quando se usa agentes qumicos: tempo de contato Quando se usa calor: tempo e a temperatura de contato OBS.: O vapor direto acarreta um aumento no volume do mosto MECANISMOS DE ESTERILIZACO Se bem que os mtodos usuais de esterilizao tenham uma ao generalizada sobre a clula, o mecanismo pelo qual isso conseguido varia conforme o agente empregado. No caso do calor, sabe-se, desde os tempos de Koch, que o mecanismo de destruio dos microrganismos pelo calor seco no o mesmo que ocorre quando se utiliza vapor. Exceto em casos em que haja uma destruio fsica do microrganismo, como o caso da flambagem do equipamento a ser esterilizado, o mecanismo de esterilizao no est bem elucidado. Em alguns casos, a ruptura da parede celular e a vacuolizao da clula so aparentes e poderiam ser interpretadas como oriundas da atuao de foras osmticas. A adsoro de corantes pelas clulas, a incapacidade de reproduo e, no caso de microrganismos mveis e a perda da motilidade, so caractersticas que auxiliam na constatao da perda de viabilidade de clulas individuais. Enquanto que a inativao pelo calor seco , essencialmente, um processo oxidativo, o uso de vapor causa uma coagulao das protenas celulares com prejuzo para a organizao estrutural do microrganismo, afetando a sua competncia fisiolgica. TABELA 1 - Efeito da temperatura sobre o tempo necessrio para destruir esporos bacterianos de fermentao simples em meio com concentrao inicial de 1,6 x 105 esporos/mL TEMPERATURA (C) 100 105 110 115 120 125 130 135 TEMPO (minutos) 1200 600 190 7 19 7 3 1

Tempo de esterilizao corresponde ao tempo em que o material foi submetido aquela temperatura especfica e no ao tempo total do processo, que deve incluir o tempo de aquecimento e resfriamento. DESNATURAO DE PROTENAS Alm das estruturas primria, secundria e terciria, as molculas de protena podem ser constitudas por mais de uma cadeia de polipeptdios. A conformao estrutural da molcula proticaProf. Raul Vicenzi 19


estabilizada por ligaes covalentes e no-covalentes. Essas ligaes reduzem a flexibilidade das cadeias polipeptdicas, garantindo sua disposio de uma forma ordenada, compacta e, conseqentemente, de baixa entropia, em vez de uma associao ao acaso. Entre as ligaes covalentes, o tipo de ocorrncia mais geral a ligao dissulfeto As ligaes no-covalentes podem ser pontes de hidrognio, ligaes hidrofbicas e inicas. As ligaes hidrofbicas so as que mais contribuem para a estabilizao da estrutura protica, pois de um modo geral, 40% dos resduos de aminocidos de uma protena possuem ramificaes no-polares. Uma alterao estrutural da molcula de protena , normalmente, acompanhada de uma perda de atividade biolgica, pois a ao de enzimas pode ser explicada por uma perturbao conformacional especifica induzida pelo substrato no centro ativo da enzima. Considerando-se que as clulas de microrganismos podem conter, normalmente, de 40 a 60% de seu peso seco em protenas, e considerando-se, ainda, as funes metablicas e/ou estruturais desempenhadas por essas protenas na clula microbiana, pode-se perceber, com facilidade, o efeito que agentes ou condies capazes de desorganizar estruturalmente as protenas podero exercer sobre a clula. ALTERAO DNA Se, de um lado, agentes que atuam sobre as protenas so capazes de comprometer diretamente a competncia fisiolgica, agentes capazes de causar alteraes no material gentico do microrganismo podem provocar o aparecimento de mutaes letais. Donde a possibilidade de se utilizarem, na esterilizao, substncias ou condies que apresentem maior afinidade pelo cido desoxirribonuclico (DNA). - Agentes qumicos como propionolactona, cido nitroso, etc., agem sobre o material gentico das clulas, causando alteraes que tero conseqncias sobre as caractersticas fisiolgicas do microrganismo. - Radiaes Fazendo-se incidir uma radiao sobre microrganismos, os componentes celulares podero absorver energia radiante. O efeito letal das radiaes uma demonstrao da presena, na clula viva, de molculas capazes de absorvera energia radiante. Protenas e cidos nuclicos, constituintes essenciais da matria viva possuem estruturas que absorvem principalmente luz ultravioleta. As alteraes fotoqumicas que ocorrem, em virtude da absoro de luz ultravioleta, so muito prejudiciais s clulas. POPULAO MICROBIANA Ao tratar de esterilizao, temos de levar em conta, tambm, as caractersticas dos microrganismos contaminantes do equipamento a esterilizar. No caso de existirem no equipamento apenas formas vegetativas de microrganismos, e se o meio em que se encontram for um meio que no as abrigue e proteja da ao do agente esterilizante, e mais ainda, se pudermos estar certos de que o agente esterilizante ser capaz de atuar sobre as clulas microbianas em condies favorveis e por tempo suficiente, ento o problema de esterilizao ser relativamente simples.Prof. Raul Vicenzi 20


FIGURA 1 - Esterilizao de um meio de cultura em autoclave a 121 C por 20 minutos. O tempo total de esterilizao 100 minutos. ESTERILIZAO POR AGENTES FSICOS CALOR SECO calor seco mata os microrganismos por oxidao dos componentes celulares. O ar seco no um bom condutor de calor e sua ao no to enrgica quanto a do vapor. Por esse motivo necessrio uma temperatura e tempo maiores de esterilizao. o emprego do calor seco ou ar quente, recomendado quando o contato direto ou completo do vapor sobre presso com o material indesejvel ou improvvel, que o caso de vidraria, leos, ps e substncias similares. A esterilizao pelo calor seco consiste em submeter o equipamento a ser esterilizado a uma temperatura tal que, durante o perodo de aquecimento, haja inativao dos microrganismos presentes. A maior resistncia demonstrada por microrganismos ao calor seco parece depender de um endurecimento da camada mais externa da clula por meio de coagulao das protemas, dificultando a penetrao do calor no interior da clula propriamente dita e ulterior coagulao das protenas plasmticas. Devido muito menor capacidade de penetrao do calor seco, necessrio aquecer o equipamento a ser esterilizado a temperaturas mais altas por tempo mais prolongado, o que torna esse mtodo inadequado quando materiais como papel, algodo, plsticos, etc., esto presentes. Populaes homogneas de esporos apresentam uma relao linear de inativao com relao ao tempo de exposio a 125 C. A no-linearidade que ocorre com populaes naturais, pode ser atribuda a uma heterogeneidade da populao. As relaes no-lineares obtidas com populaes naturais podem ser reproduzidas por misturas adequadas de esporos com resistncias trmicas diferentes, isolados daquelas mesmas populaes. Alis, essa heterogeneidade das populaesProf. Raul Vicenzi 21


naturais pode ser devida no s presena de esporos de espcies diferentes como tambm a diferentes graus de resistncia trmica entre esporos de uma mesma espcie. A temperatura empregada tem sido 125 C e comum cotar-se a resistncia trmica de um microrganismo em relao ao D125 . A desorganizao molecular que ocorre nas clulas, devido exposio a temperaturas elevadas, pode se dar dos seguintes modos: a) ativao direta das molculas pela energia trmica, com alterao conformacional por quebra de ligaes intramoleculares e interveno subseqente de outras molculas; b) reao de molculas complexas com oxignio, gua ou vapor de gua (no caso de esterilizao pelo calor mido). A exigncia bsica da esterilizao pelo calor seco que todo o material seja sujeito temperatura esterilizante. As nicas causas possveis de fracasso na esterilizao so o controle defeituoso da temperatura; a no penetrao do calor; e a presena de microrganismos com resistncia trmica superior esperada. CALOR MIDO calor mido mata os microrganismos por desnaturao protica, ou seja: pela coagulao das protenas e enzimas celulares, e tambm a fuso dos lipdeos da membrana celular; quanto maior a temperatura menor o tempo necessrio; Para destruir esporos temos que submeter este vapor de gua a uma presso positiva para alcanarmos as temperaturas de trabalho; Sempre que possvel usa-se vapor para a esterilizao, pelo seu alto contedo de calor por unidade de peso ou de volume; porque cede facilmente calor a uma temperatura constante e controlvel; por ser de fcil produo e distribuio; e porque, mesmo sendo de aquecimento rpido, a velocidade de aquecimento e a temperatura final do equipamento podem ser controladas. TABELA 2 - Relao entre a presso de vapor de gua em diferentes presses Presso de vapor da gua (atm) 0 0,34 0,68 1,00 1,36 Temperatura 100,0 109,0 115,0 121,0 126,5

Obs.: - Para assegurar a temperatura pela presso de trabalho precisamos ter certeza de que todo o ar foi expulso, primeiro porque o ar no bom condutor de calor, logo o calor no penetra no material a ser esterilizado. Segundo a temperatura do ar aquecido a uma presso inferior a temperatura do vapor aquecido a mesma presso. Causas da inativao trmica de bactrias pelo calor mido Os mecanismos propostos para explicar a influncia letal do calor mido sobre as bactrias so: (a) coagulao de protenas; (b) inativao de enzimas; (c) desorganizao dos lipdeos celulares; (d) desorganizao do aparelho gentico; (e) ruptura do RNA.Prof. Raul Vicenzi 22


A morte das clulas expostas ao calor exponencial. A base bioqumica desse fenmeno difcil de ser explicada em termos de acontecimentos especficos na clula. O calor mido age sobre vrios componentes celulares e, na clula, pode-se observar uma srie de efeitos. Inativao trmica dos esporos Os esporos so dotados de uma camada interna de mucopeptdeo recoberta por uma capa protica rica em cistena. As seguintes teorias tentam explicar a termorresistncia dos esporos: impermeabilidade do esporo; enzimas em formas inativas estabilizadas; desidratao do material protico, com estabilizao conseqente da maior interaproximao dos radicais hidrofbicos e imobilizao inica. A inativao dos esporos em presena de vapor de gua deve-se atividade da gua e no propriamente ao calor latente do vapor. Esse fato mostra que os altos coeficientes de temperatura, caractersticos da i ativao trmica de esporos. s podem ser devidos a processos de coagulao de n protenas ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS POR RADIAES UV E IONIZANTES Os princpios bsicos da utilizao da radiao UV so a reduo de microrganismos presentes no ar e a destruio de clulas depositadas na superfcie do equipamento e expostas radiao. A radiao UV tem sido empregada como agente auxiliar para diminuir os nveis de contaminao. A ao de radiaes ionizantes (raios gama) sobre os microrganismos se manifesta como um uma inibio do poder de multiplicao dos mesmos. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS POR AGENTES QUMICOS Apresenta a vantagem de ser feita a temperatura inferior a 50C. Os fatores que influenciam na eficincia da esterilizao so: tempo de contato, temperatura, pH, matria orgnica, estabilidade ao oxignio umidade, etc. detergentes, lquidos (cidos e lcalis, glutaraldedo, formaldedo, iodfors, cido peractico) Gases e vapores (oznio, brometo de metila, formaldedo, -propionolactona, xido de etileno, cido peractico) ESTERILIZAO DO MEIO DE CULTURA De acordo com um conceito bem amplo, a esterilizao de um meio a operao que tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macro ou microscpicas, saprfita ou no, existentes no meio considerado. O grau de esterilizao dos meios de fermentao varia conforme o processo a que se destina. Algumas vezes totalmente dispensvel (fermentao lctica de hortalias e polvilho; tratamento biolgicos de resduos); realizada de forma incipiente (fermentao alcolica; produo de leveduras para panificao; fermentao actica do vinagre); realizada com alto grau de exigncia (produo de antibiticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol). Em ensaios laboratoriais sempre necessrio (devido ao uso de culturas puras) Em plantas industriais o calor mido a principal forma de se efetuar a esterilizao. PodeProf. Raul Vicenzi 23


ser feita nos prprios recipientes destinados a fermentao (processo descontnuo) ou em separado (processo contnuo) ESTERILIZAO EM BATELADA:

Vrios meios de cultura so esterilizados no fermentador a 121 C (para destruir esporos), o tempo calculado em funo dos constituintes do mosto(pH, material em suspenso, etc) e do tamanho do fermentador. Esterilizar s vlvulas e eletrodos e outros equipamentos que entram em contato direto com o fermentador Mtodo indireto - injetar vapor no fermentador atravs de camisa ou da serpentina; Mtodo direto - injetar vapor direto na soluo nutriente, assim o vapor deve estar livre de aditivos qumicos OBS.: O vapor gerado pela indstria normalmente contm substncias potencialmente txicas aos microrganismos, derivadas de anticorrosivos utilizados no processo de gerao de vapor. Com injeo direta de vapor no meio de cultura o volume deste aumentar, pois uma parte do vapor se condensa aumentando o volume do lquido dentro do fermentados. Vantagem a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente, evitando perigos de contaminaes; Desvantagem a) Manuteno de temperaturas altas por perodos longos, favorecendo possveis alteraes no meio; b) Consumo elevado de vapor e gua de resfriamento; c) Problemas de corroso pelo contato do equipamento com o meio aquecido. d) Elevado tempo ocioso do equipamento; e) interaes qumicas com nutrientes

ESTERILIZAO CONTINUA As principais desvantagens apresentas podem ser evitadas pela esterilizao contnua; melhor controle de temperatura; temperaturas mais elevadas diminui o tempo da operao; Fornece meio esterilizados para fermentadores de vrios tamanhos Etapa preliminar obrigatria nos processos fermentativos contnuos, tambm tem valor nos processos em batelada, pois diminui o tempo de esterilizao e a rea fsica necessria para o processo, devido a relao exponencial entre taxa de morte e temperatura tomando bem menor o tempo necessrio para a destruio de todos os microrganismos quando temperaturas maiores so utilizadas; Na esterilizao em batelada so necessrios 30 a 60 minutos a 121 C, a esterilizao contnua normalmente realizada em 30 a 120 segundos a 140 C; Meio de cultura torna-se diludo pois a condensao do vapor aumenta o volume do lquido, para resolver este problema o meio aquecido bombeado atravs de uma vlvula de expanso e o condensado removido por uma bomba de vcuo at que o meio de cultura fique com a mesma concentrao de antes da esterilizao.Prof. Raul Vicenzi 24


Pode se feita pela injeo direta de vapor ou por meio de trocadores de calor. Em certos casos a pasteurizao j p suficiente para eliminar grande parte do flora microbiana. uma operao rpida utilizando temperaturas prximas de 100 C seguida de resfriamento. Em meio cidos equivale a uma esterilizao Para pequenas quantidade de meio pode-se lanar mo da tindalizao.

FIGURA 2 - Esquema de esterilizao contnua do meio de cultura em trocadores de calor

DESTRUIO DE NUTRIENTES A esterilizao do meio pelo calor acarreta alteraes na sua composio qumica. A experincia mostra que, quanto mais elevada for a temperatura de esterilizao de um dado meio, menor ser a destruio de nutrientes e, conseqentemente, melhores sero os resultados da fermentao posterior. Esta menor destruio de nutrientes uma conseqncia de fato observada experimentalmente de ser a energia de ativao de destruio trmica dos microrganismos maior do que a de destruio trmica dos nutrientes. Essa afirmativa de importncia prtica, tanto na esterilizao de meios de fermentao como na esterilizao de alimentos. ESTERILIZAO DO AR As fermentaes aerbias, com o microrganismo em suspenso, constituem os processos fermentativos de maior importncia industrial atualmente. Em tais fermentaes a quantidade de ar introduzida no sistema grande e perfeitamente aceitvel, que haja grande preocupao quanto a esterilizao do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser tomados principalmente nas horas iniciais da fermentao. - A maior parte dos processos fermentativos conduzido com agitao vigorosa, e o ar fornecido ao fermentador deve ser estril. - O nmero de partculas e microrganismos depende da localizao da indstria, do movimento do ar e do tratamento prvio que o ar foi submetido.

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MTODOS PARA ESTERILIZAO DO AR Calor seco - normalmente antieconmica ou de difcil realizao; Radiaes Apenas as radiaes UV poderiam ter aplicao prtica, porm pouco usada devido ao grande tempo de exposio. Pode ser usada em pequenas instalaes (laboratrios, pesquisa). Atua mais como desinfetante. Filtrao sem dvida o processo mais importante por ser o de maior aplicao na industria. Filtros feitos de l de vidro, acetato de celulose, etc Os filtros pode ser de dois tipos principais: Filtros que apresentam poros - reteno mecnica dos microrganismos (cartuchos de membranas de steres de celulose, nylon); Filtros de camadas de material fibroso (l-de-vidro, ) - Atua na combinao de vrios efeitos fsicos: inrcia, bloqueio, difuso, separao por gravidade e atrao eletrosttica.

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Metabolismo e cintica de crescimento microbiano

CRESCIMENTO CELULAR O crescimento dos microrganismos uma parte integral de quase todos os processos de fermentao. Sabe-se que as bactrias se reproduzem por diviso binria, produzindo duas clulas de mesmo tamanho, entretanto a reproduo de muitas leveduras se d por gemao;os mofos crescem por extenso das hifas e a morfologia de seu miclio pode variar em funo do meio ambiente. quando um fungo cresce na superfcie de um meio slido produz uma rede miceliana , cuja natureza reflete a natureza do meio. Nos cultivos submersos, as clulas fngicas podem crescer unidas a partculas de nutrientes suspensas na forma de miclio filamentoso difuso ou como massa densa. A morfologia e crescimento influem na velocidade de crescimento e na formao de produtos Quando um microrganismo inoculado em um meio de volume e composio conhecidos, o cultivo passa por uma srie de fases, como se pode observar na figura 1. Depois da inoculao, existe uma fase de latncia, em que o microrganismo se adapta as condies do meio. Aps um certo perodo de tempo em que a velocidade de crescimento das clulas aumenta gradualmente, as clulas crescem a uma velocidade constante mxima ; esta fase se denomina exponencial ou logartmica. medida que o crescimento continua, os nutrientes se vo esgotando e os produtos vo sendo excretados pelo organismo, a velocidade de crescimento diminui e finalmente o crescimento cessa, devido freqentemente ao esgotamento de um nutriente ou pelo acumulo de algum produto txico; esta fase se denomina estacionria.

FIGURA 3 Crescimento de um microorganismo em um cultivo desontnuo

FATORES QUE INFLUEM NA VELOCIDADE DE CRESCIMENTO A velocidade de crescimento varia com o tipo de clula microbiana e tambm em funo das condies fsico-qumicas do meio ambiente. Em geral, o tempo para que se duplique a biomassa aumenta com a complexidade do microrganismo, de forma que os tempos de duplicao mdio para as clulas animais e vegetal so substancialmente maiores que os de mofos e leveduras, que por sua vez so maiores que das bactrias.Prof. Raul Vicenzi 27


O crescimento celular varia com a temperatura. A maioria dos microrganismos cresce entre 25 e 35 C. Dentro deste espao o crescimento aumenta com o aumento da temperatura at um valor mximo, acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da taxa de morte microbiana. O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividade enzimtica. A maioria dos microrganismos cresce em uma escala de pH variando de 3 a 4. A velocidade de crescimento da clula microbiana d epende da atividade de gua (Aw) e da umidade relativa. As bactrias necessitam uma Aw 0,95 enquanto os mofos podem crescer em valores de atividade de gua menores, de at 0,7 como mnimas. Como em qualquer reao qumica, a velocidade de crescimento depende da concentrao de nutrientes qumicos, e pode ser descrita pela equao de Monod. Os valores tpicos de Ks para as diversas fontes de carbono esto compreendidos entre 1 e 10 mg/dm3 . As clulas podem crescer a velocidades prxima as max quando a fonte de carbono limitante maior que 10 Ks ou 10 a 100 mg/dm3 . As concentraes de carboidratos elevadas podem inibir o crescimento devido ao efeito osmtico que tem uma influencia maior sobre as bactrias do que sobre os mofos Foi comprovado que a quantidade de massa celular total, formada durante o crescimento celular, freqentemente proporcional a quantidade de substrato utilizado. Biomassa produzida (g) x/s = -----------------------------Substrato consumido (g)

x/s =coeficiente de rendimento de biomassa

METABOLISMO MICROBIANOO crescimento microbiano depende da capacidade da clula para utilizar os nutrientes de meio ambiente e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e tambm os principais compostos de baixo peso molecular, necessrio para a atividade celular. O metabolismo intermedirio inclui as reaes que transformam os compostos de carbono e nitrognio que entram na clula em novo material celular ou em produtos que so excretados. A sntese desses compostos necessita energia e a maioria das clulas utilizada nas fermentaes, so heterotrficas e obtm sua energia a partir da quebra de compostos orgnicos. Nos processos respiratrios ou aerbios, os microrganismos so capazes de oxidar completamente alguns dos substratos a CO2 e H2 O, obtendo o mximo de energia para a converso dos substratos remanescentes em nova massa celular. No metabolismo fermentativo ou anaerbio, as clulas so menos eficazes para converter os substratos orgnicos em material celular e usualmente excretam intermedirios degradados parcialmente. O crescimento de urna cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estgios. Aps a inoculao de uma cultura em um meio nutriente existe um perodo durante o qual o crescimento parece no ocorrer; este perodo refere-se fase lag e pode ser considerado como uma fase de adaptao. Seguindo um perodo durante o qual a taxa de crescimento das clulas aumenta gradualmente, as clulas crescem a uma taxa constante, este perodo conhecido como fase exponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa e as clulas entram fase estacionria. Aps umProf. Raul Vicenzi 28


longo perodo de tempo o nmero de clulas viveis decresce e a cultura entra na fase de morte ou declnio. Tanto quanto esta cintica de crescimento, o comportamento de uma cultura pode ser descrito de acordo com os produtos, os quais so gerados durante os estgios da curva de crescimento. Quando um microrganismo inoculado em um meio rico em nutrientes, a velocidade da diviso celular, e portanto a produo de biomassa, varia de acordo com uma seqncia caracterstica. A fase lag pode virtualmente ser eliminada aumentando o tamanho do inculo e otimizando as condies fsicas dentro do fermentador. Em um processo industrial a durao da fermentao contribui pra o custo do produto, logo uma fase lag mnima aconselhvel.

FIGURA 4. Curva de crescimento de biomassa e consumo de glicose em um cultivo em batelada. Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientes essenciais esto em excesso, esses nutrientes se transformam em produtos finais do metabolismo energtico, em calor, ou em compostos requeridos para a reproduo de novas clulas. Durante a fase exponencial de crescimento a diviso celular ou velocidade de aumento da biomassa chega a ser mxima e os produtos gerados so essencialmente para o crescimento das clulas e incluem: aminocidos, nucleotdeos, protenas, cidos nuclicos, lipdios, carboidratos, etc. Estes produtos so conhecidos como os primeiros produtos do metabolismo ou METABOLITOS PRIMRIOS e a fase a qual eles so produzidos (fase log ou exponencial) como trofofase. Tambm se inclui nesta categoria a biomassa celular que pode ser considerada como o metablito mais primrio. Muitos produtos do metabolismo primrio so considerados economicamente importantes e so produzidos por fermentao. Durante a desacelerao e na fase estacionria, algumas culturas microbianas sintetizam compostos os quais no so produzidos durante a trofofase e os quais parecem no ter nenhuma funo bvia no metabolismo celular. A estes compostos nos referimos como METABLITOS SECUNDRIOS e a fase na qual eles so produzidos (equivalente fase estacionria) como idiofase. importante salientar que os metablitos secundrios ocorrem em cultivos contnuos aProf. Raul Vicenzi 29


baixas taxas de crescimento sendo uma propriedade destas, baixas taxas de crescimento, e tambm, da fase onde no tem crescimento celular. TABELA 3. Produtos do metabolismo primrio microbiano e sua significncia comercial. Metabolismo Primrio Etanol cido Ctrico cido glutmico Lisina Nucleotdeos Fenilalanina Polissacardeos Vitaminas Significncia Comercial Ingrediente ativo em bebidas alcolicas, usado como combustvel em motores quando misturado ao petrleo Vrios usos na indstria alimentar Intensificador de Flavor Suplemento alimentar Intensificador de Flavor Precursor do Aspartame - Adoante Aplicao na indstria alimentar Suplementa Alimentar

Fonte: Stanbury, Whitaker & Hall in Principles of Fermentation Technology. 1995. Os metablitos secundrios so compostos que no so necessrios para a biossntese celular, no tendo um papel direto no metabolismo energtico. A biossntese destes compostos est intimamente ligada com o metabolismo primrio das clulas que os produzem, j que normalmente seus precursores so metablitos primrios ou modificados, como cidos orgnicos, aminocidos, derivados de acares e bases nitrogenadas. Um conceito apropriado para os metablitos secundrios so os compostos no essenciais para o crescimento exponencial (Wiseman, A.) Os metablitos secundrios mais importantes do ponto de vista comercial so os antibiticos, entre eles a Penicilina, cuja produo anual chega a 10.000 ton/ano. As toxinas e os alcalides representam o resto dos metablitos secundrios de importncia industrial. Quando se observa que microrganismos crescem a taxas relativamente baixas de crescimento no seu meio ambiente natural, isto sugere indicio de que a idiofase que prevalece sobre a trofofase, a qual pode ser mais uma das propriedades da cultura de microrganismos. METABOLISMO ENERGTICO A energia necessria aos microrganismos pode ser fornecida pela luz (organismos fototrficos), ou pela oxidao de substncias qumicas (organismos quimiorganotrficos). Nos dois casos a energia vai ser estocada pela forma de energia de ligao qumica, biologicamente utilizvel. Trata-se essencialmente da ligao anidridofosfrica do trifosfato de adenosina (ATP), formada pela fosforilao do difosfato de adenosina (ADP). ORGANISMOS QUIMIORGANOTRFICOS A maioria das bactrias, leveduras e mofos so incapazes de efetuar a fotossntese, utilizam a energia liberada no decorrer das reaes qumicas de oxidao. So chamadas quimiorganotrficas. As reaes de oxidao podem ser efetuadas de vrios modos:Prof. Raul Vicenzi 30


- Perda de eltron: Fe++ Fe+++ + e- + energia - Desidrogenao: R-CH2 OH - Hidratao-desidrogenao: R-CHO + H2 O - Descarboxilao-desidrogenao: R-CO-COOH + H2 0

R-CHO + 2H+ + 2e- + energia

R-COOH + 2H+ 2e- + Energia

R-COOH + CO2 + 2H+ + 2e- + Energia

Em todos os casos h perda de eltrons freqentemente acoplada a uma perda de prtons. Estes eltrons e prtons, aps transferncia mais ou menos longa, feita por intermdio de uma cadeia de oxireduo, vo reduzir um aceptor final. Os microrganismos quimiorganotrficos tiram sua energia da oxidao de substncias orgnicas elaboradas, as quais devem obrigatoriamente encontrar-se no meio, logo, trata-se de microrganismos heterotrficos. A grande maioria dos microrganismos que intervm na biotecnologia faz parte deste grupo. ACEPTOR FINAL DE ELTRONS O sistema de transporte de eltrons mais ou menos complexo e recorre as enzimas (desidrogenases, citocromos redutases, etc.) e co-enzimas (FAD, NAD, NADP, citocromos, etc.) que so intermedirios aceptores de eltrons (e de prtons); trata-se de um seguimento de reaes acopladas com oxireduo. No final desta cadeia, eltrons (e prtons) servem para reduzir um aceptor final que pode ser de diversas naturezas: Oxignio molecular, composto mineral oxidado ou composto intermedirio do metabolismo. Existe, tambm, um mecanismo de eliminao de eltrons e prtons prprio de numerosas bactrias anaerbias, sob a forma de hidrognio, devido a hidrogenase. Se o substrato for completamente oxidado, diz-se que h respirao (fala-se s vezes, de via oxidativa). Se o substrato for parcialmente oxidado e, por isso, incompletamente degradado, o que acarreta a formao de metablitos, diz-se que h fermentao. A fermentao traz geralmente o nome da(s) substncia(s) produzida(s) ou da mais abundante se a produo for complexa. RESPIRAO AERBIA Existem vrios mecanismos de respirao aerbia. O fato comum entre eles que o aceptor final de prtons o oxignio do ar e no podem intervir seno quando os microrganismos so cultivados em condies de aerobiose. Para cada par de prtons transformados em gua, h formao de 3 molculas de ATP, podendo s vezes haver uma oxidao direta. Esta via leva a formao de perxido de hidrognio (H2 02 ) que txico para clula; exceto se esta possuir catalase, enzima capaz de decompor o H2 O2 . Quando um microrganismo p ossui esta via, e no tem catalase, morto pelo oxignio do ar, sendo portanto, um anaerbio estrito.Prof. Raul Vicenzi 31


FERMENTAO / RESPIRAO Na fermentao propriamente dita, uma substncia orgnica originria da degradao do substrato serve como aceptor de eltrons (e de prtons). De fato, pode-se considerar que a mesma substncia que serve, ao mesmo tempo, de doador e aceptor. Numerosas fermentaes podem ser efetuadas em anaerobiose, pois todos os prtons liberados servem para reduzir um substrato orgnico; outras devem ser efetuadas em aerobiose, pois pelo menos uma parte dos prtons liberados servem para reduzir o oxignio.

CINTICA DO CRESCIMENTO MICROBIANONa fase logartmica podemos dizer que dobram por intervalo de tempo: O nmero de clulas (bactrias e leveduras): A biomassa (actomicetos e fungos).

A velocidade de crescimento se mantm constante durante a fase logartmica, ainda que o meio se altere pelo consumo de substrato e excreo de metablitos. A velocidade de crescimento independe da concentrao do substrato, pois um excesso de substrato est presente. O substrato limitante a substncia que pela mudana de sua concentraao promove: mudanas na velocidade de crescimento do microrganismo mudanas na velocidade de consumo do substrato mudana na velocidade de formao do produto. Na pratica podemos dizer que todo o substrato limitante. O processo industrial interrompido ao final da fase logartmica ou antes da fase de declnio, depende se o processo associado ou no associado. A taxa de aumento da biomassa est relacionada com a velocidade especfica de crescimento () e a concentrao da biomassa (X) expressa em g/L. dx ------- = X , onde dt = velocidade mxima da biomassa X = concentrao de biomassa A taxa do aumento do nmero de clulas est relacionada com a velocidade especfica de

crescimento e com a densidade celuIar (N) expressa em clulas/L. dN ------- = N , onde N = densidade celular dt O tempo de gerao (G) uma constante da cepa da clula e depende das condies de cultivo. o espao de tempo necessrio para que uma clula se duplique. Quando o microrganismo est na fase exponencial o tempo de gerao constante e dado por:Prof. Raul Vicenzi 32


t G = --- = z METABOLISMO MICROBIANO

t -------------------3,322 log Nf/Ni

A sntese do produto se d no interior da clula, para que o substrato seja convertido em produto, ele deve entrar na clula e ser biotransformado por uma seqncia especfica de enzimas. Quanto mais complexo o produto, maior ser o nmero de enzimas envolvidas no metabolismo. Esquema simplificado do metabolismo celular. S [X P] P

ENTRADA DO PROCESSO: transporte do substrato para dentro da clula METABOLISMO - TRANSFORMACO: o que diferencia o processo qumico do fermentativo. s vezes X =P. SAIDA DO PROCESSO: liberao do produto da enzima, podendo ficar intra ou extracelular. S = concentrao do substrato em g/L X = concentrao de clulas em g/L P = concentrao do produto em g/L ou mg/L VELOCIDADE DE FORMAO DE CLULAS A velocidade de formao de clulas e dada pela variao da concentrao de clulas em funo do tempo, na fase exponencial de crescimento (fase log), a velocidade constante e pode ser calculada pelo numero de clulas (N) por contagem direta dos microrganismos ou por contagem em placas e ainda pela massa seca de clulas (X). Ela chamada velocidade especifica de crescimento, calculada por: ln Nf ln Ni ------------------ou tf ti para [ ] de clulas ln Xf ln Xi -------------------tf - ti para Biomassa ln DOf ln DOi --------------------tf - ti para densidade tica

=

ou

FIGURA 5- Variao da Concentrao Celular em Funo do Tempo OBS.: Para microrganismos no filamentosos prefervel utilizar nmero de clulas e para microrganismos filamentosos, a massa seca de clulas.Prof. Raul Vicenzi 33


VELOCIDADE DE CONSUMO DE SUBSTRATO A medida que a clula est se reproduzindo os substratos esto sendo consumidos, a velocidade de consumo do substrato ser teoricamente constante, enquanto for constante o crescimento celular, isto quase nunca acontece, uma vez que o substrato no s utilizado para o crescimento celular, mas tambm para formao de metablitos, em alguns processos o substrato pode ter uma velocidade de consumo quase linear por um perodo de tempo, e a velocidade chamada de velocidade especfica de consumo do substrato e calculada por:

=

ln Sf ln Si ------------------tf ti

Sf = concentrao de substrato

FIGURA 6 - Variao da Concentrao de Substrato em Funo do Tempo

VELOCIDADE DE FORMAO DO PRODUTO A velocidade de formao do produto tende a ser constante durante um perodo de tempo. chamada de velocidade especifica de formao do produto e calculada por: ln Pf ln Pi ------------------tf ti

=

Pf = Produto final

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FIGURA 7 - Variao da Concentrao de Produto em Funo do Tempo

VELOCIDADE ESPECFICA DE CRESCIMENTO funo de trs parmetros: - Concentrao de substrato limitante (S) - Velocidade mxima de crescimento ( max ) - Constante especifica do substrato (ks), equivale a concentrao em = 0,5 max a concentrao de substrato que d a metade da velocidade mxima de crescimento. E dada pela equao de MONOD, que equivale a equao de Henri-Michaelis-Menten para cintica enzimtica. S = max --------------Ks = corresponde a metade do max Ks + S

FIGURA 8 - Relao entre a Velocidade de crescimento e Concentrao de SubstratoProf. Raul Vicenzi 35


Existindo vrios substratos limitantes, podemos estender a equao de Monod para: K1 .S1 K2 .S2 Kn .Sn = max . --------- + --------- + + .......+ ----------K 1 + S1 K 2 + S2 K n + Sn - Se existir um excesso de todos os substrato, ento = max e a cultura est na fase log, na sua velocidade mxima de crescimento. Se o primeiro substrato for exaurido e outro substrato estiver presente, teremos uma segunda fase lag e log com outro tempo de gerao que caracteriza a metabolizao deste segundo substrato, este fenmeno chamado de DIAUXIA. Isto ocorre porque um dos substratos, geralmente a glicose, catabolizada preferencialmente e inibe a quebra de outros substratos. As enzimas que catabolizam os outros substratos so induzidas (durante a segunda fase lag) aps a metabolizao completa do primeiro substrato. TABELA 4 - Efeito do comprimento da cadeia de glicose na velocidade mxima de crescimento de Fusarium graminearum a 30C ACAR Glicose Maltose Maltotriose N de UNIDADE de GLICOSE 1 2 3 max (h-1 ) 0,28 0,22 0,18 G (h) 2,48 3,15 3,85

FIGURA 9 Crescimento triuxico de Fusarium graminearum Com isto chegamos a concluso que o mximo depende do: microrganismo; condies de cultivo; composio do meio de cultura; temperatura de incubao; outros fatores (pH, oxignio, etc.)

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CLASSIFICAO DOS PROCESSOS

TIPO 1 - ASSOCIADO No processo associado o produto derivado diretamente do metabolismo primrio, usado para a produo de energia. O crescimento, o c atabolismo de carboidratos e a formao do produto ocorrem ao mesmo tempo. A TROFOFASE (fase de crescimento) e a IDIOFASE (fase de formao do produto) no so separadas. Ex. produo de biomassa, etanol e cido glucnico. Sendo A, B, e C, produtos intermedirios do metabolismo primrio, a formao do produto pode ser considerada: A

B

C PRODUTO

FIGURA 10 - Relao entre Crescimento Celular e Formao de Produto em um Processo Associado TIPO 2- SEMI-ASSOCIADO O Produto derivado de um substrato usado no metabolismo primrio, mas segue uma rota colateral. A tropofase e a idiofase so separadas. Em fermentao em batelada este tipo de cintica possui dois pontos importantes: 1) crescimento celular acompanhado de alto consumo de substrato e pouca ou nenhuma formao de produto; 2) O crescimento diminui e a formao do produto comea acompanhada de um alto consumo de substrato. Ex.: produo de cido ctrico e de alguns aminocidos. A reao de formao do produto pode ser exemplificada como: A B C Metabolismo Primrio

DProf. Raul Vicenzi

E

Produto37


FIGURA 11 - Relao entre Crescimento Celular e Formao de Produto em um Processo Semi-Associado TIPO 3 - NO ASSOCIADO O metabolismo primrio e a formao d produto ocorrem em tempos separados. O produto o no derivado do catabolismo, mas de rotas anfiblicas. Neste tipo de fermentao, o metabolismo primrio ocorre acompanhado do consumo de substrato, aps isto o produto formado por reaes do metabolismo intermedirio. Ex.: muitos antibiticos e vitaminas. Nesse tipo de processo freqentemente condies timas para o crescimento celular no so as mesmas para a formao do produto e a fermentao pode ser dividida em duas etapas, onde na primeira se d condies s clulas crescerem e aps altera-se a temperatura, pH, quantidade de oxignio ou concentrao de nutrientes para favorecer a formao do produto.

FIGURA 12 - Relao Entre Crescimento Celular e Formao de Produto em um Processo No associado A classificao dos processos depende da produo do metablito, da composio do meio de cultura e da regulao da cepa utilizada. Podem ocorrer formas intermedirias:Prof. Raul Vicenzi 38


- Produo de cido lctico: tipo 1 e 2 - Produo de antibiticos aminonoglicosdicos: tipo 2 e 3 Um processo pode se comportar de duas formas distintas, conforme os parmetros de fermentao. Por exemplo, a produo de etanol um processo associado, mas pela modificao das condies de fermentao, pode ser forado a se comportar como no-associado.

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Cultivos starters na industria de alimentos

EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES - STARTERS

Os cultivos starters so utilizados atualmente no processamento de alimentos para induzir diversas mudanas em suas propriedades, tais como a modificao da textura, a conservao, o desenvolvimento de aromas ou melhora nutricional, e na produo de enzimas. As principais aplicaes de cultivos starters se encontram nas indstrias de panificao, crnea e leiteira, ainda que existam leveduras starters destinadas a fermentao de bebidas alcolicas e a produo de lcool industrial. Atualmente est se impondo o emprego de starters preparados com cepas de microrganismos mais adequados para elaborao de cada produto. As culturas starters usadas nos produtos crneos curados consistem, normalmente de um organismo tipicamente acidificante como Lactobacillus ou Pediococcus para estabilizar o produto biologicamente e um organismo com caractersticas nitrato redutoras que, por uma srie de reaes produzir uma atrativa cor avermelhada associada com o tipo de produto, sendo que o organismo nitrato redutor normalmente Micrococcus ou Staphylococcus coagulase negativa. 1. DEFINIAO: Starters so grupos de microrganismos selecionados com caractersticas bioqumicas desejadas e definidas produzidos sob rigorosas e controladas condies (pH, temperatura, acidez, substrato, etc.) e so usados na elaborao de produtos fermentados. 2. OBJETIVOS DO USO DE STARTERS. Incorporar um nmero desejado de microrganismos no meio de modo que estes possam crescer, multiplicar-se e produzir as alteraes desejveis no meio e no produto final; Superar o desenvolvimento de qualquer agente contaminante, competindo com estes pelos substratos e pela produo de substncias que inibam os contaminantes; Ajustar uma escala de produo, permitindo uma produo programada de produtos (se inocular, pode-se ter certeza do que ser o produto final e o tempo que leva a produo); Obter uma maior uniformidade em diferentes lotes de produo; PARA UMA CULTURA MICROBIANA SER UTILIZADA COMO STARTER DEVE POSSUIR ALGUNS REQUISITOS FUNDAMENTAIS COMO: ser tolerante ao sal (salmoura de 6 a 10%); ser tolerante a presena de nitritos (50 a 100 ppm) ter crescimento na faixa de 26 a 43 C e temperatura tima de crescimento entre 32 a 35 C; ser homofermentativo (produzir somente cido lctico); no ser proteoltico; no ser lipoltico; no produzir sabores e aromas atpicos ao produto final;Prof. Raul Vicenzi 40


no ser patognico; apresentar destruio trmica a 57-60 C. Os cultivos starters no devem ser patognicos, toxignicos nem formar antibiticos, alm disso no devem degradar os aminocidos a aminas farmacologicamente ativas (ex. histamina) ou a cido sulfidrico. As bactrias lcticas devem formar muito pouco ou nenhum perxido de hidrognio, no formar gs e pouco ou nenhum cido actico. 3. PRODUO DE CULTURAS PARA FERMENTAAO EM ALIMENTOS Seleco: Selecionar cepas ou microorganismos que vo produzir a caracterstica ideal. O microorganismo deve ser geneticamente estvel. Manuteno: Uma vez obtido o cultivo satisfatrio devemos mant-lo puro e ativo. Mantm-se a cultura ativa por transferncia ou repicagem em meio de cultura apropriado. O meio de cultura de repicagem deve ser o mesmo da atuao, de preferncia; No ponto mdio da fase exponencial de crescimento, guardar sob refrigerao para paralisar o crescimento. Neste ponto temos o maior nmero de clulas viveis e mais saudveis de uma cultura, se a usarmos como inoculante de um processo. O nvel de sobrevivncia depende do ambiente: cuidar a temperatura, culturas mantidas a altas temperaturas (ou mesmo ambiente) continuaro metabolizando e suas enzimas podem ser descaracterizadas. Usar sempre a mesma porcentagem de inculo. Usar culturas que esto com o seu crescimento no ponto mdio da fase exponencial. Se o inculo for uma cultura mais resistente, podemos usar a cultura at o final da fase estacionria. 4. PUREZA DA CULTURA Evitar a presena de contaminantes. Os mtodos de controle usados para checar a pureza do inculo vo depender do tipo de microrganismo em questo: Exame microscpico um mtodo utilizado para identificao de contaminantes desde que se conhea a morfologia do microrganismo que estamos trabalhando e que o contaminante tenha uma morfologia diferente A deteco de substncias produzidas pelos contaminantes e que no so produzidas pelos starters. Ex.: culturas lcticas so todas catalase negativa, enquanto que a grande maioria dos contaminantes so catalase positiva. Repicar uma amostra para o meio onde o contaminante cresce bem e de preferncia tenha colnias caractersticas. Em caso de a contaminao retornar para a cultura estoque, ou se houver a suspeita de que esta est contaminada, fazer a repurificao estriando a cultura em meio seletivo para a cultura desejada e proceder a purificao.Prof. Raul Vicenzi 41


5. CARACTERSTICAS DAS BACTRIAS CIDO LCTICAS So anaerbias facultativas: crescem melhor com baixa tenso de oxignio; So basicamente sacarolticas: outros componentes so pouco alterados Produzem grande quantidade de cido lctico: so ineficientes quanto a produo de energia Diviso quanto a fermentao da lactose: homo e heterofermentativas; Mecanismos biossintticos pobres: necessrio o suprimento de carboidratos, aminocidos, lipdios, minerais, etc, para que se desenvolvam: No usam O2 no seu metabolismo, por isto no decompem completamente o alimento e seus metablitos bsicos acumulam no meio. A nica forma de metabolismo energtico a fermentao: So gram-positivas. 6. FERMENTAO POR STARTERS alterao da matria-prima, formando alimentos com caractersticas sensoriais agradveis e proporcionando uma maior vida-de-prateleira. Os primeiros produtos fermentados foram descobertos empiricamente e serviam apenas para conservar. Aps desenvolveu-se um certo gosto por produtos fermentados, hoje fabricados para obter propriedades de conservao e atender a demanda do mercado. E considerada como um mtodo de preservao provocando modificaes das caractersticas qumicas da matria-prima e pelo fato de que os agentes conservadores se formam como produto da mesma, por ao dos microrganismos so, no entanto alteraes dirigidas. As transformaes mais importantes de produtos alimentcios tem como principal substrato os carboidratos. Quase todos os conservantes produzidos por ao microbiana so cidos (cido lctico) e lcool. O efeito conservante dessas substncias geralmente complementado pela aplicao de outros mtodos: baixas temperaturas, calor, anaerobiose, sal, acar, adio de um cido (vinagre). As bactrias lcticas so utilizadas em uma srie de produtos como: queijos, leites fermentados, vegetais e produtos crneos produzem substncias inibidoras (cidos, lcool, H2 O2 e antibiticos (bacteriocinas)). 7. TIPOS DE FERMENTAO Os microrganismos lcticos utilizados na indstria de alimentos uns so homo e outros heterofermentativos, ou seja, alguns produzem apenas cido lctico (homofermentativos) como produto da transformao do substrato em questo e, outros produzem cido lctico e uma gama de outros cidos que ficam incorporados ao produto. Lctica: picles, chucrute, azeitonas verdes, queijo, leites fermentados, produtos crneos, etc.. Alcolica: vinho, cerveja, sucos de frutas fermentadas, licores, destilados. etc... Actica: maionese, vinagre, etc. Propinica: cido propinico.Prof. Raul Vicenzi 42


8. IMPORTNCIA DO DESENVOLVIMENTO DA ACIDEZ a) Controle de contaminaes indesejveis, antagonismo (patognicos); b) Ajuda na eliminao de

apostila biotecnologia de alimentos (1)

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