Apoptose

Necrose ApoptoseEstímulos Anoxia, agentes bacterianos,

químicos, físicosFisiológicos: fatores decrescimento.Patológicos: vírus, radiação,fatores de crescimentos

Morfologia Afeta grupo de células, edemaintracelular, rompimento dasorganelas e da membrana

Ocorre em células isoladas,organelas intactas, invaginaçãoda membrana, enrugamentocelular, formação de corposapoptóticos

Fragmentaçãodo DNA

Aleatória, ação de enzimasliberadas com ruptura dasorganelas

Intranuclear, ação deendonucleases específicas

Bioquímica Não requer energia, semsíntese de proteínas e não hácontrole genético

Requer energia, síntese deproteínas e comando genético

ReaçãoTecidual

Inflamação local econseqüências clínicas

Sem inflamação e danos para oorganismo

Histórico

1951 – Glücksman estuda morte celular programada em embriões de mamíferos. Biol Ver 1951, 26:59-86.

1965 – Kerr descreve “shrinkage necrosis”. J Pathol Bacteriol 1965, 90:419-35.

1970 – Currie (endocrinopatologista) observa fragmentos de células no córtex da adrenal de ratos submetidos a baixas doses de 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno.

1970 – Currie e Wyllie identificam os mesmos fragmentos celulares no córtex das adrenais de ratos recém-natos com depleção de ACTH.

Histórico• 1971 – Kerr junta-se à Currie e Wyllie, identificam

“shrinkage necrosis” em condições fisiológicas e patológicas. Crowford chama a atenção do do grupo para as publicações sobre estudos com embriões e morte celular programada.

• 1972 – Kerr, Wyllie e Currie sugerem que “necrose” seria um termo inapropriado para descrever morte celular que ocorre em condições fisiológicas. Sugerem o termo “apoptose” para o contrário de mitose na regulação do tamanho dos tecidos. Br J Câncer 1972, 26:239-57.

• Década de 80 – estudos de biologia molecular levam a importantes avanços na compreensão da apoptose.

Onde ocorre ?

• Embriogênese

• Morte neuronal, desaparecimento to timo e ducto tireoglosso, atrofia prostática pós castração

• Involução de tecidos dependentes de hormônios

• Processo de reparo e inflamação aguda

• Controle do turnover celular• Neoplasia

– Células malignas têm a capacidade diminuída em sofrer apoptose frente a um estímulo fisiológico

• Doenças auto-imunes– Perda do controle fisiológico da morte de

linfócitos auto-reativos após o término da resposta imune

• Infecção viral– Capacidade de inibir a apoptose pela produção

de proteínas supressoras da morte celular

Métodos de Detecção da Apoptose

• Microscopia de luz• Microscopia eletrônica• Técnica do TUNEL • Técnica de ISEL• Marcação in situ da cadeia terminal 3’OH• Quantificação por FACS• Fotografia por espaço de tempo• Southern blot + Hibridização

Morfologia

• Microscopia eletrônica– alterações nucleares– alterações citoplasmáticas– alterações da membrana plasmática– separação das células vizinhas– formação de corpos apoptóticos– rápida fagocitose de corpos apoptóticos pelas

células vizinhas e por macrófagos

Morfologia

• Microscopia óptica– corpos apoptóticos com ou sem material nuclear basofílico– apoptose observada em condições normais

• corpos de Councilman (fígado)• corpos cariolíticos (criptas intestinais)• corpos tingíveis (macrófagos dos centros germinativos de

linfonodos)• corpos de Civatte (liquem plano)• queimadura solar (irradiação ultravioleta, na pele)• formação de pigmentos de lipofucsina (na melanosis coli)

– Redução do número de células sem comprometimento da arquitetura tecidual.

Bioquímica

• fragmentação rápida e regular do DNA nuclear – 300-, depois em 50-kilo pares-base– divisão da dupla-fita em DNA internucleosomal

• Proteinases citoplasmáticas

BIOLOGIA MOLECULAR

Ciclo Celular

G1

MG2

S G0

CélulasQuiescentes

Ciclinas

• O progresso das células através das diferentes fases do ciclo celular é controlado por complexos de proteínas quinases (CDKs), as quais são controladas por proteínas designadas ciclinas.

• CDKs: cyclin depend kinases:– moléculas que possuem níveis celulares constantes– apresentam-se em formas ativas e inativas– ativadas pelas ciclinas

• Os níveis celulares de cada ciclina apresentam picos em fases específicas do ciclo celular– ciclina D combina-se com CDK4 e CDK6 na fase G1– ciclina E combina-se com CDK2 no final da fase G1– ciclina A combina-se com CDK2 e CDK1 na fase S– ciclina B combina-se com CDK1 na fase G2

Ciclinas

• As ciclinas são cofatores na ativação de proteínas específicas:– quinases dependentes da ciclinas (CDK)

– fosforilam inúmeras outras proteínas

– estimulam a passagem pelas diversas etapas do ciclo celular

– inibidas por proteínas inibidoras das quinases:• inespecíficas

– p21, p27 e p57

• específicas– p15, 16, 18 e 19

Genes Supressores Tumorais

• Genes que codificam proteínas capazes de alterar o ciclo celular na presença de mutações ou danos ao DNA– reparam o DNA lesado– interrompem o ciclo celular em células com danos

severos• induzem a apoptose

– liberam o ciclo após o reparo

Genes Supressores Tumorais• Mecanismos oncogênicos através dos genes supressores tumorais

– inativação de um dos alelos por• mutação herdada• mutação “de novo”• deleções ou rearranjos

– Inativação do segundo alelo– Após a perda completa da expressão do gene ocorre a neoplasia

Regulação genética

• c-myc

• p53 mutante

• bcl-2

Mecanismo de ação da p53Célula normal

Dano no DNA

Up-regulation dos genes alvo

p21inibidor das CDK

GAAD 45reparador do DNA

bax(gene ativador da apoptose)

Ciclo interrompido em G1

Reparo do DNA Falha no reparo

P53 ativadaliga-se ao DNA

Células normais Apoptose

Apoptose

• Apoptose consiste na morte celular programada, na qual a célula entra em um rígido processo de auto-destruição

• Presença de intensa condensação da cromatina com aspecto bolhoso e picnose nuclear.

• Freqüentemente acompanhada por degradação internucleossomal do DNA– A eletroforese apresenta um padrão escalonado (“ladder”)

• A apoptose é controlada por uma família de proteínas:

bcl-2bcl-xL

Inibem a Inibem a apoptoseapoptose

baxbad

bcl-xS

DesencadeiamDesencadeiama apoptosea apoptose

ApoptoseFamília bcl-2

• Família de genes que codifica proteínas homo e heterodímeros– bcl-2 e bcl-xL inibem a apoptose– bax, bad e bcl-xS induzem a apoptose pela ativação da via das

caspases

• bcl-2– gene inibidor da apoptose– codifica proteína localizada na membrana externa das mitocôndrias, na

membrana do retículo endoplasmático rugoso e na carioteca– sua mutação foi inicialmente identificada em linfomas foliculares de

células B • t(14;18) (q32;q21)

Apoptosebcl-2

• Mecanismos de ação do bcl-2– para que ocorra a apoptose, deve haver liberação do

citocromo C do interior das mitocôndrias• dimerização do bax forma canal para liberação do citocromo C

• dimerização do bcl-2 inibe a formação de canais

– p53 ativa, estimula a dimerização do bax• apoptose

– ação sinérgica do c-myc e do bcl-2• c-myc: estimula a proliferação

• bcl-2: inibe a apoptose

APOPTOSE NO

TECIDO HEPÁTICO

FÍGADO• Condições fisiológicas (regressão; regeneração)

• Doenças

• Tratamentos

• Exemplos– remoção de estimulo mitogênico (nitrato) ou de

promotores tumorais (acetato de cyproterona)– Administração de 1,1 dicloroetileno,

ciclohexamide, dimetilnitrosaminas, 1-ß-D-etanol

DISTRIBUIÇÃO

Corpos apoptóticos ao redor da

veia hepática terminal

(ratos tratados com etanol)

Sugere que a “idade”da célula pode determinar qual célula irá morrer

Infecção viral induzindo a formação de corpos de Councilman

Carcinogênese

• Taxa de crescimento: diferença entre replicação e morte celular

• Carcinógenos não genotóxicos: efeitos através da estimulação da replicação celular e modulação da incidência de apoptose

• Após iniciação muitas células entram em apoptose e nunca se desenvolve um foco pre-neoplasico apoptose determina a eficiência da

iniciação • Estágio de promoção: focos pré neoplásicos

exibem altas taxas de replicação celular, mas pouco crescimento, isso devido ao aumento da apoptose promotores tumorais inibem apoptose e aceleram o crescimento e carcinogênese

• A apoptose em nódulos neoplásicos e tumores é um importante fator determinante do crescimento e pode ser regulado por hormônios que podem diminuir ou acelerar o crescimento tumoral

TGF-beta 1

• Iniciação da apoptose

• Induz a apoptose em hepatócitos isolados

• in vivo hepatócitos que sofreram apoptose são positivos com marcadores imunohistoquímicos (anticorpos contra precursores do TGF-beta 1)

Sistema “fas/fas ligand”

• Proteína de membrana plasmática (receptor de membrana)

• Administração de anticorpos anti-fas ou do “fas ligand” determina apoptose (situação semelhante a hepatite fulminante)

• fas está super-expressado em doenças crônicas hepáticas (HBV; HCV), o que pode explicar a apoptose na necrose saca bocada

• Nos casos de apoptose induzidas pelo sistema fas o grupo de proteínas - caspases - estão ativadas; isso abre a porta para um possível tratamento através da inibição dessas enzimas\

• Em algumas linhagens celulares de hepatomas, as células escapam da apoptose devido a anormalidades do sistema fas correlacionando com disfunção da proteína fas ou de sua cascata; adequação de terapias anti-tumorais

Transplante hepático

• Oclusão vascular precoce X disfunção primária do enxerto X rejeição

• Apoptose: detectada na citotoxicidade imunomediada e nos casos de isquemia moderada

• Células apoptóticas são encontradas freqüentemente nos órgãos com rejeição

• Apoptose é um mecanismo de lesão tecidual precoce, antes da necrose; aumento da apoptose deve ser interpretado como um sinal precoce de isquemia indicando oclusão vascular inicial (Sediv, et al - Histopathology 1998)

• Apoptose de células endoteliais seguida pela dos hepatócitos é um importante envento da morte celular após injúria por isquemia/ reperfusão (Kohli V, et al - Transplantation, 1999)

• Inibição da apoptose através de alvos moleculares específicos pode servir para controlar a injúria por reperfusão (Kuo PC, et al - Clin Transplantation, 1998)

Increased apoptosis of hepatocytes in vascular occlusion after orthotopic liver trasnplantation

Gollackner B, et al. Tranpl Int 2000, 13 (1): 49-53

• 75 pacientes (m = 46; f = 26) (idade média 47; 1 a 64 anos)

• Método “TUNEL”

• Disfunção primária do enxerto (n=9)

• oclusão vascular (n = 11)

• rejeição aguda precoce (n= 22)

• controles (11)

RESULTADOS

• Os maiores índices de apoptose foram observados nos casos de oclusão vascular (P<0.001)

• Enxertos com disfunção primária evidenciaram hepatócitos 100% necróticos

• Rejeição aguda evidenciaram uma contagem de céls apoptóticas maior que o controle (P<0.003) que aumenta diretamente com a severidade da rejeição