aplicacoes da transformacao genetica

5/13/2018 Aplicacoes Da Transformacao Genetica - slidepdf.com

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Aplicações da transformação genética

Módulo de Transformação Genética e Melhoramento

Março 2009, Departamento de Botânica, Universidade de Coimbra



Objectivos da aula

3/26/2009João Loureiro2

•Herbicidas; Tolerância ao glifosato; Tolerância à fosfonitricinaImpacto ambiental

Tolerância a herbicidas:

• Bacillus thuringiensis;; A doença da broca do milho; O problema daresistência dos insectos ao Bt; Estratégias de combate à resistência dosinsectos Impacto ambiental Alternativas ao Bt em desenvolvimento

Resistência a insectos:

Resistência a vírus

•Stress hídrico; Stress salino; Stress provocado pelo frio; Stressprovocado pelo calor; Stress oxidativo

Tolerância ao stress:

•Retardamento do amadurecimento; Plantas anãs; O arrozdourado; A biofortificação

Melhoramento da produtividade equalidade das plantas cultivadas

Melhoramento do conteúdoalimentar



Tolerância a herbicidas - introdução


Principal característica existente nas plantas GMs Existem várias razões que justificam o facto do

desenvolvimento de cultivos tolerantes aherbicidas ter sido tão rápido e pioneiro:

Existência de informação sobre o modo de acção dedeterminados herbicidas e de como é que estes

afectam as vias bioquímicas. Disponibilidade de recursos biológicos para a

obtenção e compreensão do mecanismo deresistência e para o fornecimento dos genes paramanipulação genética.

Mecanismos baseados num só gene para a obtenção

de tolerância Relativamente simples dedesenvolver.

A avaliação dos riscos e benefícios de crescer umcultivo tolerante a herbicidas tem de ter em contaas propriedades do herbicida.



A problemática das ervas daninhas


As ervas daninhas têm um efeitonefasto significativo na produção equalidade dos cultivos:

Competição por luz e nutrientes;

Vector de pestes e doenças.

A agricultura moderna desenvolveuuma série de herbicidas que combatemos efeitos nefastos das ervas daninhas.

Todavia, só podem ser usados herbicidas quando as plantas cultivadas nãosão vulneráveis à sua acção.

O desenvolvimento de cultivos resistentes a antibióticos proporciona apossibilidade de “atacar” as ervas daninhas na altura certa sem danificar asplantas cultivadas.



Herbicidas


Herbicidas mais comuns:

Glifosato (Roundup)

Fosfinotricina (Basta)

Clorosulfurão (Glean)

Imazatapir

Atrazina

Os herbicidas afectam processos biológicos específicos das plantas. A actividade herbicida de muitos compostos resulta da inibição de uma

única enzima/proteína.

Os herbicidas diferem consideravelmente em estrutura, propriedades emodo de acção.

Podem agrupar-se em cerca de 15 classes de acordo com o modo de acção.



Tolerância a herbicidas


Existem quatro estratégias de engenharia genética detolerância a herbicidas:

Expressão em excesso da proteína alvo do herbicida – por integraçãode múltiplas cópias do gene ou pelo uso de promotor forte que guie aexpressão do gene (caso de estudo 1 – tolerância ao glifosato)

Mutação da proteína alvo – incorporação do gene de uma proteínamodificada (resistente à inibição induzida pelo herbicida) (caso deestudo 1 – tolerância ao glifosato).

Desintoxicação do herbicida usando um único gene de uma fonte

externa – conversão do herbicida numa forma menos tóxica e/ou suaremoção do sistema (caso de estudo 2 – tolerância ao PPT).

Desintoxicação melhorada da planta – aumento das defesas naturais daplanta contra compostos químicos.



Tolerância a herbicidas – caso de estudo 1


Tolerância ao glifosato Herbicida de espectro largo eficaz contra 76 das

78 ervas daninhas mais perigosas(particularmente gramíneas).

Comercializado como Roundup pela Monsanto O glifosato é relativamente seguro, não persiste

durante muito tempo no solo e é relativamentebarato. O alvo é a enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-

fosfato sintase (EPSPS). O EPSPS é uma enzima essencial na síntese dos

aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina e

triptofano. Como consequência a síntese proteica é bloqueada devido à falta

destes aminoácidos. Outras vias de biossíntese (e.g. via do chiquimato) também

são afectadas.



Tolerância ao glifosato


O alvo é a enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS).

O glifosato é semelhante aofosfoenolpiruvato (PEP), que é

um dos substractos do EPSPS,competindo com ele.

Como o glifosato tem umaligação mais forte aocomplexo EPSPS-chiquimato3-fosfato que o PEP, a enzima

EPSPS é inactivada de formaeficaz e a formação de 5-enolpiruvato-3-fosfato (EPSP)é bloqueada.



Estratégias de produção de cultivos tolerantes ao glifosato


Testado através da construção de um vector com o seguinte mapa:

Fusão do cDNA com o promotor 35S de CaMV e a sequência terminadora nos

Transformação mediada pelo Agrobacterium de petúnia. Resultado: aumento de 40x da actividade da EPSPS nas plantas

transgénicas tolerância ao glifosato sendo necessárias doses 2x a 4xsuperiores para matar as plantas transgénicas comparativamente com asplantas “wild-type”.

Expressão em excesso do gene EPSPS

Primeiro descoberto em cultura de tecidos depetúnia que eram tolerantes ao glifosato:

Existência de múltiplas cópias (até 20) do gene EPSPS(amplificação génica)

E não por um aumento da expressão em si.



Estratégias de produção de cultivos tolerantes ao glifosato


Genes EPSPS mutantes

Descoberta de um gene de A. tumefaciens (estirpe CP4) que codificauma enzima EPSPS mutante resistente ao glifosato.

Construção de um vector com o seguinte mapa:

Gene de interesse (resistente ao glifosato)

Promotor CaMV 35S

Terminador nos

Péptido de trânsito cloroplastidial (guiar a enzima para o cloroplasto onde ser realizaa via do chiquimato)

Roundup Ready em soja, algodão e colza. Roundup Ready em milho (optimizado para

monocotiledóneas)

Gene EPSPS resistente de milho (isolado pormutagénese e selecção em cultura de tecidos)



Tolerância a herbicidas – caso de estudo 2


A fosfinitricina (PPT) é um herbicida derivado de um produto natural(produzido por algumas espécies de bactérias Streptomyces).

Eficaz contra ervas daninhas de folha larga. Comercializado como Basta pela Hoechst (agora parte da Bayer). A acção herbicida do PPT resulta de uma inibição competitiva com a

glutamina sintetase.



Tolerância ao PPT


O PPT compete com oglutamato, que é umsubstrato da glutaminasintetase (enzimafundamental para aassimilação de amónia noaminoácido glutamina),inibindo esta enzima.

Esta inibição leva a umaacumulação de amóniaaté níveis tóxicos, levandoà morte celular.

Ocorre igualmente umadisrupção da síntese deglutamina inibição dafotossíntese.



Estratégia de tolerância ao PPT


Espécies de Streptomycesapresentam um gene dedesintoxicação que as protegedos efeitos tóxicos do PPT.

Streptomyces hygrocopicus temum gene que codifica a enzimafosfinotricina acetiltransferase

(PAT) que desintoxica o herbicidaconvertendo PPT em acetil-PPT.

A transferência deste gene para aplanta forneceu a tolerância aoPPT.



Impacto ambiental do cultivo de plantas tolerantes aherbicidas


O uso de glifosato tem vindo a aumentarcom o aumento de cultivos de sojaresistente a este herbicida, mas estefacto é compensado com umadiminuição significativa nos outrosherbicidas.

Uma vez que o glifosato é dos herbicidasmenos tóxicos para o ambiente existetambém um beneficio para o ambiente.

Existe também um benefício económico directo para o agricultor, uma vezque os custos de produção de cultivos Roundup Ready são 25$/ha maisbaratos (menos dinheiro gasto com outros herbicidas) do que os cultivosnão GM.

A adopção de cultivos tolerantes a herbicidas pode ter consequências

ambientais positivas e negativas.



Impacto ambiental do cultivo de plantas tolerantes aherbicidas – as super ervas daninhas


Receio da ocorrência de super ervasdaninhas que possam fugir ao controlo dosherbicidas comummente usados.

As super ervas daninhas podem já surgirnaturalmente após o uso repetido de

herbicidas. Mas será que o uso de cultivos resistentes a

herbicidas resultará num aumento donúmero de super ervas daninhas, da taxa deocorrência e do tipo de ervas daninhas

resistência: Por uso repetido do mesmo herbicida?

Pelo gene de resistência a herbicidas ser transferido para umapopulação de ervas daninhas por processos de fluxo de genes?



Impacto ambiental do cultivo de plantas tolerantes aherbicidas – as super ervas-daninhas


O problema de fluxo de genes:

O milho, algodão e soja não apresentamparentes próximos evolutivamente com quem sepossam cruzar (pelo menos nos EUA e Canadá)...

Mas cuidado com a transferência horizontal degenes (e.g., por vírus) para outras espécies.

O trigo, colza e beterraba possuem parentespróximos, mas apenas as duas últimasapresentam fecundação cruzada e por isso têmsido alvo de estudos de fluxo destes genes paraas ervas daninhas.

Os estudos realizados até agora indicam que existe fluxo de genes, masa introgressão dos transgenes em condições de campo é consideradarara... Mas os estudos até agora efectuados basearam-se numa escala

pequena.

São necessários muitos mais estudos!!!



Resistência a insectos - Introdução


A agricultura moderna e o crescimentodas monoculturas, encorajou oaparecimento de pestes e as cultivareselite actuais são menos resistentes queos predecessores.

Aumento do uso de pesticidas químicos

e surgimento cíclico de insectosresistentes a determinados pesticidas.

As plantas resistentes a insectos paraalém da redução óbvia dos danosprovocados pelos insectos, reduzem a

dependência dos insecticidas químicos. O uso dos genes cry da endotoxina de Bacillus thuringiensis é

a abordagem mais comum.



Bacillus thuringiensis - introdução


Bactéria do solo usada como pesticidaeficaz das larvas de insectos.

A bactéria produz uma proteínadenominada Cry (crystal) codificadapelos genes cry , que forma corpos deinclusão de cristais bipiramidais ou

cuboidais durante a esporulação. Os genes cry são transportados nos

plasmídeos e pertencem a umasuperfamília de genes relacionados.

Estirpes diferentes de bactériasproduzem versões diferentes daproteína agrupados de acordo com asua similaridade (Cry1-40 pertencentesa diversas sub-famílias, A, B, C, etc.).



Bacillus thuringiensis – as proteínas Cry


As proteínas Cry são δ-

endotoxinas que apósingestão pela larva doinsecto, os seus cristais sãosolubilizados no intestino doinsecto.

De seguida ocorre clivagem

da proteína que liberta ofragmento activo, que porsua vez interage com osreceptores proteicos dasmembranas das células.

Como consequência a

membrana torna-sepermeável a catiões (pelaabertura dos porosselectivos dos catiões), o queleva a que a célula inche erebente.



O sistema Bt como alvo ideal em biotecnologia


A interacção é muito específica e formas diferentes

da proteína Cry afectam diferentes tipos deinsectos.

As endotoxinas são muito tóxicas podem serletais mesmo a concentrações muito baixas.

A toxicidade de todas as proteínas Cry amamíferos, pássaros e peixes é muito baixa.

Pesticidas baseados em B. thuringiensis (pesticidasBt ) são usados há já muito tempo (há mais de 50anos) e apresentam bons níveis de segurança.

Os cristais isolados têm uma persistência curta nafolhagem. É um pesticida não sistémico. São baseados numa única proteína codificada por um

único gene.



Plantas modificadas geneticamente com Bt


A integração dos genes cry nasplantas é conceptualmentesimples.

Todavia as primeiras tentativas deexpressar as proteínas Cry1A eCry3A em plantas usando opromotor CaMV 35S ou

Agrobacterium T-DNA resultaramem níveis de expressão muitoreduzidos.

Os primeiros cultivos Bt foram aprovados nos E.U.A. a meados dos anos 90.

A quantidade de variedades Bt (possuindo diversos tipos de genes cry

dirigidos para pestes específicas) é já extensa.

A sequência genética procariótica teve que ser modificada para se obterem

níveis de expressão elevados.



Caso de estudo 1 – A doença da broca do milho


A broca do milho (Ostrinia nubilalis) éuma das principais pestes do milho.

Como tal o desenvolvimento deplantas resistentes às larvas desteinsecto foi um dos principaisobjectivos da biotecnologia industrial.

O gene modificado cry1Ab foi usadonalguns casos (Ciba-Geigy, agoraSyngenta; mas também Monsanto,Bayer, etc.) sendo também eficazcontra algumas larvas de insectos que

atacam o algodão. Outros genes cry foram também

testados, se bem que, alguns, como ocry9C apresentaram problemas.



A problemática do milho StarLink


A EPA nos E.U.A. colocou reservas à adequação da

proteína Cry9C para consumo humano(adicionada ao milho e comercializado comomilho Bt StarLink): Proteína é mais estável quando acídica e por isso

mais dificilmente digerida no estômago, Poucos dados sobre a sua alergenicidade.

Assim, o milho StarLink foi só aprovado paraconsumo animal (aprovação condicional),enquanto decorriam mais testes.

Em 2000 foram encontrados vestígios de milhoStarLink em tacos.

Como o milho é uma planta de fecundaçãocruzada, ocorreu polinização cruzada comvariedades de milho destinadas ao consumohumano.

Conclusão: A variedade StarLink foi abandonada.



O problema da resistência dos insectos à Bt


A especificidade da ligaçãoproteína Bt – receptor fornece ummecanismo mais fácil dedesenvolvimento da resistênciado insecto à Bt :

São necessárias poucas mutaçõespara que o gene que codifica paraa proteína receptora reduzalargamente a força da ligação auma proteína Cry em particular.

Insectos resistentes à planta Bt podem, na teoria, aparecer,dentro de poucas gerações.



Estratégias de combate à resistência dos insectos


Casos de estudo em perspectiva:

Estratégia da pirâmide

Adição de mais do que um gene de resistêncianuma planta por cruzamentos sucessivos de linhastransgénicas diferentes.

Exemplo: Bollgard II da Monsanto com cry1Ac e

cry2Ab

Genes híbridos criados por fusão dos domínios de doisgenes que resultam em proteínas quiméricas

(resistência a várias pestes).

Uso de outros genes bacterianos (para além do família

de genes Bt ) de combate aos insectos. Mas a prática em corrente é o controlo integrado das pestes que considera

as interacções peste-planta numa contexto mais lato (predadores naturais,plantas adjacentes, rotação das colheitas e produtos químicos).



A abordagem dose elevada/refúgio


Aplicado nas culturas de

algodão Bollgard (Monsanto)nos E.U.A., por exemplo.

As plantas transgénicas queexpressão doses elevadas daproteína Bt são colocadas ladoa lado com um pequeno

refúgio de plantas nãotransgénicas, ou qualqueroutra planta da qual o insectose possa alimentar.

Só os insectos resistenteshomozigóticos são capazes de

tolerar a alimentação dasplantas transgénicas. Os homozigóticos são raros

nas fases iniciais dodesenvolvimento deresistência.



A abordagem dose elevada/refúgio


Os refúgios asseguram a presença de uma população maior de insectos

homozigóticos susceptíveis (rr) nas proximidades da planta transgénica. A maior parte dos cruzamentos será entre insectos com um (Rr) ou dois

genes (RR) de resistência e insectos homozigoticos susceptíveis (rr),produzindo heterozigóticos que não conseguem sobreviver na cultura.

Problemas deste sistema:

Monitorização permanente

Maior oportunidade de mistura entre material transgénico e não transgénico.



O impacto ambiental das culturas Bt


Em 1999 surgiu um dos casos mais mediáticosacerca do impacto ambiental das culturas Bt

o pólen de milho Bt176 podia ser tóxico

para as larvas da borboleta monarca.

Como é que esta variedade Bt foi permitida

para crescimento comercial quando o pólenapresentava níveis tão elevados de expressãoda proteína Bt ?

O caso da borboleta monarca (apresentação

oral!)

Aspectos ambientais positivos: De que forma é que insectos não infestantes

beneficiaram da redução de pesticidas pelaadopção das culturas Bt ?



Outros aspectos positivos das culturas Bt


Redução do uso de insecticidas Exemplo: em 1998 o algodão Bollgard

levou a uma redução de 0.9 milhões deKg de insecticida aplicado.

Benefícios económicos Exemplo: o algodão Bollgard levou a

uma redução de custos de 20$ por ha.

Melhoria da produtividade

Exemplo: o algodão Bollgard é 10% maisprodutivo do que o algodão nãotransgénico.



Alternativas ao Bt que estão em desenvolvimento


Inibidores de enzimas de digestão

que já ocorrem naturalmente emmuitas espécies vegetais: Tripsina Outras proteases α-amilase

Lectinas – proteínas que ocorremnaturalmente em muitos tipos defeijão e que são tóxicas para osanimais. Apenas aquelas que não são tóxicas

para animais mas que retenham aspropriedades insecticidas têmpotencial para a biotecnologia.

Quitinases – enzimas que degradama quitina (presente no exoesqueletodos insectos.



Alternativas ao Bt que estão em desenvolvimento


O problema da segurança alimentar: O efeito tóxico ou alergénico destas

alternativas ao Bt nos humanos poderestringir largamente a sua aplicação.

Muitas já foram desenvolvidas, masnão passaram da fase de laboratório.

O caso Pusztai: Em 1998, Dr. Arpad Pusztai referiu que

batatas GM provocavam alterações

intestinais em ratos por acção dalectina GNA (Galanthus nivalisagglutinin) (Apresentação oral!) .





Protecção cruzada:

Desde os anos 20, que se sabe que algumasplantas infectadas por vírus estavamaparentemente protegidas contra a infecçãopor vírus relacionados.

A infecção com uma estirpe moderada induz a

resistência a infecções subsequentes comestirpes mais virulentas.

A modificação da planta com um gene quecodifica uma proteína do envelope do vírusimita este fenómeno.

Comercialização com sucesso de plantas GM

resistentes ao seguintes vírus: Closterovirus citrus tristeza (Citrinos)

Papaya Ringspot virus – PRSV (Papaia) – mais popular

Zucchini yellow mosaic virus – ZYMV (Abobrinha)

Cucumovirus – (Pepino)





Efeitos no RNA:

Uso de técnicas de anti-sense ou co-

supressão que bloqueiem a actividadedos genes virais (por silenciamentogénico) quando o vírus infectar aplanta.

Variedade de batata GM (NewLeaf ,Monsanto) que apresenta um genepara uma replicase originada do vírusPLRV (“potato leafroll virus”) emcombinação com resistência Bt -descontinuada por falta de aceitação

do mercado.



Tolerância ao stress


Existem diversos tipos de stress que afectam o crescimento e

desenvolvimento das plantas



Tolerância ao stress


A variação de factores abióticos como atemperatura, disponibilidade hídrica esalinidade afectam largamente aprodutividade das culturas de ano para ano.

A maior parte dos stress abióticos ou bióticosleva à produção de radicais livres e ROS(“reactive oxygen species”), originando stressoxidativo.

As mudanças climáticas associadas aoaquecimento global deverão induziraumentos nos níveis de stress às plantas éurgente desenvolver variedades tolerantes

ao stress. O sucesso destas iniciativas permitiria

estender a área de cultivo a ambientes quenão são ideais para o crescimento (e.g.,desertos, solos altamente salinos).



Stress hídrico


As necessidades hídricas excedem o

fornecimento. O deficit de água pode:

Inibir a fotossíntese;

Aumentar a concentração dos iões tóxicos;

Remover a protecção hídrica que envolve asmacromoléculas.

As plantas podem responder à falta deágua acumulando osmo-protectores(que reduzem o potencial osmótico): Açúcares e açúcares alcoólicos (e.g., manitol,

sorbitol, pinitol e oligossacáridos como atrealose)

Compostos zwiteriónicos (com cargaspositivas e negativsas; e.g., prolina e glicinabetaína).

Diferentes tipos de plantas produzem diferentes tipos de osmo-protectorese alguns cultivos importantes não têm esta capacidade (e.g., arroz etabaco).



Stress hídrico


Engenharia genética:

Determinação das vias biossintéticas para vários osmo-protectores

Isolamento dos genes relevantes

Desenvolvimento de vectores que guiem a expressão génica e o destinodas proteínas.

A integração no genoma vegetal de osmo-protectores está a sertestada mas as taxas de sucesso têm variado largamente. Todavia, em alguns casos tem sido conseguido um aumento da tolerância

da planta a vários tipos de stress associados a deficits de água.

Até agora foram efectuados poucos testes de tolerância ao stress nocampo.

Também... A tolerância à secura pode melhorar as taxas desobrevivência mas não garante um aumento dos níveis deprodutividade para taxas normais.



Manipulação de tolerância a stress hídricos específicos


Abordagens alternativas – stress salino

As condições salinas levam a um aumento dostress osmótico impedindo a entrada de águanas raízes e levando à acumulação tóxica deiões Na+ e Cl-.

A tolerância salina é melhorada prevenindo aacumulação citoplasmática destes iões(imitando os mecanismos das plantashalófitas). Transformação com genes da proteínas anti-port

Na+/H+ responsáveis pela entrada dos iões Na+

nos vacúolos aumento do número de portas Transformação com genes da bomba de protões

AVP1 fornecimento de mais energia de formaa que as portas funcionem mais rapidamente.





Abordagens alternativas – stress provocado pelo

frio

A tolerância ao frio pode ser induzido melhorando

os processos de aclimatação (adaptação) a baixastemperaturas:

Durante este período a planta produz um número deproteínas induzidas pelo frio (habitualmentehidrofílicas) e que desempenham um papelfundamental na resistência posterior codificados poruma classe de genes, os genes de resposta ao frio

(COR)

Problema: são necessárias bastantes tipos destasproteínas para ocorrer uma protecção eficaz das célulascontra o frio é necessário transformar muitos genesCOR no mesmo indivíduo.





Abordagens alternativas – stress

provocado pelo calor

O stress provocado pelo calor induzum conjunto de proteínas de

choque de calor (HSPs) queprotegem as células protegendo as

proteínas desnaturadas.

HSPs individuais foramtransformados em plantas com oobjectivo de melhorar a tolerânciaao calor.

Arabidopsis transgénicas com HSPexpressos constitutivamenteapresentaram uma termo-tolerânciamelhorada.



Efeitos secundários do stress abiótico – a produção de ROS


A grande maioria do stress ambiental resulta

secundariamente em stress oxidativo. Mais directamente, o stress oxidativo resulta da

poluição através do ozono ou por radiação ionizante.

A maior parte do dano celular resulta da formaçãode ROS que reage com as macromoléculas celulares

(proteínas, DNA, lípidos membranares), danificando-as.



Efeitos secundários do stress abiótico – a produção de ROS


As plantas contêm algumas enzimas

(e.g., superóxido dismutase,peroxidases, catalases) quecatalisam a cascata dos ROS econvertem-nos em produtos menosreactivos.

Algumas plantas tambémapresentam alguns compostos compropriedades antioxidantes quereagem com os ROS, transformando-os em compostos inofensivos e

regeneráveis: ß-caroteno (provitamina A) Ácido ascórbico (vitamina C) α-tocoferol (vitamina E) Glutationa



Tolerância ao stress oxidativo


A tolerância ao stress oxidativopode ser fornecido por: Aumento dos níveis de expressão

das enzimas que convertem os ROS

Aumento dos níveis dos compostosantioxidantes que reagem com osROS.

Essencialmente aplicado aplantas de tabaco e Arabidopsis.

Os resultados obtidos são

bastante promissores, uma vezque na maior parte dos casos,verificou-se um aumento natolerância ao stress oxidativo.



Melhoramento da produtividade e qualidade de culturas


A produtividade de um cultivo édeterminado em função de:

Radiação solar interceptada;

Eficiência fotossintética;

Index de colheita.

A qualidade de um cultivo é determinadoem função de:

Qualidade nutritiva;

Sabor;

Qualidade de processamento;

Tempo de vida.



Retardamento do amadurecimento


Os primeiros produtos GM comercializados foramos tomates FlavrSavr (1994; Calgene) queapresentavam um retardamento doamadurecimento e por isso um maior tempo devida nas prateleiras.

O amadurecimento dos frutos é um processocomplexo que envolve a degradação das paredescelulares, e a produção de compostos queafectam a cor, sabor e aroma dos frutos.

Este processo é induzido pela produção deetileno.

A modificação genética teve como objectivosinterferir, ou com a produção de etileno, ou comos processos de resposta ao etileno.



Retardamento do amadurecimento em tomate


As técnicas de silenciamento génico, anti-sense

(Calgene; Flavr Savr) e co-supressão (Zeneca), foramusadas nas primeiras variedades de tomate GM parareduzir a actividade do gene que codifica apoligalacturonase (PG), uma enzima que contribui parao relaxamento da parede celular durante oamadurecimento.

A actividade da PG foi reduzida durante oamadurecimento, mas outros eventos deste processocontinuaram a ocorrer (e.g., acumulação de licopeno –cor vermelha).

Flavr Savr – não teve sucesso comercial e a sua produção foiabandonada um ano após a sua implementação.

Zeneca – tomate maioritariamente usado paraprocessamento (elevado conteúdo sólido) para polpaselevada taxa de sucesso durante três anos, masabandonada em resposta à hostilidade anti-GM.



Silenciamento de genes por anti-sense


Envolve a construção de um vector em que o gene a silenciar é introduzido naorientação reversa e é unido a uma sequência promotora (geralmente umpromotor forte).

Quando a planta GM apresente este tipo de gene, sintetiza RNA da sequênciareversa e que é complementar ao gene alvo, formando dsRNA e impedindo que oRNAm sirva de modelo na síntese proteica.



Silenciamento de genes por co-supressão


Uma ou mais cópias de umgene ou de parte dele,mesmo na orientaçãocorrecta, podem ter umefeito similar à expressão

génica por antisense quandointroduzido numa plantaGM.

Em petúnia após a adição do gene responsável pela cor púrpura, as flores ficaram variegadas ou brancas.



Silenciamento génico por RNA “hairpin” (hpRNA)


RNA de interferência por produção de RNA “hairpin” (hpRNA)

Envolve a indução da síntese de dsRNA derivado do gene alvo

O vector têm a sequência do transgene e uma cópia da mesma, masinvertida, separados por um espaçador. A expressão é guiada porpromotor forte.

As duas regiõescomplementares vão unir-seformando o um “hairpin” deRNA de cadeia dupla.

O hpRNA é extremamenteeficaz na destruição dequalquer mRNA homólogo.



Retardamento do amadurecimento


O método actual – tecnologia antisense do etileno

Redução da actividade dos genes que sintetizam as enzimasnecessárias à síntese de etileno:

Ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) sintetase

ACC oxidase

Aplicado em muitas plantas de frutos comestíveis: Papaia

Manga

Ananás

Mas ainda não existem variedades comerciais disponíveis. O sucesso da manipulação do etileno revelou o potencial desta

tecnologia para a manipulação de outros reguladores decrescimento.



As plantas anãs – A revolução verde (parte II)


Descoberta inesperada de que a

elevada expressão de pioteno

sintase (enzima envolvida na viade produção do licopeno) leva auma redução da síntese degiberelinas, que

consequentemente resulta emfenótipos anões.

“Dwarfing” é uma característica agronómica importante:

Estas plantas necessitam de menos recursos dirigidos para o crescimento do

caule, permitindo que mais matéria seca seja dirigida para o grão. Estes tipos de cultivo são menos danificados pelo vento e chuva.

A característica anã foi a principal marca das variedades altamenteprodutivas de milho e trigo que originaram a 1ª Revolução Verde.



As plantas anãs – A revolução verde (parte II)


A Revolução Verde II pode surgir dentro de

pouco tempo.

Foi descoberto um gene insensível à giberelina

em Arabidopsis (gai) que codifica uma proteínaque actua como regulador da acção dagiberelina.

Uma mutação neste gene leva a que a proteínaseja insensível à sinalização de giberelina,levando à sua actuação como um repressor do

crescimento.

Plantas GM de arroz e trigo com o gene gai

mutante apresentam um fenótipo anão.

Mais detalhes na Apresentação Oral!



O arroz dourado

O arroz é o alimento mais importante do

mundo (consumido por cerca de 3.8biliões de pessoas).

Em regiões do mundo em que o arroz éum dos principais alimentos da dietaalimentar (e.g. Ásia) existe um graveproblema nutricional de vitamina A

cegueira, mas também diarreia, doençasrespiratórias, etc.

Produção de provitamina A noendosperma de grãos de arroz pormanipulação da síntese de ß-caroteno(cor laranja característica) Arrozdourado

O arroz dourado foi alvo de uma fortecampanha de oposição.

Mais detalhes na Apresentação Oral!




A biofortificação


Alimentos melhorado ao nível de

outras vitaminas ou micronutrientes deforma a colmatar carências nutritivas Variedades de arroz com níveis elevados

de ferro e zinco (suprimir deficiênciasnutritivas).

Aumento dos níveis de vitamina E Forte antioxidante (importante nas

grávidas e para prevenir doenças docoração).

Folhas de tabaco com níveis mais

elevados de vitamina C Produção de fumo menos irritante e com

benefícios ao nível dos compostosantioxidantes.

Dentes menos amarelados!!!!



Melhoramento do conteúdo alimentar (e não só!)


Conteúdo em carboidratos e lípidosComposto Origem dos genes Aplicação Planta transgénica

Carboidratos

Amido sem amilose Batata Alimentar e industrial Batata

Amido com conteúdoelevado em amilose

Batata Alimentar (gomas) e industrial Batata

Ciclodextrinas Klebsiella

penumoniae

Alimentar e farmacêutica (e.g., esteróides) Batata

Fructans Bacillus subtillis

AlcachofraIndustrialAlimentar (açúcar de baixas calorias)

Tabaco, Batata e Milho

Trealose Escherichia coli Alimentar (açúcar) Beterraba

Lípidos Tabaco

Ácidos gordos de cadeiamédia

Umbellularia

californica

Alimentar, Industrial e Detergentes Colza

Ácidos gordos saturados Brassica rapa Alimentar (ácido oleíco) Colza

Ácidos gordo mono nãosaturados

Rat Alimentar Tabaco

Polihidroxibutirato Alcaligenes

eutrophus

Plásticos biodegradáveis Arabidopsis, soja, colza ealgodão



Produção de conteúdos elevados de proteínas

Enzimas com fins industriais ou para o usona agricultura:

Peroxidade lenhina – indústria do papel

Avidina – kits de diagnóstico

ß-glucuronidase (GUS) – kits de diagnóstico

Tripsina – produção de fármacos (e.g.,insulina)

Proteínas relacionadas com a medicina:

Anticorpos;

Vacinas;

Antibióticos proteicos.

O uso de plantas para produzir enzimas em larga escala eproteínas de elevado valor:

aplicacoes da transformacao genetica

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