AntonioFerreiraMendesdeSousa

Estudodainibiçãodosistemacomplementohumanopela

salivadeanofelinos(Diptera;Anophelinae)neotropicais

UniversidadeFederaldeMinasGerais

BeloHorizonte

Dezembro,2015

AntonioFerreiraMendesdeSousa

Estudodainibiçãodosistemacomplementohumanopela

salivadeanofelinos(Diptera;Anophelinae)neotropicais

Orientador:Prof.Dr.NelderdeFigueiredoGontijo

LaboratóriodeFisiologiadeInsetosHematófagos

DepartamentodeParasitologia-UFMG

BeloHorizonte–2015

TeseapresentadaaoProgramadePós-graduação em Parasitologia doInstituto de Ciências Biológicas daUniversidade Federal de Minas Geraiscomo requisito para obtenção do graudeDoutoremParasitologiaÁreadeconcentração:Entomologia

Aos meus pais, Antonio Ferreira de Sousa

SobrinhoeFranciscaMendesdeSousa,minha

maiorinspiração

Agradecimentos

Agradeçoaomeupaieàminhamãe,AntonioFerreiradeSousaSobrinho

eFranciscaMendesdeSousa,peloincentivoconstanteaalcançarmeusobjetivos,

peloapoioincondicionalepeloamorqueconfortaefortalece.Amovocês.

Ao meu orientador, Seu Nelder (Laboratório de Fisiologia de Insetos

Hematófagos–UFMG),pelaconfiança,ensinamentoseoportunidades.

Ao Dr. Jesus Valenzuela (Laboratory of Malaria and Vector Research –

NIH), por me receber em seu laboratório para realização do doutorado

sanduíche.

AoDr.JohnAndersen(LaboratoryofMalariaandVectorResearch–NIH),

pela ajuda direta na realização dos experimentos com as proteínas

recombinantes.

Ao Dr. Luciano Moreira e à Msc. Fernanda Rezende (Laboratório de

Malária–CPqRR/Fiocruz),pelagentilezaemnoscederosmosquitosdaespécie

Anophelesaquasalis.

AoDr.VladimirFazitodoVale(LaboratóriodeSimulídeoseOncocercose,

IOC/Fiocruz),pelaamizadeepelaajudadireta,críticasesugestõesrelacionadas

aosexperimentosrealizadosnestetrabalho,semprecommuitapaciênciaeboa

vontade.

Ao Daniel Costa Queiroz (Laboratório de Fisiologia de Insetos

Hematófagos–UFMG),oqualtiveoprazerdeorientarcomoalunodeiniciação

científica,pelaajudanarealizaçãodosexperimentosnoLFIHepelaamizade.

À Dra. Hélida Andrade e à Dra. Simone Pires (Laboratório de

Leishmanioses–UFMG),pelarealizaçãodaanálisedeespectrometriademassa

noInstitutodeCiênciasBiológicasdaUFMG.

AoDr.JoséMarcosRibeiro(LaboratoryofMalariaandVectorResearch–

NIH),pelaajudanaanálisedassequênciasdosgenesdeAnophelesalbimanus.

Ao Andre Laughinhouse e ao Kevin Lee, pela criação dos mosquitos

utilizadosnosexperimentosrealizadosnoNIH.

Aos amigos do Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos,

especialmenteaoCésarOliveira,portodaajudadentroeforadolaboratório.

AosamigosdoLaboratoryofMalariaandVectorResearch,especialmente

aoDr.FabianoOliveira,peloauxílioebomhumornolaboratório.

À Sumara e Sibele, secretárias da Pós-graduação em Parasitologia, pela

amabilidadeeporestaremsempredispostasaajudar.

À Luciana, Geni e Zuleika, secretárias da curso de Parasitologia para

graduação,pelaajudadurantemeuperíodocomobolsistaREUNI.

Ao Programade Pós-graduação emParasitologia daUFMG, nas pessoas

dos seus coordenadores, Prof.RicardoToshioFujiwara eProf.MarcosHorácio

Pereira, pelos ensinamentos de qualidade, essenciais à minha formação como

Parasitologista.

Às instituições de fomento que contribuíram para a realização deste

trabalho, CAPES, CNPq e FAPEMIG, e ao programa Ciências sem Fronteiras,

atravésdoqualrealizeioestágiodeDoutoradoSanduíchenoNationalInstitutes

ofHealth(NIH),EstadosUnidos.

A todosquediretaou indiretamente ajudaramaconcluireste trabalho,

deixoomeu“MuitoObrigado!”.

Sumário

Listadeabreviações i

Listadefiguras ii

Listadetabelas iii

Resumo iv

Abstract v

1.Introdução 15

1.1Maláriaeseusvetores 15

1.2AsalivadeAnophelessp. 20

1.3Osistemacomplemento 24

1.4Inibiçãodosistemacomplementoporartrópodeshematófagos26

2.Justificativa 29

3.Objetivos 31

3.1Objetivogeral 31

3.2Objetivosespecíficos 31

4.MaterialeMétodos 32

4.1Aprovaçãoemcomitêdeética 32

4.2Criaçãodosmosquitoseobtençãodeextratodeglândulas

salivares 32

4.3Ensaiohemolíticos 33

4.4Ensaiodeativaçãodaviadaslectinas 35

4.5Ensaiodedeposiçãodecomponentesdaviaalternativa 36

4.6WesternblotparadetecçãodeFatorBeC3a 38

4.7PurificaçãoeidentificaçãodoinibidorsalivardeA.albimanus 39

4.8RT-PCRparadetecçãodogenedaproteínagSG7emextratode

glândulassalivaresdeA.albimanus 41

4.9Clonagem,expressãoepurificaçãodasproteínasgSG7egSG7-2

deA.albimanusegSG7deA.darlingi 42

4.10IdentificaçãodoinibidorsalivardocomplementodeA.aquasalis44

4.11Westernbloteensaiohemolíticocomanticorpoanti-gSG7deA.

albimanus 45

4.12ELISAparadetectarligaçãodecomponentesdocomplementoaos

inibidoressalivares 47

4.13Ensaioderessonânciaplasmônicadesuperfície 48

4.14Análiseestatística 48

5.Resultados 49

5.1QuantificaçãodeproteínasdosEGSdasespéciesdeAnopheles

estudadas 49

5.2Ensaioshemolíticos 49

5.2.1Viaalternativa 49

5.2.2Viaclássica 51

5.3Ensaiodeativaçãodaviadaslectinas 52

5.4Ensaiodedeposiçãodecomponentesdaviaalternativa 52

5.5WesternblotparadetecçãodeFatorBeC3a 54

5.6WesternblotcomC3b,FatorBeFatorDpurificados 56

5.7PurificaçãodoinibidorsalivardeA.albimanus 56

5.8RT-PCRparadetecçãodogenedaproteínagSG7emextratode

glândulassalivaresdeA.albimanus 65

5.9ExpressãoepurificaçãodasproteínasgSG7egSG7-2deA.albimanus

egSG7deA.darlingi 66

5.10IdentificaçãodoinibidorsalivardeA.aquasalis 74

5.11WesternbloteensaiohemolíticocomIgGanti-gSG7de

A.albimanus 75

5.12ELISAparadetectarligaçãodecomponentesdocomplementoaos

inibidoressalivares 77

5.13Ensaioderessonânciaplasmônicadesuperfície 79

6.Discussão 80

7.Conclusões 90

8.Referênciasbibliográficas 91

Listadeabreviações

AAPP–proteínaanti-plaquetáriadeAnopheles(doinglês,Anophelesanti-plateletprotein)ADP–adenosinadifosfatoAMP–adenosinamonofosfatoATP–adenosinatrifosfatoBLAST–BasicLocalAlignmentSearchToolBSA–albuminadesorobovino(doinglês,bovineserumalbumine)CAM–complexodeataqueàmembranacDNA–DNAcomplementarDTT–ditiotreitolEDTA–ácidoetilenodiaminotetraacéticoEGS–extratodeglândulassalivaresEGTA–ácidoetilenoglicoltetraacéticoHPLC–cromatografialíquidadealtaeficiência(doinglês,highperformanceliquidchromatography)IL-10–interleucina10IPTG–isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeoISAC–Ixodesscapularisanti-complementka–constantedeassociaçãokd–constantededissociaçãokD-constantedeafinidadeMASP–serino-proteaseassociadaàMBL(doinglês,MBL-associatedserineprotease)MBL–lectinaligantedemanana(doinglês,mannanbindinglectin)MW–pesomolecular(doinglês,molecularweight)NCBI–CentroNacionalparaInformaçãoBiotecnológica(doingles,NationalCenterforBiotechnologyInformation)NIH–InstitutoNacionaldeSaúde(doinglês,NationalInstitutesofHealth)OPD–ortofenilenodiaminaPBS–soluçãosalinafosfatada(doinglês,phosphate-bufferedsaline)PCR–reaçãoemcadeiadepolimerase(doinglês,polymerasechainreaction)RNAi–RNAdeinterferênciaSDS-PAGE–geldepoliacrilamidacomdodecilsulfatodesódio(doinglês,sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis)SHN–SorohumanonormalTw–TweenUV–ultravioleta

ListadeFiguras

Figura1:Distribuiçãoatualdoscasosdemalárianomundo. 15Figura2:CiclobiológicodeAnophelessp.. 19Figura3:Distribuiçãoglobaldosprincipaisvetoresdemalária. 20Figura4:GlândulasalivardefêmeadeAnophelesaquasalis. 21Figura 5: Esquema representativo das três vias de ativação do sistemacomplemento. 25Figura6:SequênciasdosgenessintéticosutilizadosparaclonagemeexpressãodeproteínasrecombinantesdeA.albimanuseA.darlingi. 43Figura7:Açãodo extrato de glândulas salivares de seis espécies deAnophelessobreaviaalternativadosistemacomplementohumano. 50Figura8:EfeitodetratamentosdesnaturantessobreaatividadeinibidoradaviaalternativadoEGSdeA.albimanus. 51Figura 9: Ação do EGS de A. albimanus, A. aquasalis e A. gambiae sobre a viaclássicadosistemacomplemento. 52Figura10:Efeitodo extratode glândulas salivaresdeA.albimanus sobre a viadaslectinas. 52Figura 11: Ação do EGS de A. aquasalis e A. albimanus sobre a deposição decomponentesdaviaalternativadosistemacomplemento. 53Figura 12: Efeito doEGS deA.aquasalis sobre componentes da via alternativapreviamentedepositadosemsuperfícieativadora. 54Figura13:AçãodoEGSdeA.aquasaliseA.albimanusnaativaçãodoFatorB. 55Figura14:AçãodoEGSdeA.aquasaliseA.albimanusnaativaçãodocomponenteC3. 55Figura 15: Ação do EGS deA.albimanus na formação da C3-convertase da viaalternativa. 56Figura 16: Purificação do inibidor da via alternativa presente no EGS de A.albimanus. 57Figura17:SDS-PAGEcomfraçõesdacromatografiadefasereversadoEGSdeA.albimanus. 58

Figura 18: Quantificação das proteínas salivares de A. albimanus identificadasporespectrometriademassadafraçãopurificada1H12. 59Figura 19: Sequência do gene AALB001854 de A. albimanus disponível noVectorBase. 61Figura 20: Sequências dos dois genes anotados como gene AALB001854 deA.albimanus. 62Figura21:SequênciadaproteínasalivargSG7deA.albimanus. 63Figura22:SequênciadaproteínasalivargSG7-2deA.albimanus. 63Figura23:AlinhamentodassequênciasdospeptídeosdeproteínasalivardeA.albimanuscomasequênciadaproteínagSG7obtidanoVectorBase. 64Figura24:SequênciadaproteínasalivargSG7deA.darlingi. 64Figura25:ComparaçãodassequênciasdasproteínasgSG7dediferentesespéciesdeAnopheles. 65Figura 26: Eletroforese dos produtos da reação de PCR para amplificação dogenedaproteínagSG7deA.albimanus. 66Figura 27: Cromatografia de gel filtração para purificação das proteínasrecombinantes. 67Figura 28: SDS-PAGE com as proteínas recombinantes após o último passo depurificação. 67Figura29:Açãodasproteínas recombinantesgSG7egSG7-2deA.albimanus egSG7deA.darlingisobreaviaalternativadosistemacomplemento. 68Figura30:Açãodasproteínas recombinantesgSG7egSG7-2deA.albimanus egSG7deA.darlingisobreaviaclássicadosistemacomplemento. 68Figura31:Efeitodasproteínas gSG7e gSG7-2deA.albimanus sobre a viadaslectinas. 69Figura32:EfeitodasproteínasgSG7egSG7-2deA.albimanusnadeposiçãodoscomponentesC3,FatorB,properdinaeC9emplacascobertascomagarose.70Figura 33: Efeito da proteína gSG7 de A. darlingi sobre a deposição doscomponentesC3,FatorB,properdinaeC9emplacascobertascomagarose. 71Figura34:EfeitodagSG7deA.albimanus eFatorHsobrecomponentesdaviaalternativapreviamenteligadosàsuperfícieativadora. 72

Figura35:EfeitodasproteínasgSG7egSG7-2deA.albimanus naativaçãodoscomponentesFatorBeC3. 73Figura36:AçãodasproteínasrecombinantesgSG7egSG7-2deA.albimanusnaformaçãodaC3-convertasedaviaalternativa. 73Figura37:EletroforesedasproteínasgSG7recombinantesdeA.albimanus eA.darlingiedoEGSdeA.aquasalisemgeldepoliacrilamidacoradocomprata. 74Figura38:AlinhamentodasequênciadepeptídeogeradodeproteínasalivardeA.aquasaliscomasequênciadaproteínagSG7deA.darlingi. 75Figura39:Westernblotcomanticorpoanti-gSG7deA.albimanus. 75Figura40:WesternblotcomIgGanti-gSG7deA.albimanus. 76Figura41:EfeitodoIgGanti-gSG7sobreaatividadeanti-complementodoEGSedaproteínagSG7recombinante. 77Figura42:LigaçãodecomponentesdocomplementoàgSG7deA.albimanus.78Figura43:LigaçãodecomponentesdocomplementoaoEGSdeA.aquasalis.78Figura44:EnsaioderessonânciaplasmônicadesuperfíciecomgSG7egSG7-2deA.albimanus. 79

ListadeQuadros

Quadro1:CiclosdetemperaturautilizadosnasreaçõesdePCRparaamplificaçãodogenedaproteínagSG7deA.albimanus. 42Quadro 2: Proteínas salivares de A. albimanus identificadas na fração 1H12submetidaaespectrometriademassa. 59

Resumo

Mosquitos pertencentes ao gênero Anopheles são os transmissores

naturais de malária no mundo. A transmissão ocorre durante a hematofagia,

quando esses insetos inoculam na pele do hospedeiro formas infectantes do

Plasmodiumsp.juntamentecomoconteúdodesuasglândulassalivares.Asaliva

dessesmosquitoscontémmoléculasimportantesparaosucessodahematofagia,

como vasodilatadores e anticoagulantes. Entretanto, há pouca informação

existente sobre a interação de componentes salivares de anofelinos com o

sistema imune do hospedeiro vertebrado. Este trabalho teve como objetivo

demonstrar e caracterizar a atividade inibidora do sistema complemento na

saliva de anofelinos, principalmente A. albimanus e A. aquasalis, importantes

vetoresdemalárianaAméricaLatina.Paraisso,ensaioshemolíticos,ensaiosde

deposição e Western blots para detectar ativação de componentes do

complementoforamrealizadosnapresençadeextratodeglândulassalivaresdos

mosquitos.Osresultadosdessesexperimentosmostraraminibiçãosignificativae

dose-dependente da via alternativa do sistema complemento pelo extrato de

glândulassalivaresdasduasespéciescitadas.OinibidorsalivardeA.albimanus

foipurificadoemHPLCeidentificadoporespectrometriademassacomosendoa

proteínagSG7.Ogenedessaproteínafoientãoclonadoeexpressoembactérias.

Aproteínarecombinanteapresentouatividadetãopotentequantooextratode

glândulasalivardeA.albimanus.Anticorposproduzidoscontraarecombinante

foram capazes de reconhecer tanto a recombinante como a proteína nativa

presentenoextratodeglândulas,alémdebloquearaatividadedasduasformas

da proteína. Através de ensaio de ELISA e de ressonância plasmônica de

superfície, demonstramos que a gSG7 liga-se em properdina, um regulador

positivo da via alternativa do complemento, bloqueando a ação estabilizadora

dessavia.Estaéaprimeiradescriçãodeuminibidordocomplementonasaliva

demosquitos,eapresentapotencialimportâncianoprocessohematofágicoena

transmissãodoPlasmodiumsp..

Palavras-chave: Anopheles albimanus, Anopheles aquasalis, glândulas salivares,

sistemacomplemento,gSG7,inibiçãodocomplemento.

Abstract

Anophelesmosquitoesare thenaturalvectorsofmalaria throughout the

world. The transmission occurs during bloodmeal, when the insects inject

infectiveformsofPlasmodiumtogetherwiththecontentsoftheirsalivaryglands.

Their saliva presents active molecules important for hematophagy, such as

vasodilators, anticoagulant and platelet inhibitors. However, little is known

abouttheinteractionsofAnopheles’salivarycomponentswiththehost’simmune

system. The aim of this work was to demonstrate and to characterize anti-

complement activity in the saliva of neotropical anophelines, specially A.

albimanus and A. aquasalis, important malaria vectors in Latin America.

Hemolytic assays, ELISA assays and Western blots for detecting activation of

complement components were performed in the presence and absence of

salivaryglandsextractsofbothmosquitospecies.Theresultsshowedsignificant

and dose-dependent inhibition of the alternative pathway by the saliva of the

twospecies.ThesalivaryinhibitorofA.albimanuswasthenpurifiedusingHPLC

and identifiedbymassspectrometry,asbeingagSG7protein.Thegeneof that

proteinwas cloned and expressed inE.coli bacteria. The recombinant protein

presented anti-complement activity as potent as the salivary glands extracts.

Anti-recombinant gSG7 IgGantibodiesproduced in rabbitswere able todetect

both the recombinant and the native protein in the glands extract. The

antibodiesalsoblockedgSG7activityinthehemolyticassays.ThroughELISAand

surfaceplasmonresonance,weshowedthatgSG7bindsdirectlytoproperdin,a

positiveregulatorofthealternativepathwayofthecomplementsystem.Thisis

the first report of an anti-complementmolecule inmosquito saliva,which has

potentialroleinblood-feedingandparasitetransmissionbythevector.

Key-words: Anopheles albimanus, Anopheles aquasalis, salivary glands,

complement system, gSG7, complement inhibition.

15

1.Introdução1.1Maláriaeseusvetores A malária humana é uma das principais doenças parasitárias no mundo,

provocadaporprotozoáriosdogêneroPlasmodiumetransmitidapormosquitosdo

gêneroAnopheles.Adoençaéresponsávelporelevadamortalidadeemorbidadeem

países tropicais e subtropicais, sendo atualmente endêmica em 97 países,

acometendoanualmentecercade200milhõesdepessoasecommaisde45%da

populaçãomundial sob o risco de infecção (WHO, 2014). Estima-se que cerca de

580.000 pessoas morreram de malária em 2013, principalmente crianças com

menos de 5 anos de idade residentes no continente africano (Figura 1) (WHO,

2014).

Figura 1: Distribuição atual dos casos de malária no mundo (Adaptado deWHO,2014).

NasAméricas,amaláriaocorreem21países,comcercade420.000casos

confirmadose82mortesem2013.Brasil,ColômbiaeVenezuelaapresentaram

72%doscasosdestecontinente(WHO,2014).NoBrasil,adoençapredominana

região amazônica, onde ocorremmais de 99%dos casos notificados (Oliveira-

Ferreiraetal.2010).Amaláriaapresentadistribuiçãoheterogêneanessaregião,

sendoasáreasdemaiortransmissãoaquelasrecém-ocupadas,áreasdegarimpo

16

epopulaçõesribeirinhas.Nessasáreas,odesenvolvimentodovetoreexposição

da população aomesmo são favorecidos pelos hábitos dosmoradores e pelas

condiçõesdeficientesdemoradia, favorecendoassimamanutençãodamalária

endêmica(Alvesetal.2002,Sampaioetal.2015).

OsplasmódiossãoprotozoáriospertencentesaofiloApicomplexa,família

Plasmodiidae e ao gênero Plasmodium. Atualmente cinco espécies são

consideradas causadoras de malária humana: Plasmodium falciparum,

Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e Plasmodium

knowlesi,sendoasduasprimeirasasmaisprevalentesnomundoeasprincipais

causadoras da doença em humanos (Cox-Singh & Singh 2010,WHO, 2014). P.

knowlesi possui macacos como hospedeiros vertebrados, mas recentemente

casosdemaláriahumanaprovocadaporessaespécietêmsidorelatadosnaÁsia

(Cox-Singh & Singh, 2010). De forma geral, a malária é caracterizada por

episódios de calafrios, febre com temperatura igual ou superior a 40ºC e

sudorese intensa.É comumopaciente apresentar juntamente cefaléia,mialgia,

náuseasevômitos(MS,2010).AmaláriagraveécausadaprincipalmenteporP.

falciparum, havendo obstrução de capilares sanguíneos em órgãos como rins,

pulmões, coração e cérebro, sendo comumente fatal se não tratada a tempo

(Miller et al. 2002, Weatherall et al. 2002). Emmulheres grávidas, a infecção

causaanemiaedisfunçãoplacentária, prejudicandoo crescimentodo feto, que

nasce com peso reduzido, favorecendo a mortalidade infantil nas áreas

endêmicas(Weatheralletal.,2002).Recentemente,casosdemaláriagraveporP.

vivax também têm sido relatados, caracterizados principalmente por anemia

severa,icterícia,trombocitopeniaedificuldaderespiratória(Lacerdaetal.2012).

Osplasmódiosapresentamciclobiológicoheteroxênico,divididoemciclo

assexuadonohospedeirovertebradoesexuadonomosquitovetor.Ainfecçãodo

hospedeiro vertebrado ocorre naturalmente quando fêmeas de anofelinos

infectadas, ao realizarem a hematofagia, inoculam juntamente com sua saliva

formas infectantesdoparasito,denominadasesporozoítos.Esta formaevolutiva

do Plasmodium acumula-se na glândula salivar do mosquito e, em um repasto

infectante,umafêmeainoculaemmédia120esporozoítosnapeledohospedeiro

(Medica&Innis2005).

17

Partedosparasitosinoculadosnapelepenetramemcapilarescutâneose

caem na corrente sanguínea. Os esporozoítos atravessam o citosol de várias

célulasparaativarasviasnecessáriasàinvasãoeaofuturodesenvolvimentodo

parasito no fígado (Mota & Rodriguez 2004). Em alguns minutos invadem

hepatócitos, diferenciam-se em formas arredondadas e iniciam o ciclo pré-

eritrocítico, no qual realizammerogonia e gerammilhares de células-filhas, os

merozoítos.Ohepatócitoparasitadoéentãorompido,liberandoosparasitosem

vesículas conhecidas como merossomos (Sturm et al. 2006). Muitos dos

merozoítos liberados são fagocitados pelas células de Kupffer, mas os que

conseguem sobreviver invadem hemácias e dão origem ao ciclo eritrocítico.

Nessascélulas,osplasmódiosmultiplicam-senovamentepormerogonia,gerando

dezenas de milhares de novos merozoítos. Com o rompimento da célula, os

merozoítos liberados invadem novas hemácias, repetindo novamente a

multiplicação assexuada. Após algum tempo de evolução da infecção (cerca de

seteadozediasparaP.falciparume24horasparaP.vivax),aparecemnointerior

das hemácias formas que não mais se reproduzem. São os gametócitos ou

gamontes(Weatheralletal.2002,Bousemaetal.2010).

Quando um anofelino se alimenta em hospedeiro com gametócitos

circulantes,eleingereestasformassexuadasdoparasito.DevidoaalteraçãodepH

e temperatura e produção de ácido xanturênico no trato digestivo do inseto, os

gametócitos se diferenciam em microgametas masculinos ou macrogameta

feminino (um gametócito pode dar origem a oito microgametas masculinos

flageladosouaumúnicomacrogametafemininoarredondado),quesefecundame

formamozigoto(Billkeretal.1997,Billkeretal.1998,Josling&Llinás2015).Cerca

de20horasapósafusãodosdoisnúcleos,ozigotocomeçaamovimentar-seepassa

aserchamadodeoocineto.Esteatravessaacélulaintestinaldoinseto,alojando-se

entreoepitélioeamembranabasaldointestino.Nesta localização, transforma-se

em oocisto e inicia o processo demultiplicação esporogônica, dando origem aos

esporozoítos.Ooocistomadurorompe-se,liberandoosesporozoítos,quecaemna

hemolinfa e migram para as glândulas salivares do inseto, invadindo-as. Em um

novo repasto sanguíneo, estas formas do parasito são inoculadas no hospedeiro

18

juntamente coma salivado vetor, completando seu ciclo biológico (Revisadopor

Pimentaetal.2015).

OsanofelinossãoinsetospertencentesàordemDiptera, famíliaCulicidaee

sub-famíliaAnophelinae.OgêneroAnopheles,compreendemaisde400espécies,

embora apenas aproximadamente 60 tenham importância epidemiológica para

malária (Harbach 2004). São vulgarmente conhecidos comomosquito-prego ou

carapanãnoBrasilediferenciam-sedeoutrosculicídeosporapresentarempouso

perpendicular em relação ao substrato, palpos do mesmo comprimento da

probóscide, asas manchadas, ovos com expansões cuticulares formando os

flutuadores, e larvas semsifão respiratório (Forattini, 2002).Taxonomicamente,

distribuem-se em seis subgêneros: Anopheles, Cellia, Kertezia, Lophopodomyia,

NyssorhynchuseStethomyia,dosquaisAnopheles,CelliaeNyssorhynchuspossuem

omaiornúmerodeespécies(Harbach2004).

Comotododíptero,osanofelinosapresentamcicloholometábolo,passando

pelas fases de ovo, quatro estádios larvais, pupa e adultos (Figura 2). As fases

imaturasdocicloocorrememcoleçõesdeáguacomcondiçõesvariáveisdeacordo

com a espécie de Anopheles, onde as larvas se alimentam de microrganismos

aquáticos. Os adultos se alimentam de sucos vegetais e apenas as fêmeas são

hematófagas, necessitando do sangue ingerido para maturação dos folículos

ovarianos.De formageral,acópuladosanofelinossedáemenxames, formando

‘nuvens’ nas quais os machos agarram as fêmeas com suas terminálias,

fecundando-as(Forattini,2002).

Entre as espécies do gênero Anopheles existem importantes diferenças

biológicas que permitem sua adaptação a diferentes ambientes, possibilitando a

ampla distribuição desses mosquitos nos seis continentes (Figura 3), e a

transmissãoglobaldemalária (Sinkaetal.2010).Entreosprincipaisvetoresde

malária no Velho Mundo estão: A. gambiae (principal vetor na África sub-

sahariana), A. stephensi (principal vetor nas áreas urbanas da Índia) e A. dirus

(principalvetornosudesteasiático)(Sinkaetal.2010).NaAméricadoNorte,A.

pseudopunctipeniséconsideradooprincipaltransmissordemalárianoMéxico,e

A.freebornieA.quadrimaculatusforamimportantesvetoresdadoençanascostas

19

oesteeleste,respectivamente,dosEstadosUnidosatéadécadadequarenta(CDC,

2015).

Figura 2: Ciclo biológico de Anopheles sp.. Os anofelinos possuem cicloholometábolo,passandopelas fasesdeovo, larva,pupaeadulto [Fotos:StephenDogget(larvaepupa),SamCotton(adultos),RoxanneConnely(ovos)].

NaAméricadoSul,A.darlingiéaprincipalespécietransmissorademalária.

NoBrasil,elaéencontradaemquasetodoopaís,comexceçãodoextremosulede

certasáreasmuitosecasnaregiãoNordeste(Figura3).Éaltamentesusceptívelà

infecção por Plasmodium vivax e P. falciparum e apresenta alto grau de

antropofilia, alimentando-se predominantemente no peri-domicilio (Forattini,

2002,Giletal.2007).Entretanto,nasregiõescosteirasondeamaláriaéendêmica,

A. aquasalis é incriminado como o principal vetor. Essa espécie possui como

criadouroscoleçõesdeáguasalobrae,portanto,suaslarvassuportamaltosteores

desalinidade(Forattini,2002;Silvaetal.2006).Devidoaestacaracterística,sua

distribuiçãoéquaseexclusivamentelitorânea,ocorrendonasregiõescosteirasdas

AméricasCentraledoSul.EmBelém(PA),Povoaetal(2003)relataramíndicesde

infecçãonaturaldeA.aquasalisde1,18%(edeA.darlingide1,61%),contribuindo

deformasignificativanatransmissãodadoençanessacidade.

20

Já na América Central, A. albimanus é a espécie mais importante na

transmissãodeP.vivax(Faran1980).Estaespécierealizahematofagianofinalda

tardeeduranteanoite,principalmenteforadasmoradiashumanas,apesardeser

encontradarepousandotantonointra-quantonoperi-domicílio(Breeland1972,

Sinkaetal.2010).Emrelaçãoàpreferênciaalimentar,éconsideradaumaespécie

oportunista, alimentando-se tanto em humanos quanto em animais, o que

favorecea suamanutençãonasáreasendêmicas (Sinkaet al. 2010). Suas larvas

toleramdiferentescondiçõesnosambientesaquáticos,comosalinidade,poluição

eturbidez(Faran1980).

Figura3:Distribuiçãoglobaldosprincipaisvetoresdemalária(Sinkaetal,2010).

1.2AsalivadeAnophelessp.

Durante a alimentação sanguínea, os mosquitos injetam no hospedeiro a

secreçãodesuasglândulassalivares.CadafêmeadeAnophelessp.apresentaduas

21

glândulas salivares, cada uma formada por três lobos (Figura 4), localizadas no

interiordoseutórax(Jariyapan&Choochote2007).

Figura 4: Glândula salivar de fêmea de Anopheles aquasalis. As glândulassalivares de anofelinos são compostas por dois lobos laterais (LL) e um lobomedial(LM)(Foto:KelMartins).

A saliva dos anofelinos, assim como a de outros artrópodes hematófagos,

apresenta moléculas importantes para o processo de hematofagia, como

inibidores de agregação plaquetária, anti-coagulantes e vasodilatadores.

Recentemente, com estudos de sialomas (transcriptomas e proteomas de

glândulassalivares)dessesinsetos,algumasdessasmoléculasforamidentificadas

ecaracterizadas(Titusetal.2006).

Anopheles albimanus apresenta em sua saliva um peptídeo de 6,5 kDa

denominado Anophelina. Esta molécula apresenta atividade inibidora de α-

trombina, proteína responsável pela clivagem de fibrinogênio e consequente

geração de fibrina para formação do coágulo sanguíneo. Assim, a Anophelina

constituiumimportantecomponentesalivardificultandoahemostasianolocalda

picada,favorecendoorepastosanguíneopelovetor(Valenzuelaetal.1999).

A proteína anti-plaquetária de Anopheles (AAPP), descrita na saliva de A.

stephensi, inibe fortemente a agregação plaquetária ligando-se ao colágeno

subendotelialdovasosanguíneolesadopelaspeçasbucaisdovetor.Destaforma,

bloqueia a adesão e ativação de plaquetas ao colágeno. Seus altos níveis de

expressão sugerem que a AAPP possui um importante papel na localização de

22

vasossanguíneosenaprevençãodahemostasia(Yoshidaetal.2008).Tambémna

salivadeA.stephensi, foi encontradaumaproteínada famíliaD7que liga-se em

tromboxanoA2eleucotrienos,atuandocomoinibidordeagregaçãoplaquetáriae

possivelmentecomoanti-inflamatório(Alvarengaetal.2010).

Outra importante molécula inibidora de agregação plaquetária, a enzima

apirase,jáfoidescritanasalivadeA.darlingi,A.gambiaeeA.dirus(Moreiraetal.

2001,Jariyapan&Choochote2007).AapiraseéumanucleotidasequeclivaATPe

ADP em AMP e fosfato inorgânico e desse modo inibe a agregação plaquetária

dependente de ADP (Ribeiro 1995). Mosquitos que tiveram o gene codificador

destaproteínasilenciadoporRNAinecessitaramdodobrodotempodemosquitos

normais para localizar vasos sanguíneos, retardando assim a hematofagia

(Boissonetal.2006).

O sialomadeA.gambiaemostrou que esta espécie demosquito apresenta

várias proteínas salivares relacionadas à hematofagia (como mucinas, que

lubrificamaspeçasbucaisdoinseto)eàdigestãodeproteínasedecarboidratos,

(comopeptidaseseglicosidases,respectivamente).Comensaiosdesilenciamento

gênico por RNAi, ficou demonstrada a importância de determinadas proteínas

salivaresnalocalizaçãodovasosanguíneoenosucessodahematofagia(Dasetal.

2010).

Recentemente, Francischetti et al (2014) relataram atividade de

hemaglutininanoextratodeglândulassalivaresdecincoespéciesdeanofelinos.O

extratodeglândulassalivaresdeA.gambiaeapresentouatividadesobrehemácias

de diversas espécies de vertebrados, como humanos, equinos e bovinos. Entre

outras funções, essas lectinas podem ser ingeridas durante a hematofagia,

aglutinando hemácias no intestino do mosquito e favorecendo o processo

digestivo(Francischettietal.2014).

Além da importância no processo hematofágico, alguns trabalhos têm

demonstradoa importânciadasalivadovetorna infecçãopelosesporozoítosde

Plasmodiumsp.Utilizandomodelosmurinos,Vaughanetal(1999)demonstraram

queesporozoítosdeP.bergueiinoculadosporpicadasdeA.stephensiforammais

infectantes que esporozoítos inoculados intravenosamente por injeção com

seringa. Rocha et al (2004) encontraram resultados semelhantes, observando

23

níveisaumentadosdeparasitemiaporP.gallinaceumemgalinhasinoculadascom

esporozoítosjuntamentecomsalivadeAedesfluviatilis.

Assimcomodemonstradoparaoutrasdoençastransmitidasporartrópodes,

comoleishmaniose(Oliveiraetal.2015)edoençadeLyme(Schuijtetal.2011a),a

pré-imunizaçãodecamundongoscomsalivadovetorA.stephensi,protegeuesses

animais contra a infecção por P. yoelii (Donovan et al. 2007). Estes resultados

fortalecem a ideia da utilização de antígenos salivares como componentes de

vacinasparadoençastransmitidasporartrópodes.

Osmecanismospelosquaisasalivadeflebotomíneosecarrapatosdogênero

Ixodes favorecem a infecção por Leishmania sp. e Borrelia burgdorferi,

respectivamente, vêm sendo elucidados há mais de duas décadas e várias

informações já foram adquiridas sobre a interação da saliva desses artrópodes

comoparasitoporelestransmitidoeosistemaimunedohospedeiro(Titusetal.

2006). Entretanto, há relativamente poucos trabalhos na literatura sobre a

interação da saliva de anofelinos com o sistema imune de vertebrados e os

processospelosquaiselapodeauxiliar nainfecçãopelosplasmódios.Ospoucos

trabalhos descritos até o momento foram realizados apenas com extrato de

glândulasouproteínasalivarrecombinantedeumaespécie,A.stephensi.

Owhashietal(2001,2008)demonstraramapresençadeumaglicoproteína

salivar de 200 kDa com atividade quimiotática para neutrófilos e eosinófilos,

contribuindo para a resposta inflamatória no local da picada. Demeure et al.

(2005) demonstraram que saliva de A. stephensi induz a degranulação de

mastócitos na pele de camundongos, provocando extravasamento de líquido e

rápida infiltração de neutrófilos. Em linhagens de camundongos deficientes de

mastócitos,essainfiltraçãonãofoiobservada,reforçandoopapeldosmastócitos

na resposta inflamatória provocada pela picada de anofelinos. O mesmo grupo

relatou a diminuição de respostas por linfócitos T na presença de extrato de

glândulasalivar invitroe invivo.Osautoresdemonstraramqueadiminuiçãoda

resposta de hipersensibilidade do tipo tardia foi dependente da ativação de

mastócitos e mediada por IL-10 (Depinay et al. 2006). Entretanto, não há

informação sobre outras possíveis atividades imunomoduladoras em outras

24

espécies de anofelinos, permanecendo as interações na infecção malárica um

campodepesquisapromissor.

1.4Osistemacomplemento

O sistema complemento (SC) é um dos principaismediadores da resposta

imuneinatadosvertebrados,formadoporcercade30proteínassolúveisnoplasma

ou associadas à superfície celular. Este sistema atua em esquema de cascata

proteolítica, sendo sua principal função o reconhecimento, opsonização e lise de

microrganismos invasores e células alteradas do hospedeiro (Sim& Laich 2000).

Possui também importante papel na resposta imune adaptativa, auxiliando a

apresentaçãodeantígenosetornandoarespostahumoralmaiseficiente(Morganet

al.2005).

Sua ativação se dá através de três vias: a clássica, a das lectinas e a

alternativa (Figura 5). A via clássica é ativada quando o componente C1q,

juntamentecomasserino-proteasesC1reC1s(complexoC1),seligamaanticorpos

IgM e IgG aderidos à superfície de patógenos invasores. Uma vez ativado, o

complexoC1écapazdeclivaroscomponentesC4eC2,eseusfragmentosmaiores,

C4beC2a,formamocomplexoC4b2asobreasuperfícieativadora.Estecomplexo

possui a capacidade de clivar o componente C3, omais importante e abundante

componentedosistemacomplemento,emC3aeC3b(Dunkelberger&Song2010).

O fragmento C3a é uma anafilotoxina, responsável pela quimiotaxia de

leucócitos, epelo recrutamentoedegranulaçãodemastócitos, causandoaumento

da permeabilidade vascular e facilitando a infiltração celular em pontos de

inflamação (DiScipio & Schraufstatter 2007). Já C3b é uma opsonina que liga-se

covalentemente à superfície ativadora. Esta opsonizaçãomarca o patógeno como

“estranho”,sinalizandoparaquecélulasdedefesaofagocitem.Alémdisso,C3bse

ligapróximoaocomplexoC4b2a,formandoaC5convertase(C4b2a3b),queclivao

componenteC5emC5aeC5b.Estedáinícioàmontagemdocomplexodeataqueà

membrana (CAM). C6 se liga ao C5b recém ativado e logo forma um grande

complexocompostoporC5b,C6,C7,C8eC9.DuranteamontagemdoCAM,várias

25

moléculas do componente C9 inserem-se na bicamada lipídica do patógeno,

formandoporosquelevamàlisecelular(Dunkelberger&Song2010).

Figura 5: Esquema representativo das três vias de ativação do sistemacomplemento.AviaclássicaéativadaquandoC1qseligaaanticorposaderidosao antígeno; a via das lectinas quando a lectina ligante de manana (MBL)encontra carboidratos específicos associados a patógenos; e a via alternativa éativada quando C3 sofre hidrólise espontânea e forma a C3-convertase inicialdestavianapresençados fatoresBeD.As trêsviasconvergemparaumpontocomum,aativaçãodocomponenteC3,eculminamcomaformaçãodoComplexode Ataque a Membrana, responsável pela formação de poros na membranacelular(AdaptadodeLewis&Ram2014).

Aviadas lectinas foi amais recentementedescrita.Elaéativadade forma

similar à via clássica, entretanto é independente de anticorpos. As moléculas de

ativação desta via são a lectina ligante de manana (MBL) ou ficolinas, que

reconhecem carboidratos específicos presentes na superfície de patógenos, como

manana, N- acetilglicosamina ou fucose. AMBL é semelhante estruturalmente ao

26

componenteC1qdavia clássica, e como tal, umavez ligadaaopatógeno, ativaas

proteasesMASP-1eMASP-2.Umavezativadas,asMASPsclivamC4eC2,formando

aC3convertaseC4b2a,queativaocomponenteC3,dandocontinuidadeàcascata

proteolíticaatéaformaçãodoCAM.MBLeMASPssãomuitomenosabundantesno

soroqueC1q,C1reC1s,tendo,portanto,umaimportânciamenordentrodosistema

complemento(Dunkelberger&Song2010).

Aviaalternativaé iniciadapelahidróliseespontâneadeC3, com formação

deC3bsolúvel(C3b-H2O),queseligaaocomponenteFatorB.Umavezassociados,o

complexo C3b-H2O-B é clivado pela serino-protease Fator D, que cliva o Fator B,

formandoC3b-H2O-Bbsolúvel.Esteprodutoécapazdeativaroutrasmoléculasde

C3.SealgumamoléculadeC3bseligaaumasuperfícieestranha,comoasuperfície

deumpatógeno,elavaicontinuarativaeécapazderecebermoléculasdoFatorB

que é imediatamente ativado a Bb, formando C3bBb (a C3-convertase da via

alternativa) sobre o organismo estranho (Dunkelberger e Song, 2010). Com a

ligaçãodemaisumamoléculadeC3b,forma-seaC5convertase(C3bBb3b)davia

alternativa, que ativa o componente C5. Este processo também culmina na

formaçãodoCAM.Estaviapodeseramplificadaatravésdaligaçãodeproperdinaà

C3-convertase. A properdina (ou Fator P) estabiliza o instável complexo C3bBb

funcionandocomoumaproteínaativadora, ligando-seaomesmo tempoemsítios

dos componentes C3b e Bb que impossibilitam a ação de reguladores negativos

destavia(Torreiraetal.2009).Porestaremconstanteativação,estaviaapresenta

reguladores negativos específicos, como Fator H e Fator I. O Fator H atua na C3

convertase removendo Bb do complexo C3bBb e servindo como cofator para a

proteólisemediadaporFatorI(Ricklinetal.2010).

1.5Inibiçãodosistemacomplementoporartrópodeshematófagos

O sistema complemento do hospedeiro exerce forte pressão evolutiva nos

parasitos, que por sua vez desenvolvem mecanismos de proteção contra a ação

deletériadosefeitosdessesistema.Exemplodissosãoosartrópodeshematófagos,

quedesenvolveraminibidoresdocomplementopresentesnasalivae/ouconteúdo

intestinal(Barrosetal.2009,Schroederetal.2009,Mendes-Sousaetal.2013).

27

A inibição do sistema complemento por um artrópode hematófago foi

descrita pela primeira vez em estudos com saliva de Ixodes dammini, onde

demonstrou-se que a saliva desse carrapato possui a capacidade de inibir a via

alternativa do complemento humano (Ribeiro 1987), além de inativar as

anafilotoxinas produzidas durante a ativação da cascata (Ribeiro & Spielman

1986). Valenzuela et al. (2000) purificaram, clonaram e expressaram a proteína

salivar anti-complemento de Ixodes scapularis (ISAC) e demonstraram que essa

molécula de 18,5 kDa é capaz de inibir apenas a via alternativa, inibindo a

deposiçãodeC3b e fatorB em superfícies ativadoras, alémde remover o fatorB

ligado anteriormente. A saliva de Ixodes ricinus também possui a capacidade de

inibiraviaalternativaeprevinea clivagemdoFatorBeC3 (Lawrieet al.2005).

Moléculassemelhantesà ISACforamencontradasemsuasalivaeatuamdemodo

parecido,inibindoaativaçãodosmesmoscomponentes(Couvreuretal.2008).

Estudandoainibiçãodocomplementoportriatomíneos,Barrosetal(2009)

observaramquetantoasalivaquantooconteúdointestinaldasespéciesTriatoma

infestans,T. brasiliensis eRhodniusprolixus foram capazes de atuar sobre as vias

clássicae alternativado complementohumano, causandodiminuição significativa

daatividadedessasvias.

JáasalivadeLutzomyialongipalpis,principalvetordeLeishmaniainfantum

nas Américas, possui atividade inibidora da via clássica e da via alternativa do

complementohumano(Cavalcanteetal.2003).Vale(2011)descreveuomecanismo

de ação do inibidor salivar da via clássica desse vetor. Através de cromatografia

líquida (HPLC) e testes imunoenzimáticos,mostrou tratar-se de uma proteína de

aproximadamente 11 kDaque atua ligando-se ao componenteC1q, bloqueando a

ativaçãodeC1reC1se,consequentemente,ofluxonormaldacascata.Alémdisso,

demonstroutambémqueaproteínarecombinanteLJM19,cuja formanaturalestá

presentenaglândulasalivardeL.longipalpis,apresentaamesmaaçãosobreavia

clássica do sistema complemento de seres humanos (Vale, 2011). Essa atividade

também foi observada sobre o SC de cães, ratos e cobaias (Mendes-Sousa et al.,

2013).

Recentemente, Khattab et al (2015) demonstraram que uma das formas

pelas quais fêmeas deAnophelesgambiae eA. stephensi se evadem do ataque do

28

sistema complemento ao nível de intestino, é através da ligação de fator H do

sanguedohospedeiroàscélulasintestinais.Osautoresmostrarampormicroscopia

confocal a ligação do regulador às células epiteliais do intestino do mosquito e

verificaram que mosquitos que se alimentaram com sangue contendo anticorpo

anti-Fator H apresentaram maior índice de mortalidade e menor índice de

fecundidade(Khattabetal,2015).Paranossoconhecimento,porém,nãohárelato

naliteraturadeinibidoresdosistemacomplementonasalivadeculicídeos.

Para os vetores hematófagos, a inibição do SC tem funções muito

importantes. Durante a hematofagia, essa ação levaria à diminuição parcial da

resposta inflamatória no local da picada devido à produção reduzida de

anafilotoxinas, diminuindo assim a percepção pelo hospedeiro e permitindo o

repastosanguíneocompleto(Schroederetal,2009).Adicionalmente,épossívelque

nolocaldapicadaosinibidoressalivaresreduzamconsideravelmenteaquantidade

de antígenos salivares opsonizados com C3b, diminuindo assim a produção de

anticorpos contraproteínas salivares,preservandosuaspropriedadesnecessárias

paraosucessodahematofagia(Barrosetal,2009).

Alémdisso,afunçãoaparentementemaisóbviadessesinibidoressalivaresé

aproteçãodoepitélio intestinalcontra injúriasmediadaspelocomplemento.Uma

vezqueotratodigestivodosinsetoséformadoporapenasumacamadadecélulas

(Billingsley 1990), o dano provocado pela ativação do complexo de ataque à

membranapoderialevaràsuarupturaemortedoinseto(Barrosetal,2009).

29

2.Justificativa Apesardosprogramasdecontroledamalária teremconseguidoreduzir

em torno de 45% a incidência da doença nomundo nos últimos quinze anos,

devidoàausênciadeumavacinaeficiente,daresistênciacrescentedosparasitos

aos anti-maláricos existentes e da pouca eficácia dos métodos de controle do

vetor em áreas endêmicas, a malária ainda constitui um sério e ameaçador

problemadesaúdepúblicanessasáreas(WHO,2014).

AnophelesalbimanuseA.aquasalissãoimportantesvetoresdemaláriana

América Latina e, entre as espécies de anofelinos neotropicais, são as mais

comumente mantidas em colônias de laboratório. Isso proporciona acesso a

essesinsetos,permitindosuautilizaçãoemtrabalhosdepesquisaemdiferentes

campos,comooestudodasuarespostaimuneàinfecçãoporPlasmodium(Bahia

et al. 2011), estudos de resistência a inseticidas (Molina & Figueroa 2009),

observaçõessobreseudesenvolvimentoembrionário(deCarvalhoetal.2002)e

investigações demoléculas salivares com função anti-homeostática (Ribeiro &

Nussenzveig1993,Valenzuelaetal.1999).

Entretanto, para nosso conhecimento, na literatura não consta trabalho

sobreainteraçãodasalivadessasespéciesdeAnophelescomosistemaimunedo

hospedeiro vertebrado, nem a identificação e caracterização de moléculas

salivares específicas envolvidas na interação vetor-sistema complemento,

constituindo assim um importante e promissor campo de pesquisa. A

caracterização de como os artrópodes hematófagos conseguem se evadir do

sistema do complemento tem sido tema de vários estudos (Schroeder et al,

2009) e tem constituído uma das linhas de pesquisa do nosso laboratório

(Cavalcante et al, 2003; Barros et al, 2009; Mendes-Sousa et al, 2013), na

tentativadeelucidaraslacunasnoconhecimentodasinteraçõesvetor-parasito-

hospedeirovertebrado.

Estudosvoltadosparaainteraçãodasalivadovetorcomosistemaimune

dehospedeirosfazem-seaindamaisnecessáriosdepoisdademonstraçãoinvivo

deproteçãocontrainfecçãoporPlamosdiumsp.conferidaatravésdaimunização

porpicadasdeanofelinosnãoinfectados(Donovanetal,2007).Observaçõesde

comoantígenossalivarescompotencialvacinalinteragemcomosistemaimune

30

de seres humanos são importantes para a determinação de sua utilização em

possíveisvacinas.

Considerando este contexto, o estudo da inibição do sistema

complemento pela saliva de mosquitos do gênero Anopheles é de grande

importância para um melhor entendimento da interação destes importantes

vetorescomohospedeirohumano.

31

3.Objetivos3.1ObjetivogeralDemonstrar e caracterizar a atividade inibidora do sistema complemento

humano presente na saliva de Anopheles albimanus, A. aquasalis, A. dirus, A.

freeborni,A.gambiaeeA.stephensi.

3.2Objetivosespecíficos

3.2.1 Avaliar se o extrato de glândulas salivares (EGS) deAnopheles spp. é

capazdeinibirasviasclássica,das lectinasealternativadosistemacomplemento

humano;

3.2.2AvaliaroefeitodoEGSsobrecomponentesespecíficosdaviaalternativa;

3.2.3 Identificar, clonar e expressar possíveis moléculas salivares com

atividadeinibidoradosistemacomplemento;

3.2.4Produziranticorpocontrapossíveisinibidoressalivareseavaliarsua

capacidadedebloquearaatividadeanti-complementodosmesmos;

3.2.5Investigaromecanismodeaçãodepossíveisinibidoressalivares.

32

4.MaterialeMétodos

4.1Aprovaçãoemcomitêdeética

Os experimentos realizados neste estudo foram conduzidos de acordo

comosprincípioséticosdeexperimentaçãoanimaldaUniversidadeFederalde

MinasGeraisedoInstitutoNacionaldeSaúdedosEstadosUnidos.Estetrabalho

foi aprovado pelo Comitê de Ética emExperimentaçãoAnimal (CETEA/UFMG)

sob número de protocolo número 087/11, e pelo Comitê de Uso e Cuidado

AnimaldoNIH,comIDdeaprovaçãoASP-LMVR3.

4.2Criaçãodosmosquitoseobtençãodeextratodeglândulassalivares(EGS)

OsmosquitospertencentesàsespéciesAnophelesalbimanus,A.gambiae,

A. dirus, A. stephensi e A. freeborni foram mantidos em colônias fechadas em

insetáriosnoLaboratóriodePesquisadeMaláriaeVetores(LMVR)doInstituto

Nacional de Saúde (NIH), Estados Unidos, sob a coordenação do Sr. Andre

Laughinhouse.Osinsetosadultoserammantidosemgaiolascilíndricascomtela

napartesuperior,ondechumaçosdealgodãoembebidosemsoluçãodexarope

Karo® 10% eram oferecidos aos mosquitos. Galinhas imobilizadas eram

colocadas sobre a tela das gaiolas para que as fêmeas realizassem o repasto

sanguíneo.As formas imaturas(ovos, larvasepupas)erammantidasemcubas

de plástico, contendo água da torneira. As condições climáticas dos insetários

erampreservadasa27oCe75%deumidade.

Os mosquitos das espécies Anopheles aquasalis e Aedes aegypti foram

criadosnoinsetáriodoLaboratóriodeMalária(LAMAL),noCentrodePesquisa

RenéRachou–CPqRR/FIOCRUZ,sobacoordenaçãodoDr.LucianoMoreira.Para

a criaçãodeA.aquasalis, gaiolas cilíndricasdepapelão (Barripel®) coma face

superior telada eram utilizadas para manter os insetos adultos. Bolinhas de

algodão com solução de açúcar 10% e camundongos anestesiados eram

utilizadosparasuaalimentação.Asformasimaturaserammantidasemcubasde

plástico contendo água do mar diluída 1:10. Para a criação de A. aegypti, os

33

adultos eram mantidos em gaiolas quadriculares de plástico com as laterais

teladas(BugDorm®)contendobolinhasdealgodãocomsoluçãodeaçúcar10%.

Asformasimaturaseramcriadasemcubascontendoáguafiltradaedesclorada.

Os insetários de criação das duas espécies eram mantidos a 27oC e

aproximadamente80%deumidade.

ParaobtençãodoEGS,fêmeasde4a8diasnãoalimentadascomsangue

foramdissecadasemlâminadevidroescavadacontendoPBSousoluçãosalina

0,9%, com auxílio demicroscópio estereoscópico e estiletes entomológicos. As

glândulassalivaresforamcoletadasetransferidasparatubosde1,5mlcontendo

solução específica para o teste a ser realizado emantidos constantemente em

gelo.Ostubosforamentãosonicadospor60segundosecentrifugadosa10.000g

por10minutosa4oC.Osobrenadanteerautilizadonosensaios.Aconcentração

de proteínas nos extratos de glândulas salivares foi medida pelo método de

Bradford (Bradford 1976) ou pelo kit BCA (Thermo Scientific®), ambos

baseados em uma curva padrão de albumina de soro bovino, seguindo as

orientaçõesdomanualdeinstruções.

4.3Ensaiohemolítico(BaseadoemMendes-Sousaetal.,2013)

Nos testes de hemólise mediada pela via alternativa do SC, foram

utilizadas hemácias de coelho coletadas por punção da veia auricular de um

animalmantidonobiotériodoInstitutodeCiênciasBiológicasdaUFMG(paraos

ensaios com EGS de A. aquasalis) ou obtidas comercialmente da empresa

CompTech® (para os ensaios comEGSdas demais espécies). As células foram

lavadastrêsvezescomsoluçãoMg-EGTA(HEPES1mM,NaCl30mM,EGTA10

mM,MgCl27mM,glicose3%,gelatina0,02%,pH7,4)atravésdecentrifugaçãoa

600gpor5minutosa4ºCseguidadedescartedosobrenadanteeressuspensão

dashemáciasem1mldeMg-EGTA.Antesdosexperimentos,aconcentraçãodas

célulasfoiajustadapara1x108células/ml

Para os ensaios com EGS deA. aquasalis, foi utilizado um poolde soro

humanoprovenientedacoletadesanguededoadoresvoluntáriossaudáveisno

Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos (Departamento de

34

Parasitologia,ICB,UFMG).Nosensaioscomasoutrasespécies,foiutilizadosoro

humano normal adquirido da CompTech®. Em ambos os casos, o soro foi

aliquotadoemantidoa-80oCatéarealizaçãodosexperimentos,sendoquecada

alíquotafoiutilizadaapenasumavez.

Emtubosde1,5ml,foramadicionados25μldesorohumanodiluído1:20

emMg-EGTAjuntamentecom12,5μldePBScontendoaconcentraçãodesejada

deEGS.Emseguida,foramadicionados25µldesoluçãodehemáciaseostubos

foramentãoincubadosa37ºCpor30minutosparaaativaçãodocomplemento.

Apósa incubação,250µldePBSgelado foramacrescentadosa cada tubopara

parar a reação de hemólise. Após centrifugação a 1700 g por 30 segundos,

transferiu-se200µldosobrenadanteparaumaplacade96poços,paraserlida

em leitor de ELISA (Bio-Rad Benchmark®) a 415nm. Exclusivamente com A.

albimanus, foram realizados ensaios com EGS (quantidade referente a 4

glândulas)aquecidoemáguaferventepor30minutosouincubadopor3horasa

37oCcom0,2μgdeproteinaseK.

Emcadateste,foramutilizadostrêscontroles:controlehemólisetotal,no

qual eram acrescidos 250 µl de água destilada fria após a incubação a 37oC;

hemólise espontânea (controle negativo), no qual não havia adição de soro,

apenas25μldeMg-EGTA;ehemólisepelocomplemento(controlepositivo),no

qual era acrescentado soro, mas não havia adição de EGS. Os testes foram

realizadosemduplicata,comnomínimotrêsrepetições.Paraanálisedosdados,

a média dos controles negativos era subtraída dos demais resultados e os

mesmos transformadosemporcentagemdehemólise, considerandoo controle

positivocomo100%deatividadehemolítica.

Nos ensaios com a via clássica, foram utilizadas hemácias de carneiro.

Para os experimentos com EGS de A. aquasalis, foi coletado sangue da veia

jugular de um carneiro adulto mantido no ICB. O sangue era imediatamente

misturadocomsoluçãoconservadora(ácidocítrico0,05%,citratodesódio0,8%,

glicose2,05%,NaCl0,42%)naproporção1:1earmazenadoa4oC.Parapreparo

dashemácias,1mldo sangue foi centrifugadoa600gpor5minutosa4oCeo

sobrenadante descartado. As células precipitadas foram ressuspendidas e

homogeneizadas em1ml de soluçãoGHB-EDTA (HEPES5mM,NaCl 145mM,

35

EDTA 10mM e gelatina 0,1%, pH 7,4) e centrifugadas novamente. Apósmais

duas lavagens semelhantes, as células foram ressuspendidas em1ml deGHB-

EDTAeopsonizadascomanticorpoIgGanti-hemáciadecarneiroproduzidoem

coelho(Sigma®)diluído1:1000durante incubaçãoa37ºCpor30minutossob

leve agitação. Após a sensibilização, as células foram lavadas uma vez com

soluçãoGHB-EDTAe,emseguida,duasvezescomsoluçãoGHB2+(HEPES5mM,

NaCl 145mM, CaCl2 0,15mM,MgCl2 0,5mM e gelatina 0,1%, pH 7,4). Após a

últimalavagem,aconcentraçãodashemáciasfoiajustadapara2x108células/ml

em solução GHB2+. Para os experimentos com EGS das outras espécies de

mosquitos foram utilizadas hemácias de carneiro opsonizadas com anticorpo

adquiridas da CompTech®. Essas células foram lavadas três vezes em solução

GVB2+(gelatina0.1%,veronal5mM,NaCl145mM,NaN30.025%,CaCl20.15mM,

MgCl2 0, 5mM, pH 7,3) (CompTech®), como descritas anteriormente e a

concentraçãoajustadapara2x108células/ml.Orestantedosexperimentosse

deucomodescritoparaaviaalternativa,utilizandosorohumanodiluído1:60em

solução GHB2+ (nos ensaios com A. aquasalis) ou GVB2+ (nos ensaios com as

outrasespécies).

4.4Ensaiodeativaçãodaviadaslectinas(BaseadoemBergströmetal.2009)

PoçosdeumaplacadeELISA(Costar®)foramsensibilizadosovernighta

4ºCcom50μldetampãocarbonatodesódio35mMebicarbonatodesódio15

mMpH9,6 contendo100μg/mldemananaobtidadeSaccharomycescerevisiae

(Sigma®)ouBSA1%(controlenegativo).Ospoçosforamentãoincubadoscom

200μlde soluçãodebloqueio (PBS+BSA1%)porumahoraem temperatura

ambientesobleveagitação.Emseguida,foiadicionadosorohumanonormal1%

(diluídoemtampãoGVB2+)juntamentecomdiferentesconcentraçõesdeEGSde

A. albimanus (volume final de 100 μl por poço) e a placa incubada por 30

minutosa37oC.

Após a incubação, os poços foram lavados duas vezes com 200 μl de

soluçãodelavagem(PBS-Tw0,05%)sobagitaçãopordoisminutoseemseguida

incubados com 50 μl de solução de bloqueio contendo anticorpo anti-C3

36

(CompTech®) 1:1000 por 60 minutos em temperatura ambiente sob leve

agitação.

Depoisdemaisduaslavagens,ospoçosforamincubadossobagitaçãopor

60 minutos em temperatura ambiente com 50 μl de solução de bloqueio

contendo anticorpo anti-cabra conjugado com peroxidase (Sigma®) diluído

1:1500. Em seguida, os poços foram lavados novamente e 200 μl de tampão

citratodesódio50mMefosfatodesódio50mMpH5,0contendoOPD(Sigma®)

1mg/ml e peróxido de hidrogênio 0,075% foram adicionados aos poços para

revelaçãodaplaca.Aleiturafoifeitaa450nmnomodocinéticopor10minutos

a37oCemleitordeELISA(Bio-RadBenchmark®),utilizandoosoftwareSoftMax

Pro5.2.

Poços sensibilizados comBSA1%epoços sensibilizados commananae

incubados apenas com soro (sem EGS) foram utilizados como controles

negativos e positivos, respectivamente. Os ensaios foram realizados em

duplicata,compelomenostrêsrepetições.Paraocálculoestatístico,foicalculada

amédiadecadaduplicataeamédiadocontrolenegativosubtraídadasdemais.

OsresultadosforamexpressoscomoporcentagemdeativaçãodeC3daviadas

lectinas,considerandoocontrolepositivocomo100%deativação.

4.5Ensaiodedeposiçãodecomponentesdaviaalternativaemplacascobertas

comagarose(BaseadoemMendes-Sousaetal.,2013)

Placasde96poços (Costar®) foramcobertas com100μlde soluçãode

agarose0,1%edeixadassecara37ºCovernightparaaformaçãodeumapelícula

de agarose no fundo do poço. Então foram adicionados 20 µl de soro humano

normaldiluído1:5emsoluçãoHMEBN(HEPES5mM,MgCl27mM,EGTA10mM,

BSA5mg/ml,NaCl140mM,pH7,4), juntamentecomEGSdeA.aquasalisouA.

albimanusem80µldeHMEBN,totalizandoassim100µldevolumenopoço,ea

placaincubadaa37oCpor30minutos.

Emseguida,ospoçosforamlavadosduasvezescom200µldesoluçãode

lavagem(Tris10mM,NaCl140mMeBSA0,1%)pordoisminutossobagitaçãoe

foram adicionados 50 µl de anticorpo anti-C3 (CompTech®), anti-Fator B

37

(CompTech®) ou anti-Properdina (CompTech®) diluídos 1:1000, 1:500 e

1:1000, respectivamente, em solução contendoHEPES 10mM eNaCl 140mM

(pH 7,4) e a placa incubada por 30 minutos em temperatura ambiente sob

agitação.Apósduas lavagens, os poços foram tratados com50µl de anticorpo

anti-cabra conjugado com peroxidase (Sigma®) diluído 1:1500 na mesma

soluçãoe incubadosnovamentepor30minutosem temperaturaambientesob

agitação.Orestantedoensaiosedeucomodescritoparaoensaiodeativaçãoda

viadaslectinas,utilizandopoçosincubadossemsoroepoçosincubadosapenas

com soro (sem EGS ou proteína recombinante) como controles negativos e

positivos,respectivamente.Osensaiosforamrealizadosemduplicatae,emcada

ensaio, amédia do controle negativo foi subtraída dasmédias das velocidades

máximasdas reaçõesdocontrolepositivoedospoçoscom inibidor salivar.Os

resultados foram então transformados em porcentagem de deposição de cada

componente,considerandoocontrolepositivocomo100%dedeposição.

Para investigar se os inibidores salivares deA.aquasalis eA.albimanus

eram capazes de desligar componentes da via alternativa previamente

depositados sobre superfície ativadora, realizamos ensaios de deposição como

descritosacima,mascomalgumasmodificações.Inicialmente,foramadicionados

100μldeSHNdiluídoemHMEBN(SHN7%nosensaioscomA.aquasalise4%

nos ensaios comA.albimanus) e aplaca incubadaa37°Cpor30minutospara

ativaçãodaviaalternativaedeposiçãodosseuscomponentesnofundodopoço.

Apósduaslavagenscom200μldomesmotampão,100μldeHMEBNcontendo

EGS relativo a 15 glândulasdeA.aquasalis ou concentração final de20nMde

proteína recombinante deA.albimanus foram adicionados aos poços e a placa

incubada novamente por 30 minutos a 37°C. Poços incubados apenas com

tampãoforamutilizadoscomocontrolenegativo.Nosensaioscomoinibidorde

A. albimanus, 100 μg de Fator H purificado (CompTech) também foi utilizado

como controle para o desligamento de Fator B. Após mais duas lavagens,

anticorpoanti-FatorB,anti-C3ouanti-properdina foiadicionadoaospoçoseo

restantedoensaioocorreucomodescritoparaosensaiosdedeposição.

38

4.6WesternblotparadetecçãodeFatorBeC3a(BaseadoemLawrieetal.,2005)

Ensaiosdehemólisepelaviaalternativacomodescritosnoitem4.3foram

realizados utilizando apenas quantidade de EGS referente a 4 ou 15 glândulas

salivares(nosensaioscomA.albimanusouA.aquasalis,respectivamente)esoro

humanonormaldiluído1:35emMg-EGTA.Tubos comadiçãodePBS semEGS

foramutilizadoscomocontrolespositivos.Ostubosforamincubadosa37oCeem

diferentestemposdeincubação(tempos0’e30’,nosensaioscomA.aquasalis;e

tempos0’,30’e60’,nosensaioscomA.albimanus),foramcentrifugadosa1700g

por 30 segundos, e uma alíquota de 5 μl do sobrenadante foi coletado e

misturadocomtampãodaamostra4vezesconcentrado(LifeTechnologies®)e

agente redutor 10 vezes concentrado (Life Technologies®). Os tubos foram

então aquecidos a 90oC por 5 minutos e seu conteúdo aplicado em gel de

poliacrilamida 4-10%. Em cada gel, foi utilizado 10 ng de Bb ou 5 ng de C3a

purificados(CompTech®),umpoçoapenascomsorodiluído1:35nãoincubado

a 37°C e umpadrão de bandas pré-corado (SeeBlue Pre stained, Invitrogen®)

que,juntamentecomasamostras,correramporaproximadamente30minutosa

200V.

Após a corrida, as proteínas do gel foram transferidas para uma

membranadenitroceluloseduranteumahoraa30Ve,logoapósatransferência,

amembranafoibloqueadaovernightcomsoluçãobloqueadora(PBS-Tw0,05%+

leite em pó desnatado 10%) em constante agitação. Seguindo o bloqueio, a

membrana foi lavada três vezes por cinco minutos com PBS-Tw 0,05% e

incubada por uma hora em temperatura ambiente sob agitação com anticorpo

anti-FatorBouanti-C3a(CompTech®),ambosdiluídos1:1000emPBS-Tw+1%

BSA. Após mais três lavagens, a membrana foi incubada por uma hora com

anticorpoanti-cabra(nosensaiosparadetecçãodeFatorB)diluído1:2000em

PBS-Tw + 1% BSA ou anticorpo anti-coelho (ensaios para detecção de C3a)

diluído 1:3000 na mesma solução. Ambos anticorpos secundários eram

conjugados com peroxidase. Após a incubação, as membranas foram lavadas

maistrêsvezesearevelaçãodasbandasdeFatorBeC3asedeuutilizandookit

39

Peroxidase Substrate DAB (Vector Laboratories®), seguindo as instruções do

fabricante.

Para investigar a ação da saliva de A. albimanus na formação da C3

convertase da via alternativa, 200 ng de C3b purificado, 0,5 ng de Fator D

purificadoe0,5μgdeFatorBpurificado (CompTech®)em20μl deMg-EGTA

foram incubadosa37oC juntamente com20μldomesmo tampãocomou sem

EGSreferentea4glândulas.Nostempos0’,20’e40’deincubação,umaalíquota

dostubosfoicoletadaemisturadacomtampãodaamostraeagenteredutor.O

material foi então aquecido a 95oC por cinco minutos e corrido em gel de

poliacrilamida4-10%.

AativaçãodocomponenteFatorB (surgimentodasbandas referentesa

BbeBa)foiavaliadaatravésdeWesternblotrealizadocomodescritoacima.

4.7PurificaçãoeidentificaçãodoinibidorsalivardeA.albimanus

ParapurificaroinibidordocomplementodeA.albimanus,200glândulas

salivaresdefêmeasentre4e8diasdevidanãoalimentadascomsangueforam

dissecadasearmazenadasem100μldePBS.Omaterialfoisonicadopor30a60

segundos, centrifugado a 10.000 g por 10 minutos a 4oC e o sobrenadante

coletado. Uma alíquota do material coletado foi testada em ensaio hemolítico

paraconfirmarapresençadoinibidor.Orestantefoisubmetidoacromatografia

líquidadealtaeficiência(HPLC)usandoumacolunadefasereversa(Source15

RPC 3ml, GE Healthcare®) conectada em sistema ÄKTA Purifier (GE

Healthcare®).Acoluna foiequilibradacomtampãoTBS (50mMTris,150mM

NaCl) pH 7,4 (Tampão A) num fluxo de 1 ml/min e nossa amostra foi então

aplicada.Asproteínasforameluídasdeacordocomsuahidrofobicidade,usando

gradiente (0 a 100%) de acetonitrila contendo 0,1% de ácido trifluoroacético

(Tampão B) num fluxo de 1 ml/min e coletadas em frações de 250 μL. A

concentraçãodeproteínasfoiavaliadaa220nm,utilizandoosoftwareUnicorn

5.0(GEHealthcare®).

As frações coletadas foram centrifugadas em SpeedVac-SC 110 (Savant

Instruments®)a45oCpor3horasparacompletaevaporaçãodotampãoBe,em

40

seguida, resolubilizadas em 100 μl de PBS. Uma alíquota de 12,5 μl de cada

fração foi testada em ensaio hemolítico como descrito anteriormente para

identificar atividade inibidora da via alternativa. As frações que apresentaram

atividadeeassuasadjacentes, tiveramumaalíquotacoletadaemisturadacom

tampão da amostra e agente redutor, aquecidas a 95oC por cinco minutos,

corridas em gel de poliacrilamida (4-10%) e coradas com prata usando o kit

SilverQuest(Invitrogen®),seguindooseumanualdeinstruções.

Para identificação do inibidor, inicialmente a fração 1H12 inteira foi

enviada para a plataforma de espectrometria demassa noNIH. Omaterial foi

submetido a digestão por tripsina e os peptídeos gerados submetidos a

cromatografia líquida em nano-escala associada a espectrometria de massa

simultânea(nanoLC-MS/MS).Asproteínasencontradasnafraçãoenviadaforam

identificadas a partir de comparações com os bancos de dados disponíveis

(genoma e transcriptoma) no site do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) ou

VectorBase (www.vectorbase.org). Em um segundo momento, apenas uma

bandaentre6e14kDaqueapareciaexclusivamentenasfraçõescomatividade

foisubmetidaàanálisedeespectrometriademassa.

Aproteínaidentificadanosresultadosdaespectrometriacomooinibidor

salivar de A. albimanus foi encontrada no banco de dados do VectorBase e a

similaridade com proteínas de outras espécies de anofelinos foi investigada

atravésdeBLASTnomesmositeounoNCBI.Paraaverificaçãodapresençade

peptídeosinaledepossíveisdomíniosconhecidosdaproteína,foramutilizados

os softwares SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) e

Pfam (http://pfam.xfam.org/), respectivamente. Para o alinhamento das

sequências de proteínas e desenho da árvore filogenética foram utilizados o

UniProt (http://www.uniprot.org/align/) e o PhyML (Seaview®),

respectivamente. Para investigar demais características dos genes e das

proteínas,foiutilizadoosoftwareDNAstarLasergene®.

41

4.8 RT-PCR para detecção do gene da proteína gSG7 em extrato de glândulas

salivaresdeA.albimanus

ParaconfirmarapresençadogenereferenteàproteínagSG7noextrato

de glândulas salivares de A. albimanus, foram sintetizados primers para a

sequência deste gene: albigsg7FOR1 (5’ GACAGTCATATTGCCGTTGG) e

albigsg7REV3 (5’ AACATGCGCTTTGCATACAG). Esses primers originam um

ampliconde477pb.

Inicialmente, foram dissecadas 50 glândulas salivares de fêmeas de A.

albimanus com 5 dias de vida não alimentadas com sangue. O material foi

dissecado e transferido imediatamente para 50 μl de Trizol® Reagent (Life

Technologies®). Após homogeneização do material com pistilo estéril, foi

realizadaextraçãodeRNAtotalseguindooprotocolodoTrizol®.Otubocomo

RNAextraído foi secado totalmente emSpeedVac e, em seguida, omaterial foi

dissolvidoem20μldeáguaultrapura(UltraPureDNAse/RNAseFreeDistilled

Water,LifeTechnologies®).

Utilizando o kit QuantiTect® Reverse Transcription kit (QIAGEN®),

produziu-se o DNA complementar (cDNA) a partir de 5 μl de RNA extraído,

seguindoomanualdeinstruçõesdokit,comumaalteração:aoinvésdeutilizaro

RTPrimerMixdokit,utilizamosoprimeralbigsg7REV3paraqueapenasoDNA

complementardanossasequênciafossegerado.

SeguindoomanualdeinstruçõesdoKitFastStartPCRMaster(Roche®),

comosprimersdescritosacimaeocDNAproduzidocomomolde, foi realizada

PCRparaverificar apresençadogenede interesse.Tubos comáguaultrapura

comomolde, sem cDNA, foramutilizados como controle negativo. Os ciclos da

reaçãosãoapresentadosnoQuadro1.

Nove microlitros dos produtos da PCR foram misturados com 1 μl de

tampãodaamostra10x (Invitrogen®),aplicadosemgeldeagarose1,2%com

SYBRSafestain(Invitrogen®)ecorridospor30minutosa100V.Comopadrão

depesomolecular,foiutilizadooGeneRuler1kb(ThermaScientific®).Apósa

corrida,ogelfoivisualizadoefotografadoemaparelhotransiluminadorcomluz

UV.

42

Quadro1:CiclosdetemperaturautilizadosnasreaçõesdePCRparaamplificaçãodogenedagSG7deA.albimanus

Ciclos Temperatura(ºC) Tempo

Desnaturação 1 95 4min

DesnaturaçãoAnelamentoAlongamento

30 955972

30seg30seg2min

Extensãofinal 1 72 7min

4.9 Clonagem, expressão e purificação das proteínas gSG7 e gSG7-2 de A.

albimanusegSG7deA.darlingi(BaseadoemAlvarengaetal.,2010)

GenessintéticosotimizadosdasproteínasgSG7egSG7-2deA.albimanus

e gSG7deA.darlingi sem a sequência do peptídeo sinal (Figura 6) ligados em

vetor Pet17b foramproduzidos (BioBasic®) e expressos emE. coli BL21 pLys

(NewEnglandBioLabs®).

SequênciadogenesintéticodagSG7deA.albimanus:

SequênciadogenesintéticodagSG7-2deA.albimanus:

43

SequênciadogenesintéticodagSG7deA.darlingi:

Figura 6: Sequências dos genes sintéticos utilizados para clonagem eexpressãodeproteínasrecombinantesdeA.albimanuseA.darlingi.

Asbactériasforamtransformadasporchoquetérmico(mantidasemgelo

por15minutos, transferidasparabanho-mariaa42ºCpor30segundose, logo

em seguida,mantidas emgelo novamente), transferidas para placa de ágar LB

contendoampicilina100μg/ml(KDMedical®)eincubadasovernighta37oC.As

colônias crescidas foram transferidas para um frasco com 50 ml de meio LB

Broth (KD Medical®) contendo 50 μl de ampicilina 100 mg/ml e 50 μl de

cloranfenicol35mg/mleincubadasa37oCovernight.

Quatrogarrafascom1litrodemeioLBcontendoampicilina100μg/mle

cloranfenicol 35 μg/ml foram semeadas com 10 ml da cultura crescida e

incubadasatéaconcentraçãodebactériasatingirA600de0,6a0,8.Emseguidaas

culturas foram induzidas com 1ml de IPTG 1M (Invitrogen®) e incubadas a

37oCpor3horas.Apósaincubação,asculturasforamcentrifugadasa7000rpm

por 15 minutos a 10oC e o sobrenadante descartado. O pellet formado foi

resolubilizado em 150 ml de TBS e centrifugado da mesma forma. O

sobrenadantefoidescartado,eopelletformadocongeladoa-20oCovernight.

Apósdescongelar,opelletfoiresolubilizadoem150mldeTBS,sonicado

em sonicador de ponta por aproximadamente 1minuto e centrifugado por 15

minutos a 7000 rpm a 10oC. O sobrenadante foi descartado e o pellet

resolubilizado, sonicado e centrifugado novamente. O pellet formado foi então

resolubilizadoem100mldeTBScontendo1gdeTritonX-100(Sigma-Aldrich®)

e agitado combarramagnética por 30minutos em temperatura ambiente. Em

seguida, o material foi centrifugado como anteriormente, o sobrenadante

descartadoeopelletresolubilizadoem100mldeTBS.Estalavagemfoirepetida

44

maisduasvezeseapósaultimacentrifugação,opelletfoiredissolvidoem50ml

detampãoTris20mMpH8,0contendohidrocloretodeguanidina(Invitrogen®)

6Meincubadopor1horaemtemperaturaambientesobagitaçãoconstante.Em

seguida, foi adicionado ditiotreitol (DTT) (Sigma-Aldrich®) na concentração

finalde10mMeo frasco incubadopor30minutossobagitaçãoconstanteem

temperatura ambiente. Após esse período, o material desnaturado pela

guanidina e pelo DTT foi adicionado gota a gota a 4 litros de tampão de

renovelamento(Trizma20mM,arginina300mM,dihidrocloretodecistamina2

mM,pH9,2)sempreemagitaçãocombarramagnéticae,emseguida, incubado

overnighta4oC.Asproteínasrenoveladasforamconcentradasusandoaparatode

concentração Millipore® pressionado por nitrogênio e filtro de 10 kDa

(MilliporeUltracell®)atéatingirovolumefinaldeaproximadamente10ml.

Parapurificaçãodasproteínas, omaterial foi aplicadoemcolunade gel

filtração HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR (GE Healthcare®) conectada em

aparelhodeHPLC(ÄKTAPurifier,GEHealthcare®)easproteínascoletadasem

fraçõesde4mldeTBSpH7,4.UmaalíquotadecadafraçãofoicorridaemSDS-

PAGE, corado comComassie blue. As frações contendo a proteína de interesse

forammisturadaseconcentradasparaaproximadamente10mlusandofiltrode

10 kDa (Amicon®). As proteínas concentradas foram novamente purificadas

usando coluna de gel filtração Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare®) e a

purezadaproteínaavaliadaporSDS-PAGEcoradocomComassieblue.Asfrações

contendo a proteína de interesse foram misturadas, concentradas e a

concentraçãofinalcalculadapelocoeficientedeextinçãomolardecadaproteína.

Asproteínaspurificadasforamtestadasnosensaioshemolíticosparavia

alternativaeviaclássica,ensaiosdedeposiçãodecomponentesdocomplemento

(C3, Fator B, properdina e C9) e Western blots, como descritos previamente,

substituindooEGSpelasproteínasrecombinantes.

4.10IdentificaçãodoinibidordocomplementodasalivadeA.aquasalis

Em gel de poliacrilamida 12,5% foram corridos 0,5 μg de gSG7

recombinantedeA.albimanus,0,5μgdegSG7recombinantedeA.darlingie5μg

45

deEGSdeA.aquasaliseogelcoradocomprataparavisualizaçãodasproteínas

presentes.

Paraaidentificaçãodopossível inibidorsalivardeA.aquasalis,umnovo

gelfoicorridocom20μgdeEGSdessaespéciee10μgdegSG7recombinantede

A.darlingiecoradocomComassieblue.Aproteínarecombinanteeumaproteína

do EGS deA. aquasalis com peso similar foram cortadas do gel com ajuda de

bisturi,transferidasparatubosde1,5mletratadascombicarbonatodeamônio,

acetonitrila e iodoacetamina para descorar a banda e desidratar o gel. Em

seguida,asproteínasforamsubmetidasadigestãoportripsinaa37°Covernight.

Os peptídeos gerados pela tripsinização foram então sequenciados em

aparelho MALDI-TOF-TOF (Bruker®) mantido no Instituto de Ciências

BiológicasdaUFMG,utilizandoosoftwareMASCOT.Assequênciasdospeptídeos

gerados das duas amostras foram comparados com a sequência da gSG7 deA.

darlingi,utilizandoosoftwareUniProt(http://www.uniprot.org/align/).

4.11Westernbloteensaiohemolíticocomanticorpoanti-gSG7deA.albimanus

Anticorpos anti-gSG7 foram produzidos pela Spring Valley Laboratories

(Woodbine,Maryland,EUA),emcoelhoimunizadocomaproteínarecombinante

juntamente com adjuvante de Freunds. Após três imunizações, o animal foi

sangradoeseusorofoicoletadoeenviadoaoLaboratóriodePesquisadeMalária

eVetores.

Para purificação de IgG do soro, foi utilizado coluna de proteína A

(HiTrapTM 5 ml Protein A HP, GE Healthcare®), seguindo o seu manual de

instruções. O IgG purificado foi então testado por Western blot para ver o

reconhecimentodaproteínarecombinanteedaproteínapresentenoEGS.Para

isso, quantidade de EGS relativo a 20 glândulas salivares de fêmeas de A.

albimanus e 0,2 μg da proteína recombinante gSG7 foram corridos em gel de

poliacrilamida(4-12%)a200Vpor30minutos.Antesdeaplicadosnogel,oEGS

ouarecombinanteforammisturadoscomtampãodaamostraeagenteredutore

aquecidaspor5minutosa95ºC.

46

Apósacorrida,asproteínasdogelforamtransferidasparamembranade

nitrocelulose,quefoibloqueadaporduashorascomsoluçãobloqueadora(PBS-

Tw 0,05% + leite em pó desnatado 10%) em agitação constante. Seguindo o

bloqueio, a membrana foi lavada três vezes por cinco minutos com PBS-Tw

0,05% e incubada por uma hora em temperatura ambiente com IgG anti-gSG7

diluído 1:10000 em PBS + 1% BSA. Apósmais três lavagens, amembrana foi

incubada por uma hora com anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase

diluído 1:5000 na mesma solução. Após a incubação, as membranas foram

lavadasmaistrêsvezesearevelaçãosedeuutilizandookitPeroxidaseSubstrate

DAB(VectorLaboratories®).

Para verificar se o IgG anti-gSG7 de A. albimanus reconheceria outras

proteínassalivaresdeoutrasespéciesdemosquitos,foramaplicadosecorridos

emgeldepoliacrilamida12,5%,0,5μgdegSG7deA.albimanus,0,5μgdegSG7-2

de A. albimanus, 0,5 μg de gSG7 de A. darlingi, 5 μg de EGS de fêmeas de A.

aquasalise5μgdeEGSdefêmeasdeAedesaegypti.OWesternblotfoirealizado

como descrito acima, utilizando anticorpos primário e secundário diluídos

1:2000.

ParaavaliaracapacidadedoanticorpodebloquearaatividadedagSG7de

A.albimanus,ensaioshemolíticosforamrealizadosnapresençadoIgGanti-gSG7.

Emumtubode1,5ml,foramadicionados12,5μldePBScontendoEGSreferente

a1glândulasalivarougSG7naconcentraçãode30nM(concentraçãofinalde5

nM no tubo) e, em seguida, misturados com 12,5 μl de Mg-EGTA contendo

diferentesdiluiçõesdoIgGanti-gSG7.Apósadiçãode25μldesorodiluído1:20e

25μldehemáciasdecoelhosnaconcentraçãode1x108céls/ml,oconteúdodos

tubos foi homogeneizado e incubado a 37ºC por 30 minutos. Um controle foi

adicionado aos experimentos: um tubo com apenas hemácias e IgG anti-gSG7

diluído1:10(concentraçãomaisaltatestada),paraaveriguarseoanticorpopor

si só afetaria as hemácias. O restante do ensaio se deu como descrito

previamentenoItem4.3.

47

4.12 ELISA para detectar ligação de componentes do complemento aos

inibidoressalivaresdeA.aquasaliseA.albimanus

Placas de ELISA (Costar®) foram sensibilizadas com0,5 μg de gSG7 ou

gSG7-2 de A. albimanus ou 5 μg de EGS de A. aquasalis em 50 μl de tampão

carbonato de sódio 35 mM/bicarbonato de sódio 15 mM pH 9,6 durante

incubaçãoovernighta4oC.PoçosincubadoscomBSA1%foramutilizadoscomo

controlesnegativos.

Os poços foram bloqueados por uma hora com 200 μl de solução de

bloqueio(PBS+BSA1%)emtemperaturaambientesobagitaçãoe,emseguida,

incubadoscom0,2μgdecadacomponentedocomplementoasertestado(Fator

B,Bb,C3,C3b,FatorDeproperdina)em50μldePBSemtemperaturaambiente

por30minutos.Ospoçosforamentãolavadosduasvezescom200μldesolução

delavagem(PBS-Tw0,05%)por2minutossobagitaçãoeincubadoscom50μl

de solução de bloqueio contendo anticorpo específico para cada componente

testado(anti-C3foiutilizadoparadetectarC3eC3b;anti-FatorB,paradetectar

Fator B e Bb) diluído 1:5000 por 30 minutos em temperatura ambiente sob

agitação. Após mais duas lavagens, os poços foram tratados com anticorpo

secundário conjugado com peroxidase diluído 1:3000 em solução de bloqueio

por 30 minutos em temperatura ambiente e agitação constante. Seguindo a

incubação,maisduaslavagensforamrealizadaseospoçosforamreveladoscom

200μldesubstratoparaperoxidase(OPDeperóxidodehidrogênioemtampão

citratopH5,0,comodescritonosensaiosdeELISAnoItem4.5)eapós5minutos

a37oC,asplacasforamlidasa450nmemleitordeELISA.

Os ensaios foram realizados em duplicata, com 3 repetições. Asmédias

das absorvâncias das duplicatas de cada componente foram calculadas e

comparadas estatisticamente comamédiado seu respectivo controlenegativo

(poçosensibilizadocomBSA).

48

4.13Ensaioderessonânciaplasmônicadesuperfície

Ensaiosderessonânciaplasmônicadesuperfícieforamrealizadosusando

aparelho Biacore T100 (GE Healthcare®). As proteínas recombinantes gSG7 e

gSG7-2deA.albimanusdiluídasemtampãoacetatodesódio10mMpH5,0(20

μg/ml) foram imobilizadas em chips Sensor CM5 (GE Healthcare®) usando

grupamentoamina,comalvode imobilizaçãode1200unidadesderessonância

(RU). Células do chip sem proteína imobilizada foram utilizadas como branco

para subtração do efeito do tampão no sensorgrama. Para avaliar a ligação de

properdina às proteínas, experimentos de cinética foram realizados com

diferentesconcentraçõesdeproperdinaemtampãoHBS-P(HEPES0,01M,NaCl

0,15 M, Surfactante P20 0.005% v/v, pH 7,4, GE Healthcare®). O tempo de

contato das moléculas foi de 120 segundos em fluxo de 30 μl/min a 25ºC. A

dissociaçãodocomplexoproperdina-gSG7foimonitoradapor400segundosea

superfície do chip foi regenerada com um pulso de 10 segundos de tampão

glicina10mM.

Os sensorgramas foram montados usando o modelo 1:1 de ligação de

Langmuir das fases de associação e dissociação simultaneamente, usando o

softwareBiacoreEvaluationv2.0.3 (GEHealthcare®).Aconstantedeafinidade

(KD) foi calculada a partir da razão das constantes das taxas de dissociação e

associação(kd/ka).

4.14Análiseestatística

Os cálculos estatísticos foram realizados com o auxílio do software

GraphPad Prism 5.0. Em todos os experimentos, pelo menos três repetições

independentes foram feitas. A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste

Kolmogorov-Smirnov. As variáveis com distribuição normal foram analisadas

atravésdotesteTpareado(nocasode2grupos)oupelostestesANOVAeTeste

de Tukey (no caso de mais de 2 grupos). Valor de p < 0,05 foi considerado

estatisticamentesignificativo(*).

49

5.Resultados

5.1QuantificaçãodeproteínasdosEGSdasespéciesdeAnophelesestudadas

A concentração de proteínas no extrato de glândulas salivares dos

anofelinos em estudo foi medida por teste de Bradford ou pelo kit BCA. As

médias e desvios padrões das concentrações de proteínas totais no EGS deA.

albimanus, A. aquasalis, A. dirus, A freeborni, A. gambiae e A. stephensi foram,

respectivamente, 0,75 ± 0,02 μg/glândula, 0,75 ± 0,05 μg/glândula, 0,59 ± 0,1

μg/glândula, 0,83 ± 0,04 μg/glândula, 0,56 ± 0,04 μg/glândula, e 0,71 ± 0,08

μg/glândula.

5.2Ensaioshemolíticos

5.2.1Viaalternativa

ConformedemonstradonaFigura7,oEGSdeA.albimanus,A.aquasalise

A. freeborni foi capaz de inibir a atividade hemolítica provocada pela via

alternativa de forma dose-dependente e estatisticamente significativa.

Curiosamente, o EGS de A. gambiae, A. dirus e A. stephensi não apresentou

nenhumaatividadesobreahemóliseprovocadapelocomplemento,mesmocom

quantidadedeEGSreferentea15glândulassalivares.

Quando tratado com aquecimento por fervura ou proteinase K, o EGS

referente a 4 glândulas de A. albimanus perdeu a atividade inibidora da via

alternativa(Figura8).

50

Anopheles aquasalis

Controle

+

2,5 glân

dulas

5 glân

dulas

10 glân

dulas

15 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

**

*

**

Hem

ólis

e (%

)

Controle

+

0,5 glân

dula

1 glân

dula

2 glân

dulas

4 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

**

*

*

Anopheles albimanus

Hem

ólis

e (%

)

Controle

+

2,5 glân

dulas

5 glân

dulas

10 glân

dulas

15 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

Anopheles freeborni

**

*

* *

Hem

ólis

e (%

)

Controle

+

2,5 glân

dulas

5 glân

dulas

10 glân

dulas

15 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

Anopheles stephensi

Hem

ólis

e (%

)

Controle

+

2,5 glân

dulas

5 glân

dulas

10 glân

dulas

15 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

Anopheles dirus

Hem

ólis

e (%

)

Anopheles gambiae

Controle

+

2,5 glân

dulas

5 glân

dulas

10 glân

dulas

15 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120H

emól

ise

(%)

Figura 7: Ação do extrato de glândulas salivares de seis espécies deAnophelessobreaviaalternativadosistemacomplementohumano.OEGSdeA.aquasalis,A.albimanuseA.freebonifoicapazdeinibirahemólisedeformadose-dependente e estatisticamente significativa em relação ao controle seminibidor(ANOVA+TestedeTukey.*p<0,05).Asbarrasverticaisrepresentammédia+desviopadrãodasrepetições.

51

Figura8:EfeitodetratamentosdesnaturantessobreaatividadeinibidoradaviaalternativadoEGSdeA.albimanus.QuandotratadocomaquecimentoemáguaferventeoucomdigestãoporproteinaseK,oEGSperdeusuaatividade(ANOVA + Teste de Tukey). As barras verticais representam média + desviopadrãodasrepetições.

5.2.2Viaclássica

O EGS deA.gambiae eA.albimanus não foi capaz de inibir a atividade

hemolíticaprovocadapelaviaclássicadosistemacomplementohumano(Figura

9).QuandosalivadeA.aquasalisfoitestada,observamosumaleveinibiçãocom

diferençaestatísticasignificativaapenasquandoquantidadedesalivareferentea

10glândulasfoiutilizada(p=0.03402)(Figura9).

Controle

+

4 glân

dulas

4 glân

dulas aq

uecidas

4 glân

dulas +

protei

nase K

0

20

40

60

80

100

120

Hem

ólis

e (%

)

Anopheles albimanus

p < 0,001*

p < 0,001*

52

Anopheles albimanus

Controle

+

1 glân

dula

2 glân

dulas

4 glân

dulas

10 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

Hem

ólis

e (%

)

Anopheles aquasalis

Controle

+

1 glân

dula

2 glân

dulas

5 glân

dulas

10 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

*

Hem

ólis

e (%

)

Anopheles gambiae

Controle

+

1 glân

dula

2 glân

dulas

4 glân

dulas

10 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

Hem

ólis

e (%

)

Figura9:AçãodoEGSdeA.albimanus,A.aquasaliseA.gambiaesobreaviaclássica do sistema complemento. ANOVA + Teste de Tukey. * p < 0,05. Asbarrasverticaisrepresentammédia+desviopadrãodasrepetições.

5.3Ensaiodeativaçãodaviadaslectinas

O EGS de A. albimanus não apresentou atividade inibitória sobre a

deposiçãodeC3bdaviadaslectinas,mesmocomconcentraçõesreferentesa10

glândulassalivares(Figura10).

Controle

+

1 glân

dula

2 glân

dulas

4 glân

dulas

10 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

Anopheles albimanus

Dep

osiç

ão d

e C

3b (%

)

Figura10:EfeitodoextratodeglândulassalivaresdeA.albimanussobreavia das lectinas. Asbarras verticais representammédia+desviopadrãodasrepetições.5.4Ensaiodedeposiçãodecomponentesdaviaalternativa Tanto o EGS de A. aquasalis como o de A. albimanus foram capazes de

provocarinibiçãodose-dependenteeestatisticamentesignificativadadeposição

de C3b e Fator B da via alternativa (Figura 11). No caso deA.albimanus, EGS

53

referentea0,5glândulasalivarjáfoisuficienteparacausarinibiçãosignificativa

tanto de C3b como de Fator B (p < 0,0001). A deposição de properdina foi

testadaapenasnapresençadeEGSdeA.aquasaliseapresentouaçãoinibitória

forteedose-dependente(Figura11).

Anopheles aquasalis

Deposição de C3b

Controle

+

2,5 glân

dulas

5 glân

dulas

10 glân

dulas

15 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

*

*

*

Dep

osiç

ão d

e C

3b (%

)

Anopheles aquasalis

Deposição de Properdina

Controle

+

2,5 glân

dulas

5 glân

dulas

10 glân

dulas

15 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

**

*

Dep

osiç

ão d

e Pr

oper

dina

(%)

Controle

+

2,5 glân

dulas

5 glân

dulas

10 glân

dulas

15 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

**

Anopheles aquasalis

Deposição de Fator B

Dep

osiç

ão d

e Fa

tor B

(%)

Controle

+

0,5 glân

dula

1 glân

dula

2 glân

dulas

4 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

**

*

*

Anopheles albimanus

Deposição de C3b

Dep

osiç

ão d

e C

3b (%

)

Controle

+

0,5 glân

dula

1 glân

dula

2 glân

dulas

4 glân

dulas0

20

40

60

80

100

120

Anopheles albimanus

Deposição de Fator B

*

*

**

Dep

osiç

ão d

e Fa

tor B

(%)

Figura11:AçãodoEGSdeA.aquasaliseA.albimanussobreadeposiçãodecomponentesda via alternativado sistema complemento.OEGSprovocouinibiçãodose-dependentedadeposiçãodeC3b,FatorBeProperdina(ANOVA+Teste deTukey. * p < 0,05). As barras verticais representamamédia e desviopadrãodasrepetições. O EGS de A. aquasalis foi testado em ensaio de desligamento de

componentes da via alternativa previamente depositados em placas cobertas

comagarose. ComoobservadonaFigura12,nãohouvediferençaestatísticana

deposiçãodecomponentesdeC3beFatorBapósaincubaçãocomoEGS.

54

Figura 12: Efeito do EGS de A. aquasalis sobre componentes da viaalternativa previamente depositados em superfície ativadora. As barrasverticaisrepresentamamédia+desviopadrãodasrepetições.5.5WesternblotparadetecçãodeFatorBeC3a OefeitodoEGSdeA.aquasaliseA.albimanusnaativaçãodeFatorBeC3

foi observado através de Western blot utilizando anticorpos específicos para

cada componente. Na presença do EGS das duas espécies, houve inibição da

ativaçãodeFatorB(Figura13),poisnãohouveosurgimentodabandareferente

aBb(produtodaativaçãodoFatorB),comoobservadonocontrolepositivo,em

quefoiacrescentadoapenasPBS,semEGS.

O EGS das duas espécies também foi capaz de inibir a ativação do

componenteC3.Napresençadoextratodeglândulas,nãohouveaparecimento

dabandareferenteaC3a,produtodaativaçãodocomponenteC3,após30e60

minutosdeincubaçãoa37ºC(Figura14).

55

Figura13:AçãodoEGSdeA.aquasaliseA.albimanusnaativaçãodoFatorB. Ambas as espécies inibiram a ativação do componente, não havendosurgimentodabandareferenteaocomponenteBb(produtodaativaçãodeFatorB),após30e60minutosdeincubaçãoa37ºC.

Figura 14: Ação do EGS de A. aquasalis e A. albimanus na ativação docomponente C3. Ambas as espécies inibiram a ativação do componente, nãohavendo surgimento da banda referente ao peptídeo C3a (indicado pela seta),após30e60minutosdeincubaçãoa37ºC.

56

5.6WesternblotcomC3b,FatorBeFatorDpurificados Para investigar se o EGS de A. albimanus interfere diretamente na

formação da C3-convertase da via alternativa, formou-se este complexo

enzimático artificialmente através da incubação a 37ºC dos componentes

purificados, na presença e ausência do EGS. Com o conteúdo do tubo em

diferentes tempos de incubação, foi realizado Western blot usando anticorpo

anti-Fator B. Conforme demonstrado na Figura 15, o EGS não interferiu na

ativaçãodoFatorB,sendopossíveladetecçãodosprodutosdoFatorB,BbeBa

após20e40minutosdeincubação,mesmonapresençadoextratodeglândulas.

Figura15:AçãodoEGSdeA.albimanusnaformaçãodaC3-convertasecomcomponentesC3b,FatorBeFatorDpurificados.OEGSnãoinibiuaativaçãodoFatorB, sendoobservadoasbandasreferentesaosprodutosdaativaçãodoFatorB(BbeBa)tantonascanaletascomesemEGS.5.7PurificaçãodoinibidorsalivardeA.albimanus

Acromatografiade fase reversaemaparelhodeHPLC foiutilizadapara

purificar o inibidor da via alternativa presente no extrato de 200 glândulas

salivaresdeA.albimanus.Ocromatogramageradoapresentoucercade10picos

deproteínas,separadasdeacordocomahidrofobicidade(Figura16-A).

Uma alíquota de cada fração a partir do primeiro pico foi testada no

ensaio hemolítico e quatro frações seguidas (frações 1H11, 1H12, 2A1 e 2A2)

apresentaram atividade anti-via alternativa (Figura 16-B). Sobrepondo o

57

resultadodoensaiohemolíticoaocromatograma,observou-sequeoinibidorfoi

eluídoemumpicoespecífico,emtornodo24ºmldecoleta(Figura16-C).

Figura16:PurificaçãodoinibidordaviaalternativapresentenoEGSdeA.albimanus. A: Cromatograma do EGS aplicado em coluna de fase reversa eeluídocontragradientedeacetonitrila.B:Açãodasfraçõesdacromatografianaativação da via alternativa. Quatro frações apresentaram atividade anti-complemento. C: Sobreposição do resultado do ensaio hemolítico aocromatogramadapurificação comcolunade fase reversa.O inibidor foi eluídoemapenasumpicoespecífico.

58

As frações com atividade e suas adjacentes foram corridas em gel de

poliacrilamida e coradas com a prata. O resultado indicou duas bandas mais

abundantes nas frações commaior atividade (1H11, 1H12 e 2A1): uma pouco

maiorque62kDaeoutramenor,entre6e14kDa(Figura17).

Figura17:SDS-PAGEcomfraçõesdacromatografiadefasereversadoEGSde A. albimanus. As frações com atividade anti-complemento (1H11, 1H12 e2A1)apresentaramduasbandasmaisintensas:umaemtornode62kDaeoutraentre6e14kDa. O resultado da espectrometria de massa da fração 1H12 indicou nove

proteínassalivaresdeA.albimanus,apresentadasnoQuadro2.

Como observado na Figura 18, as proteínas AALB001854-PA e

AALB009922-PA foram asmais abundantes na fração. A AALB009922-PA tem

pesomolecularaproximadode72kDa,oquesugereserabandamaiordetectada

nogel(alinhadalogoacimadomarcadorde62kDa).Entretanto,aAALB001854-

PAidentificadanaespectrometriademassatempesomolecularaproximadode

30,7 kDa, em discordância com o tamanho observado da outra banda mais

intensanogel,localizadaentreosmarcadoresde6e14kDa(Figura17).

59

Quadro2:ProteínassalivaresdeA.albimanusidentificadasnafração1H12submetidaaespectrometriademassa

Figura 18: Quantificação das proteínas salivares de A. albimanusidentificadasporespectrometriademassadafraçãopurificada1H12,queapresentouatividadeanti-complemento.

Para confirmar o resultado da espectrometria de massa, corremos

novamente as frações com atividade em gel de poliacrilamida, coramos com

prataesubmetemosapenasabandamenor(entre6e14kDa)dafração1H12à

espectrometria de massa. O resultado indicou que a banda corresponde

AALB0099

22-P

A

AALB0013

05-P

A

AALB0098

27-P

A

AALB0018

54-P

A

AALB0050

83-P

A

AALB0000

58-P

A

AALB0075

57-P

A

AALB0016

05-P

A

AALB0107

55-P

A0

2×105

4×105

6×1052.0×106

2.5×106

3.0×106

3.5×106

4.0×106

Proteínas identificadas na espectrometria de massa

Qua

ntifi

caçã

o Proteína Pesomolecularaproximado Peptídeosinal

AALB009922-PA 71,9kDa -

AALB001305-PA 36,5kDa +

AALB009827-PA 197,5kDa +

AALB001854-PA 30,7kDa +

AALB001605-PA 58,0kDa -

AALB005083-PA 89,6kDa +

AALB010753-PA 23,7kDa -

AALB000058-PA 26,0kDa +

AALB007557-PA 13,3kDa +

60

realmente à proteína AALB001854-PA. Usando a sequência desta proteína

disponível no VectorBase, fizemos BLASTp no site do NCBI contra outros

anofelinosevimosqueestaproteína temalta similaridade (e-value de5e-32a

2e-41) com a proteína salivar gSG7 de A. darlingi, A. funestus, A. gambiae, A.

sinensiseA.stephensi.

No banco de dados do VectorBase, o gene AALB001854 desta proteína

apresenta seis éxons, com um longo íntron no meio da sequência, conforme

demonstradonaFigura19. Entretanto, ao analisarmosmais cuidadosamente a

sequência, notamos que, na verdade, se trata de dois genes distintos, que

provavelmenteforamanotadoserroneamentecomosendoumsónogenomade

A.albimanus.Oprimeirogenecomeçarealmentenostartcódondogeneanotado,

mas termina em stop códon (TAA) um pouco depois do final do terceiro éxon

(Figura20). Jáo segundogene, começano start códonumpoucoantesdoque

seriaoquartoéxondogeneanotado(Figura20)eterminanostopcódon(TAA)

comoanotadopreviamente.

61

TCCATGTCTACCAAAGACACCTTCCCCTTTCACACGACACCAGTGATTGCCAGAAATGTC CGATGTCACACAACAAACATCAACAATGGGGTCCAACTGATTATGGAAGTTATAATTTTA TTTACAACGCCAGCACGTACTACCATAACTTTGTGCACGCTCCTCCTGGCTGTGGCGTTG ACTGTGGCTTGCTGGTGCATGTGGAGGTACTGGCCGGAGGTTGGCTTGGTTTCCCCTTTC CCCAGTCTCCTCACTTGCAACCATTCATCAAAGTCACACAACATTTACTCAACCATGGTC GGTGTGAAACAGTTGGAGAGGAGTGCACCAGCAGTGATTGTACAAACAAGCAGTTTCCGT TTGTATTTAATTCAACTCTCTGTCTCCTAGCTTCCCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTTTCTGTCTCTCTGGATATCTTCAACTCTCATCCCATCCGACCTTTGGCGAAACACTT GCGTAAACAGTTACTTCTTCACAGCGAATGCTCGTGAGGAAATAAAAAGGGAATCCATTA GCAATGGGAACCGGAGAAGTTGCTGGAAGTTAACCAATTATACCTGGAGTTCCTAATAGG ATGGCCGTTAGAATGACAGTCATATTGCCGTTGGCAATGGCCTTGATCTGCCTGATGCAG GTATGCAGCGCCTTTCGGCGCCCTACTACATCACATTCAATGCATAATTTCGCTTCCGAT TATTCACTTGCTAGGCTGAACCAGCTACGGCGGCAAATAACCACATCAGGACCGTTCTGA AGCTCTTCCGCACCATTGATCTGGACGATTCGAAAAAGAGCTTCTACCTAACAGCAGCCA AGTATGGCATCCAGACGCAGCTTCGCGAACCGATCATTCGAATCGTTGGAGGCTATCTTC CATCCACTAAGGTATGTCTATTCGATGATGCTCTGTGATCACATTAGTATCTGATCCAAC CGGGTCACTTGCAGCTATCAGAAGCATGCGTGAAGAATATGATCAGCGAGGTATACGAAA TAGAAGGCGACTTTTACTCCAAGTTCAGCTACGCGTGTGAAGACCATGCTCCCTACTCGG TCGAATGCCTGGAGGACGCTAGGGACGACTACCTCACCCAACTGGTGGAGCTGTTCAAGG AAACCAAGAAATGTTTGCGGGAATAAGATGAAGTATGTGACAAACTAAAATGCAGATAAA CCAATAAACTGTATGCAAAGCGCATGTTCCGGTACATGGAATTATGATTGAGTTGATTGC TTGAAACATGAGGTTTCTGTGAAGAACAGCAGGGCCTCCAAACAATATTCTATGGAAGCA TTGACTAATGGTGTGTCTTAACTGGAAACATTTATTACTTTGTCTGCATGTCAGCATTGA CCTCAGAATGTATTGTTCGTTCCATTCCTGCCAATTTTCAGAACACCAGCTTCCCAACGA GCTTCATTATTTCCCGAAGAGCGGATTCCCCCCAGAGACCGACAACAGTCTTGTTTATGA GGGATGGGATCAATATTGAGAAAGGTTCATCATCGTCCGATCCAGGTTTGCTCACCTGGC ATCCTATCCCATCAACCTGATACCCTATCCTGCAGAAAGTAATTGCATCAAGGCATGGTT TCTGTTTGCACTCACAGCTAGAGATAGGTGAGCAATCATTTGGTCTGGGACTGGGCTCCA TGCACCCTTTCTAACAAATCATTCGACGGGGAAAAACAGTATAAGTGTAGCAATTGAACG GAATTCACTTCAATCCAGTGTTGATTGTGCATCAGGATGGAACTTATTGGTACTAATGTT GTAATGTTAGCCGCATTTGCATTGATCAGCATAATGCAGGTACTGGAAATGCGACGTAGC AGTGCTTTCAGATACAGTACCTTCCTTGTAACTGTCGTGATTTATTGGGTTACTTCCAGT TCAATGCCATCGATGCGACACACGAGCACGCCAACAAAATGACAAACATCTTCAGGCGCG TCAAGCTAGATAAAACGAAAAACGCAGTTTATCAAGATTACGTCCAGAAGGGAATCAAGA CGCTGCTGAAGGATCCGCTCGTCTCGAAGGCAATGCTTCTGCCGGCCAGCAAATCGGTAA GCTGAATCGGTTAACTTCGACCTCCGATCCCAGTTAGTGTACTAGCTCCCTTTACTCCGT TATTTAAGCTTCCCGACGACTGCCTAAACGCCATGGTGGACGAAGCGAGAGAGCATGAGA ACAAGTTCTACGCGGTTTTTACGTACGACTGCCAAGATCACATCCCCACAGCTTTCCCAT GCTTGGAAAAGGGAGTAGCCACGTACTATGAGAACCTGAAAGCGCTGGAAAAATCCACTG AAAAGTGTTGCAACATGTAATAGCCGCTTTACCACTTTTATGATGACGATGATGATGATG TAAATGGTGATTGTGTTAGCATGAAATACAATGAAAATATCACAGGCAAATTGAATGATT GCTGTCCATTTTTATTCTCAAAACAATTTCCGATTTTCTCCCCAAAAAAAAAAATAGAAC CGGCCATTCGCTTGTGATGGTTGGAGCACGATTCCGAGTACACTGTCGACAGTTTTTGTC CAACCAACCGGGCGCAGATAGACTGGAAAAATTAAATAAACAAATCCTCACCCCGGAATA TCACTGAAAGCCTCCGATGAGCCGTTGGCACGTAAACGAATCCATGAAAAAAAGGGGTTG ATTTGTGGACCATCGCAAAAAGCCCACAGTCAACGGAACGTCCACCCAGGCCCAGCTCAC CCAGTGGATCATCGGGTCCACGGTCAGTTCAACCATTCTCGCTTATTCGTTCTCCAACAG AAAGGGCTGGAAAAAACGAGCAGAAGTTATTAAAATAATGCCACATCGAAGGGACTCTCC CAATGAAGGAAGCACGATCCTCACGGAAAAAAACAATAGCTCTTCACGTCCTCAGCTGGC AAAAAAAAAAAACAATGGCC

Figura19: Sequênciado geneAALB001854disponívelnoVectorBase.org.Emdestaque,asregiõesdasequênciaapresentadascomocodificadoras.

62

TCCATGTCTACCAAAGACACCTTCCCCTTTCACACGACACCAGTGATTGCCAGAAATGTC CGATGTCACACAACAAACATCAACAATGGGGTCCAACTGATTATGGAAGTTATAATTTTA TTTACAACGCCAGCACGTACTACCATAACTTTGTGCACGCTCCTCCTGGCTGTGGCGTTG ACTGTGGCTTGCTGGTGCATGTGGAGGTACTGGCCGGAGGTTGGCTTGGTTTCCCCTTTC CCCAGTCTCCTCACTTGCAACCATTCATCAAAGTCACACAACATTTACTCAACCATGGTC GGTGTGAAACAGTTGGAGAGGAGTGCACCAGCAGTGATTGTACAAACAAGCAGTTTCCGT TTGTATTTAATTCAACTCTCTGTCTCCTAGCTTCCCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTTTCTGTCTCTCTGGATATCTTCAACTCTCATCCCATCCGACCTTTGGCGAAACACTT GCGTAAACAGTTACTTCTTCACAGCGAATGCTCGTGAGGAAATAAAAAGGGAATCCATTA GCAATGGGAACCGGAGAAGTTGCTGGAAGTTAACCAATTATACCTGGAGTTCCTAATAGG ATGGCCGTTAGAATGACAGTCATATTGCCGTTGGCAATGGCCTTGATCTGCCTGATGCAG GTATGCAGCGCCTTTCGGCGCCCTACTACATCACATTCAATGCATAATTTCGCTTCCGAT TATTCACTTGCTAGGCTGAACCAGCTACGGCGGCAAATAACCACATCAGGACCGTTCTGA AGCTCTTCCGCACCATTGATCTGGACGATTCGAAAAAGAGCTTCTACCTAACAGCAGCCA AGTATGGCATCCAGACGCAGCTTCGCGAACCGATCATTCGAATCGTTGGAGGCTATCTTC CATCCACTAAGGTATGTCTATTCGATGATGCTCTGTGATCACATTAGTATCTGATCCAAC CGGGTCACTTGCAGCTATCAGAAGCATGCGTGAAGAATATGATCAGCGAGGTATACGAAA TAGAAGGCGACTTTTACTCCAAGTTCAGCTACGCGTGTGAAGACCATGCTCCCTACTCGG TCGAATGCCTGGAGGACGCTAGGGACGACTACCTCACCCAACTGGTGGAGCTGTTCAAGG AAACCAAGAAATGTTTGCGGGAATAAGATGAAGTATGTGACAAACTAAAATGCAGATAAA CCAATAAACTGTATGCAAAGCGCATGTTCCGGTACATGGAATTATGATTGAGTTGATTGC TTGAAACATGAGGTTTCTGTGAAGAACAGCAGGGCCTCCAAACAATATTCTATGGAAGCA TTGACTAATGGTGTGTCTTAACTGGAAACATTTATTACTTTGTCTGCATGTCAGCATTGA CCTCAGAATGTATTGTTCGTTCCATTCCTGCCAATTTTCAGAACACCAGCTTCCCAACGA GCTTCATTATTTCCCGAAGAGCGGATTCCCCCCAGAGACCGACAACAGTCTTGTTTATGA GGGATGGGATCAATATTGAGAAAGGTTCATCATCGTCCGATCCAGGTTTGCTCACCTGGC ATCCTATCCCATCAACCTGATACCCTATCCTGCAGAAAGTAATTGCATCAAGGCATGGTT TCTGTTTGCACTCACAGCTAGAGATAGGTGAGCAATCATTTGGTCTGGGACTGGGCTCCA TGCACCCTTTCTAACAAATCATTCGACGGGGAAAAACAGTATAAGTGTAGCAATTGAACG GAATTCACTTCAATCCAGTGTTGATTGTGCATCAGGATGGAACTTATTGGTACTAATGTT GTAATGTTAGCCGCATTTGCATTGATCAGCATAATGCAGGTACTGGAAATGCGACGTAGC AGTGCTTTCAGATACAGTACCTTCCTTGTAACTGTCGTGATTTATTGGGTTACTTCCAGT TCAATGCCATCGATGCGACACACGAGCACGCCAACAAAATGACAAACATCTTCAGGCGCG TCAAGCTAGATAAAACGAAAAACGCAGTTTATCAAGATTACGTCCAGAAGGGAATCAAGA CGCTGCTGAAGGATCCGCTCGTCTCGAAGGCAATGCTTCTGCCGGCCAGCAAATCGGTAA GCTGAATCGGTTAACTTCGACCTCCGATCCCAGTTAGTGTACTAGCTCCCTTTACTCCGT TATTTAAGCTTCCCGACGACTGCCTAAACGCCATGGTGGACGAAGCGAGAGAGCATGAGA ACAAGTTCTACGCGGTTTTTACGTACGACTGCCAAGATCACATCCCCACAGCTTTCCCAT GCTTGGAAAAGGGAGTAGCCACGTACTATGAGAACCTGAAAGCGCTGGAAAAATCCACTG AAAAGTGTTGCAACATGTAATAGCCGCTTTACCACTTTTATGATGACGATGATGATGATG TAAATGGTGATTGTGTTAGCATGAAATACAATGAAAATATCACAGGCAAATTGAATGATT GCTGTCCATTTTTATTCTCAAAACAATTTCCGATTTTCTCCCCAAAAAAAAAAATAGAAC CGGCCATTCGCTTGTGATGGTTGGAGCACGATTCCGAGTACACTGTCGACAGTTTTTGTC CAACCAACCGGGCGCAGATAGACTGGAAAAATTAAATAAACAAATCCTCACCCCGGAATA TCACTGAAAGCCTCCGATGAGCCGTTGGCACGTAAACGAATCCATGAAAAAAAGGGGTTG ATTTGTGGACCATCGCAAAAAGCCCACAGTCAACGGAACGTCCACCCAGGCCCAGCTCAC CCAGTGGATCATCGGGTCCACGGTCAGTTCAACCATTCTCGCTTATTCGTTCTCCAACAG AAAGGGCTGGAAAAAACGAGCAGAAGTTATTAAAATAATGCCACATCGAAGGGACTCTCC CAATGAAGGAAGCACGATCCTCACGGAAAAAAACAATAGCTCTTCACGTCCTCAGCTGGC AAAAAAAAAAAACAATGGCC

Figura20:SequênciasdosdoisgenesanotadoscomogeneAALB001854deA. albimanus. As letras vermelhas representam os éxons das sequências. Aregião destacada em amarelo marca o final do primeiro gene e o início dosegundo.

Primeirogene

Segundogene

63

O primeiro gene codifica a proteína denominada de gSG7, cuja

sequênciaestádescritanaFigura21.Elaapresentapeptídeosinal,comsítiode

clivagem entre o 26º e 27º aminoácido. A proteína secretada (sem peptídeo

sinal),tempesomolecularde13,4kDa,écompostapor116aminoácidoseponto

isoelétrico5,39.

MAVRMTVILPLAMALICLMQAEPATAANNHIRTVLKLFRTIDLDDSKKSFYLTAAKYGIQTQLREPIIRIVGGYLPSTKLSEACVKNMISEVYEIEGDFYSKFSYACEDHAPYSVECLEDARDDYLTQLVELFKETKKCLRE

Figura21:SequênciadaproteínasalivargSG7deA.albimanus.Emvermelhoestá representado o sítio de clivagem do peptídeo sinal, entre o 26º e 27ºaminoácido.

JáosegundogenecodificaaproteínadenominadadegSG7-2,mostrada

na figura 22. Esta proteína também apresenta peptídeo sinal, sendo o sítio de

clivagem entre o 18º e o 19º aminoácido. Sem o peptídeo sinal, a gSG7-2 tem

peso molecular de 13,3 kDa, é composta por 116 aminoácidos e tem ponto

isoelétrico7,72.

MLAAFALISIMQFNAIDATHEHANKMTNIFRRVKLDKTKNAVYQDYVQKGIKTLLKDPLVSKAMLLPASKSLPDDCLNAMVDEAREHENKFYAVFTYDCQDHIPTAFPCLEKGVATYYENLKALEKSTEKCCNM

Figura 22: Sequência da proteína salivar gSG7-2 de A. albimanus. Emvermelhoestárepresentadoosítiodeclivagemdopeptídeosinal,entreo18ºe19ºaminoácido.

AsproteínasgSG7egSG7-2deA.albimanusapresentamapenas32,6%

de similaridade e, interessantemente, os peptídeos gerados na digestão por

tripsina para análise por espectrometria de massa da proteína salivar de A.

albimanusrecuperadadogelapresentaramsimilaridadeapenascomfragmentos

daprimeiraproteína(gSG7),conformedemonstradonaFigura23.

64

Figura 23: Alinhamento das sequências dos peptídeos gerados pelotratamento com tripsina da proteína salivar recuperada do gel com asequênciadagSG7deA.albimanusobtidanoVectorBase.

No NCBI, acessamos a sequência da gSG7 de A. darlingi (GenBank:

ACI30142.1)evimosqueelatambémtempeptídeosinal(entreosaminoácidos

26 e 27 da sequência), tem pesomolecular de 13,4 kDa, é composta por 116

aminoácidosepontoisoelétrico7,77(Figura24).

MAARMTIMLPLAVALICLLQTEPGMAAHSHIRKVLQLFRSIELDDSKKSFYLTAAKYGIQTQLREPLVRFAGGFAPSTRLSEACVKNAIARIYEIEGEFYAKFSYACENHDPYSVECLEEAQDDYPTKLGELFKKTKKCLRE

Figura24:SequênciadaproteínasalivargSG7deA.darlingi.Emvermelhoestá representado o sítio de clivagem do peptídeo sinal, entre o 26º e 27ºaminoácido.

Comparando as sequências das gSG7s de A. albimanus e A. darlingi,

pudemos ver que asmesmas apresentam 75% de similaridade (Figura 25). Já

quando comparada com as sequências de gSG7s de A. gambiae (GenBank:

CAC35523.1), A. funestus (GenBank: ABI83776.1), A. sinensis (GenBank:

KFB36874.1)eA.stephensi(GenBank:AAO06828.1),aproteínadeA.albimanus

apresentouapenascercade40%desimilaridade(Figura25).

65

Figura 25: Comparação das sequências das proteínas gSG7 de diferentesespéciesdeAnopheles.(A)AlinhamentodassequênciasdaproteínagSG7deA.albimanus, A. darlingi, A. funestus, A. gambiae, A. sinensis e A. stephensi. Osasteriscosindicamosaminoácidosidênticosemtodasasproteínas,doispontosindicamaminoácidoscomaltasimilaridadeeumpontoindicaaminoácidoscompoucasimilaridade.(B)ÁrvorefilogenéticabaseadanasequênciadasproteínasgSG7, confirmando a proximidade maior entre as gSG7s de A. albimanus e A.darlingi.

5.8 RT-PCR para detecção do gene da proteína gSG7 em extrato de glândulas

salivaresdeA.albimanus

Com o objetivo de detectar o gene da proteína gSG7 no extrato de

glândulas salivares de fêmeas de A. albimanus, 50 glândulas salivares foram

dissecadas e tiveram RNA total extraído pelo método de Trizol. A partir do

material extraído, foi produzido cDNA utilizando primer específico para

sequência do gene, e em seguida, foi realizada PCR convencional, utilizando o

cDNAcomomoldeeumpardeiniciadoresespecíficosparaasequênciadogene

citado.

66

O produto da PCR corrido no gel apresentou apenas uma banda, em

tornode500paresdebase(Figura26),compatívelcomotamanhodoamplicon

gerado pelos primers utilizados (477pb). No controle negativo, não houve

amplificaçãodenenhummaterial,indicandoausênciadecontaminação.

Figura26:EletroforesedosprodutosdareaçãodePCRparaamplificaçãodogenedaproteínagSG7deA.albimanus.UsandoocDNAproduzidoapartirdeRNAextraídodeglândulassalivares,houveamplificaçãoapenasdeumgene,que coincide com o tamanho aproximado do amplicon gerado pelos primersutilizados na reação (477pb). No tubo controle, não houve amplificação denenhumfragmentodeDNA.

5.9ExpressãoepurificaçãodasproteínasgSG7egSG7-2deA.albimanusegSG7

deA.darlingi

AsproteínasgSG7egSG7-2deA.albimanus egSG7deA.darlingi foram

expressas emE.coli BL21 pLys e purificadas através de cromatografias de gel

filtração em HPLC. Na Figura 27 estão representados os cromatogramas do

último passo da purificação das recombinantes, com formação de apenas um

pico,indicandoapurezadasnossasamostras.

67

Figura 27: Última cromatografia de gel filtração para purificação dasproteínas recombinantes gSG7 e gSG7-2 de A. albimanus e gSG7 de A.darlingi.Nastrêscromatografias,apenasumpicofoiformado,indicandopurezadasamostras.

Talpurezafoiconfirmadacorrendoumaalíquotadecadaamostraemgel

de poliacrilamida e corando com Comassie blue. Na Figura 28, estão

apresentadas as três proteínas recombinantes, evidenciando a ausência de

contaminantesnasamostraspurificadas.

Figura28:SDS-PAGEcomasproteínasrecombinantesapósoúltimopassodepurificação.Apresençadeapenasumabandaemcadacanaletaevidenciaapurezadasamostras. Astrêsproteínasforamtestadasnoensaiohemolíticoparaviaalternativa

conformedescritoparaosensaioscomEGS(25μldesorodiluído1:20+25μlde

hemácias+12,5μldePBScontendoasrecombinantes).AsgSG7sdeA.albimanus

eA. darlingi inibiram significativamente a hemólise (Figura 29). A gSG7 deA.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240

5

10

15

20

25

30

35

ml

mA

U (2

80nm

)Anopheles albimanus gSG7

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240

100

200

300

400

500

ml

mA

U (2

80nm

)

Anopheles albimanus gSG7-2

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240

20406080

100120140160

ml

Anopheles darlingi gSG7

mA

U( 2

80 n

M)

68

albimanus apresentou uma potente atividade, sendo necessário apenas 20 nM

(concentraçãofinal)daproteínaparainibir100%aviaalternativa,confirmando

serrealmenteoinibidorpresentenaglândulasalivardessemosquito.AgSG7de

A.darlingi também apresentou atividade. Entretanto, uma concentraçãomaior

destaproteínafoiexigidaparainibirsignificativamenteahemólise. JáagSG7-2

de A. albimanus não apresentou nenhuma atividade sobre a via alternativa

(Figura29).

Controle

+1n

M5n

M10

nM20

nM0

20

40

60

80

100

Anopheles albimanus gSG7

*

*

*

*

Concentração final de proteína

Hem

ólis

e (%

)

Controle

+10

nM50

nM

100 n

M

500 n

M0

20

40

60

80

100

120

Anopheles albimanus gSG7-2

Concentração final da proteínaH

emól

ise

(%)

Controle

+

100 n

M

200 n

M

400 n

M

500 n

M0

20

40

60

80

100

Anopheles darlingi gSG7

*

*

**

Concentração final da proteína

Hem

ólis

e (%

)

Figura 29: Ação das proteínas recombinantes gSG7 e gSG7-2 de A.albimanus e gSG7 de A. darlingi sobre a via alternativa do sistemacomplemento.ANOVA+TestedeTukey,*p<0,05.Osresultadossãoexpressoscomomédia+desviopadrãodepelomenostrêsrepetições.

Astrêsrecombinantestambémforamtestadasemensaiohemolíticoda

viaclássica.CoincidindocomosresultadosobtidoscomoEGSdeA.albimanus,

nenhumadassuasproteínasrecombinantesapresentouatividadesobreessavia.

A gSG7 de A. darlingi também não apresentou atividade sobre a via clássica,

mesmocomconcentraçõestãoaltasquanto1μM(Figura30).

Controle

+

100 n

M

200 n

M

500 n

M1u

M0

20

40

60

80

100

120

Anopheles darlingi gSG7

Concentração final de proteína

Hem

ólis

e (%

)

Controle

+5 n

M10

nM50

nM

100 n

M0

20

40

60

80

100

120

Anopheles albimanus gSG7-2

Concentração final da proteína

Hem

ólis

e (%

)

Controle

+5n

M10

nM50

nM10

0nM

0

20

40

60

80

100

Anopheles albimanus gSG7

Concentração final da proteína

Hem

ólis

e (%

)

69

Figura 30: Ação das proteínas recombinantes gSG7 e gSG7-2 de A.albimanus e gSG7 de A. darlingi sobre a via clássica do sistemacomplemento.Osresultadossãoexpressoscomomédia+desviopadrãodepelomenostrêsrepetições.

AsproteínasrecombinantesdeA.albimanusforamtestadastambémno

ensaiodeativaçãodaviadaslectinas.Emnenhumadasconcentraçõestestadas

as proteínas apresentaram inibição da deposição de C3b ativado por esta via

(Figura31).

Anopheles albimanus gSG7

Controle

+5 n

M10

nM20

nM

100 n

M0

20

40

60

80

100

120

Concentração final da proteína

Dep

osiç

ão d

e C

3b (%

)

Anopheles albimanus gSG7-2

Controle

+5 n

M10

nM20

nM

100 n

M0

20

40

60

80

100

120

Concentração final da proteína

Dep

osiç

ão d

e C

3b (%

)

Figura31:EfeitodasproteínasgSG7egSG7-2deA.albimanus sobreaviadas lectinas. As barras representam a média e desvios padrões dasporcentagens de deposição de C3b em relação ao controle positivo (seminibidor).

EnsaiosdedeposiçãodeC3b,FatorB,properdinaeC9napresençade

gSG7deA.albimanuseA.darlingiedagSG7-2deA.albimanusemplacacoberta

com agarose foram realizados, conforme descrito para os ensaios comEGS no

Material e Métodos (Item 4.5). Houve inibição dose dependente e

estatisticamente significativa da deposição de todos os componentes testados

apenas na presença da proteína gSG7 (Figuras 32 e 33). A proteína de A.

albimanussemostroumaispotente,precisandodeconcentraçõesfinaisemtorno

de20nMparainibirquase100%adeposiçãodetodososcomponentes(Figura

32).

70

C3b

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

120

140

gSG7gSG7-2

Concentração de proteína (nM)

Dep

osiç

ão d

e C

3b (%

)Fator B

0 20 40 60 80 1000

20406080

100120140

gSG7gSG7-2

Concentração de proteína (nM)

Dep

osiç

ão d

e Fa

tor B

(%)

Properdina

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

120

gSG7gSG7-2

Concentração de proteína (nM)

Dep

osiç

ão d

e Pr

oper

dina

(%)

C9

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

120

140

gSG7gSG7-2

Concentração de proteína (nM)

Dep

osiç

ão d

e C

9 (%

)

Figura 32: Efeito das proteínas gSG7 e gSG7-2 de A. albimanus sobre adeposição dos componentes C3, Fator B, properdina e C9 em placascobertas com agarose. A deposição dos componentes foi avaliada através deanticorposespecíficosparacadacomponente.Osresultadossãoexpressoscomomédia+desviopadrãodepelomenostrêsrepetições.

JáaproteínarecombinantedeA.darlingitambémapresentouatividade

masexigiuconcentraçãofinalde600nMparainibirtotalmenteadeposiçãodos

componentes testados (Figura 33). A proteína gSG7-2 de A. albimanus foi

utilizadacomocontrolenegativopornãoapresentaratividadeinibidorasobrea

viaalternativa.

71

Properdina

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

20

40

60

80

100

120

gSG7gSG7-2

Concentração de proteína (µM)

Dep

osiç

ão d

e Pr

oper

dina

(%)

C9

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

20

40

60

80

100

120

gSG7gSG7-2

Concentração de proteína ( µM)

Dep

osiç

ão d

e C

9 (%

)

Fator B

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

20

40

60

80

100

120

gSG7gSG7-2

Concentração de proteína (µM)

Dep

osiç

ão d

e Fa

tor B

(%)

C3b

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

20

40

60

80

100

120

gSG7gSG7-2

Concentração de proteína (µM)

Dep

osiç

ão d

e C

3b (%

)

Figura33:EfeitodasproteínasgSG7deA.darlingi sobreadeposiçãodoscomponentesC3,FatorB,properdinaeC9emplacascobertascomagarose.Adeposiçãodoscomponentesfoiavaliadaatravésdeanticorposespecíficosparacadacomponente.Osresultadossãoexpressoscomomédia+desviopadrãodepelomenostrêsrepetições.

A proteína gSG7 de A. albimanus foi também avaliada em ensaio de

desligamento de componentes da via alternativa previamente depositados em

superfície ativadora. Não houve diferença estatística entre os resultados de

deposição de C3b, FatorB ou properdina na presença ou ausência do inibidor

(Figura 34). Quando Fator H foi adicionado aos poços, houve diminuição

estatisticamentesignificativadadeposiçãodeFatorB(Figura34).

72

Figura34:EfeitodagSG7deA.albimanuseFatorHsobrecomponentesdaviaalternativapreviamente ligadosàsuperfícieativadora.Barrasverticaisrepresentamamédiaedesviopadrãodasrepetições.

Foram realizados também os ensaios de Western blot para detectar

ativação de C3 e Fator B presentes no soro humano normal na presença das

proteínas gSG7 e gSG7-2 de A. albimanus, na concentração final de 20 nM.

Repetindo os resultados obtidos com o EGS desta espécie, a gSG7 inibiu a

ativaçãotantodoC3quantodoFatorB(Figura35).ArecombinantegSG7-2foi

utilizadacomocontrolenegativopornãoapresentaratividadeinibitória.

A

73

Figura35:EfeitodasproteínasgSG7egSG7-2deA.albimanusnaativaçãodoscomponentesFatorB(A)eC3(B).NascanaletascomagSG7,nãohouveaparecimentodasbandasreferentesaBb(A)eC3a(B),produtosdaativaçãodeFatorBeC3,respectivamente.

OWesternblotcomoscomponentespurificadosC3b,FatorBeFatorD

também foi repetido, substituindo o EGS pelas proteínas recombinantes na

concentraçãofinalde20nM.NemagSG7nemagSG7-2 inibiramaativaçãode

FatorBnesseexperimento(Figura36).

Figura 36: Ação das proteínas recombinantes gSG7 e gSG7-2 de A.albimanusnaformaçãodaC3-convertasecomcomponentesC3b,FatorBeFator D purificados. As proteínas não inibiram a ativação do Fator B, sendoobservadoasbandasreferentesaosprodutosdaativaçãodoFatorB(BbeBa)nasrespectivascanaletas.

B

74

5.10IdentificaçãodoinibidorsalivardeA.aquasalis

AsproteínasgSG7recombinantesdeA.albimanusedeA.darlingiforam

corridasaoladodeEGSdefêmeasdeA.aquasalisemgeldepoliacrilamida12,5%

e coradas comprata.Nas canaletas emque foramaplicadas as recombinantes,

apenas uma banda com peso molecular de aproximadamente 13 kDa foi

observada.NacanaletaemqueoEGSfoiaplicado,aproximadamenteoitobandas

foram detectadas, incluindo uma com peso molecular muito próximo ao das

gSG7s(Figura37).

Figura 37: Eletroforese das proteínas gSG7 recombinantes de (1) A.albimanus e (2) A. darlingi e do (3) EGS de A. aquasalis em gel depoliacrilamida corado com prata. A seta indica uma banda no EGS com omesmopesomoleculardasproteínasrecombinantesdasoutrasespécies.

AsbandasreferentesàgSG7deA.darlingieasuacorrespondentenoEGS

deA.aquasalis foramextraídasdo gel e submetidas a tripsinização seguidade

espectrometria de massa. Dos peptídeos gerados a partir da amostra de A.

darlingi,umalinhoucom100%desimilaridadedeaminoácidoscomasequência

dagSG7dessaespécie.Interessantemente,umdospeptídeosgeradosapartirda

amostra de A. aquasalis também alinhou com 100% de similaridade com um

fragmentodiferentedasequênciadagSG7deA.darlingi(Figura38).

75

Figura 38: Alinhamento da sequência de peptídeo gerado da proteínasalivar de A. aquasalis (Pep1) com a sequência da proteína gSG7 de A.darlingi.

5.11WesternbloteensaiohemolíticocomIgGanti-gSG7deA.albimanus Para verificar se o anticorpo anti-gSG7 reconheceria a proteína

recombinanteeaproteínapresentenoEGS,foirealizadoWesternblotusandoo

anticorponadiluiçãode1:10000.ComomostradonaFigura39,oanticorpofoi

capaz de identificar as duas formas testadas da proteína, apresentando uma

únicabandaemcadacanaleta.

Figura 39: Western blot com anticorpo anti-gSG7 de A. albimanus. O IgGproduzidoemcoelhoreconheceutantoaproteínarecombinantecomoaproteínanativapresentenoextratodeglândulassalivares.

76

Diferentemente, o anticorpo anti-gSG7deA.albimanus não foi capazde

reconheceroutrasproteínassalivares,comoagSG7-2dessaespécieeagSG7de

A.darlingi,nemproteínasdoEGSdeA.aquasalisouA.aegypti(Figura40).

Figura 40: Western blot com IgG anti-gSG7 de A. albimanus. O anticorporeconheceu a gSG7 recombinante de A. albimanus (1) mas não reagiu contragSG7-2 da mesma espécie (2) nem com gSG7 de A. darlingi (3). O anticorpotambémnãoreconheceunenhumaproteínanoEGSdeA.aquasalis(4)ouEGSdeA.aegypti(5).

O IgG anti-gSG7 foi capaz de bloquear a atividade inibidora tanto da

proteínarecombinantequantodaproteínanoEGS.QuandotestadosobreoEGS,

oanticorpo foi capazdebloquearaatividadeestatisticamente significativanas

diluiçõesde1:10e1:100.Jáquandotestadocomaproteínarecombinante,oIgG

bloqueou de forma estatisticamente significativa até na diluição de 1:1000

(Figura 41). Quando apenas o anticorpo diluído 1:10 foi incubado com as

hemácias,nenhumahemólisefoiobservada,mostrandoqueoanticorpoporsisó

nãoatuacomohemolisina.

77

Figura41:Efeitodo IgGanti-gSG7sobreaatividadedoEGSedaproteínagSG7 recombinante. O anticorpo bloqueou de forma estatisticamentesignificativatantoaatividadedoEGSquantodaproteínarecombinante(ANOVA+ Teste de Tukey. **** p<0,0001; * p<0,05). As barras verticais representammédia+desviopadrãodasrepetições.

5.12 ELISA para detectar ligação de componentes do complemento aosinibidoressalivares

Na tentativa de encontrar o alvo dos inibidores do SC dos anofelinos

estudados,realizamosensaioscomplacasdeELISAsensibilizadascomgSG7de

A.albimanusouEGSdeA.aquasalis,gSG7-2ouBSAeincubadascomdiferentes

componentesdocomplemento.Utilizandoanticorposprimáriosespecíficospara

cadacomponente,foipossívelidentificarumaforteligaçãodeproperdinaàgSG7,

comdiferençaestatisticamentesignificativaemrelaçãoàgSG7-2eBSA(Figura

42). Não foi detectada ligação das proteínas recombinantes a nenhum outro

componentedaviaalternativa.

Controle

+

1 glân

dula

1 glân

dula + a

nti-gSG7 1

:10

1 glân

dula + a

nti-gSG7 1

:100

1 glân

dula + a

nti-gSG7 1

:500

1 glân

dula + a

nti-gSG7 1

:1000

Apenas

anti-

gSG7 1:10

0

20

40

60

80

100

120

Hem

ólis

e (%

)

********

Extrato de glândula salivar

Controle

+

gSG7 5 nM

gSG7 + an

ti-gSG7 1

:10

gSG7 + an

ti-gSG7 1

:100

gSG7 + an

ti-gSG7 1

:500

gSG7 + an

ti-gSG7 1

:1000

apen

as an

ti-gSG7 1

:100

20

40

60

80

100

120

Hem

ólis

e (%

)

gSG7 recombinante

*************

78

Figura 42: Ligação de componentes do complemento à gSG7 de A.albimanus.AtravésdeELISAcomplacassensibilizadascomgSG7,gSG7-2eBSAeincubadascomdiferentescomponentesdaviaalternativa,foipossíveldetectarligaçãodiretadeproperdinaàgSG7(ANOVA+TestedeTukey,****p<0,0001).

TambémfoidetectadaligaçãodeproperdinaaoEGSdeA.aquasaliscom

diferençaestatísticaemrelaçãoaocontrolecomBSA(p<0,001)(Figura43).

Figura43:LigaçãodecomponentesdocomplementoaoEGSdeA.aquasalis.Através de ELISA com placas sensibilizadas com EGS e BSA e incubadas comdiferentescomponentesdaviaalternativa,foipossíveldetectarligaçãodiretadeproperdinaaoEGS(Testet,****p<0,001).

gSG7

gSG7-2 BSAgSG7

gSG7-2 BSAgSG7

gSG7-2 BSAgSG7

gSG7-2 BSAgSG7

gSG7-2 BSAgSG7

gSG7-2 BSA0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5O

D (4

50 n

M)

Properdina

C3 C3b Fator B Bb Fator D

****

79

5.13Ensaioderessonânciaplasmônicadesuperfície

Confirmando a ligação observada no ELISA, no ensaio de ressonância

plasmônicadesuperfícietambémfoidetectadaligaçãodeproperdinaàgSG7de

A.albimanus(Figura44).Aligaçãofoiconsistente,compoucadissociaçãoapóso

tempo de contato e a cinética apresentou KD de 7,99 nM. Não foi observada

ligaçãodeproperdinaàgSG7-2emnenhumadasconcentraçõestestadas(Figura

44).

Figura 44: Ensaio de ressonância plasmônica de superfície com gSG7 egSG7-2 de A. albimanus. Os sensorgramasmostram a consistente ligação degSG7em todasas concentraçõesdeproperdina testadas.Nãohouve ligaçãodeproperdinaàgSG7-2.

0 100 200 300 400 500 600

0

20

40

60

80

100

Tempo (s)

RU

gSG7

300 nM150 nM

75 nM

37.5 nM

18.8 nM9.4 nM4.7 nM

Properdina

-100 0 100 200 300 400 500 600

0

20

40

60

80

100

Tempo (s)

RU

gSG7-2

4.7 nM9.4 nM18.75 nM37.5 nM75 nM150 nM300 nM

Properdin

80

6.Discussão

As proteínas do SC presente no sangue constituem uma importante

armadosistemaimuneinatocontrapatógenosinvasoresecélulasalteradasdo

hospedeiro.Umavezativado,oSCinduzorecrutamentoeativaçãodefagócitos,

alémdeformarporosnamembranacelular,levandoaodesequilíbrioosmóticoe

morte dos organismos estranhos. Para garantir sua sobrevivência, esses

organismosdesenvolverammecanismosdeescapedoSC,sendoasformasmais

comuns a secreção de inibidores de componentes específicos da cascata de

ativação e a adsorçãode reguladoresnegativosdoSCpresentesno sangueem

sua superfície. Mecanismos de evasão do SC já foram descritos em bactérias

(Potempa & Potempa 2012), fungos (Luo et al. 2013), vírus (Avirutnan et al.

2010),protozoários(Sacks&Sher2002),helmintos(Da’dara&Krautz-Peterson

2014)eatémesmoemcélulascancerígenashumanas(Okrojetal.2015).

Para inibição do SC, artrópodes hematófagos apresentam moléculas

específicas na saliva ouno intestino (Schroeder et al. 2009), pois esse sistema

permanece intacto por até uma hora no sangue ingerido e pode ser ativado

dentrodolúmenintestinaldos insetos(Simonetal.2013,Khattabetal.2015),

causandodanoaotratodigestivocasonãosejainativadoporinibidoressalivares

ouintestinais(Barrosetal.2009,Khattabetal.2015).Assim,sejaanívelsalivar

ouintestinal,a inibiçãodoSCpodeserconsideradaumprocessocrucialparaa

sobrevivênciadeartrópodesquesealimentamdesangue.

Neste estudo, a atividade anti-complemento foi pesquisada pela

primeiraveznoEGSdemosquitospertencentesaogêneroAnopheles.Aatividade

foiobservadanosEGSsdasespéciesneotropicaisA.albimanus,A.aquasaliseA.

freeborni.OEGSdeA.albimanusapresentoupotenteatividadeexclusivasobrea

viaalternativa,cominibiçãodeaproximadamente80%comquantidadedesaliva

referente a apenas uma glândula (Figura 7). Quando submetido a tratamentos

desnaturantes, comoaquecimentoedigestãoporproteinaseK,oEGSperdeua

atividade(Figura8),indicandoqueoinibidorédenaturezaproteica.OEGSdeA.

aquasalis, além de inibir a via alternativa de maneira dose-dependente,

apresentou leve inibição da via clássica, embora tenha sido necessário uma

81

grandequantidadedesaliva(referentea10glândulassalivares).OefeitodoEGS

de A. freeborni sobre outras vias do complemento não foi avaliado. As três

espéciesqueapresentaramatividadeanti-complementopossuemconcentrações

semelhantes de proteína por glândula salivar (aproximadamente 0,8 μg de

proteína/glândula) e, portanto, a diferença na intensidade da inibição da via

alternativapelosEGSsdastrêsespéciespodeserdevidoaoutrosmotivos,como

mecanismosdiferentesdeinibição,diferençanaexpressãodo(s)inibidor(es)ou

mesmodiferençasestruturaisdosmesmos.

AinibiçãodaviaalternativapeloEGSdeA.albimanuseA.aquasalisfoi

confirmada em ensaios de deposição em placas cobertas com agarose, onde

observamos a inibiçãodadeposiçãodeC3b, FatorB eproperdina (Figura11).

Por ensaiosdeWesternblot, demonstramosquenapresençadoEGSdasduas

espécies não há ativação dos componentes Fator B e C3 (Figura 13 e 14),

corroborandoos resultadosobservadosnos ensaiosdedeposição.Essesdados

indicam que os inibidores atuam logo no início da cascata de ativação da via

alternativa.QuandooWesternblotfoirealizadoutilizandoC3b,FatorBeFatorD

purificados,oEGSdeA.albimanusnãoinibiuaativaçãodocomponenteFatorB

(Figura15),indicandoqueoinibidornãoatuadiretamenteemnenhumdostrês

componentesutilizados.

A via alternativa possui grande importância na ativação do CS pois

independedemoléculasativadorase,porser iniciadaporhidróliseespontânea

do componente C3, está constantemente sendo ativada em baixos níveis na

circulação (Dunkelberger& Song 2010). Alémdisso, ela amplifica em cerca de

80%aatividadedaviaclássica(produçãodeC5aeCAM),poisoC3bgeradopor

estaviapode formarasC3- eC5-convertasesdavia alternativa, ativandomais

moléculas de C3 e C5, respectivamente, e consequentemente, formando mais

CAM (Harboe et al. 2004). Apesar de não observado em nossos resultados

(apenas com alta concentração de saliva de A. aquasalis), é possível que os

inibidoressalivaresdaviaalternativaatuem indiretamentesobreasatividades

das vias clássica e das lectinas no local da picada e dentro do intestino do

mosquito,diminuindoaatividadedessasvias.

82

Curiosamente, os EGSs de anofelinos do Velho Mundo (A. dirus, A.

gambiaeeA.stephensi) não apresentaramatividade anti-complemento,mesmo

com altas concentrações de proteínas salivares (Figura 7). Recentemente,

Khattabetal(2015)demonstraramqueA.gambiaeeA.stephensiligamFatorH,

um regulador negativo do SC, ao seu epitélio intestinal, inativando o SC. Isso

explicariaporqueessesmosquitosnãoapresentaminibidoressalivares,umavez

que os inibidores intestinais seriam suficientes para a proteção do trato

digestivo desses insetos.De fato, inibidores do sistema complemento têm sido

descritosnointestinodebarbeirosTriatomainfestans,T.brasiliensiseRhodnius

prolixus (Barros et al. 2009), do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis (Mendes-

Sousa et al. 2013), damosca tsé-tséGlossinamorsitans (Ooi et al. 2015) e do

ácaroSarcoptesscabiei(Bergströmetal,2009).Embarbeiroseflebotomíneos,já

foramdescritosinibidoresdocomplementotantonasalivaquantonointestino,

evidenciando a importância desses inibidores para a hematofagia e

sobrevivência desses vetores. É possível que existam também inibidores do

complemento no intestino dos anofelinos do Novo Mundo, atuando

sinergicamentecomosinibidoressalivaresnaproteçãodotratodigestivodesses

mosquitos.

Nosensaioshemolíticosparaativaçãodaviaalternativa,usamos25µl

deSHNdiluído1:20.Portanto,emcadatuboutilizadohavia1,25µldeSHN.EGS

referente a uma glândula salivar deA. albimanus foi suficiente para inibir em

torno de 80% a atividade dessa via (Figura 7). Considerando que: a) um

anofelino ingereemtornode2,5µldesangue(Jeffery1956,Phasomkusolsilet

al. 2015) e que o hematócrito humano permanece em torno de 45%, logo o

volume de soro ingerido pelomosquito é de aproximadamente 1,4µl; e b) os

anofelinos injetam na pele do hospedeiro até metade do conteúdo das suas

glândulas salivares (portanto, o conteúdo de uma glândula) (Golenda et al.

1995), a quantidade de saliva de A. albimanus inoculada seria suficiente para

inibir o SC ingerido no respasto sanguíneo. Já A. aquasalis e A. freeborni

necessitaram de quantidades maiores de proteínas salivares para inibir

significativamente o SC (em torno de 10 glândulas). Esses dados reforçam a

hipótese da existência de inibidores intestinais nos anofelinos neotropicais,

83

sendonecessáriosparaagirjuntamentecomosinibidoressalivaresnaproteção

dointestinodessasespéciescontraaativaçãodoCAM.

O inibidor salivar de A. albimanus foi purificado e identificado por

espectrometria de massa como pertencente à família gSG7 (gambiae Salivary

Gene7),queéamplamentedistribuídanasglândulassalivaresdeanofelinos.O

gene codificador dessa proteína foi descrito inicialmente no sialoma de A.

gambiae, sendo expresso exclusivamente nas glândulas salivares de formas

adultas do mosquito (Lanfrancotti et al. 2002). Posteriormente, esse gene foi

tambémdescritoemA.stephensi(Valenzuelaetal.2003),A.darlingi(Calvoetal.

2009),A.funestus(Calvoetal.2007)eA.sinensis(Zhouetal.2014).Essegrupo

de proteínas possui pouca similaridade de sequência com outros grupos de

proteínas de outros organismos, apresentam peptídeo sinal, não possuem

domíniosconhecidoseaindanãopossuiestruturacaracterizada.

A gSG7 recombinante de A. albimanus apresentou atividade anti-

complemento de forma semelhante ao EGS dessa espécie em todos os

experimentostestados(ensaiohemolítico,ensaiosdedeposiçãoeWesternblot),

confirmandoserrealmenteoinibidordocomplementopresentenasalivadeA.

albimanus.AssequênciasdasgSG7sdeanofelinosdoVelhoMundoapresentam

aproximadamente 45% de identidade de aminoácidos com a gSG7 de A.

albimanus. As diferenças nas sequências dos aminoácidos destas proteínas

devemocorrernosítiodeaçãodagSG7dosinsetosdoNovoMundo,justificando

aausênciadeatividadeanti-complementonosanofelinosdoVelhoMundo. Jáa

mesmaproteínamaduradeA.darlingiapresenta77%deidentidadecomadeA.

albimanus e também apresenta atividade anti-complemento. Esses dados

sugerem que a atividade anti-complemento é característica das gSG7s de

mosquitosdoNovoMundoeevoluíramapósadivergênciadeformasdoNovoe

VelhoMundos.

No EGS deA. aquasalisobservamos uma banda namesma altura das

gSG7sdeA.albimanuseA.darlingi(Figura37).Oresultadodaespectrometriade

massa indicou um peptídeo com 100% de similaridade com um fragmento da

sequência de aminoácidos da gSG7 de A. darlingi. Considerando que as três

espécies pertencem ao mesmo subgênero (Nyssorhynchus) e são

84

filogeneticamentemaispróximas,essesresultadossugeremaexistênciadeuma

proteína da família gSG7 no EGS deA.aquasalis, possivelmente o seu inibidor

salivar do SC. O transcriptoma total de larvas L3, L4 e fêmeas dessa espécie

alimentadascomaçúcarousanguefoirecentementepublicado(Costa-da-Silvaet

al. 2014), com algumas sequências depositadas nos bancos de dados virtuais.

Entretanto, nenhuma sequência de A. aquasalis apresentou similaridade

significativa com o gene ou a proteína gSG7 de outros anofelinos. RNAm de

glândulas salivares dessa espécie foram extraídos e atualmente estão sendo

sequenciados e analisados para a anotação do sialotranscriptoma. Quando o

mesmoestiverfinalizado,poderemosinvestigarcommaiorprecisãoapresença

dealgumasequênciacomsimilaridadecomagSG7deA.albimanuseA.darlingi.

Isawa et al (2007) produziram a gSG7 recombinante de A. stephensi,

denominadaanophensina,edemonstraramqueamesmaéinibidoradosistema

cinina-calicreína, ligando-seemFatorXII e cininogêniodealtopesomolecular,

bloqueando a produção de bradicinina, importante mediador de resposta

inflamatória. Em nosso estudo, outras atividades da gSG7 de A. albimanus,

incluindoaatividadeacimadescrita,nãoforaminvestigadasmasépossívelque

ela também apresente outras finalidades além de inibir o complemento.

Considerando que esta espécie de mosquito apresenta dezesseis proteínas no

seuEGSequeapenasnovedelassãosecretadas(Fontaineetal.2012),nãoseria

de se admirar que suas moléculas salivares apresentemmais de uma função,

agindosinergicamentedemodoafavorecerahematofagia.

Por ensaios de ELISA, demonstramos a ligação de properdina à gSG7

recombinante de A. albimanus e ao EGS de A. aquasalis utilizados para

sensibilizar a placa. Essa ligação foi confirmada para o inibidor da primeira

espécieatravésdeensaiode ressonânciaplasmônicadesuperfície (Figura44),

ondeobservamos forte ligaçãodaproperdinaao inibidor.Este componentedo

SCéumaglicoproteínade53kDaformadapor7domíniosdetrombospondina,

encontrada comumente na forma de oligômeros, principalmente dímeros,

trimerosetetrâmeroscirculantesnoplasmacomconcentraçãode5a20µg/mL

(Pangburn 1989). A properdina liga-se em C3bB e C3bBb, estabilizando a C3-

convertase da via alternativa, aumentando em até 10 vezes sua vida média,

85

permitindoaativaçãodemuitomaismoléculasdeC3(Fearon&Austen1975).

Além disso, protege esse complexo enzimático de reguladores negativos como

FatorH,queinduzadissociaçãodeFatorBdeC3beatuacomoreceptordeFator

I,queenzimaticamenteinativaC3bemiC3b(C3binativado)(Medicusetal.1976,

Hourcade2006,Torreiraetal.2009).Defato,jáfoidemonstradoqueanticorpos

IgG específicos contra properdina são capazes de inibir a atividade lítica e a

deposição de componentes da via alternativa, ressaltando a importância desse

componente para a ativação dessa via (Gupta-Bansal et al. 2000, Pauly et al.

2014). Essa ligação explica porque o inibidor salivar de A. albimanus atua

somente sobre a via alternativa e porquenosWesternblots realizados apenas

comoscomponentesC3b,FatorBeFatorDpurificados(semproperdina)nãofoi

observadanenhuma inibiçãodaativaçãodocomponenteFatorB (Figuras15e

35).

Proteínas salivares de artrópodes hematófagos com atividade anti-

complemento foram identificadas na saliva dos carrapatos Ixodes scapularis

(Valenzuela et al., 2000) e I. ricinus (Tyson et al. 2008), vetores daDoença de

LymenaAméricadoNorteeEuropa,respectivamente.NasalivadeI.scapularis

foramdescritas a ISACe a Salp20, proteínasque inibemexclusivamente a via

alternativa. Duas famílias de proteínas homólogas anti-via alternativa foram

encontradas na saliva de I. ricinus: as IRACs (Daix et al. 2007) e as IxACs

(Couvreur et al. 2008). Salp20 e as IxACs inibem a via alternativa ligando em

properdina(Tysonetal.2008;Couvreuretal.2008).Ainibiçãodaviaalternativa

já foidescrita tambémnasalivadeL.longipalpis (Cavalcanteetal.,2003).Vale

(2011)caracterizouparcialmenteessaatividade,demonstrandoqueoEGSatua

noiníciodacascata inibindoaativaçãodoFatorB,masquenãoage inibindoa

atividadeenzimáticadocomponenteFatorD.Recentemente,descobrimosqueo

inibidor salivar desse flebotomíneo trata-se da proteína Lufaxin, inicialmente

descrita como o anti-coagulante salivar de L. longipalpis (Collin et al. 2012).

Resultados preliminares demonstraram que essa proteína recombinante

bloqueia exclusivamente a ativação da via alternativa através da ligação em

properdina(manuscritoempreparação).

86

Porligarememproperdina,essasproteínassalivaresinibemsualigação

na C3-convertase da via alternativa, desestabilizando o complexo enzimático,

acelerandosuadissociação,alémdepermitiraligaçãodereguladoresnegativos

da C3-convertase, como Fator I, inativando a cascata dessa via. Baseado em

nossos resultados,podemosassumirqueos inibidoressalivaresdosanofelinos

apresentamummecanismodeaçãosimilar.Entretanto,agSG7inibeadeposição

deFatorBeoutroscomponentesemplacascobertascomagarosemas,diferente

de ISAC e Salp20 (Valenzuela et al., 2000; Tyson et al., 2007), não remove

componentes previamente depositados (Figura 34). Assim, podemos concluir

queela é capazdebloquear a formaçãodaC3-convertase,masnãoatua sobre

complexos pré-formados, assim como tem sido descrito para o EGS de L.

longipalpis (Vale, 2011) e as SMIPPs, inibidores do complemento presentes no

intestinodeSarcoptesscabiei,que também inibemaviaalternativa ligandoem

properdina(Bergstrometal.,2009).

JáfoidemonstradoqueasalivadeL.longipalpisfavoreceainfecçãopor

Leishmania no hospedeiro vertebrado, exacerbando o tamanho e a carga

parasitárianalesãocutânea(Titus&Ribeiro1988)eque,apesardeapresentar

mecanismosprópriosdeevasãodocomplemento(Späthetal.2003),a inibição

do SC pela saliva do vetor ajuda amanter a viabilidade dos parasitos quando

expostos ao soro humano (Nascimento 2011). Também já se sabe que TSLPI,

umaproteínasalivardocarrapatoI.scapularisqueinibeoSC,éimportantepara

atransmissãodaespiroquetacausadoradeDoençadeLyme,Borreliaburgdorferi

(Schuijt et al. 2011b). O silenciamento do gene dessa proteína ou anticorpos

contra ela provocaram uma diminuição da sobrevivência da bactéria tanto no

hospedeiro vertebrado quanto no intestino do carrapato (Schuijt et al. 2011).

Recentemente, foi demonstrado que merozoítos e gametas de P. falciparum

captamFatorHpresentenosanguecirculanteenosangue ingeridopelovetor,

respectivamente,paraevadirdalisepelocomplemento(Simonetal.2013,Rosa

et al. 2015). Entretanto, não há relatos de como esporozoítos, as formas

infectantes inoculadas pelo vetor, evadem desse sistema. Essas formas são

depositadasnapeledohospedeirodurantea fasede sondagemdomosquitoe

apósalgunsminutosinvademcapilarescutâneos,atingindoacorrentesanguínea

87

(Aminoetal.2006),permanecendoexpostosaoSCdurantetodoesseprocesso.

Épossíveleprovávelqueesta formaevolutivadoparasitotenhaseuspróprios

mecanismosdeescapedoSC,masapresençadeinibidoresnasalivadosvetores

doNovoMundodeveajudarnosucessodainfecção,tornandomenosinóspitoo

ambientedeinoculaçãodosesporozoítos.

Neste trabalhodemonstramosqueanticorpos IgGespecíficoscontraa

gSG7recombinantedeA.albimanusreconhecemtantooinibidornativopresente

no EGS quanto o recombinante (Figura 39), confirmando serem a mesma

proteína. Entretanto, os anticorpos não reconheceram outras proteínas dessa

mesmaespécieoudeoutrasespéciesdemosquitos,comoaproteínagSG7deA.

darlingiouproteínasdoEGSdeA.aquasalisouA.aegypti(Figura40),sugerindo

queosítioimunogênicodaproteínaéespecíficoparacadaespécie.Dessaforma,

se proteínas dessa família forem imunogênicas e estimularem produção de

anticorpos em indivíduos expostos aos mosquitos em áreas endêmicas para

malária, elas poderiam ser bons candidatos para marcadores de exposição

espécie-específicos,permitindoa identificaçãodeespéciescommaiorpotencial

vetorial, especialmente em áreas onde diferentes espécies se sobrepõem.

Adicionalmente,adetecçãodeanticorposanti-salivadovetorpoderiaserusada

para indicar infecção por Plasmodium, além de atuar como marcador da

severidadedadoença(Andradeetal.2009).

Atualmente, muitos trabalhos têm focado na pesquisa para o

desenvolvimentodevacinasdebloqueiodetransmissão(VBT)contraparasitos

transmitidos por artrópodes, cujo objetivo é impedir o desenvolvimento do

patógenonovetoresesuasubsequentetransmissão(Carter2001).Antígenosde

estágios sexuados do Plasmodium (encontrados no intestino do vetor) e

moléculassalivareseintestinaisdomosquitotêmdemonstradopotencialvacinal

(Carter2001,Lavazec&Bourgouin2008).Nocasodasleishmanioses,estudosde

VBTcomantígenossalivaresde flebotomíneosdoVelhoedoNovoMundotêm

sidodescritos.Gomesetal.(2008)verificaramqueaimunidadeaumaproteína

salivarespecíficadeL.longipalpis,aLJM19(queéinibidordaviaclássicadoSC),

propiciouproteçãosignificativacontraaleishmaniosevisceralfatalemhamster.

Recentemente,Oliveiraetal(2015)demonstraramqueaimunizaçãodemacacos

88

do gênero Rhesus com a proteína salivar PdSP-15 de Phlebotomus duboscqi é

capaz de proteger esses animais contra o surgimento de leishmaniose cutânea

provocadaporL.major.EmestudoscomcarrapatosI.scapularis, tambémjáfoi

descrito que a imunização de camundongos com a proteína inibidora do

complemento TSLPI levou a diminuição da carga parasitária em diferentes

tecidos do hospedeiro vertebrado (Schuijt et al. 2011). Considerando a

importância da evasão do SC por esporozoítos de Plasmodium nos primeiros

momentos da infecção, se um anofelino infectado inocular o parasito em um

indivíduo imunizado com gSG7 e, portanto, com este inibidor inativado por

anticorpos,osesporozoítosinoculadosficarãomaissusceptíveisaoataquedoSC,

resultandoemdiminuiçãodaquantidadedeparasitos viáveisno sangue.Além

disso, os anticorpos poderiam bloquear o inibidor no intestino do mosquito,

deixando o complemento ativo neste órgão, podendo causar danos ao epitélio

intestinal do mesmo. Caso estas hipóteses sejam verdadeiras, a gSG7 teria

potencial como um componente de vacina de bloqueio de transmissão para

malária.

Atualmente, doenças auto-imunes mediadas pelo complemento têm

recebidomuita atenção devido à sua severidade, como a SíndromeHemolítica

Urêmicaatípica(SHUa)eaHemoglobinúriaParoxísticaNoturna(HPN),doenças

decarátercrônicoquelevamaoóbitoempoucosanossenãotratadas(Bottoet

al. 2009, Ricklin & Lambris 2013, DeZern & Brodsky 2015). A causa dessas

gravesdoençaséadesregulaçãodaviaalternativadoSCpordiferentesrazões,

como ausência ou produção insuficiente de reguladores de membrana, como

CD55eCD59, emutaçõesemgenes codificadoresde reguladoresdoSC (como

FatorHeFatorI),levandoaproduçãodeformasalteradasdessasproteínasque

nãoapresentamadevidafunção(Roumeninaetal.2011).Essasalteraçõeslevam

àativaçãoinapropriadadessavia,queatacacélulaspróprias,provocandodanos

em tecidos normais do hospedeiro, principalmente eritrócitos. Atualmente, a

drogadisponívelparao tratamentodaSHUaedaHPNéumanticorpoanti-C5

(Soliris®),quebloqueiaaativaçãodocomponenteC5,prevenindoaativaçãodo

CAMnasuperfíciedecélulasnormais(Brodskyetal.2008).Entretanto,comoC5

éumcomponentecomumdastrêsviasdeativaçãodocomplemento,suainibição

89

levaàsusceptibilidadedohospedeiroapatógenosinvasores,levandoainfecções

respiratóriasouurinárias(Brodskyetal.2008).Assim,agSG7deA.albimanus,

umaproteínadebaixopesomolecularqueligaemproperdinaeinibeapenasa

via alternativa, poderia ser um candidato promissor para testes de uma nova

droga para doenças auto-imunes mediadas pelo sistema complemento,

diminuindo o risco de infecções durante o tratamento, uma vez que as vias

clássicaedaslectinasaindaestariamativascontrapatógenosinvasores.

Tendo em vista os aspectos levantados nesta discussão, o

descobrimentodeumamoléculadasalivadeanofelinoscapazdeinibirosistema

complementoconstituiumgrandepassonoestudodainteraçãovetor-parasito-

hospedeiro vertebrado. Além disso, nosso trabalho abre portas para novos

estudosvoltadosparaafisiologiaeevoluçãodeinsetoshematófagos,vacinasde

bloqueio de transmissão, marcadores de exposição e o desenvolvimento de

drogas para síndromes graves e fatais causadas pela desregulação do sistema

complemento.

90

7.Conclusões

• EGSdeA.albimanus,A.aquasaliseA.freeborniinibemaviaalternativado

sistemacomplementohumano;

• O inibidor salivar de A. albimanus, A. darlingi e A. aquasalis pertence à

famíliadeproteínasgSG7;

• AnticorposIgGcontraagSG7recombinantedeA.albimanusreconhecem

ebloqueiamosinibidoresrecombinanteenativodesseanofelino;

• A gSG7 atua ligando-se em properdina, o regulador positivo da via

alternativaimpedindoqueelaestabilizeaC3convertasedessavia.

91

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