1

AVALIAO POR IMUNOISTOQUMICA DA EXPRESSO DE FATORES DE CRESCIMENTO E DE FATORES RELACIONADOS

INFLAMAO EM CNCER DE MAMA TRIPLO-NEGATIVO.

Antnio Fernando Melo Filho

Orientador: Dr. Vladmir Cludio Cordeiro de Lima

Co-Orientador: Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro

Fortaleza Cear 2010

2

AVALIAO POR IMUNOISTOQUMICA DA EXPRESSO DE FATORES DE CRESCIMENTO E DE FATORES RELACIONADOS

INFLAMAO EM CNCER DE MAMA TRIPLO-NEGATIVO.

Antnio Fernando Melo Filho

Orientador: Dr. Vladmir Cludio Cordeiro de Lima

Co-Orientador: Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro

Fortaleza Cear 2010

Dissertao apresentada Fundao Antnio Prudente como pr-requisito para obteno do ttulo de Mestre em Oncologia.

3

FICHA CATALOGRFICA Preparada pela Biblioteca da Escola Cearense de Oncologia

Melo Filho, Antnio Fernando.

Avaliao por imunoistoqumica da expresso de fatores de crescimento e de fatores relacionados inflamao em cncer de mama triplo-negativo. / Antnio Fernando Melo Filho Fortaleza, 2010.

150p. Dissertao (Mestrado)-Fundao Antnio Prudente e Escola Cearense de Oncologia ECO. Programa de Ps - Graduao Interinstitucional (MINTER) em oncologia. Curso de Ps-Graduao em Cincias - rea de concentrao: Oncologia.

Orientador: Prof. Dr. Dr. Vladmir Cludio Cordeiro de Lima Co-Orientador: Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro

Descritores: 1. MAMA/patologia. 2. NEOPLASIAS DA MAMA/gentica. 3. IMUNOISTOQUIMICA/mtodos. 4. TRIPLO NEGATIVO.

4

ANTNIO FERNANDO MELO FILHO

AVALIAO POR IMUNOISTOQUMICA DA EXPRESSO DE FATORES DE CRESCIMENTO E DE FATORES RELACIONADOS

INFLAMAO EM CNCER DE MAMA TRIPLO-NEGATIVO.

Dissertao apresentada ao Programa de Mestrado e Doutorado MINTER/DINTER da Fundao Antnio Prudente como requisito para a obteno do ttulo de Mestre.

Aprovada em: 25 de outubro de 2010.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Jos Vassallo Fundao Antnio Prudente - FAP

Prof. Dr. Paulo Roberto Carvalho de Almeida Universidade Federal do Cear - UFC

Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeito Fundao Antnio Prudente - FAP

Prof. Dr. Vladmir Cludio Cordeiro de Lima Fundao Antnio Prudente - FAP

Prof. Dr. Marcos Vencio Alves Lima Instituto do Cncer do Cear - ICC

5

DEDICATRIA

A todas as mulheres vtimas desta doena to heterognea , o cncer de mama, a qual precisamos conhecer melhor, para melhor trat-las, em especial s annimas que participaram com o material de seus espcimes tumorais para este estudo.

6

DEDICATRIAS ESPECIAIS

A meu pai Fernando Melo, to precocemente levado pelo cncer gstrico, ausente deste momento to importante.

Ao Alexandre, irmo, que partiu levado pela violncia no carnaval de 1989.

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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

A Deus pela existncia, pela sade, pela disposio para realizar este trabalho de pesquisa e esta dissertao.

Famlia representada por minha esposa, Ins, os filhos, Fernando Neto, Iam e Yasmin, pelo apoio e a compreenso nas horas deles tomadas para execuo deste projeto.

famlia no sentido mais amplo representada por minha me Thereza exemplo para todos, e irmos Joo Alfredo, Flvio, portadores de ttulo de mestres, e Ticiana, portadora de ttulo de doutora, que me estimularam a acompanh-los nesta titulao.

famlia no sentido ainda mais amplo, os sogros Luiz Aguiar e Juscileide pelo estmulo recebido.

8

AGRADECIMENTOS

Ao Hospital do Cncer Instituto do Cncer do Cear, pela iniciativa de ter realizado o programa Minter/Dinter em parceria com o Hospital A. C. Camargo, em especial ao Dr. Srgio Ferreira Juaaba Diretor Geral do ICC e ao Prof. Manfredo Lins Diretor da Escola Cearense de Oncologia (ECO).

Ao Hospital A. C. Camargo, por ter viso de descentralizao realizando a parceria com o Instituto do Cncer do Cear, possibilitando esta pesquisa dentre outras.

Ao orientador, Dr. Vladmir Cludio Cordeiro de Lima, por seu rigor cientifico e estmulo.

Ao Co-orientador, Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, pelo estmulo, disponibilidade e amizade.

Ao Coordenador da Ps-Graduao do Hospital A. C. Camargo, Prof. Dr. Fernando Augusto Soares, por seu estmulo e empenho pessoal na realizao dos exames de imunoistoqumica.

Dra. Maria do Perptuo Socorro Saldanha e equipe do Laboratrio de Patologia Prof. Livino Pinheiro do Hospital do Cncer Instituto do Cncer do Cear, pela colaborao na reviso e realizao de exames de imunoistoqumica.

Ao Prof. Dr. Marcos Venicio Alves Lima, diretor de ensino da ECO, por seu estmulo e colaborao na montagem da ficha da pesquisa.

Ao Prof. Dr. Valdeci Ferreira, cuja atuao foi fundamental na implantao do projeto Minter/Dinter.

Wallita Linhares e Luciana Costa, secretrias da Escola Cearense de Oncologia ECO, do Instituto do Cncer do Cear, pela organizao e disponibilidade nas atividades didticas deste mestrado.

9

Cynthia Brasil, bibliotecria do Instituto do Cncer do Cear, por sua disponibilidade na organizao das referncias e confeco da ficha catalogrfica, e ainda Jucileide Andrade e Aline Costa, secretria e estagiria desta biblioteca respectivamente.

Suely Francisco, bibliotecria do Hospital A. C. Camargo, pela disponibilidade, ateno, quando solicitado de forma presencial ou distncia.

A Dr. Rafael Malagoli, Sueli Nonogaki e Carlos Ferreira Nascimento, do laboratrio de patologia experimental da Fundao Antonio Prudente do Hospital A. C. Camargo, que realizaram importante papel na confeco do bloco de TMA, titulao e preparao do material para reviso e anlise dos marcadores.

A Sr Ana Maria Kuninari coordenadora da Ps-Graduao da Fundao Antonio Prudente pela ajuda quando solicitada.

s residentes do Servio de Mastologia Dras. Heloisa Magalhes e Glaucia Cordeiro pela colaborao em diversas fases deste estudo.

Aos acadmicos do Programa de Educao Tutorial da Faculdade de Medicina Universidade Federal do Cear PET, Danni Chagas, Everton Rodrigues e Caio Gonalves.

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema do desenvolvimento da clula mamria a partir da clula tronco, sua diferenciao e os diversos perfis moleculares..................................................................................... 6

Figura 2 Esquema mostrando a clula mamria com destaque para epitlio luminal, culas mioepiteliais, citoqueratinas de alto e baixo peso molecular.

13

Figura 3 Esquema mostrando possvel sobreposio fenotpica entre os diferentes perfis...............................................................................

17 Figura 4 Fluxograma de incluso e excluso dos casos de carcinoma de

mama participantes do estudo 27

Figura 5 Tissue microarrayer apropriado (Beecher Instruments Micro Array Technology, NJ, EUA) Laboratrio Experimental Fundao Antonio Prudente So Paulo ......................................................... 29

Figura 6-a

Bloco de TMA contendo amostra utilizada do presente estudo (frente e verso)................................................................................

30 Figura 6-b

Lmina corada por HE contendo amostras utilizadas neste estudo.............................................................................................. 30

11

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 Relao de anticorpos utilizados, clone utilizado, titulao, fabricante e pas........................................................................ 33

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Caractersticas clnico-demogrficas e patolgicas da amostra de tumores triplo-negativos.................................................................. 46

Tabela 2 Anlise comparativa de diversas associaes de marcadores considerados basais para definio de tumores triplo-negativos basais.............................................................................................. 47

Tabela 3 Caractersticas clnico-demogrficas das pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativo comparando os fentipos basal e no-basal...................................................................................... 48

Tabela 4 Marcadores basais nos tumores mamrios triplo-negativos comparando so fentipos baasal e no basal................................. 49

Tabela 5 Marcadores relacionados ploriferao e inflamao nos tumores mamrios triplo-negativos comparando so fentipos baasal e no basal.......................................................................... 50

Tabela 6 Caractersticas patolgicas e de tratamento das pacientes de toda a amostra e seus tumores agrupadas quanto ao fentipo basal ou no-basal......................................................................... 57

Tabela 7 Avaliao da resposta clnica ao tratamento neoadjuvante de pacientes portadores de tumores triplo-negativos de mama, comparando os perfis basal e no-basal........................................ 62

Tabela 8 Resposta patolgica ao tratamento neoadjuvantes de pacientes portadores de tumores triplo-negativos de mama, submetidas a quimioterapia neo-adjuvante comparando os perfis basal e no-basal............................................................................................... 63

Tabela 9 Anlise do padro de recidiva nos tumores mamrios triplo-negativos e nos subgrupos basal e no-basal................................ 64

Tabela 10 Anlise multivariada da sobrevida global das pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos Regresso de Cox.................................................................................................. 83

13

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1 Sobrevida livre de doena de pacientes portadoras de tumores basais e no-basais. A sobrevida foi medida do trmino do tratamento inicial at o surgimento da primeira recidiva (intervalo livre de doena) e as curvas calculadas pelo mtodo de Kaplan-Meier.................................... 66

Grfico 2 Sobrevida global das pacientes portadoras de tumores de mama triplo negativo comparando os subgrupos basal e no-basal. A sobrevida medida da data do diagnstico at a morte por qualquer causa e as curvas calculadas pelo mtodo de Kaplan-Meier.................................... 67

Grfico 3 Sobrevida global das pacientes portadoras de tumores triplo-negativos, comparando os subgrupos basal e no-basal, em paciente com idade inferior a 50 anos. A sobrevida foi medida da data do diagnstico at a morte por qualquer causa. As curvas foram calculadas pelo mtodo de Kaplan-Meier e comparadas pelo mtodo de log-rank..............................................................................................

68

Grfico 4 Sobrevida das pacientes portadoras de tumores triplo-negativos com idade superior 50 anos de idade, comparando os subgrupos basal e no-basal. A sobrevida foi medida da data do diagnstico at a morte por qualquer causa. As curvas foram calculadas pelo mtodo de Kaplan-Meier e comparadas pelo mtodo de log-rank...........................

69

Grfico 5 Impacto do estadiamento clnico agrupado ([EC1+EC2] x [ECIII + ECIV]), na sobrevida global de pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos...................................................................... 70

Grfico 6 Sobrevida global de pacientes portadoras de tumores triplo-negativos em funo do perfil imunoistoqumico e de variveis clnicas e patolgicas............................................................................................... 70

Grfico 7 Impacto do status axilar ([N-] x [N+]), na sobrevida global de pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos................. 71

Grfico 8 Impacto do estadiamento patolgico agrupado ([EP1+EP2] x EP3), na sobrevida global da pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos................................................................................................ 71

14

Grfico 9 Impacto do tamanho tumoral patolgico agrupado ([pT1 + pT2] x [pT3 + pT4]), na sobrevida global das pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos...................................................................... 72

Grfico 10 Impacto da realizao cirurgia na sobrevida global de pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos................................. 72

Grfico 11 Impacto do tipo de cirurgia, (mastectomia x cirurgia conservadora), na sobrevida global das pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos....................................................................................... 73

Grfico12 Impacto da realizao de quiomioterapia neodjuvante na sobrevida global de pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos................................................................................................ 73

Grfico 13 Impacto da resposta clnica (presena x ausncia de resposta) da QTneo em pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos............................................................................................... 74

Grfico 14 Impacto da realizao de quimioterapia adjuvante na sobrevida global de pacientes portadoras de tumores triplo-negativos............................. 75

Grfico 15 Impacto da evoluo (ausncia de recidiva x recidiva loco-regional x recidiva sistmica), na sobrevida global das pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos........................................................ 75

Grfico 16 Impacto da expresso de EGF na sobrevida global das pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos................................. 76

Grfico 17 Impacto da expresso de PDGRA na sobrevida global de pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos................................. 76

Grfico 18 Sobrevida global de pacientes portadoras de tumores triplo-negativos em funo do perfil imunoistoqumico e da varivel cor......................... 77

Grfico 19 Sobrevida global de pacientes portadoras de tumores triplo-negativos em funo da presena de metstase ao diagnstico........................... 78

Grfico 20 Sobrevida global de pacientes portadoras de tumores triplo-negativos em funo da imunoexpresso de PDGF.............................................. 79

Grfico 21 Sobrevida global de pacientes portadoras de tumores triplo-negativos em funo da imunoexpresso de VEGFR............................................ 80

Grfico 22 Sobrevida global de pacientes portadoras de tumores triplo-negativos em funo da imunoexpresso de NOS2............................................... 81

15

Grfico 23 Anlise multi-variada Regresso de Coxi, sobrevida global das pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos................. 82

Grfico 24 Anlise multi-variada Regresso de Coxi, sobrevida global das pacientes portadoras de tumores mamrios triplo-negativos, controlando os perfis basal e no-basal....................................................................................................... 82

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LISTA DE ABREVIATURAS

AA AC ACT

AMPK cDna

cido aracdnico Esquema de quimioterapia o qual utiliza adriamicina e ciclofosfamida Esquema de quimioterapia o qual utiliza adriamicina, ciclofosfamida e paclitaxel (taxol) AMP activated protein kinase cido Desoxiribonucleico complementar, do ingls complementary Deoxyribonucleic acid

CK5 Citoqueratina 5 CK14 Citoqueratina 14 CK17 Citoqueratina 17 c-kit CD117 ou receptor do SDF1 (stromal derived factor 1) COX2 Ciclo-oxigenase 2 EC EGF

Fator de Crescimento Epidrmico Estadiamento clnico

EGFR Receptor do Fator de Crescimento Epidrmico ERBB2 Receptor 2 da famlia HER (human epidermal growth factor receptor) ERE FGF2

Elementos de resposta ao estrgeno Fator de crescimento derivado de fibroblastos

FGFR2 Receptor de fator de crescimento derivado de fibroblastos GN HE

Grau nuclear Hematoxilina-Eosina

IC Intervalo de confiana ILD Intervalo livre de doena Il1B Interleucina 1 Beta Ki-67 kiel cidade alem onde foi desenvolvida 67 o clone original (Protena

Nuclear relacionada a proliferao celular) NO NOS2

xido Ntrico xido Ntrico Sintase 2

P63 protena de 63KD PARP Poly ADP-Ribosis polimerase

17

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

PDGFRA Receptor de Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas alfa PDGFRB Receptor de Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas beta Qt-neo Quimioterapia neoadjuvante RE RT-PCR

SBR

Receptor de estrgeno Reao de cadeia da polimerase ps transcrio reversa, do ingls Reverse transcription polymerase chain reaction Scarf Bloom Richardson

TLR9 Toll-like Receptor 9 TMA TN

Triplo-negativo Tissue micro array

VEGFA Fator de Crescimento do Endotlio Vascular A VEGFR Receptor de Fator de Crescimento do Endotlio Vascular

18

NDICE 1 INTRODUO.......................................................................................... 1

1.1 Cncer de Mama....................................................................................... 1

1.2 Classificao histolgica dos tumores de mama....................................... 2

1.3 Classificao molecular do cncer de mama............................................ 3

1.3.1 Perfis de expresso gnica em tumores de mama................................... 3

1.4 Papel da imunoistoqumica na classificao dos tumores de mama......... 7

1.5 Tumores de mama triplo-negativos........................................................... 9

1.6 Tumores de mama basais......................................................................... 13

1.7 Fatores de crescimento, mediadores da inflamao e cncer de mama 18

2 OBJETIVOS................................................................................................ 24

2.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 24

2.2 Objetivo Especfico..................................................................................... 24

3 MATERIAIS E MTODOS.......................................................................... 25

3.1 Casustica.................................................................................................... 25

3.2 Coleta de dados.......................................................................................... 28 3.3 Confeco de bloco para TMA (Tissue Microarray) e preparo das

lminas....................................................................................................... 28 3.4 Caracterizao dos tumores triplo-negativos............................................... 34

3.5 Identificao de tumores triplo-negativos basais e no basais.................. 36

3.6 Imunoistoqumica de marcadores relacionados a fatores de crescimento e inflamao............................................................................................. 37

3.7 Imunomarcao para fatores de crescimento............................................. 37

19

3.8 Imunomarcao para fatores associados inflamao.............................. 39

3.9 Coleta de Dados.......................................................................................... 40

3.10 Anlise estatstica........................................................................................ 40

4 RESULTADOS............................................................................................ 42

4.1 Caractersticas clnico-demogrficas e patolgicas.................................... 42

4.2 Classificao dos tumores triplo-negativos basais..................................... 44

4.3 Fatores relacionados proliferao celular............................................... 51

4.4 Marcadores relacionados inflamao...................................................... 53

4.5 Anlise de dados demogrficos................................................................. 55

5 DISCUSSO............................................................................................. 84

6 CONCLUSES............................................................................................ 113

7 PERSPECTIVAS.........................................................................................

115

REFERNCIAS 116

ANEXOS

Anexo I Ficha de coleta de dados................................................................... 142

Anexo II Tabela TMA......................................................................................... 144

Anexo III Prancha de microfotografias ............................................................... 145

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RESUMO

MELO FILHO, AF. Avaliao por imunoistoqumica da expresso de fatores de crescimento e de fatores relacionados inflamao em cncer de mama triplo-negativo. [Dissertao de mestrado Curso de Ps-Graduao em Oncologia da Fundao Antonio Prudente (Minter/Dinter Hospital AC Camargo/Hospital do Cncer Instituto do Cncer do Cear ICC]. Orientador: Dr. Vladmir Claudio Cordeiro de Lima. Co-Orientador: Dr. Ronaldo Albuquerque Ribeiro.

O cncer de mama uma doena heterognea, sendo considerado um problema de sade pblica, ocupando o segundo lugar em incidncia em todo o mundo, com um milho de novos casos diagnosticados, levando a bito 400.000 mulheres anualmente. Aps incorporao clnica da avaliao dos receptores hormonais, bem como do estudo da amplificao do Receptor de Crescimento Epidrmico 2 - ERBB2, os tumores classificados por triplo-negativo (TN), por seu peculiar padro de agressividade passaram a despertar maior interesse. Dentre os TN tornaram-se necessrias a definio e a diferenciao dos subtipos basal e no-basal. No presente trabalho foi realizado estudo imunoistoqumico, aps confeco de tissue microarray (TMA) de 74 amostras de tumores TN oriundas do Instituto do Cncer do Cear - ICC, e seguindo critrios mais aceitos pela literatura, classificados em basais e no-basais. Foram estudados e comparados os seguintes marcadores: Receptor de crescimento epidrmico (EGFR), Citoqueratina5 (CK5), Citoqueratina14 (CK14), p63, Fator de crescimento epidrmico (EGF), Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), Receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRA), Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRB), Fator de crescimento do endotlio vascular (VEGF), Receptor de fator de crescimento do endotlio vascular (VEGFR). Fator de crescimento de fibroblastos (FGF2), Receptor de fator de crescimento de fibroblastos (FGFR2), Ciclo-oxigenase2 (COX2), xido ntricosintase2 (NOS2), Interleucina 1beta (IL-1) e Toll like repceptor9 (TLR9). Foi encontrada significncia estatstica (p < 0,05) quando confrontados os dois subgrupos (basal x no-basal) e a imunomarcao de PDGF e PDGFRA, os quais foram encontrados com maior freqncia no subgrupo basal. Foi encontrada significncia estatstica (p < 0,05) no estudo comparativo da COX2, com maior frequncia de imunomarcao nos tumores basais. A NOS2 tambm apresentou significncia estatstica (p< 0,05), porm sua positividade esteve relacionada ao fentipo no-basal. Foram avaliados tambm diversos variveis como idade, raa, estadiamento clnico, estadiamento patolgico, tratamento realizado (cirurgia, quimioterapia, radioterapia), e resposta clnica e patolgica ao tratamento neoadjuvante, sem que se tenha encontrado diferenas estatsticas ao se comparar os dois subgrupos. Igualmente, o Intervalo livre de doena nestes subgrupos no foi estatisticamente diferente. Ao ser ajustada por idade, as pacientes at 50 anos, portadoras de tumores basais, diferente daquelas acima de 50 anos, apresentaram, na anlise das curvas de Kaplan-Meyer, uma pior sobrevida quando comparadas com aquelas portadoras de tumores no-basais. Ficou evidenciada a pior sobrevida das pacientes jovens portadoras de tumores basais. Foi encontrada pior sobrevida nas pacientes que apresentaram imunomarcao positiva para p63 e VEGFR. Os dados aqui apresentados sugerem um potencial papel para PDGF e PDGFRA na caracterizao dos tumores TN basais, e como potenciais alvos teraputicos. Descritores: Mama/patologia; Neoplasias da mama; Imunoistoquimica; Triplo negativo.

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SUMMARY FILHO, A.FM Immunohistochemical evaluation of growth factors and inflammation-related factors in triple-negative breast cancer. Masters thesis by, Postgraduate Course in Oncology at Fundao Antonio Prudente (Minter/Dinter Hospital AC Camargo/Hospital do Cncer, Instituto do Cncer do Cear, ICC). Advisor: Dr. Vladmir Claudio Cordeiro de Lima. Co-advisor: Dr. Ronaldo Albuquerque Ribeiro.

Breast cancer is a heterogeneous disorder. A public health concern, it is the second most common type of cancer in the world, with a million new cases diagnosed and 400,000 deaths annually. Since the evaluation of hormonal receptors and Human epidermal factor receptor HER2 (ERBB2) amplification became routine clinical practice, more attention has been given to the occurrence of triple-negative tumors due to their particular aggressiveness. Triple-negative tumors may be differentiated into basal and non-basal. In this study a tissue microarray of 74 samples of triple-negative tumors from the Cear Cancer Hospital were submitted to standard immunohistochemistry for identification of the basal and non-basal subtypes. The markers Epidermal growth factor receptor (EGFR), Cytokeratin 5 (CK5), Cytokeratin (CK14), p63, Epidermal growth factor (EGF), Platelet- derived growth factor (PDGF), Platelet derived growth factor receptor alfa (PDGFRA), Platelet derived growth receptor factor beta (PDGFRB), Vascular endolethelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), Fibroblastic growth factor 2 (FGF2), Fibroblastic growth factor receptor 2 (FGFR2), Cyclooxygenase-2 (COX2), Nitric oxid synthase 2 (NOS2), Interleukin-1 beta (IL-1) and Toll like receptor 9 (TLR9) were quantified and compared. The subgroups (basal vs. non-basal) differed significantly (p

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1 INTRODUO

1.1 Cncer de mama

O cncer de mama ocupa o segundo lugar em incidncia em todo o mundo, com um milho de casos novos diagnosticados por ano, e leva morte 400.000 mulheres anualmente (GLUZ et al., 2009), tornando-se assim um grande problema de sade pblica. Sua incidncia varia de pas para pas, com diferenas mais marcantes entre pases desenvolvidos e em desenvolvimento. Segundo o Instituto Nacional do Cncer (NCI) dos Estados Unidos foram estimados 192.370 novos casos para o ano de 2009 e 40.170 mortes decorrentes de neoplasia de mama no mesmo perodo (http://www.cancer.org/downloads/STT/F861009_final%209-08-09.pdf acesso em 04/01/10), mostrando um pequeno acrscimo no nmero de casos novos ao compararmos o ano de 2009 com 2008 (192.370 versus 182.460), com uma tambm discreta reduo na mortalidade (40.170 versus 40.840). Ainda segundo Hayat e col (2004), o cncer de mama nos Estados Unidos corresponde a 18% das neoplasias malignas no sexo feminino.

No Brasil, o Instituto Nacional do Cncer (INCA) Ministrio da Sade, bienalmente divulga estimativas para novos casos de cncer, por localizao da neoplasia, bem como por estados. Em 2009, o INCA divulgou as estimativas para o anos de 2010 para o Brasil, com a expectativa de 49.240 novos casos de cncer de mama, com uma taxa bruta de 49,27 por 100.000 mulheres, dos quais 17.540 casos nas capitais, com uma taxa bruta de 74,56/100.000 mulheres. No Cear so esperados 1.660 novos casos, com uma taxa bruta de 37,29/100.00 mulheres, sendo 690 para a capital, com uma taxa bruta de 51,57/100.00 mulheres. H uma heterogeneidade na distribuio dos casos de cancer de mama na nossa populao, a estimativa em nosso pas varia de 11,91/100.000 mulheres no Maranho a 88,30/100.000 mulheres no estado do Rio de Janeiro, com estimativa global para o

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pas de 49,27/100.000 e 74,56/100.000 nas capitais brasileiras. O Cear se encontra com uma estimativa intermediria conforme citado acima (INCA, 2010).

As taxas de mortalidade por cncer de mama esto declinando em alguns pases da Europa e Amrica do Norte, apesar do aumento em sua incidncia. Em nosso pas, entretanto, estas taxas continuam apresentando curva crescente (INCA, 2010).

1.2 Classificao histolgica dos tumores de mama

Quase todas as neoplasias malignas da mama so adenocarcinomas, isto , neoplasias de linhagem epitelial que reproduzem glndulas ou tbulos. So divididas inicialmente em dois grupos: in situ, carcinomas que em seu crescimento no ultrapassam a membrana basal; e carcinomas invasivos, que infiltram a lmina prpria at o estroma e que podem tambm metastatizar para linfonodos regionais ou para orgos distantes. Os carcinomas tambm podem-se dividir, a grosso modo, com base em sua morfologia, em tipos ductal e lobular, embora se originem da mesma unidade terminal do lbulo. Os carcinomas mamrios mais freqentes so os carcinomas ductais invasivos sem especificao, correspondente aproximadamente a 90% de todas as neoplasias de mama. Tambm so encontrados outros tipos de neoplasia de mama como: carcinoma lobular invasivo, alm de variantes do carcinoma ductal como o carcinoma medular, carcinoma colide, carcinoma tubular, carcinoma papilar invasivo, carcinoma metaplsico e ainda o carcinoma inflamatrio. (ROSEN, 2009).

Por muito tempo os principais fatores prognsticos do cncer de mama foram apenas o tamanho tumoral (T) e o status axilar (N), porm hoje inconcebvel se tratar a neoplasia de mama sem o conhecimento do padro de expresso dos receptores hormonais, ou seja receptores de estrgeno e de progesterona (RE e RP), bem como da anlise da amplificao do oncogene ERBB2 ou a imunoexpresso da protena codificada por este oncogene, alm de fatores j

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incorporados prtica clnica como idade, invaso linfovascular, grau histolgico e nuclear (ROSEN, 2009).

1.3 Classificao molecular do cncer de mama.

O surgimento de novas tcnicas de biologia molecular tem permitido estudos mais acurados de anlise da expresso gnica dos tumores de mama. Tcnicas como hibridizao in situ por fluorescncia (FISH), hibridizao cromognica in situ (CISH), microarray (microarranjo de DNA) so exemplos da evoluo tecnolgica no campo do diagnstico e da deteco de fatores prognsticos/preditivos. Grande avano foi obtido com o desenvolvimento dos microarranjos de tecidos (tissue microarray - TMA), o qual utiliza cilindros de tecido retirados das amostras de interesse e que so introduzidos em um bloco de parafina receptor, o qual pode conter at 1.000 amostras diferentes. O TMA pode ser construdo para ser utilizado em anlises histolgicas e imunoistoqumicas, bem como para hibridizao in situ (FISH ou CISH). Com esta tcnica pode-se avaliar um nico gene ou produto gnico em um grande nmero de amostras tumorais, acelerando estudos que buscam associaes entre variaes moleculares e aspectos clnico-patolgicos (CASALI et al., 2008).

1.3.1 Perfis de expresso gnica em tumores de mama

A avaliao do perfil da expresso gnica dos tumores de mama permitiu o desenvolvimento de produtos, hoje disponveis comercialmente, para auxiliar o diagnstico e a individualizao do tratamento desta neoplasia.

Atualmente dispomos de trs testes que estudam o perfil dos tumores de mama, Acreditamos que o mais divulgado destes seja o Oncotype DX (Genomic

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Heath, Redwood City, Califrnia), desenvolvido por Paik et al. (2004), o qual analisa 21 genes atravs da tcnica de Reao de cadeia da polimerase ps transcrio reversa (RT-PCR, do ingls Reverse transcription polymerase chain reaction), gerando um escore de 0 a 100 quanto ao risco de recidiva. Este mtodo foi validado inicialmente para tumores nos estdios clnicos I e II, sem comprometimento linfonodal axilar e receptor de estrgeno positivo. Apresenta como grande vantagem a possibilidade de estudos retrospectivos, visto que pode ser realizado em blocos de tecidos includos em parafina (PAIK et al., 2004; PAIK et al., 2006).

VANT VEER e col. (2002) desenvolveram inicialmente na Noruega, sendo validado na Europa, o mtodo conhecido por Mammaprint, o qual avalia a expresso de 70 genes em uma amostra de tecido fresco de tumor de mama ressecado cirurgicamente. Utilizando a tcnica de microarranjo de cDNA fornece um ndice de risco de recidiva distncia para cinco e dez anos. So elegveis para uso do Mammaprint pacientes estadiadas como I ou II, com idade at 61 anos e axila negativa, podendo o status hormonal (estrgeno) ser positivo ou negativo. Mais recentemente, este teste foi validado tambm para tumores de pacientes que apresentam axila positiva (MARCHIONNI et al., 2008).

Outro mtodo, conhecido por plataforma H/I, utiliza a razo entre a expresso de dois genes (HOXB13 e IL17BR), avaliada por RT-PCR (reverse transcriptase-polimerase chain reaction) (MA et al., 2004). A expresso alta e isolada do gene HOXB13 indica risco elevado de recorrncia, enquanto a expresso elevada de IL17BR indica menor risco de recidiva. Podem ser avaliados por este mtodo tumores com receptor de estrgeno positivo de pacientes com status linfonodal positivo ou negativo.

Alm da heterogeneidade clnica e histopatolgica, os carcinomas invasivos de mama tambm se apresentam de forma heterognea quando classificados molecularmente. Atualmente so conhecidos cinco perfis genticos para o cncer

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invasivo de mama, os quais detalhamos a seguir (VANT VEER et al., 2002, SORLIE et al.,2003):

Luminal A apresenta forte expresso de receptores hormonais, de estrgeno e progesterona, e ausncia de hiperexpresso de ERBB2, alm de grau histolgico baixo e baixa expresso de Ki67. o subtipo de melhor prognstico.

Luminal B receptores de estrgeno e progesterona positivos, porm em menor intensidade que no Luminal A e ausncia da superexpresso de ERBB2. Apresentam grau histolgico 2 ou 3 e Ki67 elevado, com prognstico pior que o do luminal A. Alguns autores consideram os tumores que expressam receptores hormonais e Her2/neu como luminais B.

HER-2 - apresentam hiperexpresso do oncogene ERBB2 associada negatividade de receptores de estrgeno.

Basalide (Basal) encontra-se classificado entre aqueles tidos como triplo-negativos, com ausncia de ambos os receptores hormonais, estrgeno e progesterona, alm da ausncia de hiperexpresso de ERBB2. Apresenta expresso de queratinas de alto peso molecular como CK 5/6 e CK 17, bem como de vimentina. H grande divergncia na literatura quanto aos marcadores imunoistoqumicos necessrios para que seja caracterizado um tumor no perfil basalide (PEROU et al., 2000; VAN DE RIJN et al., 2002; VANT VEER et al., 2002; SRLIE et al., 2003; NIELSEN et al, 2004; FULFORD et al., 2006; CASSALI et al., 2008; CHEANG et al, 2008;; OLIVEIRA e BERTOZZI, 2008; REIS-FILHO e TUTT, 2008). Encontram-se neste grupo a maioria das neoplasias com mutao do BRCA1 e os carcinomas metaplsicos. O carcinoma medular o tipo, dentre estes, mais enigmtico, cerca de 95% destes apresenta o perfil basalide, uma morfologia agressiva, porm possuem prognstico favorvel (CARVALHO, 2007).

Normal-like no expressam receptores hormonais nem ERBB2 e no apresentam marcadores basais como citoqueratina de alto peso molecular.

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Mais recentemente, Herschlowitz e col. (2007) e Prat e Perou (2009) descreveram um novo subtipo classificado como claudin low, que apresenta baixa expresso de genes envolvidos na juno e adeso celular como claudina 3, 4 e 7, ocludina e E-caderina. Estes tumores apresentam uma varivel expresso de genes relacionados a marcadores basais. Os mesmos apresentam uma alta expresso de marcadores para linfcitos e clulas endoteliais, e ainda marcadores da transio epitlio-mesnquima, como HRAS e TWIST1, bem como para o tecido mesenquimal, como a vimentina.

Figura 1: Esquema do desenvolvimento da clula mamria a partir da clula tronco, sua diferenciao e os diversos perfis moleculares.

Fonte: Prat e Perou, Nat Med 2009;842-4

A realizao de testes, como cDNA microarray e TMA, ainda se encontra distante de nossa realidade, mesmo em centros de pesquisa, e principalmente na prtica clnica. A realizao de exames como Oncotype DX apresenta um alto custo financeiro, j o Mammaprint, alm do custo financeiro, apresenta a necessidade da sua realizao em material fresco. Apesar de ser um campo envolvente e

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estimulante, comprometendo grandes investimentos no desenvolvimento de plataformas e bibliotecas de genes, os estudos publicados carecem de reprodutibilidade e de controles de qualidade (REIS-FILHO e TUTT, 2008). possvel adaptarmos a taxonomia do cncer de mama e utilizar os termos da biologia molecular para classificar os tumores de mama em quatro ou cinco grupos conforme anlise de imunoistoqumica, o que acessvel em nosso meio.

1.4 Papel da imunoistoqumica na classificao dos tumores de mama

ingavel o valor da avaliao do perfil da expresso gnica do cncer invasivo de mama, porm necessrio que se tenha conhecimento de suas limitaes e da realidade brasiliera, e no negar a importncia da histopatologia convencional, bem como da imunoistoqumica. A assinatura gnica um mtodo que vem para somar, e no para substituir aqueles j incorporados prtica clnica. Raica e col. (2009), no ttulo de seu artigo publicado recentemente, apresentam a seguinte interrogao: Do diagnstico patolgico convencional classificao molecular do carcinoma mamrio: estamos preparados para a mudana?. Para estes autores a definitiva incorporao da avaliao do perfil da expresso gnica prtica clnica far-se- quando este mtodo vier responder pelo menos trs grandes questes: 1) a biologia de cada tipo de tumor difere entre si e da biologia do tecido normal?; 2) o perfil de expresso gnica pode com acurcia predizer o resultado clnico para tumores morfologicamente semelhantes?; e 3) possvel predizer a resposta a uma terapia especfica em casos individuais?

A expresso de receptores especficos para os hormnios sexuais esterides (estrgeno e progesterona) pelas clulas tumorais dos carcinomas mamrios representa um importante fator prognstico e preditivo no cncer de mama (ORVIETTO e VIALE, 2002). O receptor de estrgeno (RE) uma protena de 66KD, ligante-dependente, em cuja seqncia so reconhecidos domnios separados com funes especficas, como domnio de ligao ao DNA, domnio de

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transativao, domnio de dimerizao e regio de ligao ao hormnio. O estrgeno um esteride lipossolvel capaz de atravessar as membranas celulares e atingir o ncleo onde ir ligar-se a um domnio especfico de seu receptor. Aps a sua ligao, ativam-se a transcrio de vrios outros genes que contenham elementos de resposta ao estrgeno (ERE), que, por sua vez exercem a funo de regulao e de diferenciao celular (ORVIETTO e VIALE, 2002). O RE detectado em cerca de 60 a 80% das amostras de cncer de mama.

O receptor de progesterona (RP) uma das molculas cujo gene transativado pelos receptores de estrgeno. A determinao dos receptores de progesterona foi incorporada prtica clnica porque sua expresso testemunha a funcionalidade do receptor de estrgeno. Quando ambos os receptores so analisados em conjunto, aumenta-se o poder preditivo sobre uma possvel resposta terapia endcrina. sabido que as neoplasias de mama que expressam ambos os receptores (60% dos casos) apresentam taxa de resposta ao tratamento de cerca de 75%, ao passo que nas neoplasias negativas para ambos os receptores (cerca de 15%), a taxa de resposta de aproximadamente 15%. interessante observar que tumores que expressam apenas o receptor de progesterona apresentam melhor resposta quando comparado queles que expressam apenas o receptor de estrgeno (ALRED et al., 1998).

Ambos, RE e RP, so protenas nucleares que podem ser medidas nas clulas intactas ou em extratos de tumores por muitas tcnicas, sendo a imunoistoqumica (IHQ) a mais usada, por sua simplicidade e reprodutibilidade. Alm disso, o mtodo oferece a vantagem de no necessitar de amostras frescas, podendo ser realizada em material de arquivo emblocado em parafina. A IHQ pode ser empregada para reconhecer os RE e RP humanos e pode ser realizada em amostras pequenas, no sendo afetada por nveis de hormnios endgenos. Os dois parmetros utilizados de marcao na imunoistoqumica so o nmero de clulas coradas (marcao nuclear), expresso em porcentagem, e a intensidade da reao, avaliada como negativa, fraca, moderada e forte. A sua expresso se correlaciona

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diretamente com diferenciao, ploidia e ndices proliferativos baixos e inversamente com a expresso de receptores de fatores de crescimento como o ERBB2 e EGFR (ORVIETTO e VIALE, 2002).

A utilizao da pesquisa de receptores em neoplasias mamrias possui uma importante aplicao prtica que selecionar pacientes que tero maior benefcio com a terapia endcrina, mas ainda desconhecido por que cerca de 40 a 50% desses pacientes falham em obter uma resposta teraputica adequada. A marcao quantitativa e a determinao simultnea de RP aumentam a capacidade preditiva. Tumores com alta expresso de RE ou positivos para RE e RP tm maior probabilidade de resposta teraputica. (ELSTON e ELLIS, 1991; BATTIFORA et al., 1993).

O ERBB2, codificado pelo gene HER2/neu, uma molcula presente na membrana celular que pertence famlia dos receptores do fator de crescimento epidrmico. Encontra-se superexpresso em 15 a 30% dos cnceres de mama recm-diagnosticados, estando associado com um comportamento mais agressivo. Vrias potenciais aplicaes clnicas tm sido propostas para a avaliao da expresso de ERBB2, incluindo determinao de prognstico em pacientes no tratadas, predio de benefcios com a terapia anti-HER2, em particular trastuzumabe e lapatinibe, predio de resistncia a terapias endcrinas ou predio de resistncia relativa a certos esquemas de quimioterapia, como CMF (ciclofosfamida, metotrexato e fluorouracil), e ainda predio de resposta a antraciclinas e paclitaxel (HARRIS et al., 2007).

1.5 Tumores de mama triplo-negativos

Existia certa confuso na literatura na definio de tumores triplo-negativos e tumores basalides. REIS-FILHO e TUTT em artigo de reviso publicado em 2008

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apresentam o seguinte questionamento: Triple-negative and basal-like breast cancer: synonyms?, mostrando a importncia de se distinguir as duas entidades, com fins de diagnstico, teraputica, bem como para avaliao de resultados de estudos cientficos. Outros autores (FERNANDES et al., 2009) passaram a expor em seus artigos a importncia de no mais se confundir as duas entidades acima citadas.

Parece haver uma heterogeneidade na apresentao de dados referentes frequncia de tumores triplo-negativos, REIS-FILHO (2009) relatam que a incidncia de tumores triplo-negativos varia de 10 a 17%, j SILVA et al., (2008) referem que a incidncia de tumores basais varia de 2 a 18%.

Em estudo apresentado no Saint Gallen 11th International Conference, pesquisadores da Espanha (SANZ et al., 2009) encontraram, em um estudo com 345 pacientes portadoras de cncer de mama, 22 tumores classificados como triplo-negativo (6.4%). J em Israel a frequncia foi de 104 tumores triplo-negativos dentre 1.073 casos de tumor de mama (SHKLAR et al., 2009). Na Coria do Sul, HUR et al. (2009), ao estudarem 1.325 tumores invasivos de mama, encontraram 213 tumores triplo-negativos (16,1%). RAICA et al. (2009) relatam, em experincia romena, uma frequncia de 8 a 20% de carcinomas basalides dentres os casos de cncer de mama, sendo mais frequente na mulheres pr-menopausadas. Em estudo tailands LIN e colaboradores (2009) apresentam a frequncia de 167 tumores triplo-negativos dentre 1.048 tumores de mama estudados no perodo de janeiro de 2002 a dezembro de 2006, correspondendo a 15,9%.

SASA e colaboradores (2007) relatam que a incidncia de tumores basalides dentre os triplo-negativos de aproximadamente 50-60%. KURODA e colaboradores (2009) relatam que a maioria dos tumores triplo-negativos so basalides, porm alguns destes no apresentam o perfil basal ao utilizar citoqueratinas 5, 14 e 17 e p63 para definir o perfil basal.

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Diversos autores, ou mesmo quase a unanimidade dos autores, relatam que este perfil tumoral encontra-se mais frequentemente em pacientes jovens (REIS-FILHO et al., 2006; ANDERS e CAREY, 2008; CHEANG el al., 2008; KOBAYASHI, 2008; MILLIKAN et al, 2008; STEAD et al, 2009).,

Tambm de forma quase unnime relatada a maior frequncia de tumores triplo-negativos em mulheres de raa negra. STEAD e colaboradoes (2009) relatam que independente da faixa etria da paciente, mulheres de raa negra apresentam trs vezes mais tumores triplo-negativos que mulheres de outra etnia. Diversos outros autores relatam a maior incidncia deste subtipo em mulheres com ascendncia africana (REIS-FILHO et al., 2006; ANDERS e CAREY, 2008; KOBAYASHI, 2008; HUO et al., 2009).

Estudos clnicos tm mostrado um pior prognstico para os tumores triplo-negativos e HER2 positivos (VAN DE RIJN et al., 2002; SRLIE et al., 2003; ROUZIER et al., 2005; HICKS et al, 2006; OLIVEIRA e BERTOZZI, 2008; REIS-FILHO e TUTT, 2008; ROSEN, 2009).

Rakha e col. (2008) tambm relatam que os tumores basalides apresentam uma maior frequncia dos chamados tumores de intervalo, aqueles cujos diagnsticos acontecem nos intervalos entre a realizao de mamografias anuais atribuindo esse achado sua maior atividade proliferativa.

Os tumores triplo-negativos, conforme diversos autores (CHEANG et al, 2008; KOBAYASHI et al., 2008; NAM et al., 2008; RHEE et al., 2008; SASA et al., 2007), apresentam um elevado grau nuclear, bem como um elevado grau histolgico de Scarff, Bloom e Richardson (SBR).

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sbido, tambm que os tumores triplo-negativos apresentam uma maior agressividade, um maior potencial metasttico, um pior prognstico, o que consequentemene leva a menor sobrevida livre de doena e menor sobrevida global (ANDERS & CAREY, 2008; CHEANG et al., 2008; LIN et al., 2009; CHEANG et al., 2008; RAKHA et al., 2008; RAKHA et al., 2009).

Os tumores classificados como triplo-negativos apresentam, em geral, um padro de metastatizao de preferncia hematognica, em especial para o sistema nervoso central (LIN et al, 2008), com uma menor frequncia de disseminao linftica. Em estudo Japons publicado por SASA e colaboradores (2007) apresentada uma maior frequncia de disseminao distncia em pacientes portadores de fentipo basal. Estes autores analisaram 513 casos de cncer de mama em perodo de dois anos, destes 66 apresentavam axila positiva, nos quais ocorreram 13 casos de recidiva a distncia, sendo 11, de um total 40 pacientes, com fentipo basal, correspondendo a 27,5%, e apenas duas recidivas a distncia em pacientes com fentipo no-basal de um grupo de 26 pacientes com axila positiva e fentipo no-basal, correspondendo a 7,7%. Freedman e colaboradores (2009), mostram que a recidiva locoregional na cirurgia conservadora para cncer de mama no apresenta maior incidncia em pacientes portadoras de tumores triplo-negativos quando comparada a pacientes submetidas cirurgia conservadora e portadoras de tumores no triplo-negativos.

Segundo NAM e colaboradores (2008), a frequncia de metstases cerebrais maior em portadores de tumores triplo-negativos. Este estudo coreano englobava 126 casos de metstases cerebrais, sendo 47 em pacientes portadores de tumores triplo-negativo, 37 em pacientes com perfil HER2+/RE negativo, 23 pacientes classificadas no perfil luminal A e 19 no luminal B.

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1.6 Tumores de mama basais

Os tumores basalides apresentam um padro que se assemelha ao das clulas epiteliais basais da glndula mamria normal (MATOS et al., 2005; OLIVEIRA e BERTOZZI, 2008; ; REIS-FILHO & TUTT, 2008; RHEE et al., 2008), expressando os genes presentes nestas clulas (REIS-FILHO et al., 2006). H diversas definies na literatura quanto s imunomarcaes necessrias para se caracterizar um tumor com perfil basalide (CASSALI et al., 2008; NIELSEN et al., 2004; OLIVEIRA & BERTOZZI, 2008; PEROU et al., 2000; Srlie et al., 2003; REIS-FILHO et. al., 2006; VAN DE RIJN et al., 2002; VANT VEER et al., 2002). Do ponto de vista de expresso gnica os tumores basais expressam niveis mais elevados de citoqueratinas de alto peso molecular (CK5, CK6, CK14 e CK17), alm de calponina, p63 ou P-caderina (PEROU et al., 2000).

LumemClulas

MioepiteliaisEpitlio Luminal

Estroma Intralobular

CLULAS EPITELIAIS LUMINAIS

Citoqueratinas de baixo PM:(CK 7, 8, 18, 19) Mucina, BCL2, RH

CLULAS BASAIS (CELs. MIOEPITELIAIS)

Citoqueratinas de alto PM( CK 5, 6, 14, 17 ) SMA, Calponina, P63 , P-Caderina , etc.

Tecido Mamrio Normal

de grande importncia o estudo multinstitucional publicado por NIELSEN e colaboradores (2004), ao utilizarem a biblioteca gncia do estudo incial de PEROU (2000), testaram por imunositoqumica os seguintes marcadores basais: ckit, CK5/6 e EGFR. Estes autores encontraram positividade de apenas 28,5% para ckit, j para

Figura 2: Esquema da glndula mamria com destaque para epitlio luminal, clulas mioepiteliais, citoqueratinas de alto e baixo peso molecular. Modificado de: Perou C, Nature 460; 747-752,2000 e J Mammary Gland Biol Neoplasia;1998: 3; 23-35.

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CK5/6 e EGFR isoladamente foi de 61,9% para cada um dos marcadores. Quando avaliada a positividade para um destes dois marcadores foi encontrada sensibilidade de 76% e especifidade de 100% para a definio de tumor basalide, utilizando com critrio a positivade de CK5/6 e/ou EGFR.

Van de Rijn e col. (2002) publicaram um artigo em que correlacionam as citoqueratinas de alto peso molecular (CK5 e CK17) com um pior prognstico, porm a CK17 mostrou-se difcil de avaliar por IHQ. Hicks e col. (2006), ao estudarem CK5/6, relacionaram a imunoexpresso desta citoqueratina ao desevolvimento de metstases cerebrais, portanto com um pior prognstico.

O receptor do fator de crescimento epidrmico (EGFR ou HER1) faz parte da famlia dos receptores HER, composta por mais trs receptores (HER2, HER3 e HER4). O EGFR encontra-se imunoexpresso em mais de 60% dos tumores basalides (REIS-FILHO et al., 2008). Alguns autores (DOGU et al., 2009; NIELSEN et al., 2004) consideram a expresso do EGFR como um dos pr-requisitos na identificao dos tumores basalides, ao contrrio de outros pesquisadores que no a consideram essencial, embora reconheam que a expresso deste marcador est to largamente presente nos cnceres de mama basalides, que combinado com outros marcadores refora este perfil (PEROU et al., 2000; VAN DE RIJN et al., 2002; NIELSEN et al., 2004; HICKS et al., 2006; REIS-FILHO et al., 2006). Para Nielsen e col. (2004), portanto, a associao da expresso de EGFR com tumores basalides poderia definir uma subpopulao que viria a ser beneficiada com o tratamento isolado com inibidores deste receptor, quer anticorpos (cetuximabe e panitumumabe), ou inibidores de sua tirosina-quinase (erlotinibe ou gefitinibe), ou ainda tratamentos combinando estes inibidores e quimioterapia padro, expectativa esta que no chegou a ser confirmada, pois estudos recentes mostraram baixa atividade antitumoral por parte de erlotinibe e gefitinibe (DICKLER et al., 2008, 2009; MAYER et al., 2009).

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Soares et al (2000), ao analisarem 86 amostras de carcinomas invasivos da mama, quanto imunomarcao para TGF alfa e seu receptor EGFR encontraram positividade para EGFR em 34,2% dos tumores e em 46,1% dos casos, o mesmo era positivo nas clulas endoteliais prximas ao tumor. TGF alfa foi positivo em 72,1% dos casos, tanto nas clulas epiteliais, como nas clulas estromais adjacentes. A presena de EGFR nas clulas endoteliais se correlacionou com idade mais baixa das pacientes, bem como se observou uma associao do EGFR em clulas endoteliais e angiognese nos tumores com tamanho inferior a 2,0 cm. Contrariamente, a expresso de TGF alfa nos tumores maiores no foi associada com a angiognese. Para os autores, os resultados sugerem que EGFR nas clulas endoteliais pode ter um papel nos estgios da angiognese do cncer de mama.

So diversos os marcadores das clulas basais como as citoqueratina 5, 6, 14, a vimentina, p63, P-caderina, como so muitas as publicaes com diferentes critrios e combinaes de marcadores para definir o perfil basal (NIELSEN et al., 2004; MATOS et al , 2005; MATKOVIC et al, 2008; NALWOGA et al., 2008; e SASA et al., 2007).

Ressaltamos a importncia da publicao e aceitao na literatura, do critrio apresentado por NIELSEN e colaboradores (2004), os quais consideram a positivida por imunomarcao de CK5/6 e/ou EGFR para definio de tumor de mama triplo-negativo basal. Estes autores utilizaram 21 amostras da biblioteca gnica do estudo incial de PEROU e colaboradores (2000), e testaram a imunomarcao de CK5/6, EGFR e ckit. Referidos autores compararam os resultados encontrados no estudo gentico com aqueles encontrados por imunoistoqumica, em relao ao ckit foi encontrada concordncia de apenas 26,5%, j o CK5/6 e o EGFR isoladamente apresentaram positividade em 61,9%, quando analisada a imunomarcao para um dos dois marcadores foi encontrada positividade de 90%, devido a este alto ndice de concordncia e sua grande aceitao na literatura, o critrio de Nielsen (2004) foi escolhido para a definio de tumor triplo-negtativo neste estudo ora apresentdo.

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A associao entre tumores com fentipo basal e a mutao de BRCA1 relatada em diversas publicaes. Lakhani e colaboradores em estudo publicado em 2005, analisaram marcadores para fentipo basal CK14, CK5/6, CK17, EGFR e osteonectina, e evidenciaram uma maior frequncia nas pacientes com cncer de mama triplo-negativo e portadoras de mutao do gene BRCA1 do que naquelas pacientes portadoras de cncer de mama triplo-negativo controle (no portadoras de mutao gentica neste gene). J ao avaliar a relao de marcadores basais e mutao do gene BRCA2, esta no foi significante. Kobayashi (2008) tambm apresenta uma associao dos tumores basalides com a presena de mutao do BRCA1, este autor relata a baixa incidncia de mutao de BRCA1 na populao japonesa, porm forte a associao do perfil basal com a mutao do BRCA1, bem como um pior prognstico O mesmo ainda apresenta a necessida de maiores estudos no que se refere metilao do gene BRCA1.

FERNANDES et al, (2009) em artigo de reviso citam que um estudo (SRLIE et al 2003) mostra forte correlao, ao analisar microarranjo de amostras tumorais de 18 pacientes com mutao de BRCA1, que 100% delas apresentaram expresso gnica basal. Os autores concluem ser impossvel definir como causa ou consequncia a sobreposio existente entre os grupos, demonstrada na figura 3.

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Figura 3 Possvel sobreposio entre os diferentes perfis. Fonte: Fernandes GS, Calabrisch A, Katz A. Cncer de mama triplo-negativo; aspectos clnicos, laboratoriais e teraputicos. Rev. Bras. Mastol. 2009;19:76-82.

H escassez de dados na literatura nacional acerca da incidncia de tumores basalides ou mesmo triplo-negativos em nossa populao, bem como de sua correlao com caractersticas demogrficas. Foi descrita uma incidncia de 19,1% de tumores triplo-negativos em nosso pas, conforme o projeto Amazonas apresentado durante a Terceira Conferncia Brasileira de Cncer de Mama Enfoque em San Antonio 2008, realizada em So Paulo, em abril de 2009, promovido pelo Grupo Brasileiro de Estudos em Cncer de Mama (GBECAM). De Brot e colaboradores, em recente artigo publicado em 2009, descrevem 140 casos de tumores triplo-negativos oriundos da Universidade Federal de Minas Gerais e do Hospital A.C. Camargo, dos quais 75% so basais, apresentando maior agressividade e potencial de metastatizao sistmica, especialmente para pulmes, crebro e ossos. Ainda recentemente foi anunciado incio de estudo pela Universidade Federal da Bahia, o qual se dispe a estudar a frequncia da doena na raa negra, levando em considerao a grande miscigenao da populao baiana (NASCIMENTO, 2010). necessria a realizao de estudo, provavelmente multicntrico, a fim de que se conhea a realidade do cncer de mama do ponto de vista molecular em nosso pas, considerando as diferentes miscigenaes, devido s diversas formas de colonizao conforme as regies.

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1.7 Fatores de crescimento, mediadores da inflamao e cncer de mama

Vrios fatores de crescimento solveis e seus receptores participam da regulao e controle de mecanismos importantes na carcinognese como proliferao celular apoptose, angiognese, invaso, adeso celular, migrao e resposta imune.

Nos ltimos anos, muita ateno tem sido dedicada aos fatores pr-angiognicos e seus receptores no contexto da estimulao e manuteno do crescimento tumoral. Neste cenrio a famlia de fatores de crescimento do endotlio vascular (VEGFA, VEGFB, VEGFC e VEGFD) e seus receptores (VEFR1, VEGFR2 e VEGFR3) tm merecido destaque em pesquisas, bem como no desenvolvimento de terapias-alvo para diversos tumores malignos, incluindo o carcinoma invasivo de mama.

Est bem demonstrada, em estudo de fase III, a melhora na sobrevida geral dos pacientes portadores de cncer de clon e de pulmo de clulas no-pequenas submetidos a esquemas quimioterpicos associados ao anticorpo anti-VEGFA (bevacizumabe). (HURWITZ et al, 2004; SANDLER et al, 2006). Adicionalmente, tem-se observado aumento significativo da resposta objetiva quando o bevacizumabe adicionado quimioterapia com paclitaxel (MILLER et al., 2007) ou capecitabina (MILLER et al., 2005) em pacientes portadoras de cncer de mama metasttico.

Outros dois fatores pr-angiognicos envolvidos no crescimento tumoral so o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o fator de crescimento do fibroblasto (FGF2). Da mesma forma seus receptores (PDGFRA e FGFR2) tm sido pesquisados como potenciais alvos teraputicos, inclusive para o cncer de mama (LINDERHOLM et al., 2003 e CARVALHO et al., 2005).

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As cicloxigenases (COX) so enzimas presentes no citoplasma dos mais diversos tipos celulares, estando ligadas ao retculo endoplasmtico. So responsveis pela sntese de prostaglandinas (PG), a partir do cido araquidnico (AA), molcula derivada de fosfolipdios da membrana celular por ao de fosfolipases (RANG et al., 2001). A COX age sobre o AA produzindo inicialmente PGG2, por ao de uma perxido-sintetase e em seguida converte esta em PGH2 por ao de uma peroxidase. Da PGH2 surgem derivados especficos (PGI2, TXA2, PGD2, PGE2 e PGF2-), a partir de enzimas especficas, em clulas especficas (KATZUNG, 1998). Existem duas formas bem caracterizadas de COX: a COX1 e a COX2. Recentemente foi descrito um terceiro tipo de COX, a COX3, sendo a mesma uma variante da COX1 (CHANDRASEKHARAN et al., 2002). A COX1 representa a forma constitutiva, participando da manuteno do estado fisiolgico celular, produzindo baixos nveis de prostaglandinas. A COX2 a forma induzida, liberada por clulas inflamatrias em resposta a estmulos inflamatrios como fatores de crescimento e citocinas, sobretudo o fator de crescimento fibroblstico bsico (FGF ou FGF2) e o fator de necrose tumoral alfa (TNFA) (RANG et al., 2001). Alm de seu papel no processo inflamatrio, nos ltimos anos a COX2 tem chamado a ateno como importante fator carcinognico. O gene para COX2 hoje uma promissora fonte de estudos na elucidao de mecanismos envolvidos na biologia do cncer. Ao promover a sntese de PG, sobretudo PGE2, a COX2 estimula os seguintes efeitos carcinognicos: proliferao celular; invasividade, angiognese e inibio da apoptose.

Na mama, em um modelo de carcinognese, foi encontrado efeito mutagnico de radicais livres de nitrognio e oxignio induzidos por COX2 (HARRIS et al., 1999). A PGE2 tem efeito mitognico em clulas epiteliais mamrias normais (ROSE et al., 1994). A PGE2 parece responsvel tambm, no modelo citado, por um efeito parcrino ao agir sobre o tecido adiposo adjacente ao epitlio ductal mamrio e induzir a expresso da aromatase, enzima responsvel pela sntese de estrgeno, importante agente de promoo tumoral na mama (SHOU et al., 1996). A perda ou alterao na expresso de protenas de adeso intercelular como as cateninas (ZHOU et al., 2002) ou a preservao ou aumento da adeso clula-matriz mediada pelas integrinas so aspectos fundamentais no processo de infiltrao e

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metastatizao de clulas neoplsicas. Estudos sobre uma possvel associao entre a expresso de COX2 e protenas envolvidas com a adeso intercelular existem, mas so raros e incipientes (TSUJII et al. 1997; JIANG et al., 2001).

A angiognese um importante mecanismo no crescimento e infiltrao local de tumores, alm de favorecer a formao de metstases. A produo de fatores angiognicos a partir de COX2 tem sido descrita em diversos tipos de neoplasias (TSUJII et al., 1998). COX2, atravs da PGE2, favorece a produo de fatores de crescimento como FGF2 e fator de crescimento do endotlio vascular (VEGFA), secretados pelas clulas tumorais (CHENG et al., 1998). O FGF2 leva proliferao de tecido conjuntivo e vasos (FRIESEL e MACIAG, 1995). O VEGFA age sobre clulas endoteliais, estimulando sua proliferao e a formao de novos vasos. Alm do VEGFA, outros fatores angiognicos tm sido relatados em associao com alta expresso de COX2, como o fator de permeabilidade vascular (VPF) (BROWN et al., 1997) e o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) (HARRIS et al. 1999). Em modelos animais, utilizando crneas, drogas antiinflamatrias no-esteroidais (DAINES), de conhecido efeito inibitrio sobre COX2, inibem a angiognese induzida por fatores de crescimento (DANIEL et al., 1999), achados que favorecem a importante ao angiognica da enzima.

A inibio da apoptose pela COX2, via PGs, que ocorre em muitas leses malignas e pr-malignas, favorece o crescimento neoplsico, ao permitir que clulas mutantes sobrevivam e assim se reproduzam mais (MASFERRER et al., 2000).

Estudos revelaram que COX2 ao promover catabolismo do cido araquidnico, diminui o efeito pr-apopttico deste (WU et al., 2001) Alm disso, COX2 e PG induzem o gene bcl-2 (CHEN et al., 2005).

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No cncer de mama a expresso de COX2 e PG est aumentada, parecendo ocorrer tanto ao mutagnica quanto mitognica (LIU e ROSE, 1996). Em modelo proposto de carcinognese, foi encontrado efeito mutagnico a partir de radicais livres de nitrognio e oxignio, induzidos por COX2, e ao mitognica, pela estimulao estrognica associada (HARRIS et al., 1999). Estudos pr-clnicos em ratas mostraram redues moderadas a acentuadas de tumores induzidos nestas aps o uso de DAINES (HARRIS et al., 2000).

O xido ntrico (NO) um radical diatmico que exerce uma variedade grande de funes regulatrias in vivo. Esta molcula sinalizadora participa de numerosos processos fisiolgicos e fisiopatolgicos como vasodilatador, neurotransmissor, imunomodulador e molcula efetora-antimicrobiana (GELLER et al., 1998). O NO sintetizado a partir do aminocido L-arginina pelas NO-sintases, constitutivas, endotelial (NOS3) e neuronal (NOS1), e induzida (NOS2) (MONCADA et al., 1991).

Os efeitos do NO em neoplasias podem ser tanto de promoo tumoral, como de supresso tumoral. Altas concentraes de NO podem ser citotxicas, enquanto baixas concentraes podem mesmo proteger alguns tipos celulares de danos induzidos por estmulos qumicos e radiao, e da apoptose (MONCADA et al., 1991).

Durante o incio do crescimento tumoral, clulas natural killer e macrfagos matam clulas tumorais por um mecanismo dependente de NO. Por outro lado, o NO pode tambm suprimir as defesas antitumorais, promover angiognese tumoral e aumento do fluxo sanguneo na neovasculatura tumoral, aumentando o crescimento, invasividade e metastatizao (MONCADA et al., 1991).

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No cncer primrio de mama, imunoreatividade para NOS2 relativamente alta tem sido observada em clulas estromais, parecendo haver inclusive uma correlao entre esta imunorreatividade e o grau do tumor (THONSEN et al., 1995). Em outro estudo foi observada imunoexpresso de NOS2 predominantemente em clulas tumorais, havendo uma correlao com a presena de linfonodos axilares comprometidos (VAKKALA et al., 2000). Posteriormente, foi demonstrado que clulas do cncer de mama, em adio s clulas do estroma, expressam NOS2 e so capazes de produzir NO. Os carcinomas com clulas tumorais e clulas estromais positivas para NOS2 apresentam altos ndices apoptticos e vascularizao aumentada, sugerindo que NOS2 contribui para promoo de apoptose e angiognese no cncer de mama (VAKKALA et al., 2000). Associao entre maior nmero de clulas NOS2 positivas e doena metasttica tambm foi observada, tendo sido atribuda ao estmulo da angiognese, resultando numa maior densidade de vasos e, conseqentemente, uma maior probabilidade de invaso de clulas tumorais (VAKKALA et al., 2000).

A famlia Toll like receptor (TLR) formada por protenas ligadas imunidade inata e TLR9, podendo ser encontrada em tumores de prstata e pulmo, alm do carcinoma de mama, atravs de IHQ (JUKKOLA-VUORINEN et al., 2009). Jukkola-Vuorinen e colaboradores, em artigo recente (2009), relatam uma freqncia de expresso deste marcador em aproximadamente 98% em neoplasias mamrias, quando apenas cinco dentre 141 espcimes estudadas foram negativas. No h diferena entre a freqncia de TLR9 quando se compara o carcinoma ductal com o carcinoma lobular, porm, verificam-se maiores nveis de imunomarcao nos tumores mucinosos que nos tumores tubulares. O mecanismo pelo qual os receptores de estrgeno alfa regulam a expresso de TLR9 ainda no so claros e necessitam de mais estudos.

Tumores com comprometimento axilar apresentam nveis de TLR9 levemente elevados, quando comparadas com aqueles tumores que so classificados como N0. estatisticamente significante a correlao inversa entre

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TLR9 e nveis de RE. Os nveis deste receptor esto levemente elevados em tumores de mama triplo-negativos em comparao com os tumores que apresentam a combinao dos trs marcadores (RE, RP e ERBB2) ou duplo-positivos (RE e RP positivos), porm isto no apresenta significncia estatstica. Se as clulas neoplsicas realmente utilizam a via mediada por TLR9 para a invaso, o bloqueio desta via, como por exemplo, pela cloroquina, deve ser testado, bem como inibidores sintticos da TLR9 como uma arma da imunoterapia.

Os tumores triplo-negativos, segundo diversos autores (CARVALHO, 2008; CHEANG et al., 2008; HAFFTY et al., 2006; LIN et al., 2009; NAM et al., 2008; RAKHA et al., 2008; RAKHA et al., 2009; REIS-FILHO e TUTT, 2008; RHEE et al., 2008) apresentam maior agressividade em relao aos demais tumores de mama.

O melhor conhecimento do perfil molecular dos tumores mamrios, atravs de ligantes, seus respectivos receptores, sua correlao com o perfil molecular em estudo, no caso, o triplo-negativo, um importante passo para o desenvolvimento de terapia alvo especfico para esta agressiva forma de cncer mamrio.

Novos horizontes so necessrios na pesquisa de novas linhas de tratamento para o cncer de mama triplo-negativo, considerando a ausncia de resposta aos tratamentos considerados reconhecidamente efetivos. Desta forma, entendimento da literatura que este tipo de cncer de mama tem um pior comportamento e no responde a tratamentos como hormonioterapia ou terapia-alvo com trastuzumabe, precisa ser melhor conhecido. necessrio um melhor conhecimento sobre sua quimiossensibilidade a drogas especficas, bem como avaliar melhor o papel desempenhado por fatores relacionados inflamao e dos fatores de crescimento citados anteriormente, para o melhor entendimento desta neoplasia e o eventual desenvolvimento de novas formas de terapia-alvo. Alm disso, de grande importncia que se investigue o curso clnico e comportamento biolgico destes tumores numa amostra de indivduos brasileiros.

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2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a expresso de fatores de crescimento e de marcadores de inflamao por imunoistoqumica em carcinomas mamrios triplo-negativos.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

a) Estudar a freqncia e as caractersticas demogrficas de pacientes portadoras de carcinomas de mama triplo-negativos dentre todos os casos de cncer de mama, tratados no Hospital do Cncer Instituto do Cncer do Cear no perodo de janeiro de 2000 a dezembro de 2006. b) Avaliar a imunoexpresso de fatores de crescimento e seus receptores (EGFR, EGF, PDGF, PFGFRA, VEGFA, VGFR2, FGF2, FGFR2) e de fatores relacionados inflamao (COX2, NOS2, IL1, TLR-9) em cncer de mama triplo-negativo. c) Investigar o padro de distribuio demogrfica e de metastatizao dos tumores triplo-negativos comparando os subgrupos basal e no- basal. d) Avaliar a sobrevida de pacientes portadoras de tumores de mama triplo-negativos diferenciando entre os subgrupos de pacientes portadores de tumores basal e no-basal. e) Correlacionar o padro de expresso dos marcadores acima descritos com a sobrevida de todos os portadores de cncer de mama triplo-negativo e seus subgrupos (basal e no-basal).

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3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Casustica

A populao deste estudo o conjunto de todos os casos de neoplasia maligna de mama no sexo feminino, submetidos avaliao imunoistoqumica para receptor de estrgeno (RE), receptor de progesterona (RP) e ERBB2, registrados nos arquivos de Laboratrio Prof. Livino Pinheiro, do Hospital do Cncer Instituto do Cncer do Cear, no perodo de janeiro de 2000 a dezembro de 2006, sendo ao todo avaliados 5.625 laudos de imunoistoqumica. Como, nessa poca, raramente se fazia no hospital imunoistoqumica de imediato para esses trs marcadores, inicialmente apenas o RE, foram selecionados 683 casos que apresentaram imunorreao negativa para pelo menos um desses marcadores.

Foram encontrados 127 pacientes com painel imunohistoqumico triplo- negativo previamente definido. Dentre eles, 27 pacientes no tinham material histolgico disponvel no laboratrio do ICC, sendo, portanto, excludos. Dos 100 restantes, 62 foram submetidos avaliao do material pelo mtodo de microarranjo tecidual (TMA), no Hospital AC Camargo. Aps a anlise, 10 pacientes foram ainda excludos: um por tratar-se de um caso de melanoma associado, outro por ter sido submetido a tratamento com tamoxifeno, 6 porque apresentavam positividade para ERBB2 e 2 pacientes no possuam dados demogrficos no pronturio. Restaram 52 pacientes deste grupo inicial de tumores triplo-negativos que foram ento includos no estudo.

Cento e vinte e um pacientes tinham RE e RP negativos e no haviam sido submetidos anlise de ERBB2. Aps realizao do exame, 21 pacientes foram excludos por apresentar positividade do ERBB2 e 60 pacientes foram excludos por no haver blocos de parafina disponveis no ICC. Entre os 40 restantes, 5 foram enviados ao TMA, e destes, 3 foram excludos por tratar-se de ERBB2 positivo.

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Apenas 2 pacientes deste grupo inicial de RE e RP negativos foram, ento, includos no estudo.

Duzentos e doze pacientes tinham apenas o RE negativo, sem avaliao de RP ou ERBB2. Dentre eles, 118 tinham material histolgico indisponvel no Instituto do Cncer e, em uma paciente, o exame RE negativo foi obtido aps resposta patolgica completa, sendo desconsiderado. Dos 93 pacientes restantes, 25 foram submetidos avaliao de RP e ERBB2, sendo 17 deles triplo negativos, dos quais 15 foram enviados ao TMA. Aps anlise no TMA destes 15 pacientes, 4 foram excludos: 2 pacientes fizeram tratamento com tamoxifeno, 2 tinham na verdade ERBB2 positivo, restando 11 pacientes includos no estudo. Outras quinze amostras de pacientes do grupo RE negativo inicial foram enviadas ao TMA antes de avaliar RP e ERBB2 no ICC; destes, 7 eram ERBB2 positivo, um paciente ERBB2 inconclusivo e 2 foram submetidos a tratamento com tamoxifeno, restando 5 pacientes aptos ao presente estudo.

Dos duzentos e dezoito pacientes restantes da amostra inicial de 683, que apresentavam no laudo imunostoqumico para RE ou RP positividade focal, foi possvel revisar e enviar para o TMA o material de apenas quatro pacientes. Essas quatro amostras foram confirmadas como triplo-negativas sendo, ento, includas no presente estudo. O planejamento inicial era revisar todos os casos diagnosticados como positividade focal, considerando que, luz dos conhecimentos atuais, essa classificao no mais utilizada. No houve, entretanto, tempo hbil para faz-lo.

Cinco pacientes que estavam inclusos no grupo enviado anlise no TMA foram excludos, um por apresentar carcinoma ductal in situ, um outro por apresentar tumor filodes, um terceiro portador de doena de Paget e outros dois por apresentarem outras neoplasias como: carcinoma espinocelular e adenocarcinoma gstrico.

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Ao todo, 106 pacientes foram submetidos anlise e validao atravs do TMA, restando 74 pacientes aptas para incluso no estudo, vide figura 4, o que obviamente no representa a incidncia real de tumores triplo-negativos nesta instituio.

RE 212

RP e ERB2

Material indisponvel

118

94 Excludo por RPC

1

93 Enviados ao TMA

15

Excludos 10

TMA vlido Triplo

5

Entrada no estudo

Enviados ao TMA Triplo

15

Excludos 4

Entrada no estudo

TMA vlido 11

RE focal ou RP focal

218

Enviados ao TMA

4

TMA vlido Triplo

4

Entrada no estudo

RE e RP 121

ERB2 + 21

Sem material disponvel

60

Duplo negativo

40

Perdidos 35

Enviado ao TMA

5

Excludos 3

TMA vlido

2 Entrada no

estudo

Excludos

61

Triplo 127

Excluidos 27

100 Enviados ao TMA 62

Excludos 10

TMA vlido

Triplo

Entrada no estudo

No enviados ao

estudo

Figura 4: Fluxograma de incluso e excluso dos casos de carcinoma de mama participantes do estudo

Laudos iniciais 5625

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3.2 Coleta de dados

Foi confeccionada ficha para coleta de dados, contendo dados referentes paciente, como idade, raa, histrico familiar de cncer de mama e/ou ovrio, caractersticas morfolgicas do tumor (tipo histolgico, grau de diferenciao de Scarf, Bloom e Richardson, grau nuclear de evoluo, e ainda invaso linftica e/ou vascular), estadiamento clnico e patolgico, tratamentos (cirrgico, radioterpico, quimioterpico neo-adjuvante e adjuvante), intervalo livre de doena, stios de recidiva/metstase e sobrevida (vide anexo I), e realizada a coleta de dados nos pronturios sob guarda do servio de arquivo mdico e estatstica Same do Hospital do Cncer ICC.

3.3 Confeco de bloco para TMA (Tissue Microarray) e preparo das lminas

Aps a confirmao histolgica do diagnstico de carcinoma ductal infiltrante da mama, procedeu-se a seleo de reas representativas de 74 casos, nas lminas coradas por HE. Para seleo das reas a serem amostradas foi escolhido um corte de cada caso. A seguir, foi feita marcao da melhor rea na lmina e de sua rea correspondente no respectivo bloco de parafina, os chamados blocos doadores. Retirou-se um cilindro 1 mm de dimetro de cada bloco doador, que foi, por sua vez, transferido para um outro bloco de parafina chamado bloco receptor, empregando-se um tissue microarrayer apropriado (Beecher Instruments Micro Array Technology, NJ, EUA). Foi desta forma, confeccionado um nico bloco de parafina micro-arranjo tecidual (Tissue microarray - TMA), o qual continha amostras de todos os casos inicialmente selecionados. Vide Figura 5

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Figura 5 Tissue microarrayer apropriado (Beecher Instruments Micro Array Technology, NJ, EUA) Laboratrio Experimental Fundao Antonio Prudente So Paulo

O bloco receptor final continha 106 amostras de tumores de mama, 71 classificados como triplo-negativos pelos dados do Laboratrio Prof. Livino Pinheiro, do Hospital do Cncer Instituto do Cncer do Cear e um segundo grupo formado de 35 amostras de tumores classificados como duplo-negativos (RE e RP negativos nos quais no havia sido testado o produto do oncogene ERBB2). As amostras deste bloco foram ento inicialmente submetidas imunoistoqumica para RE, RP e ERBB2, no Laboratrio de Patologia Experimental da Fundao Antnio Prudente, e reavaliadas por patologista com experincia no diagnstico dos tumores de mama (Dr. Fernando Soares), para verificao da classificao inicial. Do primeiro grupo, foram excludas onze amostras, oito por no apresentarem reao de boa qualidade

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para o ERBB2 e trs por apresentaram reao positiva para o ERBB2. Do segundo grupo foram excludas nove amostras, quatro porque a reao para ERBB2 foi inconclusiva, outras quatro por apresentarem positividade para este anticorpo. Para uma outra amostra desse grupo, far-se-ia necessria a realizao de reao de FISH, por apresentar marcao classificada como escore 2+, ou seja, indeterminada, tendo-se decidido pela excluso deste caso. Portanto, nosso bloco de TMA formado com 86 amostras de tumores triplo-negativos, destes 74 fizeram parte do estudo, composto por anlise por imunoistoqumica dos marcadores e anlise de dados demogrficos (vide fluxograma e figuras 4 e 6).

Figura 6 (a ) Bloco de TMA contendo amostra utilizada do presente estudo frente e verso e (b) lmina corada por HE contendo amostras utilizadas neste estudo.

O preparo das lminas seguiu padronizao do Laboratrio de Patologia Experimental da Fundao Antnio Prudente So Paulo SP, sendo detalhado da maneira que se segue.

Aps colocar uma fita adesiva contra o bloco de TMA, foram realizados os cortes deste bloco de TMA, sendo o mesmo cortado em micrtomo rotativo na espessura de 5m. A fita adesiva com o material foi colado na lmina apropriada (Instrumedics Inc.) e com a presso manual de um rolo. A lmina com a fita adesiva

a) b)

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sofreu irradiao com o ultravioleta (UV) por trinta minutos, sendo em seguida mergulhada em soluo solvente (TPC fornecido pelo fabricante do kit de TMA Instrumedics Inc USA) e seca em temperatura ambiente. As fitas adesivas foram retiradas aps a secagem. As lminas aps sofrerem banho de parafina, estavam prontas para armazenamento em freezer.

Para a confeco de lminas para imunoistoqumica, as lminas foram inicialmente submetidas desparafinizao, composta de diversas etapas detalhadas a seguir. As lminas contendo os cortes histolgicos foram imersas em xilol a 60C durante 20 minutos, aps haverem permanecido por 24 horas em estufa a 60C. A seguir foram imersas em xilol temperatura ambiente por perodo de 20 minutos e, posteriormente, reidratadas em etanol em concentraes decrescentes: 100% por 30 segundos, 85% por 30 segundos e 70% durante 30 segundos.

Aps a desparafinizao, as mesmas foram lavadas seguidamente em gua corrente e destilada. As lminas foram colocadas em panela de presso (Eterna, Nigro) contendo tampo citrato 10mM pH=6.0 fervente. Em seguida a panela foi lacrada com a vlvula de segurana aberta. Aps a sada do vapor saturado, foi abaixada a vlvula de segurana e aguardada a pressurizao total, cronometrou-se ento 4 minutos aps este momento.

Em seguida deixou-se a panela fechada sob gua corrente at a despressurizao total, destampando-a e lavando as lminas em gua corrente e destilada em sequncia.

Procedeu-se o bloqueio da peroxidase endgena com H2O2 a 3,0%, (gua oxigenada 10 vol) com 3 lavagens de 10 minutos cada. Lavou-se em gua corrente e destilada e, depois, com soluo salina tamponada com fosfato (PBS - phosphate buffered saline) 10mM pH=7.4 por 5 minutos.

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As lminas foram incubadas com o anticorpo primrio diludo em ttulo pr-estabelecido, conforme tabela abaixo, em PBS contendo albumina bovina (BSA) 1% (Sigma, A9647, EUA) e azda sdica (NaN3) 0,1%, por 18 horas, a 4C, em cmara mida. Os anticorpos anti-RE, anti-RP, anti-ERBB2, anti-CK5, anti-CK-14, anti-p63, anti-EGFR e anti-COX2 j haviam sido previamente padronizados pelo Departamento de Patologia Clnica para rotina laboratorial ou para outros projetos. Os demais anticorpos precisaram ter seus ttulos e condies de marcao padronizadas para este estudo, para tal contamos com o auxlio do Dr. Rafael Malagoli. Foi excluda do estudo a anlise do fator de necrose tumoral, TNF, devido impossibilidade de titulao do anticorpo no laboratrio de patologia experimental da Fundao Antonio Prudente.

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Quadro 1 Relao de anticorpos utilizados, clone utilizado, titulao, fabricante e pas.

Anticorpo Clone Ttulo Fabricante e Nmero de

Catlogo

Receptor de Estrgeno Monoclonal de coelho SP1 1:4000

Neomarkers # RM9101,Fremont,CA,EUA

Receptor de Progesterona PgR636 1:300 Dako # M3569, Carpinteira, EUA

C-erbB2 Policlonal de coelho A-485 1:2000

Dako #A048, Glostrup, Dinamarca

Citoqueratina 5 XM26 1:300 Neomarkers #MS 1896

Citoqueratina 14 LL002 1:400 Biogenex # MU146-UC

p63 4A4 1:500 Dako # M7247

EGFR EGFR-25 1:100 Novocastra #NCLEGFR-384

VEGFA SC-152 1:100 Santa Cruz Biotechnology, Inc. USA.

COX2 Monoclonal de

rato 4H12

1:6000 Novocastra #NCL-COX2,

Newcastle upon Tyne, Reino Unido

VEGFR2 Policlonal de coelho 1:100 Neomarkers # RB239

FGF2 Policlonal de coelho 1:500

Chemicon # AB1459

PDGF Policlonal de coelho 1:50 Neomarkers # 9257

PDGFR alfa Policlonal de coelho 1:50 Neomarkers # Rb 9027

PDGFR beta Policlonal de coelho 1:50 Neomarkers # 9032

NOS2 Clone 6 1:100 BD Biosciences,# 610238 USA

TLR9 Monoclonal de rato Abcam # 26C593, USA

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A seguir foram lavadas 3 vezes em PBS durante 3 min cada lavagem, e em seguida incubadas por trinta minutos a 37C com anticorpo secundrio (Novolink Pos Primary antibody - Novolink Max Polymer cod # RE720k, Reino Unido).

Posteriormente foram lavadas 3 vezes com PBS por trs minutos cada lavagem, e, aps esta fase, incubadas com Novolink Polimer (Leica Microsystems Inc.) por 30 minutos a 37C. A seguir, foram novamente lavadas 3 vezes em PBS durante 3 minutos cada lavagem. Em seqncia, as lminas foram incubadas em soluo substrato (3,3 Diaminobenzidine Tetrahydrochloride) (DAB) 100 mg% (Sigma, D-5637-EUA); 1,0 ml de Dimetilsulfxido (JT Baker, Phillipsburg, NJ, EUA); 1,0 ml de H2O2 6%, gua oxigenada 20 vol, (Quimesp, Guarulhos, SP),100 ml de PBS (manipulao prpria); por 5 minutos a 37C, ao abrigo da luz.

Ao final desta etapa, verificou-se ao microscpio se houve o desenvolvimento de colorao castanho-dourada nas lminas controles, com o padro esperado para cada protena estudada, como produto final da reao. As lminas foram ento lavadas em gua corrente e gua destilada por 3 minutos, contra-coradas com Hematoxilina de Harris por 1 minuto e, a seguir, lavadas em gua corrente e destilada. Foram imersas 2 vezes em gua amoniacal (soluo aquosa de hidrxido de amnio a 0,5%), lavadas em seguida em gua corrente e destilada, e depois desidratadas em etanol em concentraes crescentes, 80%, por 30 segundos, 95%, por 30 segundos e 100% duas vezes, por 30 segundos cada. As lminas foram ento diafanizadas em xilol 4 vezes, por 30 segundos cada e, finalmente, foram montadas em Entellan neu (Merck, 1.07961, Alemanha).

3.4 Caracterizao de tumores triplo-negativos

Aps a confeco do bloco de TMA e das lminas, com intuito de se confirmar a classificao realizada no laboratrio de origem, foi novamente avaliada

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a expresso de receptores de estrgeno e progesterona, alm da pesquisa da protena ERBB2 em todas as amostras selecionadas.

Para o receptor de estrgeno, foi utilizado um anticorpo monoclonal de coelho (Quadro 1) que produz um padro de marcao nuclear na clula epitelial e reconhece uma protena de 67 KDa, identificada como o receptor de estrgeno alfa, um importante regulador do crescimento e diferenciao da glndula mamria (CANO et al,. 2003; HUANG et al., 2004).

Para identificao da presena de receptores de progesterona, foi utilizado anticorpo monoclonal de rato (ELASHRY-STOWERS et al., 1988). Receptores de progesterona podem ser encontrados por imunoistoqumica no ncleo de clulas normais da mama, alm de endomtrio e prstata. Alm dos tumores mamrios, outros tumores do trato reprodutivo feminino tambm podem expressar receptores de progesterona como carcinoma endometrial, sarcoma endometrial, meningeoma e tecoma ovariano dentre outros (BRANDIS et al., 1993).

Para concluir a classificao dos tumores como triplo-negativo, foi realizada a imunomarcao da protena ERBB2, para o que se utilizou um anticorpo policlonal de coelho (Quadro 1). O anticorpo em estudo marca aproximadamente 20% dos tumores mamrios, ovarianos e do trato gastrintestinal. Diferentemente dos anticorpos de receptores de estrgeno e progesterona que marcam o ncleo, a marcao da ERBB2 membranar, com marcao ocasional do citoplasma. A hiperexpresso do ERBB2 relacionada a um risco elevado de recidiva tanto em pacientes portadores de tumores positivos para receptores hormonais, bem como tumores negativos para tais receptores. A definio da hiper-expresso do ERBB2 ainda alm de importante fator prognstico, um valioso marcador de fator preditivo (SLAMON et al., 2001).

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3.5 Identificao de tumores triplo-negativos basais e no basais.

No h consenso na literatura para caracterizao de tumores basais. Em nosso estudo, utilizamos a citoqueratina 5 (CK5) e o receptor do fator de crescimento epidrmico (EGFR) para identificar os tumores basais, havendo necessidade de expresso de um destes dois marcadores para tal classificao. Foi avaliada tambm a expresso da citoquertina 14 (CK14) e da protena p63. Nas anlises dos dados avaliamos tambm a associao dos marcadores e do prognstico, quando os tumores foram classificados usando-se estas protenas ou empregando-se apenas um dos marcadores previamente selecionados para subclassificao (EGFR e CK5).

Para estudar a positividade para CK5 foi utilizado um anticorpo monoclonal de rato (Quadro 1). A CK5 tem peso molecular de 58 KDa, sendo encontrada em tecido epitelial e mesotelioma, com marcao citoplasmtica (CLOVER et al., 1997).

A pesquisa do EGFR foi realizada com um anticorpo monoclonal de rato (Quadro 1). O anticorpo citado detecta o antgeno na membrana e muitas vezes no citoplasma de diversos tumores, a exemplo de (pulmo, pele, colo uterino, rim, endomtrio, tireide e coln, alm dos carcinomas mamrios (TISCHKOWITZ et al., 2007).

A citoqueratina 14 uma protena com peso molecular de 50 kDa, sendo encontrada em clulas do epitlio escamoso estratificado e clulas basais e parabasais do epitlio escamoso no-queratinizado do trato urinrio adulto. No tecido tumoral mamrio, encontrada nas clulas basais, sendo importante para estudo do prognstico do carcinoma de mama. Para sua anlise foi utilizado um anticorpo monoclonal de rato (Quadro 1).

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Para identificao da protena p63, foi utilizado um anticorpo monoclonal de rato (Quadro 1). A p63 faz parte da famlia da protena p53, e sua localizao predominante na camada basal do epitlio escamoso estratificado. Esse anticorpo apresenta um padro nuclear de imunomarcao.

Para anlise de todas as imunomarcao foi tomada como padro de positividade mnima de 10%.

3.6 Imunoistoqumica de marcadores relacionados a fatores de crescimento e inflamao.

Aps a classificao dos tumores mamrios triplo-negativos em basais e no-basais avaliou-se a expresso de alguns fatores de crescimento, bem como de fatores relacionados inflamao. No que diz respeito aos fatores de crescimento, foram estudados o fator de crescimento epidrmico (seu receptor, EGFR, foi pesquisado na etapa de classificao dos tumores basais), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e seus receptores PDGFRA e PDGFRB, fator de crescimento de fibroblastos (FGF2) e seu receptor FGFR2, fator de crescimento do endotlio vascular (VEGFA) e seu receptor VEGFR2. Quanto aos fatores relacionados inflamao, foram estudadas a Cicloxigenase-2 (COX2), a interleucina-1 beta (IL1B), a xido ntrico sintase induzida (NOS2) e ainda o Toll-like receptor 9 (TLR9). Todos esses marcadores foram pesquisados na clula neoplsica, no tendo sido valorizado a expresso em clulas inflamatrias infiltrantes e clulas do estroma.

3.7 Imunomarcao para fatores de crescimento.

O Fator de Crescimento Epidrmico (EGF) uma protena de 170 KDa e tem importante ao na diferenciao de clulas in vivo e um potente efeito

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mitognico em um grande nmero de culturas de clul