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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Anna Karolina Cruz Duarte
ANÁLISE METABOLÔMICA DE CÁLICES DE HIBISCO (Hibiscus sabdariffa L) E
AVALIÇÃO FITOQUÍMICA E ANTIOXIDANTE IN VITRO DE SUAS INFUSÕES
Diamantina
2019
Anna Karolina Cruz Duarte
ANÁLISE METABOLÔMICA DE CÁLICES DE HIBISCO (Hibiscus sabdariffa L) E
AVALIÇÃO FITOQUÍMICA E ANTIOXIDANTE IN VITRO DE SUAS INFUSÕES
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como requisito para obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Harriman Aley Morais Coorientadora: Prof.a Dr.a Cristiane Fernanda Fuzer Grael
Diamantina
2019
a
Dedico este trabalho à luz dos meus olhos, à
minha alegria de viver: minha irmã Anna
Paula, aos meus amados pais Paulo César e
Vanda (im memoriam) aos meus amigos e ao
meu amor Geidson Vitor por todo amor,
carinho e apoio.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, milagre supremo de amor. Que do teu Sagrado Coração fez
morada onde me abriguei no tempo de dor e de onde tirei forças para seguir meu caminho.
A minha mãe, Vanda (in memoriam) que desde o berço me amou e me preparou para enfrentar
todos os espinhos do caminho em busca da minha felicidade e que, dos céus agora, me
acompanha e torce por mim!
Ao meu pai, Paulo Cesar (Chopinho), pelo amor, apoio, carinho, suporte e força.
A minha irmã e afilhada Anna Paula por estar presente em todos os momentos, a minha avó
Alaide, as minhas tias Verônica e Marlene, minhas madrinhas Valéria e Celme por cuidarem
de mim como filha. Família, vocês são meu porto seguro!
Agradeço ao meu amor Geidson Vitor e as minhas amigas Rosana, Cristiane e Adriana por
sentirem minha dor comigo e não terem permitido que eu desistisse. Saibam que a vida seria
infinitamente mais triste e difícil sem a presença de vocês.
Ao professor, orientador e amigo Harriman Aley Morais, por seu exemplo de profissionalismo
e competência. Por despertar em mim um novo modelo pessoal e profissional: mais real, mais
leal, mais humano, mais amigo, mais verdadeiro e mais feliz. Não tenho palavras para
agradecer a compreensão, apoio e paciência com que me conduziu ao término deste trabalho.
À Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, minha casa desde a graduação!
Em especial à Engenharia de Alimentos, por despertar em mim esta paixão, ao Programa de
Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos (PPGCTA) por ter me recebido.
Agradeço aos Departamentos de Farmácia e de Ciências Básicas pelo apoio, compreensão e
utilização dos equipamentos, em especial as servidores e amigos Kelly, Vivianne, Dayana,
Ricardo e Gabriela pelo suporte ao longo do mestrado.
Ao Mauro, pela disponibilidade e auxílio prestado no tratamento estatístico dos dados.
A banca examinadora, que se dispôs a enriquecer este trabalho com toda a sabedoria que lhes
cabe.
A todos que, de alguma forma contribuíram para a realização deste sonho.
Sou mestre!
Mas não é possível segurar o tempo. Em relação a ele, a única coisa de que podemos nos apropriar é a
experiência que ele nos permite construir o tempo todo. O que você vai fazer com esse tempo que vai passando?
O que você está fazendo com esse tempo que está passando? Para mim, essa reflexão é a chave geral que “liga” a lucidez das
escolhas. (ARANTES, 2016, p. 47).
RESUMO
A comunidade acadêmica têm estudado exaustivamente o hibisco devido às diversas alegações
de saúde relacionadas à sua rica composição, como antihipertensiva, antitumoral,
antimicrobiana, diurética dentre outras, ocasionando um crescimento exponencial em seu
consumo, especialmente na forma de chá. Espera-se que durante o processo de infusão, os
compostos fenólicos presentes no cálice do hibisco migrem para bebida conferindo a esta suas
propriedades. Logo o presente trabalho se dividiu em duas etapas: A primeira objetivou detectar
e identificar os principais compostos presentes no chá de hibisco comercial, por espectrometria
de massas com ionização por paper spray. A segunda etapa foi realizar o delineamento
composto central rotacional visando avaliar a influência dos parametros temperatura, tempo de
infusão e volume de água no teor de compsotos fenólicos, flavonóides, na atividade
antioxidante e na presença de classes de compostos através da triagem fitoquímicaAs mesmas
serão apresentadas na sessão cinco, nos capítulos 1 e 2 no formato de artigo. Os resultados do
delinemento experimental não convergiram para um ponto ótimo de extração, porém foi
possível observar a influência significativa dos parâmetros escolhidos nas variáveis resposta.
Quanto à espectrometria de massas, A análise do PS-MS nos modos positivo e negativo
permitiu a identificação de várias substâncias, entre elas, ácidos orgânicos, açúcares,
flavonoides e antocianinas como luteolina 7-O- diglucuronideo, delfinidina-3-O-hexosideo,
cianidina-3-O-sambubiosídeo, dentre outros, sendo possível comprovar a presença de diversos
compostos bioativos na infusão comercial.
Palavras chave: Hibiscus sabdariffa L. DCCR. Compostos fenólicos, PS-MS
ABSTRACT
The academic community has extensively studied the hibiscus because of the various health
claims related to its rich composition, such as antihypertensive, antitumor, antimicrobial,
diuretic among others, causing an exponential growth in its consumption, especially in the form
of tea. It is expected that during the infusion process, the phenolic compounds present in the
calyx of the hibiscus migrate to the beverage conferring thereon their properties. The present
work was divided in two stages: First, to detect and identify the main compounds present in
commercial hibiscus tea, following the manufacturer's guidelines, by mass spray ionization
mass spectrometry. The second step was to perform the central rotational compound design
aiming to evaluate the influence of parameters temperature, infusion time and water volume on
the content of phenolic compounds, flavonoids, antioxidant activity and the presence of classes
of compounds through phytochemical screening. They will be presented in session five,
chapters 1 and 2 in the article format. The results of the experimental delineation did not
converge to an optimal point of extraction, but it was possible to observe the significant
influence of the parameters chosen in the response variables. Analysis of PS-MS in the positive
and negative modes allowed the identification of various substances, including organic acids,
sugars, flavonoids and anthocyanins such as 7-O-diglucuronide luteolin, delphinidin-3-O-
hexoside, cyanidin-3-O-sambubioside, among others, and it is possible to prove the presence
of several bioactive compounds in the commercial infusion.
Keywords: Hibiscus sabdariffa L. DCCR. Phenolic compounds, PS-MS
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 19 2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 21
2.1 Objetivo geral ................................................................................................................... 21 2.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 21 3. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................... 23
3.1. Breve Histórico sobre os Chás ............................................................................. 23
3.2. Hibisco (Hibiscus sabdariffa L.): características gerais .................................... 24
3.3. Metabolismo secundário: aspectos gerais ........................................................... 26
3.3.1. Compostos fenólicos ............................................................................................... 29
3.4. Alegações de saúde dos compostos bioativos do hibisco .................................... 32
3.4.1. Propriedade antioxidante ....................................................................................... 33 3 METODOLOGIAS ............................................................................................................ 37
3.1 Matéria-prima .................................................................................................................. 37
3.2 Análise metabolômica do hibisco por espectrometria de massa ................................. 37
3.3 Delineamento experimental da atividade antioxidante ................................................ 38
3.4 Preparação das amostras ................................................................................................ 40
3.5 Triagem fitoquímica ........................................................................................................ 40
3.5.1 Açúcares redutores ........................................................................................................ 40
3.5.2 Alcaloides ....................................................................................................................... 40
3.5.3 Aminoácidos ................................................................................................................... 41
3.5.4 Antraquinonas ............................................................................................................... 41
3.5.5 Esteróides ....................................................................................................................... 41
3.5.6 Fenol .............................................................................................................................. 41
3.5.7 Flavonoides .................................................................................................................... 41
3.5.8 Glicosídeos cardíacos..................................................................................................... 42
3.5.9 Saponinas ....................................................................................................................... 42
3.5.10 Taninos ......................................................................................................................... 42
3.5.11 Terpenos/terpenóides ................................................................................................... 43
3.6 Determinação do teor de compostos fenólicos totais .................................................... 43
3.7 Determinação do teor de flavonoides totais .................................................................. 43
3.8 Avaliação da atividade antioxidante .............................................................................. 44
3.9 Análise estatística ............................................................................................................. 44 REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 45
4 CAPÍTULO 1 – ANÁLISE METABOLÔMICA DE HIBISCO (Hibiscus sabdariffa L.) USANDO ESPECTROMETRIA DE MASSA POR PAPER-SPRAY .............................. 55
RESUMO ................................................................................................................................ 55
ABSTRACT ............................................................................................................................ 56
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 56
2 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 57
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 59
4 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 65
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 65 CAPÍTULO 2 – OTIMIZAÇÃO DO TEMPO DE INFUSÃO, TEMPERATURA E VOLUME DE ÁGUA NA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE CHÁ DE HIBISCO (Hibiscus sabdariffa L.) .......................................................................................................... 71
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 72
2 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 73
2.1 Reagentes e amostra ................................................................................................... 73
2.2 Otimização multivariada ........................................................................................... 73
2.3 Preparação das bebidas ............................................................................................. 73
2.4 Triagem fitoquímica ................................................................................................... 74
2.5 Determinação do teor de compostos fenólicos totais ............................................... 74
2.6 Determinação do teor de flavonoides totais ............................................................. 74
2.7 Avaliação da atividade antioxidante ......................................................................... 75
2.8 Análises estatísticas .................................................................................................... 75
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 75
3.1 Otimização multivariada ........................................................................................... 75
3.2 Triagem fitoquímica ................................................................................................... 76
3.3 Teor de compostos fenólicos totais ............................................................................ 78
3.4 Teor de flavonoides totais .......................................................................................... 82
3.5 Avaliação da atividade antioxidante ......................................................................... 84
4 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 89
REFERENCIAS ..................................................................................................................... 89 Anexo I– Graficos de superfície de resposta para para o teor de compostos fenólicos totais nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa, para a amostra HS1 (A, B e C) . 94 Anexo II– Graficos de superfície de resposta para para o teor de compostos fenólicos totais nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa, para a amostra HS2 (A, B e C) . 95 Anexo III – Graficos de superfície de resposta para para o teor de flavonóides totais nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa, para as amostras HS1 (A, B e C)..... 96 Anexo IV – Graficos de superfície de resposta para para o teor de flavonóides totais nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa, para as amostras HS2 (A, B e C)..... 97
3
Anexo V – Graficos de superfície de resposta para para o teor de atividade antioxidante pelo método DPPH expresso em % de Inibição nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus
sabdariffa, para as amostras HS1 (A, B e C) ....................................................................... 98 Anexo VI – Graficos de superfície de resposta para para o teor de atividade antioxidante pelo método DPPH expresso em % de Inibição nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus
sabdariffa, para as amostras HS2 (A, B e C) ....................................................................... 99 Anexo VII – Graficos de superfície de resposta para para o teor de atividade antioxidante pelo método DPPH expresso em EAGmg. L-1 nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus
sabdariffa, para as amostras HS1 (A, B e C) ..................................................................... 100 Anexo VIII – Graficos de superfície de resposta para para o teor de atividade antioxidante pelo método DPPH expresso em EAGmg. L-1 nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus
sabdariffa, para as amostras HS2 (A, B e C) ..................................................................... 101
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1. INTRODUÇÃO
Os chás são uma das bebidas mais consumidas entre diferentes povos, seja por fins
de prevenção a doenças, religiosos, curativos e, até mesmo, simplesmente pelo fato de
apresentarem sabores e aromas que agradam aos mais exigentes dos consumidores. Com
relação as suas propriedades de saudabilidade, a literatura científica é repleta de estudos que
denotam a presença dos compostos fenólicos como as principais substâncias relacionadas aos
seus efeitos benéficos, sendo que, na atualidade, o chá de hibisco (Hibiscus sabdafira L.) tem
recebido muita atenção, tanto da mídia, quanto do meio científico.
Há evidências científicas de que o chá de hibisco contribui para a melhoria da saúde,
em virtude de suas propriedades antioxidantes e antimutagênicas e, especialmente entre as
pessoas comuns, têm-se difundido a ideia de que o consumo deste produto também auxilia no
controle do peso corporal. Porém, apesar dos vários relatos científicos que avaliaram as
propriedades do hibisco (planta e seus derivados), nos mais diversos tipos de extratos
(metanólico, etanólico, aquoso, hidroalcóolico, dentre outros), observou-se uma escassez de
pesquisas com o chá em sua forma comercial, que afinal é a forma na qual a maior parte das
pessoas tem acesso ao produto.
Diante desta realidade surgiu a inquietação para o desenvolvimento desta
dissertação, isto é, estudar como os diferentes parâmetros empregados no preparo de chás
(tempo de infusão, temperatura e quantidade de água) poderiam influenciar na extração de
maior quantidade de compostos antioxidantes e, paralelamente, tentar identificar quais as
substâncias presentes nas amostras, por meio da espectrometria de massas.
Finalmente, ressalta-se que esta dissertação foi elaborada conforme o Manual de
Normalização de Trabalhos Acadêmicos da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha
e Mucuri – UFVJM (2016), sendo o trabalho estruturado da seguinte maneira:
1. Introdução, que acaba de ser apresentada.
2. Seção de objetivos.
3. Referencial teórico, apresentado no formato tradicional.
4. Seção de métodos.
5. Seção de resultados e discussão, apresentada sob a forma de dois artigos:
a. Análise Metabolômica de Hibisco (Hibiscus sabdariffa L.) Usando
Espectrometria de Massa por Paper-Spray Espectrometria
b. Efeito do Tempo de Infusão, Temperatura e Volume de Água na Atividade
Antioxidante de Chá de Hibisco (Hibiscus sabdariffa L.): Aplicação de DCCR
20
21
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Identificar os principais compostos presentes em amostras desidratadas comerciais de
hibisco e avaliar a propriedade antioxidante de seus extratos aquosos.
2.2 Objetivos específicos
• Preparar diferentes extratos aquosos de hibisco, por meio de delineamento experimental
do tipo composto central rotacional (DCCR), variando os parâmetros temperatura,
tempo de infusão e volume de água.
• Realizar a triagem fitoquímica qualitativa das infusões.
• Determinar do teor de compostos fenólicos totais e de flavonoides das infusões.
• Avaliar a atividade antioxidante in vitro das infusões.
• Detectar e identificar os principais compostos presentes nos cálices de hibisco
desidratados por cromatografia gasosa com espectrometria de massas por paper spray.
22
23
3. REFERENCIAL TEÓRICO
3.1. Breve Histórico sobre os Chás
A origem dos chás, datada por volta de 3000 anos a. C, é permeada por diversas lendas
envolvendo civilizações orientais e indígenas, porém o primeiro registro escrito ocorreu em
torno de 200 a. C já mencionando os efeitos medicinais de sua ingestão como a melhora do
fluxo sanguíneo, eliminação de toxinas e aumento da resistência as mais diversas enfermidades
(PINTO, 2013; BRAIBANTE et al., 2014).
No Brasil, seu consumo, anteriormente relacionado a práticas religiosas e curativas, se
modernizou, levando ao surgimento das primeiras legislações específicas referentes à sua
produção.
Seguindo o consenso mundial, o chá foi definido pela Comissão Nacional de Normas e
Padrões para Alimentos (CNNPA) como o produto constituído pelas folhas novas e brotos de
várias espécies do gênero “Thea”, atualmente englobado pelo gênero “Caméllia”, sendo mais
especificamente a infusão obtida através da Camellia sinensis (BRASIL. 1978).
Uma vez que esta nomenclatura não fazia jus a forma como os chás são consumidos no
Brasil, a referida norma foi revogada, englobando atualmente diversas outras espécies
vegetais,de forma que, atualmente, chá é o produto constituído de uma ou mais partes de
espécie(s) vegetal(is) inteira(s), fragmentada(s) ou moída(s), com ou sem fermentação,
tostada(s) ou não, constantes de Regulamento Técnico de Espécies Vegetais para o Preparo de
Chás. O produto pode ser adicionado de aroma e ou especiaria para conferir aroma e ou sabor.
(BRASIL, 2005).
Farmacologicamente o extrato aquoso de plantas pode ser obtido através da maceração,
onde a planta é amassada e ou picada, vertida em água à temperatura ambiente e mantida
durante tempo oportuno para extração, decocção em que a planta é acrescida ao volume de água
desejado e a mistura é levada a fervura, ou a infusão, método de extração a quente mais
utilizado, em que a planta é vertida em água fervente e a mistura é mantida pelo tempo desejado,
sendo este em torno de três a dez minutos (MELECCHI, 2005). Sendo o ultimo a forma correta
de referenciação ao produto elaborado no presente trabalho.
Nos últimos anos, têm-se demonstrado que a presença de compostos fenólicos nas
infusões conferem-lhes propriedades antioxidantes, que por sua vez tem sido associadas com a
redução do risco de desenvolvimento de diversas doenças crônicas não transmissíveis, como
24
cânceres e patologias do sistema circulatório (NAKAMURA et al., 2013; FERNANDES et al.,
2017).
Atualmente, muita divulgação tem sido dada às propriedades benéficas dos chás,
resultando na ampliação do consumo mundial destas bebidas, especialmente pelas pessoas que
cada vez mais buscam uma alimentação mais natural e saudável. Neste contexto, Neste
contexto, o extrato aquoso de hibisco, popularmente nomeado como chá de hibisco tem se
tornado notório e, dessa forma, foi a matéria-prima selecionada para o desenvolvimento desta
pesquisa, sendo que algumas de suas características foram abordadas neste referencial.
3.2. Hibisco (Hibiscus sabdariffa L.): características gerais
A maior parte das centenas de espécies de hibiscos (Hibiscus spp) é utilizada como
planta ornamental, todavia propriedades medicinais têm sido atribuídas especialmente ao
Hibiscus sabdariffa (FIG. 1). A parte mais importante da planta é o cálice ou bráctea, que já é
utilizado pelas indústrias de alimentos, de bebidas e farmacêuticas como matéria-prima para
elaboração de alimentos e como fonte natural de corantes. Ele pode ser empregado na
elaboração de bebidas (chás e sucos), geleias, pastas, doces, xaropes e vinhos, vinagre, molhos
ou ser consumidos in natura. Já as flores, de sabor azedo, são comestíveis e podem ser
desidratadas para a elaboração de doces, produtos de confeitaria ou chás. As folhas, cálices,
sementes e fibras, além da alimentação humana e de animais, são fonte de fibras para a indústria
de tecido e papel (CHEN et al., 2003; NACHTIGALL; ZAMBIAZI; CARVALHO, 2004;
MUKHTAR, 2007; VIZZOTTO; PEREIRA, 2008; OLIVEIRA et al., 2013; ALAM et al.,
2018).
Figura 1 – Cálice ou brácteas da Hibiscus sabdariffa L
Fonte: VIZZOTTO; PEREIRA (2008).
25
A Hibiscus sabdariffa L., planta da família Malvaceae, é originária da Índia, do Sudão
e da Malásia, sendo posteriormente levada para a África Oriental e países da América Central
e encontra-se amplamente distribuída nas regiões tropicias e subtropicas do globo terrestre
(YAMAMOTO et al., 2007; VIZZOTTO; CASTILHO; PEREIRA, 2009; HUANG et al., 2015;
ALAM et al., 2018). É cultivada desde o nível do mar até 900 m de altitude e requer distribuição
de chuva entre 800 a 1.600 mm e temperaturas variando de 18 a 35 ºC (YAMAMOTO et al.,
2007; FREITAS; SANTOS; MOREIRA, 2013).
Esta espécie é popularmente chamada no Brasil de hibisco, hibiscus, vinagreira, rosela,
rosélia, groselha, groselheira, azedinha, quiabo azedo, caruru-azedo, caruru-da-guiné, quiabo-
de-angola, quiabo-róseo, quiabo-roxo, pampolha, pampulha, papoula, papoula-de-duas-cores,
sendo que em outros países tem como sinonímia rosa da Jamaica, chá de Jamaica, red sorrel ou
Jamaica sorrel, cardade, afrikanische, bissap, karkade, mesta, lal ambari, patwa, amta, amti,
malve ou roselle (YAMAMOTO et al., 2007; VIZZOTTO; CASTILHO; PEREIRA, 2009;
HUANG et al., 2015; ALAM et al., 2018).
É um arbusto lenhoso perene, de ciclo anual, que pode atingir mais de 1,80 m de altura.
Suas flores têm de 8 a 10 cm de diâmetro, com base levemente amarelada e uma pronunciada
mancha vermelha escura na base de cada pétala. Seu cálice carnudo e robusto na base varia de
1 a 2 cm de largura, ampliando de 3,0 a 3,5 cm, de coloração vermelho vivo quando o fruto
amadurece (YU et al., 2016; ALAM et al., 2018; RIAZ; CHOPRA, 2018).
O cálice do hibisco, parte comumente utilizada para a elaboração do chá, contém
polissacarídeos (pectina) e açúcares redutores (como a glicose e a frutose), minerais (cálcio,
ferro, magnésio e potássio), vitaminas (niacina, riboflavina, ácido ascórbico, vitamina A) e
ácidos orgânicos (tartárico, succínico, málico, oxálico, cítrico e hibíscico), além de quantidade
significativa de fibras alimentares (VIZZOTTO; PEREIRA, 2008; ABOU-ARAB; ABU-
SALEM; ABOU-ARAB, 2011; FREITAS; SANTOS; MOREIRA, 2013; PURO et al., 2014).
Além disso, vários estudos já detectaram a presença de diversos metabólitos secundários
(saponinas, taninos, esteroides, flavonoides) aos quais são atribuídos diversas propriedades
bioativas ao hibisco, disseminando-se seu uso como agente diurético, uricosúrico,
antimicrobiano, leve laxante, sedativo, anti-hipertensor, antitússico, hipolipidêmico,
antioxidante, antimutagênico, antitumoral e antileucêmico (VIZZOTTO; PEREIRA, 2008;
FREITAS; SANTOS; MOREIRA, 2013).
26
3.3. Metabolismo secundário: aspectos gerais
O metabolismo é definido como o conjunto total das transformações das moléculas
orgânicas, catalisadas por enzimas, que ocorre nas células vivas, suprindo o organismo de
energia, renovando suas moléculas e garantindo a continuidade do estado organizado
(MARZZOCO; TORRES, 2014). Divide-se em metabolismo primário, que é o conjunto de
reações relacionadas à produção das principais macromoléculas (carboidratos, lipídeos,
proteínas e ácidos nucléicos) e está presente em todos os seres vivos, e metabolismo secundário,
que é responsável pela produção de compostos orgânicos, de baixo peso molecular, com
funções biológicas próprias da sobrevivência de organismos específicos como
microorganismos e plantas (SANTOS, 2007).
O desenvolvimento das rotas metabólicas secundárias acompanhou o processo
evolutivo do reino vegetal determinado por necessidades ecológicas. Os metabólitos têm
funções de proteção da planta contra herbívoros, agentes patógenos (fungos, bactérias, vírus,
insetos) e agentes externos (temperatura, umidade, raio ultravioleta, dentre outros), servem
como atrativos (aroma, cor, sabor) de polinizadores ou animais dispersores de semente, e
funcionam como agentes de competição entre plantas e de simbiose entre plantas e micro-
organismos (HARTMANN, 2007; SANTOS, 2007; VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010).
Os metabólitos secundários são, em princípio, não essenciais para a vida, mas
contribuem definitivamente para a adaptação das espécies e sua sobrevivência, sendo provável
que a sua importância ecológica tenha alguma relação com potencial efeito medicinal para os
seres humanos. Todavia, a produção destes compostos ocorre em quantidade limitada e está
restrita a fatores intrínsecos e extrínsecos da planta como, por exemplo, condições ambientais,
solo, presença de ameaças, idade e sazonalidade e, além disso, destaca-se que está restrita a
processos químicos únicos para uma dada espécie ou família de vegetal não sendo, portanto,
reações universais (HARTMANN, 2007; SANTOS, 2007; GARCÍA; CARRIL, 2009;
VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010).
Metabólitos secundários nas plantas podem ser divididos em três grupos distintos
quimicamente: terpenos, compostos fenólicos e componentes contendo nitrogênio (alcaloides).
Embora de estruturas diversas, as principais rotas de produção destes compostos derivam do
metabolismo primário do carbono (GARCÍA; CARRIL, 2009; VIZZOTTO; KROLOW;
WEBER, 2010), conforme apresentado na Figura 2.
27
Os terpenos ou terpenoides constituem o grupo mais numeroso de metabolitos
secundários, sendo produzidos a partir do ácido mevalônico (no citoplasma) ou do piruvato e
3-fosfoglicerato (no cloroplasto) através de duas rotas: ácido mevalônico e metilertritol fosfato.
A rota biossintética destes compostos também origina metabólitos primários como hormônios
(giberelinas, ácido abscísico e citoquininas), carotenoides, clorofilas e plastoquinonas
(fotossíntese), ubiquinonas (respiração celular) e esteroides (SANTOS, 2007; GARCÍA;
CARRIL, 2009; VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010).
Apesar de apresentarem diferenças estruturais entre si, todos os terpenos/terpenoides
são basicamente estruturados em blocos de cinco carbonos – unidades de isopreno ou
isopentenilpirofosfato (C5H8), que ligadas entre si dão origem aos monoterpenos (C10),
sequiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30) e os tetraterpenos (C40) (SANTOS,
2007; GARCÍA; CARRIL, 2009; VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010; FELIPE; BICAS,
2017).
Os monoterpenos e sesquiterpenos, com estruturas terpênicas de menor massa
molecular, apresentam volatilidade acentuada, sendo denominados óleos essenciais ou
essências. A função destes compostos nas plantas pode ser tanto para para atrair polinizadores
quanto para repelir insetos e, além disso, estão envolvidos na defesa da planta contra pragas e
doenças. Em virtude da volatilidade, estes compostos apresentam grande importância para o
aroma dos produtos naturais, particularmente de frutas cítricas, ervas aromáticas, especiarias e
condimentos (VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010; FELIPE; BICAS, 2017).
Já as moléculas de tamanho superior aos sesquiterpenos, devido ao tamanho da cadeia,
praticamente não contribuem com o aroma, porém os di- e triterpenos são um dos componentes
principais de oleorresinas obtida de diferentes tipos de plantas, com variada aplicação industrial
(fixador de perfumes, solvente ou matéria-prima para a produção de tintas, graxas e ceras) e
medicinal. No que diz respeito aos tetraterpenos, destacam-se os carotenoides, pigmentos
acessórios da fotossíntese em plantas e que também são responsáveis por conferir a coloração
de diferentes de certos vegetais e alimentos, sendo que alguns apresentam expressiva atividade
antioxidante (VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010; FELIPE; BICAS, 2017).
Os alcaloides são compostos orgânicos cíclicos que possuem pelo menos um átomo de
nitrogênio no seu anel, sendo que estas substâncias atuam na defesa contra herbívoros. Todavia,
são compostos estudados em virtude de possuírem acentuado efeito no sistema nervoso, como
a morfina e a cafeína, por exemple e, além disso, algumas moléculas deste grupo parecem ser
nocivas e até tóxicas em animais e seres humanos (SANTOS, 2007; VIZZOTTO; KROLOW;
WEBER, 2010).
28
Figura 2 – Esquema geral da correlação entre o metabolismo primário e secundário
Fonte: TAIZ; ZEIGER (2013). Adaptado.
Por fim, os compostos fenólicos são uma classe de substâncias que envolvem estruturas
simples e complexas, que por sua diversidade química apresentam diversas funções nos
vegetais: defesa contra herbívoros e patógenos, atrativos de polinizadores, proteção contra
radiação UV, reguladores de enzimas e como agentes de inibição do crescimento de espécies
competitivas (SANTOS, 2007; VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010). Tendo em vista a
diversidade deste grupo, algumas de suas características foram melhor detalhadas neste
referencial, como apresentado a seguir.
CO2
Metabolismo primário do
Fotossíntese
Eritrose 4-fosfato
Fosfoenolpiruvato 3-fosfoglicerato
Ciclo de Krebs Acetil-CoA
Aminoácidos alifáticos
Piruvat
Rota do ácido chiquímico
Rota do ácido malônico
Rota do ácido mevalônico
Rota do metileritritol-fosfato
Aminoácidos aromáticos
Produtos secundários nitrogenados
Compostos fenólicos
Terpenos
Metabolismo secundário do carbono
29
3.3.1. Compostos fenólicos
Quimicamente, os compostos fenólicos são substâncias que possuem pelo menos um
anel aromático no qual ao menos um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila
(VACCARI; SOCCOL; IDE, 2009). Podem ser pigmentos, que dão a aparência colorida aos
alimentos, ou produtos do metabolismo secundário, normalmente derivado de reações de defesa
das plantas contra agressões do ambiente. Esses compostos agem como antioxidantes, não
somente pela sua habilidade em doar hidrogênio ou elétrons, mas também em virtude de seus
radicais intermediários estáveis, que impedem a oxidação de vários ingredientes do alimento,
particularmente de lipídios (SANTOS; VEGGI; MEIRELES, 2010; SILVA et al., 2010;
VIZZOTTO; KROLOW; WEBER, 2010).
Este grupo de substâncais pode ser classificado em diversas classes de acordo com
a configuração do esqueleto principal (QUADRO 1) e a maioria não é encontrada na natureza
em sua forma livre e sim, na forma de ésteres e heterosídeos, sendo, portanto, solúveis em água
e em diversos solventes apolares(CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2007). Dentre os
fenólicos, destacam-se os flavonóides, os ácidos fenólicos, os taninos e os tocoferóis como os
mais comuns antioxidantes fenólicos de fonte natural (ANGELO; JORGE, 2007). Esta classe
de compostos também pode ser simplesmente dividida em flavonoides ou polifenóis
(catequinas, antocianinas, isoflavonas e chalconas), um grupo amplamente distribuído nas
frutas e nos vegetais, e os não-flavonoides (fenóis simples ou ácidos) (ANGELO; JORGE,
2007; SILVA et al., 2010).
Quadro 1 - Classificação dos Compostos fenólicos de acordo com o esqueleto básico Esqueleto básico Classe de compostos fenólicos
C6 Fenóis simples e benzoquinonas C6 – C1 Ácidos fenólicos C6 – C2 Acetofenonas e àcidos fenilacéticos
C6 – C3 Fenilpropanóides: ácidos cinâmicos e compostos análogos, fenil
propenos, cumarinas, isocumarinas e cromonas C6 – C4 Naftoquinonas
C6 – C1 – C6 Xantonas C6 – C2 – C6 Estilbenos e antraquinonas C6 – C3 – C6 Flavonóides e isoflavonóides
(C6 –C3)2 Lignanas (C6 – C3 – C6)2 Diflavonóides
(C6)n Melaninas vegetais (C6 – C3)n Ligninas (C6 – C1)n Taninos hidrolisáveis
(C6 – C3 – C6)n Taninos condensados
Fonte: CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2007
30
A literatura é vasta de estudos que avaliaram a capacidade antioxidante dos compostos
fenólicos, assim como seu possível efeito na prevenção de diversas enfermidades
cardiovasculares, cancerígenas e neurológicas, sendo a ação benéfica destas substâncias ainda
relacionada com sua atividade anti-inflamatória e antiplaquetária (KUSKOSKI et al., 2004;
CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; VERZELLONI; TAGLIAZUCCHI; CONTE,
2007).
Entre estes compostos, os mais estudados como antioxidantes são os flavonoides que
têm em comum a estrutura C6-C3-C6 isto é, sua estrutura básica é composta por dois anéis
aromáticos (FIG. 2), que geralmente contém um átomo de oxigênio, ligados por uma cadeia
alifática de três carbonos (CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2007; CERQUEIRA;
MEDEIROS; AUGUSTO, 2007). Flavonoides estão presentes em frutas vermelhas ou berries
(como uvas, mirtilo, framboesa, ameixa e cereja, por exemplo), em vegetais folhosos, raízes,
tubérculos, bulbos, ervas, temperos, legumes, chá, café, cacau e vinho (VACCARI; SOCCOL;
IDE, 2009; OLIVEIRA et al., 2010; SILVA et al., 2010; SALGADO; MORZELLE, 2017).
Figura 2 - Estrutura básica dos flavonoides
Fonte: CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL, 2007.
Dentre os flavonoides com maior capacidade antioxidante estão as antocianinas
(FIG. 3), substâncias fenólicas que são um grupo de pigmentos naturais responsáveis pela
coloração rosa, escarlate, vermelha, violeta e azul das pétalas de flores e dos frutos dos vegetais
superiores (ZUANAZZI; MONTANHA, 2007; VACCARI; SOCCOL; IDE, 2009; OLIVEIRA
et al., 2010), como o hibisco, por exemplo, cores essas que têm um papel importante em vários
mecanismos reprodutores das plantas, tais como, na polinização e na dispersão de sementes.
Estes compostos ainda desempenham diversas funções nas plantas, dentre as quais temos:
atividades antioxidantes, proteção à ação da luz, mecanismo de defesa e função biológica
(LOPES et al., 2007). Estas moléculas ainda são tidas como uma das principais substâncias
31
bioativas relacionadas com o controle do estresse oxidativo no corpo humano (SALGADO;
MORZELLE, 2017).
Figura 3 - Estrutura dos principais compostos antociânicos
Fonte: VACCARI; SOCCOL; IDE (2009). Adaptado.
Além da atividade antioxidante, outras propriedades também já foram atribuídas aos
flavonoides, como observado no Quadro 2. Considerando-se a presença de diferentes
metabólitos secundários nos tecidos vegetais, no próximo tópico serão abordadas algumas
propriedades bioativas associadas ao hibisco, com ênfase na atividade antioxidante, que foi o
objeto de estudo desta dissertação.
Quadro 2 - Atividades farmacológicas atribuídas a alguns flavonoides
Atividade Flavonoide
Antitumoral Quercetina
Antiespasmódica Quercetina-3-glicosídeo, rutina, pinostrobina
Anti-inflamatória 5,7,3-triidroxi-3,6,4-trimetóxiflavona, quercetina, buteina, ternatina, xenognosina B, 5,3–diidroxi-4-metoxi-carbometoxi-flavonol, coparina, 3-O-metil-violanona,
Antimicrobiana 7’,4’-diidroxi-5-metox-flavona; 4’2,4’-tri-diidroxi-6’-metoxi-chalcona; 3’,4’,5,7-tetra-hidroxi-3-metoxiflavona; quercetina;
Antimutagênica Nobiletina; tangeretina
Antiulcera Quercetina
Antiviral Quercetina; acacetina; apigenina; crisina; pectolinaregina; canferol; galangina; luteonica; amentoflavona
Antioxidante
Quercetina; diidroquercetina; rutina; diosmina; hesperidina; catequina; luteonina-3’-O-β-D-glicuronídeo, luteonina-3’-O-(4”-O-acetil)-β-D-glicuronídeo, luteonina-3’-O-(3”-O-acetil)-β-D-glicuronídeo
Fonte: ZUANAZZI; MONTANHA, 2007.
32
3.4. Alegações de saúde dos compostos bioativos do hibisco
Já foi demonstrado que vários polifenóis (QUADRO 3) encontrados no cálice do hibisco
apresentam propriedades benéficas à saúde. Assim, em algumas pesquisas as antocianinas de
hibisco e o ácido protocatecuico apresentaram efeitos antineoplásicos (TSENG et al., 2000;
CHANG et al., 2005; HOU et al., 2005; LIN et al., 2005; UMAMAHESWARI; GOVINDAN,
2007; FORMAGIO et al., 2015; ALAM et al., 2018; SU et al., 2018b).
Outros estudos apontam que extratos de hibisco apresentaram efeitos anti-
hiperlipidêmicos, atuando como antioxidantes na prevenção da oxidação do LDL bem como
reduzindo as concentrações séricas de colesterol e triglicerídes (CHEN et al., 2003;
HIRUNPANICH et al., 2006; HOPKINS et al., 2013; SU et al., 2018a).
Pesquisas também revelaram importantes efeitos antiobesidade (ALARCON-
AGUILAR et al., 2007; MOYANO et al.,2016), hipoglicemiantes (SHADHAN; BHARI, 2017;
SEUNG et al., 2018) e neuroprotetores (BAKHTIARI, HOSSEINI, MOUSAVI, 2015;
OWOEYE; GABRIEL, 2017; SHALGUM et al., 2018) de extratos do hibisco.
Ainda já foi observado o efeito hipotensor após a administração do hibisco na forma de
chás, extratos concentrados e infusões em pacientes hipertensos, inclusive em comparação com
os fármacos anti-hipertensivos atualmente utilizados, sugerindo-se seu uso como coadjuvante
na redução de risco de problemas associados aos quadros de hipertensão leve a moderada (
MCKAY et al., 2010; WAHABI et al., 2010; GBOLADE, 2012; HOPKINS et al., 2013;
WALTON; WHITTEN; HAWRELAK, 2016; ZHEOAT et al., 2019).
Algumas pesquisas também apontam para a atuação do hibisco no sistema urinário
como diurético e uricosúrico, tanto em humanos quanto em camundongos, e, de forma geral,
com aumento do volume de urina, bem como maior concentração de oxalato, citrato e ácido
úrico excretada (PRASONGWATANA et al., 2008; ALARCÓN-ALONSO et al., 2012; KUO
et al., 2012), assim como promoveu melhoria de quadros de infecção urinária em pacientes que
utilizaram cateteres por longos períodos (CHOU et al., 2016) ou em diabéticos (YANG et al.,
2013; MARDIAH et al., 2015).
33
Quadro 3 - Compostos bioativos no cálice do hibisco (Hibiscus sabdariffa)
CLASSE SUBCLASSE TIPO DE
EXTRATO COMPOSTO BIOATIVO
Ácidos fenólicos Aquoso,
hidroetanólico e Metanólico
Ácido 3-cafeoilquínico Ácido 4-cafeoilquínico Ácido 5-cafeoilquínico
Ácido 5-O-cafeoil-shikimico Ácido cafeico
Ácido clorogênico Ácido clorogênico isômeros
I e II Ácido hibisco
Ácido hidroxicítrico Ácido protocatecuico
Flavonoides
Antocianina Aquoso e
hidroetanólico Delfinidina-3-sambubiosídeo Cianidina-3-sambubiosídeo
Flavonol Aquoso e
hidroetanólico
Kaempferol-3-O-rutinosídeo Kaempferol-3-P-ceroglucosídeo
Quercetina Quercetina-3-rutinosídeo Quercetina-3-sambubiosil Quercitina-3-glucosideo
Miricetina-pentosil-hexosídeo
Quercetina-pentosil -hexosil
Flavanol Metanólico Catequina
Epigalocatequina galato Fonte: RIAZ; CHOPRA (2018). Adaptado.
3.4.1. Propriedade antioxidante
Antioxidantes podem ser definidos como substâncias que, mesmo em baixas
concentrações, por diversos mecanismos podem postergar ou prevenir a oxidação de um
determinado substrato, neutralizando as espécies reativas (ou radicias livres) formadas pelo
metabolismo e restaurando o equilíbrio dinâmico do corpo. (FERREIRA et al., 2010; SANTOS;
VEGGI; MEIRELES, 2010; SILVA et al., 2010).
A formação de radicais livres (RL) é um processo metabólico e fisiológico normal no
corpo, todavia também podem ser derivados de processos patológicos, exercícios físicos
prolongados ou de fontes externas (exposição à radiação ionizante, ozônio, fumaça de cigarro,
poluentes ambientais, produtos químicos. Quando a produção de RL é exacerbada, o organismo
dispõe de um eficiente sistema antioxidante (sistemas enzimáticos ou por micromoléculas
34
endógenas ou adquiridas da dieta), que consegue controlar e reestabelecer o equilíbrio entre as
espécies reativas formadas e inativadas (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006;
CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; VASCONCELOS et al., 2007; LOBO et al.,
2010; KUNWAR; PRIYADARSINI, 2011).
Embora a presença de RL tenha sido correlacionada com um grande número de doenças,
tais como as degenerativas (cardiopatias, aterosclerose, diabetes, injúria isquêmica),
inflamatórias (artrite reumatóide, colite ulcerativa e pancreatite), neurológicas (doença de
Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, síndrome de Down, doença de Alzheimer), indução do
câncer e a propagação de AIDS em pacientes soropositivos (HIV+), por exemplo, estas espécies
não têm um papel etiológico na grande maioria dos estados patológicos, mas participam
diretamente dos mecanismos fisiopatológicos que determinam a continuidade e as
complicações presentes nestes processos. Assim, o equilíbrio entre a formação e a remoção de
espécies radicalares no organismo deve ser regulado de forma que as reações e processos
metabólicos dependentes das mesmas possam ocorrer em um nível adequado para a manutenção
da fisiologia das células (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; CERQUEIRA; MEDEIROS;
AUGUSTO, 2007; VASCONCELOS et al., 2007; LOBO et al., 2010; KUNWAR;
PRIYADARSINI, 2011).
As proteções conhecidas do organismo contra os RL abrangem a proteção enzimática
ou por micromoléculas, que podem ter origem no próprio organismo ou serem adquiridas da
dieta (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). As enzimas podem neutralizar ou eliminar
radicais já formados, enquanto que as moléculas podem agir como sequestradores
(“scavenger”) de radicais; doadores de prótons ou elétrons, supressores (“quencher”) de
oxigênio singleto, sinergistas ou inibidores enzimáticos, e agentes quelantes de íons metálicos,
ou ainda podem exercer seus efeitos em sistemas biológicos pela regulação da expressão gênica
(CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; LOBO et al., 2010).
Considerando que os componentes celulares não são totalmente protegidos por
antioxidantes endógenos, e que antioxidantes obtidos da dieta são indispensáveis para
minimizar os efeitos do estresse oxidativo, há crescente interesse em identificar outros
compostos dos alimentos que também possam atuar como antioxidantes naturais e, neste
sentido, muita atenção tem sido voltada para o cálice da flor de hibisco (Hibiscus sabdariffa L),
(FAROMBI; FAKOYA, 2005; OLATUNDE; FAKOYA, 2005; RAMAKRISHNA et al., 2008;
RAMOS et al., 2011; AL-HASHIMI, 2016; MACIEL et al., 2012; BORRÁS-LINARES et al.,
35
2015; SOBOTA; PINHO; OLIVEIRA, 2016; ZHEN et al., 2016) devido à presença de
compostos fenólicos em sua constuição, especialmente os flavonoides.
Os principais mecanismos relacionados com a capacidade antioxidante dos flavonoides
incluem a inativação e/ou neutralização de radicias livres, o estímulo da atividade de enzimas
antioxidantes endógenas (superóxido dismutase, glutationa oxidase e catalase) ou a inibição da
atividade de enzimas pró-oxidantes (ciclo-oxigenase, lipoxigenase e xantina oxidase), além da
expressão do óxido nítrico, o que impede a oxidação de partículas de lipoproteínas séricas.
Entretanto, é importante ressaltar que ainda há inúmeras lacunas a serem preenchidas no que
concerne à elucidação de seu mecanismo de ação no caso de determinadas doenças
(SALGADO; MORZELLE, 2017).
36
37
3 METODOLOGIAS
Nesta seção, estão descritos todos os procedimentos adotados nesta pesquisa. Os
experimentos foram realizados nos laboratórios dos Departamentos de Ciências Básicas e de
Farmácia, ambos da Faculade de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade Federal dos
Vales do Jequitinhonha e Mucuri – UFVJM, Campus JK, no município de Diamantina – MG,
sendo que a análise metabolômica foi realizada em parceria com o Departamento de
Química/UFMG.
3.1 Matéria-prima
Neste estudo, foram selecionadas duas marcas comercias (amostras A e B) de chá de
hibisco (Hibiscus sabdariffa L.), constituídas pelo cálice do botão seco da flor. As embalagems
escolhidas foram avaliadas quanto a presença de avarias e estarem dentro do prazo de validade
estipulado pelos fabricantes. O conteúdo das embalagens foi processado em moinho de facas
(modelo TE-625, Tecnal, São Paulo, Brasil) e o pó obtido foi armazenado em frasco âmbar
identificado e mantido em temperatura ambiente até o momento a preparação dos extratos.
3.2 Análise metabolômica do hibisco por espectrometria de massa
Esta análise foi realizada conforme Silva et al. (2019). Assim, para a extração dos
metabólitos secundários, 0,5 g de cada amostra e 1,0 mL de metanol/água (50:50, v/v) foram
adicionados em tubo Eppenderf de 2,0 mL. Após 1 hora a temperatura ambiente, os tubos foram
centrifugados a 25.406 x g por 15 minutos e o sobrenadante recolhido. Em seguida, 1,0 mL de
acetona/água (70:30, v/v) foi adicionado resíduo, com nova etapa de incubação e centrifugação
nas mesmas condições descritas acima. Ambos sobrenadantes foram misturados e água
destilada foi adicionada até completar o volume de 5,0 mL.
Os espectros de massas foram adquiridos em um equipamento modelo LCQ FLEET
(Thermo Fisher Scientific, San Jose, Califórnia, EUA) com analisador de massas de baixa
resolução do tipo ion trap. A fonte de ionização “paper spray” foi construída no laboratório de
Química/UFMG (FIG. 3) e consiste de um conector de cobre do tipo jacaré soldado a um fio
de cobre e fixado a um suporte universal contendo uma plataforma móvel (nas direções x, y e
z) que permite o alinhamento do papel na entrada do espectrômetro de massas.
38
Figura 3 – Espectrômetro de massas com analisador do tipo ion trap e fonte de ionização por paper spray (A), com detalhes da fonte de ionização (B)
Para as análises, o instrumento foi operado em: voltagem da fonte de ionização de
+ 4.0 kV (modo de ionização positivo) e –3.0 kV (modo de ionização negativo); voltagem do
capilar de 40 V; temperatura do tubo de transferência de 275 °C; potencial das lentes de 120 V;
distância entre o papel e a entrada do espectrômetro de massas de 0,5 cm; volume de amostra
aplicado sobre o papel de 25,0 µL e faixa de massas de 100-1.000 m/z. A energia de colisão
usada para a fragmentação dos compostos variou de 15 a 30 eV (SILVA et al., 2019). Todas as
amostras foram analisadas em triplicata. Os íons e seus fragmentos obtidos nesta análise foram
identificados com base em dados descritos na literatura.
3.3 Delineamento experimental da atividade antioxidante
Adotou-se um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), em planejamento
fatorial 23, contendo 4 pontos centrais e sua extensão axial, totalizando 18 ensaios, como
apresentado nas Tabelas 1 e 2 (RODRIGUES, IEMMA, 2005). As faixas de variação entre o
limite inferior e o superior de cada variável independente foram estabelecidas com base em
dados comumente observados na literaruta científica.
39
Tabela 1 – Níveis codificados e reais das variáveis independentes
Variáveis independentes Códigos Níveis
- -1 0 +1 + Água (mL) X1 50,00 141,07 275,00 408,93 500,00
Temperatura (ºC) X2 60,00 68,10 80,00 91,90 100,00 Tempo de infusão (min) X3 3,00 4,42 6,50 8,58 10,00
O valor de foi calculado em função do número de variáveis independentes (n = 3),
por meio da Equação 1.
= (23)1/4 = 1,68 (1)
Tabela 2 – Ensaios do delineamento composto central rotacional Ensaio Água (mL) Temperatura (ºC) Tempo (min)
01 141,00 68,10 4,42 02 141,00 68,10 8,58 03 141,00 91,90 4,42 04 141,00 91,90 8,58 05 409,00 68,10 4,42 06 409,00 68,10 8,58 07 409,00 91,90 4,42 08 409,00 91,90 8,58 09 50,00 80,00 6,50 10 500,00 80,00 6,50 11 275,00 59,99 6,50 12 275,00 100,01 6,50 13 275,00 80,00 3,00 14 275,00 80,00 10,00
15 (C) 275,00 80,00 6,50 16 (C) 275,00 80,00 6,50 17 (C) 275,00 80,00 6,50 18 (C) 275,00 80,00 6,50
Como respostas a este planejamento, as variáveis dependentes foram as análises de
triagem fitoquímica qualitativa, o teor de compostos fenólicos totais e de flavonoides e a
determinação da atividade antioxidante. Os resultados foram analisados por meio do software
Statistica® 7.0 (STATSOFT, 2004) sendo empregada análise de variância para estimar os
parâmetros estatísticos e avaliar a predição ou não de um modelo matemático.
40
3.4 Preparação das amostras
A extração dos compostos hidrossolúveis foi efetuada por infusão a quente,
seguindo a configuração experimental pré-estabelecida. Basicamente, três gramas de cada
amostra foram colocados em erlenmeyer, sendo adicionado um volume de água mineral
(Crystal, Spal Industria Brasileira de Bebidas S/A, Mogi das Cruzes, São Paulo, Brasil) na
temperatura determinada para cada ensaio. As amostras foram mantidas em banho-maria com
agitação (modelo SL180/DT, Solab, Piracicaba, São Paulo, Brasil) pelo tempo desejado. Após
este período, as amostras foram filtradas em filtros qualitativos (Unifil, código 501.012, São
Paulo, Brasil) e os extratos armazenados em frascos de vidro sob refrigeração (5 ºC), até o
momento das análises.
3.5 Triagem fitoquímica
Os diferentes extratos obtidos foram submetidos a uma análise fitoquímica preliminar
para a detecção de diferentes metabólitos secundários, sendo que cada grupo de substâncias
pode ser detectado por meio de reações químicas, que resultaram no desenvolvimento de cor
e/ou formação de precipitado. Todos os reagentes empregados nestas análises eram de grau
analítico.
3.5.1 Açúcares redutores
Nesta etapa, foi empregada a metodologia descrita por Ayoola et al. (2008) e Yadav;
Agarwala (2011) com modificações. Alíquotas de 1,0 mL de cada extrato foram misturadas
com iguais volumes dos reagentes A e B de Fehling e aquecidas em banho-maria em ebulição,
por 3 minutos. A formação de um precipitado de coloração avermelhada no tubo teste é
indicativa da presença de açúcares redutores.
3.5.2 Alcaloides
Misturas de 1,0 mL de cada extrato com 10 mL de ácido sulfúrico a 1% (v/v) foram
aquecidas em banho-maria em ebulição por 2 minutos. Em seguida aas soluções foram
resfriadas (25 ºC), filtradas em papel de filtro qualitativo (Unifil, código 501.012, São Paulo,
Brasil), sendo empregadas para determinar a presença de alcaloides, pelos testes de Mayer ou
41
de Bouchardat/Wagner. O aparecimento de precipitado esbranquiçado, no teste de Mayer, ou
de coloração marrom, no teste de Wagner, foi considerado resultado positivo para a presença
de alcaloides (DENNY et al., 2007; HUSSAIN et al., 2011).
3.5.3 Aminoácidos
De acordo com Yadav; Agarwala (2011), 2,0 mL dos extratos foram aquecidos com
igual volume de solução alcoólica de ninhidrina a 0,2 g%, e o aparecimento de coloração violeta
sugere a presença de aminoácidos e proteínas.
3.5.4 Antraquinonas
Foram aquecidos 10,0 mL de ácido sulfúrico concentrado com 0,5 mL dos extratos e
filtrados em papel de filtro qualitativo. O filtrado foi agitado com 5,0 mL de clorofórmio. Após
esta etapa, a camada clorofórmica foi pipetada em outro tubo e adicionada de 1,0 mL de amônia
diluída. A solução resultante foi observada para detecção de alterações de cor, conforme Ayoola
et al. (2008).
3.5.5 Esteróides
Segundo o procedimento de Borokini; Omotayo (2012), 2,0 mL de anidrido acético foi
misturado com 0,5 mL do extrato de cada planta, e com 2,0 mL de ácido sulfúrico concentrado.
A mudança de coloração de violeta para azul indica a presença de esteroides.
3.5.6 Fenol
De acordo com Hussain et al. (2011) e Yadav; Agarwala (2011), 2,0 mL dos extratos
foram misturados com 2,0 mL de solução de cloreto férrico a 2 g% (p/v), e o aparecimento de
coloração verde escura ou preta será considerado indicativo da presença de fenóis.
3.5.7 Flavonoides
Nesta análise, foi utilizado o procedimento proposto por Egwaikhide, Okeniyi e Gimba
(2009) e por Yadav; Agarwala (2011). Assim, 2,0 mL de solução de hidróxido de sódio a 2,0
42
g% (p/v) foram adicionados a 2,0 mL dos extratos. Intensa coloração amarela aparecerá, e que
se tornará clara a medida poucas gotas de solução de ácido clorídrico diluída forem
acrescentadas na solução, indicando a presença de flavonoides. Alternativamente, a
confirmação da presença destes compostos será realizada de acordo com Borokini; Omotayo
(2012). Cinco mililitros (5,0 mL) de solução de amônia diluída foram misturados com 2,0 mL
dos extratos das ervas, seguida pela adição de ácido sulfúrico concentrado, sendo o
aparecimento da coloração amarela indicativo da presença de flavonoides.
3.5.8 Glicosídeos cardíacos
A presença de glicosídeos foi verificada pelo teste de Keller-Killani, descrito por
Borokini; Omotayo (2012). Assim, 2,5 mL de cada extrato foram tratados com 1,0 mL de ácido
acético glacial e 2 gotas de solução de cloreto férrico a 2,0 g% (p/v). A mistura foi transferida
para outro tubo contendo 1,0 mL de ácido sulfúrico concentrado, sendo que o escurecimento da
interface indicativo da presença de cardenolídeos, ou seja, um desoxi-açúcar característico de
glicosídeos. Abaixo desta região, pode-se observar o aparecimento de anel violeta, indicativo
da presença de carboidratos, enquanto a camada de ácido acético adquirirá uma coloração
esverdeada
3.5.9 Saponinas
O teste da espuma persistente, de acordo com Borokini; Omotayo (2012), foi utilizado
nesta análise, com modificações. Assim, 30,0 mL de água destilada foram misturados com 2,0
mL dos extratos, e a solução foi vigorosamente agitada e aquecida em banho-maria até a
ebulição. A formação de espuma estável indica a presença de saponinas.
3.5.10 Taninos
A cada 0,5 mL dos extratos, foram adicionados 1,0 mL de água destilada e 3 gotas de
solução de cloreto férrico a 2,0 g% (p/v), conforme Edeoga; Okwu; Mbaebie (2005), Hussain
et al. (2011) e Borokini; Omotayo (2012). Uma coloração preto-esverdeada indica teste positivo
para taninos.
43
3.5.11 Terpenos/terpenóides
O teste de Salkowski, conforme Yadav; Agarwala (2011) e Borokini; Omotayo (2012)
foi empregado, misturando-se 2,0 mL dos extratos com igual volume de clorofórmio. Então,
2,0 mL de ácido sulfúrico foram cuidadosamente adicionados ao tubo. O surgimento de
coloração marrom-avermelhada indica a presença de terpenos ou terpenóides.
3.6 Determinação do teor de compostos fenólicos totais
Para a quantificação dos compostos fenólicos totais das amostras de chá de hibisco,
adaptou-se a metodologia de Singleton; Rossi (1965) para sua realização em microplacas.
Pipetou-se 100 μl de água Milli-Q (pH= 7,0), 12,5 μL da amostra e 12,5 μL do reagente Folin-
Ciocauteau (código F9252, Sigma-Aldrich Brasil Ltda, São Paulo, Brasil) em cada um dos 96
poços da microplaca. Esta foi submetida à agitação de 30 segundos e repouso de 5 minutos. Em
seguida, acrescentou-se 125 μL de carbonato de sódio a 1,0 mol.L-1, obtendo-se volume final
de 250 μL por poço. A microplaca foi mantida à temperatura ambiente, ao abrigo da luz por 90
minutos. A determinação das absorbâncias no comprimento de onda de 750 nm foi realizada
no leitor de microplacas Spectramax® utilizando água destilada como branco. Para o cálculo
da concentração de compostos fenólicos, foi elaborada uma curva de calibração de ácido gálico
(código G7384, Sigma-Aldrich Brasil Ltda, São Paulo, Brasil), com concentrações variando de
0 a 2.000 mg.L-1.
3.7 Determinação do teor de flavonoides totais
Para a quantificação do teor de flavonóides totais das amostras, adaptou-se a
metodologia de Pereira et al. (2009) para sua realização microplacas. Pipetou-se 12,5μL da
amostra, 12,5 μL de solução metanólica de cloreto de alumínio a 2% (p/v) e compleou-se o
volume com 112,5 μL solução metanólica de ácido acético a 5% (v/v). Após 30 minutos, as
absorbâncias foram lidas a 425 nm. Para cada amostra foi preparado um branco, transferindo-
se 100 μL das amostras e ajustando-se o volume para 250 μL com solução metanólica de ácido
acético a 5% (v/v). Para o cálculo da concentração de flavonoides, foi elaborada uma curva de
foi elaborada uma curva de calibração de quercetina (código PHR1488, Sigma-Aldrich Brasil
Ltda, São Paulo, Brasil), com concentrações variando de 0 a 100 µg.L-1.
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3.8 Avaliação da atividade antioxidante
Esta análise foi realizada pelo método do 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH),
adaptando-se a metodologia de Brand-Williams, Cuvelier e Berset (1995). Em uma microplaca
de 96 poços foram adicionados 244 μL de DPPH 60 μmol.L-1, em ambiente escuro e em
seguida, adicionou-se uma alíquota de 6 μL de cada diluição dos extratos, obtendo um volume
final de 250 μL. Um controle contendo somente o reagente DPPH a 60 μmol.L-1 foi preparado
para análise dos resultados. A placa foi mantida à temperatura ambiente e ao abrigo da luz por
um período de 30 minutos, após os quais foi realizada leitura das absorbâncias do meio
reacional a 515 nm em leitor de microplacas Spectramax®, utilizando o metanol como branco.
Os resultados foram expressos como equivalentes de ácido gálico (código G7384,
Sigma-Aldrich Brasil Ltda, São Paulo, Brasil), a partir de uma curva de calibração elaborada
nas concentrações variando de 0 a 2000 mg.L-1, e também como a porcentagem de sequestro
dos radicais DPPH (%Inibição), sendo calculada pela Equação 2, considerando-se as
absorbâncias das amostras e da solução padrão de DPPH:
% 𝐼𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 = 𝐴𝑏𝑠𝐷𝑃𝑃𝐻− 𝐴𝑏𝑠𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎𝐴𝑏𝑠𝐷𝑃𝑃𝐻 𝑋 100 (2)
Onde: 𝐴𝑏𝑠𝐷𝑃𝑃𝐻 = absorbância do reagente DPPH puro 𝐴𝑏𝑠𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎= absorbância da amostra
3.9 Análise estatística
Os experimentos foram realizados em triplicata, sendo os resultados expressos como
média ± desvio padrão. A análise de variância foi empregada para determinar o efeito do tipo
de extrato na capacidade antioxidante das amostras, sendo as diferenças significativas (p < 0,05)
entre as médias avaliadas pelo teste de Tukey. As correlações entre os valores da atividade com
os teores de compostos fenólicos e de flavonoides foram determinadas pelo coeficiente de
correlação de Pearson (r), que mede o grau de associação entre duas variáveis, sendo o valor p
determinado pelo teste t-Student, empregando-se o software Bioestat (AYRES et al., 2007) para
a análise dos dados.
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55
4 CAPÍTULO 1 – ANÁLISE METABOLÔMICA DE HIBISCO (Hibiscus sabdariffa L.)
USANDO ESPECTROMETRIA DE MASSA POR PAPER-SPRAY
Anna Karolina Cruz Duarte1,2, Mauro Ramalho3, Cristiane Fernanda Fuzer Grael2, Rodinei
Augusti4, Júlio Onésio Ferreira Melo5, Harriman Aley Morais1,2.
1 Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM), Instituto de Ciência e
Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Diamantina,
MG, Brasil. 2 Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM), Faculdade de Ciências
Biológicas e da Saúde, Diamantina, MG, Brasil 3 Centro Universitário de Sete Lagoas (UNIFEMM), Unidade de Ensino de Filosofia,
Ciências e Letras, Sete Lagoas, Minas Gerais, Brasil 4 Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Departamento de Química, Belo Horizonte,
MG, Brazil 5 Universidade Federal de São João Del-Rei (UFSJ), Departamento de Ciências Exatas e
Biológicas, Sete Lagoas, MG, Brazil
RESUMO
As propriedades anti-inflamatórias, hipolipidêmicas, anti-hipertensivas, diuréticas dentre
outras atribuídas à presença de compostos fenólicos, em especial antocianinas (delfinidina-3-
sambubioside e a cianidina-3-sambubioside) e outros flavonoides (catequina, epigalocatequina,
quercetina) do hibisco têm sido comprovadas pela literatura e incentivado o desenvolvimento
de diversos produtos industrializados. Foram selecionadas duas marcas de chá de hibisco
comercializadas na cidade de Diamantina- MG. Foi realizada a espectrometria de massas com
ionização por paper spray (PS-MS). A análise do PS-MS nos modos positivo e negativo
permitiu a identificação de várias substâncias, entre elas, ácidos orgânicos, açúcares e
flavonoides como luteolina 7-O- diglucuronideo, delfinidina-3-O-hexosideo, cianidina-3-O-
sambubiosídeo, dentre outros, A partir da espectrometria de massas foi possível comprovar a
presença de diversos compostos bioativos na infusão comercial.
Palavras-chave: Hibiscus sabdariffa L. PS-MS. Compostos fenólicos.
56
ABSTRACT
The anti-inflammatory, hypolipidemic, antihypertensive and diuretic properties, among
others attributed to the presence of phenolic compounds, especially anthocyanins (delphinidin-
3-sambubioside and cyanidin-3-sambubioside) and others flavonoids (catechin,
epigallocatechin, quercetin) of the hibiscus have been proven in the literature and encouraged
the development of several industrialized products. Two brands of hibiscus tea marketed in the
city of Diamantina-MG were selected. Paper spray ionization (PS-MS) mass spectrometry was
performed. The analysis of PS-MS in the positive and negative modes allowed the identification
of several substances, including organic acids, sugars and flavonoids such as 7-O-diglucuronide
luteolin, delphinidin-3-O-hexoside, cyanidin-3-O -ambubioside, among others. From the mass
spectrometry it was possible to prove the presence of several bioactive compounds in the
commercial infusion.
Key-wors: Hibiscus sabdariffa L. PS-MS. Phenolic compounds.
1 INTRODUÇÃO
A consciência do consumidor sobre a intima relação entre alimentação saudável e
promoção à saúde têm crescido consideravelmente nos últimos anos, gerando alteração
substancial na indústria de alimentos, que atendendo ao mercado consumidor, tem desenvolvido
produtos menos processados, com reduzido número de ingredientes que em sua maioria devem
ser de origem natural (CAROCHO, MORALES, PEREIRA., 2015; MARTINS et al., 2016).
Neste cenário destaca-se o Hibisco (Hibiscus sabdariffa L), planta originária da China
que se desenvolve bem em regiões de clima tropical e subtropical. Também conhecida como
roselle ou vinagreira, é um arbusto rasteiro com 2 a 3 centímetros de altura, com flores brancas
de cálice em tons avermelhados (HUANG et al., 2015; ALAM et al., 2018).
Os produtos elaborados a partir desta planta, especialmente o chá, têm se popularizado
mundialmente, uma vez que, sua composição, rica em flavonoides, antocianinas e ácidos
orgânicos (CHANG et al., 2012; MOYANO et al., 2016; KANE et al., 2018) é associada a
prevenção de doenças crônicas não transmissíveis devido à sua atividade antimicrobiana, anti-
inflamatória, cardioprotetora, hepatoprotetora, nefroprotetora e anticancerígena (AZIZ,
WONG, & CHONG, 2013; MOYANO et al., 2016; RIAZ &CHOPRA, 2018).
Uma das técnicas mais utilizadas atualmente na análise da composição de matrizes
complexas como alimentos, medicamentos, pesticidas, etc., é a espectrometria de massas com
57
ionização por paper spray (PS-MS), que se destaca por ser uma metodologia de elevada
sensibilidade, baixo consumo de amostras e reagentes, alta seletividade e baixo custo (WANG
et al., 2010).
Diante deste contexto, o presente estudo objetivou a avaliação da composição do chá de
hibisco, quanto à migração de metabólitos secundários durante o processo de infusão, em
amostras comerciais.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Preparação da amostra e reagentes
Duas amostras comerciais (HS1 e HS2) de cálices desidratados de hibisco (Hibiscus
sabdariffa L.) foram adquiridas na cidade de Diamantina, MG, Brasil. As embalagens
escolhidas foram avaliadas quanto a presença de avarias e data de prazo de validade estipulada
pelos fabricantes. O conteúdo de ambas embalagens foi processado, separadamente, em moinho
de facas Tecnal TE-625 (São Paulo, Brasil) e o pó obtido foi armazenado em frasco âmbar
identificado e mantido em temperatura ambiente até o momento a preparação das amostras.
Para a extração dos metabólitos secundários adotou-se o procedimento descrito por
Rufino et al. (2010). Assim, 0,5g de cada amostra e 1,0 mL de mistura de metanol (grau HPLC,
JT Baker, Phillipsburg, NJ, EUA) /água (50:50, v/v) foram adicionados em tubos Eppendor de
2,0 mL. Após uma hora a temperatura ambiente, os tubos foram centrifugados a 25,406 x g por
15 minutos e o sobrenadante recolhido. Em seguida, 1,0 mL de mistura de acetona grau HPLC,
JT Baker, Phillipsburg, NJ, EUA) /água (70:30, v/v) foi adicionado ao resíduo, com nova
incubação e centrifugação nas mesmas condições descritas acima. Ambos sobrenadantes foram
misturados, com adição de água destilada até alcançar volume final de 5,0 mL.
2.2. Análise metabolômica
A análise do perfil químico das duas amostras foi realizada, individualmente e em
triplicata, utilizando um espectrômetro de massas LCQ Fleet (Thermo Scientific, San Jose, CA,
EUA) equipado com uma fonte de ionização paper spray (FIG. 1) e foram executadas nos
modos positivo e negativo.
58
Figura 1 – Diagrama da fonte de ionização por paper spray.
Fonte: Laboratório de Espectrometria de Massas, Departamento de Química, UFMG
Para a realização das análises, papel cromatográfico (1 CHR, Whatman, Little Chalfont,
Buckinghamshire, Reino Unido) cortado na forma de um triângulo equilátero (1,5 cm) foi
posicionado a frente da entrada do espectrômetro de massas. Este papel foi suportado por um
conector metálico e posicionado a uma distância de 0,5 cm com auxílio de uma plataforma
móvel (XYZ). Este aparato foi conectado a fonte de alta tensão do espectrômetro de massas por
meio de um fio de cobre. Por fim, 2,0 µL das amostras foram aplicados na extremidade dos
triângulos, 40,0 µL de metanol eram transferidos para o papel cromatográfico e a fonte de
voltagem foi ligada para aquisição dos dados.
O instrumento foi operado em: voltagem da fonte PS-MS igual a + 4,0 kV (modo
positivo) e – 3,0 kV (modo negativo); voltagem do capilar de 40 V; temperatura do tubo de
transferência de 275 °C; voltagem das lentes do tubo de 120 V; faixa de massas de 50 a 600 m/z
(modo positivo) e de 50 a 1000 m/z (modo negativo). Os íons e seus fragmentos obtidos nestas
análises foram identificados com base em dados descritos na literatura. A energia de colisão
usada para a fragmentação dos compostos variou de 15 a 30 eV. Os espectros de massa obtidos
foram processados com o software Xcalibur version 2.1 (Thermo Scientific, San Jose, CA,
USA).
59
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Exemplos de espectros de Hibiscus sabdariffa nos modos positivo [PS(+)-MS] e
negativo [PS(-)-MS] estão apresentados na Figura 2. De modo geral, foi possível identificar
íons referentes a moléculas de ácidos orgânicos e compostos fenólicos.
Figura 2 – Representação do (-)PS-MS (A) e (+)PS-MS (B) de uma amostra de
chá de hibisco comercializado na cidade de Diamantina
No Quadro 1 estão mostrados alguns possíveis compostos detectados na análise de
varredura (ionização no modo negativo) do hibisco em ambas as amostras, uma vez que o
espectro obtido foi o mesmo. O sinal m/z 189 refere-se ao ácido hibisco, que foi identificado
pelos íon obtido após a reações de fragmentação, que gerou um íon secundário em m/z 127.
Este mesmo perfíl de fragmentação também foi relatado para extratos aquosos preparados a
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100127
189
83
@ [ ]
200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100611
593
551
431355
407
533283 449
60
partir de amostras de hibisco coletadas no Senegal (RODRÍGUEZ‐MEDINA et al., 2009) e no
México (RAMÍREZ-RODRIGUES et al., 2011).
Quadro 1 – Compostos identificados nos extratos aquosos de Hibiscus sabdariffa PS-MS
no modo negativo
Possível composto
m/z ID Principais fragmentos Referências
Ácido hibisco 189 [M‐H]− 171, 170, 145, 127, 83,
73
(RODRÍGUEZ-MEDINA et
al., 2009; RAMÍREZ-RODRIGUES et al., 2011)
Ácido hibisco glicosídeo
351 [M‐H]− 333, 307, 291, 261, 231, 213, 189, 170,
127, 125
(RAMÍREZ-RODRIGUES et
al., 2011)
Derivado de ácido quínico
405 [M‐H]−
620, 387, 359, 351, 343, 331, 330, 323, 311, 285, 273, 271, 247, 233, 231, 230, 215, 211, 189, 171,
167, 127
SPÍNOLA et al. (2017); GOUVEIA & CASTILHO
(2009)
Cornosídeo Murristerona A
541 [M‐H]−
523, 508, 500, 462, 443, 433, 390, 363, 378, 351, 333, 291,
221, 195, 189
GUO et al. (2017); STEVENS; REED; MORRÉ
(2008)
O íon com m/z 351 foi reconhecido com sendo o ácido hibisco glicosídeo, que
fragmentou originando dois importantes íons secundários (m/z 189 e 127), similar ao estudo de
Ramírez-Rodrigues et al. (2011), que afirmam que a diferença entre m/z 351 e 189 é de 162, o
que corresponderia a molécula de glicose.
O sinal m/z 405 foi reconhecido como algum derivado do ácido quínico. Assim, Spínola
et al. (2017) relatam que, em extratos metanólicos de Myrica maia, planta típica da Ilha da
Madeira, foram obtidos os fragmentos m/z 388, 387 e 191 obtidos a partir deste íon, sendo que
o m/z 191, novamente fragmentado, resultou nos sinais m/z 173, 127, 111 e 93. Com base nesse
perfil, os autores identificaram o composto m/z 191 como o ácido quínico e, consequentemente,
o m/z 405 como um de seus derivados.
Dois possíveis compostos foram atribuídos ao íon m/z 541 devido à sua fragmentação.
Guo et al. (2017) identificou o sinal m/z 541 com fragmentação m/z195 como cornosídeo nos
frutos secos de Cornus officinalis, conhecidos como corni fructs, ou Cornelius cherry. Por
outro lado, Stevens, Reed e Morré (2008), em estudo de caracterização das sementes da espuma
do prado (Limnanthes alba), utilizando o padrão muristerona A, foi obtido um sinal m/z 541,
com fragmentação m/z 523, 351 e 333, semelhantes também ao presente estudo.
61
No Quadro 2 são apresentados alguns possíveis compostos detectados na análise de
varredura por ionização no modo positivo do hibisco. Conforme o esperado, foram identificados
alguns compostos da classe dos flavonóides:
Os ions m/z 287 e m/z 317 foram identificados como 3,9-hidrometilpterocarpano e
dihidroxi-isoflavona respectivamente em comparação com estudo realizado por Zhang et al.
(2014), onde as raízes secas de Astragalus membranaceus foram submetidas à extração
metanólica. Conhecida na medicina oriental como Huangqi (Radix Astragali), suas raízes
pulverizadas já são comercializadas no Brasil, devido ao potencial antioxidante e
hepatoprotetor.
O sinal m/z 295 com fragmentação m/z 277 foi identificado como composto pertencente
à classe de diterpenos abietanos, tanshinone, especificamente isolados da salvia vermelha (
Salvia miltiorrhiza Bge) cujas propriedades antitumorais, vasodilatadoras são reconhecidas na
literatura oriental, porém seu mecanismo de ação é ainda desconhecido (WANG et al., 2012;
GAO et al., 2018).
O sinal m/z 303, com fragmentação m/z 257 e 229 foi reconhecido como ácido elágico
por comparação com o estudo desenvolvido por Ibrahim et al. (2015) para identificação de
compostos nas flores de Securigera securidaca, usada na medicina popular iraniana, indiana e
egípcia como antidiabético e anti-hiperlipidêmico
O íon m/z 313 foi identificado por Lopez-Avila; Yefchak (2011), em seu estudo de
identificação de cumarinas secundárias por espectrometria de massas, como 6-O-
dimetilsalutaridina, metabólito secundário da classe dos alcaloides.
Diversos autores identificaram, de forma diferente, o composto atribuído ao íon m/z 465
com fragmentação m/z 303: A partir de amostras de hibisco coletadas em Portugal (JABEUR
et al., 2017) e no Senegal (SEGURA-CARRETERO et al., 2008) os autores identificaram este
como sendo delfinidina -3-O-glucosideo. Resultado este corroborado por Bochi; Godoy e
Giusti (2015) na investigação de antocianinas e outros compostos fenólicos em frutos de
groselha do Ceilão (Dovyalis hebecarpa) bem como por Mena e colaboradores (2012) na
avaliação da presença de compostos polifenólicos no suco de româ (Punica granatum L.)
62
Quadro 2 – Compostos identificados nos extratos aquosos de Hibiscus sabdariffa PS-MS no modo negativo
Possível composto m/z ID Principais fragmentos Referências
3,9-hidrometilpterocarpano
287 [M-H]+
361, 322, 304, 289, 287, 272, 269, 246, 244, 228, 225, 222, 218, 202, 189, 187, 184, 171, 161, 160, 151, 147, 139, 125,
107, 98
ZHANG et al. (2014)
Trijuganone A Isotanshinone IIA
295
[M-H]+ 488, 348, 330, 312, 295, 277, 259, 253,
241 211, 195, 165, 145, 133, LI et al. (2006); YANG et al. (2015); WANG et
al. (2012)
Ácido Elágico
303
[M-H]+ 356, 355, 338, 337, 320, 316, 302, 293, 286, 285, 274, 271, 260, 258, 257, 245, 244, 243, 239, 231, 229, 227, 215, 210,
197, 187, 175, 165, 164, 149
IBRAHIM et al. (2015)
6-O-demetilsalutaridina
313
[M-H]+ 478, 765, 407, 348, 344, 330, 321, 313, 302, 295, 285, 281, 270, 267, 258, 254, 253, 240,226, 225, 211, 203, 195, 187,
185, 133
LOPEZ-AVILA; YEFCHAK (2011)
Dihidroxi-isoflavona 317 [M-H]+ 334, 317, 302, 299, 298, 289, 285, 275, 261, 258, 256, 254, 244, 240, 228, 214,
202, 180, Zhang et al. (2014)
Delfinidina-3-O hexosideo ou Delfinidina-3-O-
glucosideo Quercetina-galactosideo
ou Quercetina-glucosideo Quercetina-3-O-β-D-
glucosideo
465
[M-H]+
847, 663, 602, 572, 543, 465, 447, 433, 403, 356, 303, 292, 229, 203, 201
SPÍNOLA et al. (2017); TEIXEIRA et al. (2015); JABEUR et al. (2017); SEGURA-CARRETERO et al. (2008); MENA et al.
(2012); BOCHI; GODOY; GIUSTI (2015); DIACONEASA et al. (2014); WAN et al.
(2011)
63
Cianidina-3-O-sambubiosideo
581
[M-H]+ 851, 581, 563, 521, 501, 419, 377, 327,
321, 287, 282, 213, 173
JABEUR et al. (2017); SEGURA-CARRETERO et al. (2008); RAMÍREZ-
RODRIGUES et al. (2011); RODRÍGUEZ-MEDINA et al. (2009)
Delfinidina-3-O-sambubiosideo
Quercetina-pentosil-hexosideo
597
[M-H]+
876, 736, 689, 597, 579, 541, 465, 421, 393, 337, 303, 283, 257
JABEUR et al. (2017); SEGURA-CARRETERO et al. (2008); RAMÍREZ-
RODRIGUES et al. (2011); RODRÍGUEZ-MEDINA et al. (2009); VENTER; JOUBERT;
BERR (2013)
Cianidina-3,5-diglucosideo
611 [M-H]+ 753, 725, 637, 611, 610, 593, 579, 551,
533, 512, 489, 449, 433, 430, 395, 391, 356, 355, 346, 309, 283, 258
SEGURA-CARRETERO et al. (2008); MENA et al. (2012)
luteolina 7-O- diglucuronideo 639
[M-H]+ 938, 838, 639, 621, 607, 579, 575, 561, 477, 459, 456, 449, 435, 405, 359, 343,
311, 303, 283, 257 ZHU et al. (2014)
64
Por outro lado, o mesmo composto foi reportado como delfinidina-3-O-hexosideo em
estudos da composição das folhas de frutos da Faia da ilhas (Myrica faya) coletados em Portugal
(SPÍNOLA et al.,2017) e colaboradores (2017) e nos frutos de grumixama (Eugenia
brasiliensis Lam.) coletados em São Paulo por TEIXEIRA et al. (2015).
Dos mais de trinta tipos de antocianidinas, seis se destacam como os mais comuns em
plantas superiores, sendo estas: pelargonidina, peonidina, malvidina, petunidina, cianidina e
delfinidina, sendo estas três ultimas às mais difundidas na natureza na forma de glicosídeos
(Kong et al., 2003).
As delfinidinas, compostos presentes no chá de hibisco comercial do presente estudo,
demonstraram várias atividades, tais como antioxidante, antimutagênese, propriedades anti-
inflamatórias, hepatoprotetiva, neutroprotetiva (PATEL; JAIN; PATEL, 2013). Esta classe
pode desempenhar um papel crítico como um agente quimioterápico através do
comprometimento dos mecanismos de proteção celular inibindo a autofagia, permitindo que as
ERO se acumulem e, finalmente, aumentem a morte celular por apoptose (LEE et al., 2018).
Daveri et al., (2018), avaliando a resistência a insulina e modulação do processo
inflamatório em camundongos concluiu que o consumo de Cianidina e a Delfinidina na dieta
ou por meio de suplementação é uma estratégia positiva para controlar os efeitos adversos das
dietas ocidentais, incluindo sobrepeso, obesidade e diabetes tipo 2.
Ainda, o sinal m/z 465 foi identificado como quercetina-glucosideo ou quercetina-
galactosideo por Diaconeasa et al. (2014) durante a identificação de ácidos fenólicos, flavonol
glicosídeos e potencial antioxidante em mirtilos, amora preta, framboesas e cranberries
adquiridas na Transilvânia, e como quercetina-3-O-β-D-glucosideo por Wan et al. (2011) na
análise das folhas de veludo-roxo Gynura divaricata. Esta substância possui atividades
antimicrobianas (ZENG et al.; 2019), hepatoprotetora (LI et al.; 2019), ação na prevenção da
diabetes (BULE et al.; 2019) e na hipertensão (GRANDE et al., 2016).
O íon m/z 581 com fragmentação m/z 287 foi reconhecido como Cianidina-3-O-
sambubiosideo e o sinal Delfinidina-3-O-sambubiosideo (m/z 597 com fragmentação m/z 303),
similar ao encontrado em amostras de hibisco coletadas em Portugal (JABEUR et al., 2017) e
no Senegal (RODRÍGUEZ‐MEDINA et al., 2009; SEGURA-CARRETERO et al., 2008) e no
México (RAMÍREZ-RODRIGUES et al. 2011)
Porém, durante a caracterização dos compostos fenólicos em ameixa sul-africana
(Prunus salicina L.) Venter, Joubert e Berr (2013) identificaram o sinal m/z 597 com
fragmentação m/z 303 como quercetina-pentosil-hexosideo.
65
O sinal com m/z 611, cuja fragmentação resultou em m/z 449 foi reconhecido como
Cianidina-3,5-diglucosideo. A mesma substância foi identificada por Segura-Carretero et al.
(2008) em estudo de separação e identificação de antocianinas do hibisco colhido no Senegal,
bem como na polpa de romãs (Punica granatum L) (MENA et al.; 2012).
4 CONCLUSÃO
A espectrometria de massas mostrou-se como uma técnica simples, rápida e eficiente na
obtenção do fingerprint dos constituintes do chá de hibisco, permitindo a identificação de vários
compostos bioativos.
Foram encontados ácidos orgânicos (ácido elágico e ácido hibisco), flavonoides como
quercetina-glucosideo, quercetina-galactosideo e Dihidroxi-isoflavona, alcaloides e
antocianidinas de importante ação biológica como cianidinas e delfinidinas.
Desta forma é possivel afirmar que o chá de hibisco comercial possui em sua constituição
diversos compostos bioativos que podem desencadear benefícios à saúde, porém, se fazem
necessários maiores estudos acerca de sua quantificação e biodisponibilidade.
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70
71
CAPÍTULO 2 – OTIMIZAÇÃO DO TEMPO DE INFUSÃO, TEMPERATURA E
VOLUME DE ÁGUA NA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE CHÁ DE HIBISCO
(Hibiscus sabdariffa L.)
RESUMO
O chá de hibisco ganhou crescente destaque na mídia devido as alegações de benefícios
nutricionais do seu consumo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência dos parâmetros
de extração comercial do hibisco no total de compostos fenólicos, flavonóides e atividade
antioxidante de duas marcas comercializadas da cidade de Diamantina-MG. Um delineamento
composto central rotacional foi construído para um total de 18 ensaios com 4 repetições do
ponto central para otimização do processo. Uma caracterização fitoquímica das bebidas para os
açúcares redutores alcalóides, aminoácidos, antraquinonas, esteróides, fenóis, flavonoides,
glicosídeos, saponinas, taninos e terpenos, análises quantitativas de compostos fenólicos,
flavonoides e atividade antioxidante pelo método DPPH foram realizadas. Os extratos
apresentam considerável teor de compostos fenólicos e atividade antioxidante, além de
indicativos da presença de flavonóides, taninos, fenóis e aminoácidos. Os resultados não foram
convertidos para um ponto de extração ideal, mas uma proporção significativa dos parâmetros
escolhidos nas variáveis de resposta foi observada.
Palavras-chave: Hibiscus sabdariffa L. DCCR. Compostos fenólicos. DPPH. Triagem
fitoquimica
ABSTRACT
Hibiscus tea has gained increasing prominence in the media after proving the alegations of
nutritional benefits of its consumption. The objective of this work was to evaluate the influence
of the commercial extraction parameters of hibiscus on total phenolic compounds, flavonoids
and antioxidant activity of two most popular brands in the city of Diamantina-MG. A rotational
central composite design was constructed for a total of 18 trials with 4 replicates of the central
point for the process otimization. A phytochemical characterization of the beverages for the
alkaloid reducing sugars, Amino acids, Anthraquinones, steroids, Phenols, flavonoids,
glycosides, saponins, tannins and terpenes, quantitative analysis of phenolic compounds,
flavonoids and antioxidant activity by the DPPH method were performed. The extracts present
72
considerable content of phenolic compounds and antioxidant activity, as well as indicative of
the presence of flavonoids, tannins, phenols and amino acids. The results were not converted to
an optimal extraction point, but a significant proportion of the parameters chosen in the
response variables were observed.
Keywords: Hibiscus sabdariffa L. DCCR. Phenolic compounds. DPPH. Phytochemical
screening.
1 INTRODUÇÃO
O hibisco (Hibiscus sabdariffa L.) é um arbusto lenhoso pertencente a família das
malváceas que se desenvolve em regiões de clima tropical e subtropical ao redor do mundo
(HUANG et al., 2015; ALAM et al., 2018). O cálice de suas flores apresenta coloração
vermelho vivo, devido à presença de flavonoides com gossipetina, hibiscetina e seus respectivos
glicosídeos; ácido protocatecuico e eugenol, da classe das antocianinas como a delfinida-3-
sambubiosídeo e a cianidina-3-sambubiosídeo e ácidos orgânicos como ácido cítrico, ácido
ascórbico, ácido maleico e ácido hibisco (CHANG et al., 2012; MOYANO et al., 2016; KANE
et al., 2017).
A associação destes compostos à elevada atividade antioxidante e propriedades
funcionais como ação anti-inflamatória, anticarcinogênica, hipolipidêmica, anti-hipertensiva,
antimicrobiana, por exemplo, tem despertado incessantes estudos acerca do potencial do hibisco
em suas diversas formas de extratos, bem como a inserção em massa de diversos produtos a
base do hibisco, especialmente os chás (AZIZ; WONG; CHONG, 2013; PETER et al., 2014;
MARDIAH et al., 2015; MOYANO et al., 2016; RIAZ; CHOPRA, 2018).
Porém, embora se espere que estes compostos bioativos migrem para a bebida durante
o processo de infusão a quente, poucos foram os trabalhos encontrados na literatura que
relacionaram as propriedades da bebida obtida na forma de uso mais familiar aos consumidores.
Neste contexto, o objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito das variáveis volume de água,
temperatura e tempo de extração sobre os teores de compostos fenólicos e flavoides e na
atividade antioxidante in vitro de extratos obtidos a partir de amostras comerciais de hibisco
comercializadas na cidade de Diamantina, MG, Brasil.
73
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Reagentes e amostra
Os padrões de ácido gálico e quercetina, o 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) e o
reagente de Folin-Ciocauteau foram adquiridos da Sigma Chemical (São Paulo, SP, Brasil).
Todos os reagentes empregados foram de grau analítico. As amostras (HS1 e HS2) de hibisco
desidratado foram compradas no comércio na cidade de Diamantina, MG, Brasil. As
embalagens escolhidas foram avaliadas quanto a presença de avarias e estarem dentro do prazo
de validade estipulado pelos fabricantes.
2.2 Otimização multivariada
No presente estudo usou-se um delineamento composto central rotacional (DCCR)
composto por um planejamento fatorial 23, com 18 ensaios, incluindo quatro replicatas no ponto
central (RODRIGUES, IEMMA, 2005). Investigou-se o efeito do tempo de infusão, da
temperatura e do volume de água empregados no preparo das bebidas no teor de compostos
fenólicos e flavonoides assim como na atividade antioxidante dos chás de hibisco. As faixas
estudas foram de 3 a 10 minutos para a duração da infusão (correspondendo aos níveis de -1,68
a +1,68), 60 a 90 °C para a temperatura da água, e de 50 a 500 mL para o volume de água. Estes
valores foram selecionados com base na literatura, assim como nos valores comumente
empregados pelos consumidores no preparo de chás.
2.3 Preparação das bebidas
As amostras usadas neste estudo (cálices secos de Hibiscus sabdariffa) foram
processadas em moinho de facas (modelo Tecnal TE-625, São Paulo, SP, Brasil) e armazenadas
em frascos âmbar, a temperatura ambiente. Para a preparação das bebidas, três gramas de cada
amostra foram misturados com o volume de água à temperatura determinada para cada ensaio,
sendo mantidas sob aquecimento em banho-maria com agitação (SOLAB, modelo SL180/DT,
Piracicaba, SP, Brasil) pelo tempo desejado. Após este período, as amostras foram filtradas
(papel de filtro Unifil, código 501.012, São Paulo, SP, Brasil) e os extratos armazenados em
frascos de vidro sob refrigeração (5 ºC), até o momento das análises.
74
2.4 Triagem fitoquímica
A caracterização fitoquimica nas bebidas envolveu a determinação qualitativa de
açúcares redutores, alcaloides, aminoácidos, antraquinonas, fenóis, flavonoides, esteroides,
glicosídeos, saponinas, taninos e terpenos (DENNY et al., 2007; AYOOLA et al., 2008;
EGWAIKHIDE; OKENIYI; GIMBA, 2009; HUSSAIN et al., 2011; YADAV; AGARWALA,
2011; OMOTAYO; BOROKINI, 2012; OBOUAYEBA et al., 2015), sendo todas as análises
realizadas em triplicata.
2.5 Determinação do teor de compostos fenólicos totais
Nesta etapa, adaptou-se a metodologia de Singleton; Rossi (1965) para realização em
microplacas. Pipetou-se 100 μl de água Milli-Q (pH= 7,0), 12,5 μL de cada amostra, dos
diferentes ensaisos, e 12,5 μL do reagente Folin-Ciocauteau em cada um dos 96 poços da
microplaca, que foi agitada por 30 segundos e mantida em repouso por 5 minutos. Em seguida,
acrescentaram-se 125 μL de solução de carbonato de sódio a 1 mol.L-1 (p/v), mantendo a
microplaca à temperatura a 25 ºC), ao abrigo da luz, por 90 minutos. A determinação das
absorbâncias foi realizada a 750 nm em leitor de microplacas Spectramax® (San Jose, CA,
Estados Unidos). Para o cálculo da concentração de compostos fenólicos foi elaborada uma
curva analítica a partir do ácido gálico (2.000 mg.L-1) como padrão.
2.6 Determinação do teor de flavonoides totais
Esta análise foi realizada de acordo com a metodologia adaptada de Pereira et al. (2009),
para sua realização microplacas. Assim, 12,5μL de cada amostra e de cada ensaio, 12,5μL de
solução metanólica de cloreto de alumínio a 2 g% (p/v) e 112,5μL solução metanólica de ácido
acético a 5 g% (v/v) foram colocados em cada um dos 96 poçoes da microplaca, que foi mantida
em repouso, a temperatura ambiente (25 ºC) por 30 minutos. A determinação das absorbâncias
foi realizada a 425 nm em leitor de microplacas Spectramax® (San Jose, CA, Estados Unidos).
Para o cálculo da concentração de flavoides totais foi elaborada uma curva analítica a partir da
quercetina (100 µg.L-1) como padrão.
75
2.7 Avaliação da atividade antioxidante
Em uma microplaca de 96 poços foram adicionados 244 μL de solução metanólica de
DPPH a 60 μmol.L-1, seguida da adição de 6 μL de cada uma das amostras (ensaios). Um
controle contendo somente o reagente DPPH também foi preparado simultaneamente. A placa
foi mantida à temperatura ambiente (25 ºC) e ao abrigo da luz por 30 minutos. A determinação
das absorbâncias foi realizada a 515 nm em leitor de microplacas Spectramax® (San Jose, CA,
Estados Unidos), utilizando metanol como branco (BRAND-WILLIAMS, CUVELIER E
BERSET, 1995).
A atividade antioxidante foi expressa como equivalentes de ácido gálico (mg.L-1) e
como percentual de inibição da auto-oxidação do DPPH, induzida pelas amostras e pela solução
padrão de ácido gálico, e foi calculada de acordo com a Equação 1:
% Inibição= AbsDPPH- AbsAmostraAbsDPPH
X 100 (1)
Onde: 𝐴𝑏𝑠𝐷𝑃𝑃𝐻 = absorbância do reagente DPPH puro 𝐴𝑏𝑠𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎= absorbância da amostra
2.8 Análises estatísticas
Os dados da otimização multivariada foram avaliados pela análise de variância
(ANOVA), com auxílio do software Statistica 7.0 (Statsoft, Estados Unidos). Os teores de
compostos fenólicos e flavonoides totais, assim como os valores da atividade antioxidante entre
os ensaios foram comparados pela ANOVA e pelo teste de Bonferroni (p< 0,05), para
determinar se houve diferença significativa entre as amostras das bebidas. Todas as análises
experimentais foram realizadas em triplicata.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Otimização multivariada
Na Tabela 1 estão as variáveis estudadas (codificadas) e os níveis experimentais
(variáveis decodificadas) empregados no preparo dos diferentes extratos de cálices de hibisco.
Dessa forma, para cada uma das amostras deste estudo (HS1 e HS2) foram feitos 18
76
experimentos, totalizando 36 ensaios, nos quais foram realizadas a triagem fitoquímica
qualitativa, a determinação dos teores de compostos fenólicos e flavonoides totais, bem como
a avaliação da atividade antioxidante.
Tabela 1 – Variáveis e níveis experimentais dos ensaios obtidos no delineamento composto central rotacional
Ensaios Variáveis codificadas Variáveis decodificadas
X1 X2 X3 X1 X2 X3 01 -1,00 -1,00 -1,00 141,00 68,10 4,42 02 -1,00 -1,00 +1,00 141,00 68,10 8,58 03 -1,00 +1,00 -1,00 141,00 91,90 4,42 04 -1,00 +1,00 +1,00 141,00 91,90 8,58 05 +1,00 -1,00 -1,00 409,00 68,10 4,42 06 +1,00 -1,00 +1,00 409,00 68,10 8,58 07 +1,00 +1,00 -1,00 409,00 91,90 4,42 08 +1,00 +1,00 +1,00 409,00 91,90 8,58 09 -1,68 0,00 0,00 50,00 80,00 6,50 10 +1,68 0,00 0,00 500,00 80,00 6,50 11 0,00 -1,68 0,00 275,00 60,00 6,50 12 0,00 +1,68 0,00 275,00 100,00 6,50 13 0,00 0,00 -1,68 275,00 80,00 3,00 14 0,00 0,00 +1,68 275,00 80,00 10,00
15 (C) 0,00 0,00 0,00 275,00 80,00 6,50 16 (C) 0,00 0,00 0,00 275,00 80,00 6,50 17 (C) 0,00 0,00 0,00 275,00 80,00 6,50 18 (C) 0,00 0,00 0,00 275,00 80,00 6,50
X1 = água (mL); X2 = temperatura (ºC); X3 = tempo (minutos)
3.2 Triagem fitoquímica
A triagem fitoquimica é um estudo preliminar em que ensaios químicos qualitativos
foram utilizados para identificar a possível presença ou ausência de metabólitos secundários
nas preparações de hibisco. Verfica-se na Tabela 2 que para ambas as amostras, em todos os
ensaios experimentais, detectaram-se os mesmos tipos de metabólitos secundários.
Além da presença de compostos fenólicos das classes fenóis, flavonoides e taninos,
moléculas alvo deste estudo, destaca-se também a presença dos aminoácidos que além do seu
valor nutricional atuam como como copigmentadores das antocianinas produzindo um aumento
na intensidade de cor. (MAZZA & BROUILLARD, 1987).
Destaca-se também a ausência de açúcares redutores, ponto positivo uma vez que a
ingestão de açúcares redutores está relacionada à efeitos adversos à saúde, como cárie dentária
(MOYNIHAN & KELLY, 2014), obesidade (DELLA TORRE et al., 2016), diabetes tipo 2
77
(IMAMURA et al., 2015), doenças cardiovasculares (WARFA et al., 2016) e alguns tipos de
câncer (GIOVANNUCCI, 2001).
Freitas, Santos e Moreira (2013), em extratos hidroalcoólicos de caules ou folhas de
hibisco adquiridos na cidade de São José do Ribamar/MA, encontraram indicativos positivos
de saponinas, taninos, esteroides, flavonoides e fenóis. Por outro lado, Sobota, Pinho e Oliveira
(2016), extratos aquosos ou alcoólicos, obtidos por infusão ou decocto, em amostra
comercializada na cidade de Campo Largo/PR, detectaram apenas cumarinas e flavonoides.
Em amostras de folhas de hibisco coletadas na cidade de Karduna (Nigéria), Adamu e
Ngwu (2015) revelaram a presença de flavonoides, taninos, saponinas e esteroides em extratos
metanólicos, enquanto que Obouayeba et al. (2015), com cálices obtidos em Adjame (Costa do
Marfim), detectaram a presença de alcaloides, polifenóis, flavonoides taninos e saponinas,
empregando metanol acidificado para a obtenção dos extratos. Ao comparar diferentes tipos de
solventes (água destilada, etanol, metanol, éter de petróleo e acetato de etila), na realização de
triagem fitoquímica, Okereke, Iroka e Chukwuma (2015) verificaram a presença de taninos,
saponinas, glicosídeos, fenóis e flavonoides, porém destacaram o maior percentual quantitativo
de flavonoides na análise destes compostos em uma bebida preparada com o cálice do hibisco.
Tabela 2 – Avaliação fitoquímica dos extratos de Hibiscus sabdariffa
Teste fitoquímico Ensaios Freitas,
Santos e Moreira (2013)
Sobota, Pinho e Oliveira (2016)
Adamu e
Ngwu (2015)
Obouayeba et al.
(2015)
Okereke, Iroka e
Chukwuma (2015)
Açúcares redutores - n.r n.r n.r n.r n.r Alcaloides - - - - + - Aminoácidos + n.r n.r n.r n.r n.r Antraquinonas - n.r n.r n.r n.r n.r Fenóis + - n.r n.r + + Flavonoides + + + + + + Esteroides - + - + - - Glicosídeos - n.r n.r n.r n.r + Saponinas + + n.r + + + Taninos + + - + + + Terpenos - n.r n.r n.r - n.r
(+) = presença; (-) = ausência (n.r) = não realizado
Embora pequenas diferenças tenham sido observadas nos diferentes estudos, estas
podem estar relacionadas com as condições climáticas (radiação solar, raios ultravioletas,
78
períodos de seca ou chuva, estações do ano) e de cultivo (tipo de solo, nutrientes), que
influenciam diretamente na produção destes compostos pelos tecidos vegetais (TAIZ; ZEIGER,
2013).
3.3 Teor de compostos fenólicos totais
A influência das variáveis volume de água, temperatura e tempo de extração nos teores
de compostos fenólicos totais das amostras de hibisco está apresentada na Figura 1, equanto
que os resultados desta análise estão mostrados na Tabela 3. Para a amostra HS1, foram
observados valores variando de 120,04 a 1.017,54 equivalentes de ácidos gálico (mg.L-1),
enquanto que para a amostra HS2, eles oscilaram entre 182,13 a 1.670,04 equivalentes de ácidos
gálico (mg.L-1), com diferenças significativas tanto para os diferentes ensaios, quanto entre as
amostras.
Tabela 3 – Teores de compostos fenólicos e de flavonoides em extratos aquosos de cálices
de Hibiscus sabdariffa
Ensaio Compostos fenólicos totais (EAG mg.L-1) Flavonoides totais (EQ mg.L-1)
HS1 HS2B HS1 HS2B 01 884,63 ± 1,25Bx 866,71 ± 38,27Ax 19,84 ± 0,34Bx 22,45 ± 0,20Ax 02 930,88 ± 21,36Bx 861,29 ± 28,51Ax 13,93 ± 0,66Ey 21,35 ± 0,49Ax 03 865,46 ± 30,68By 1.074,63 ± 33,14Ax 15,69 ± 0,33Dy 24,37 ± 0,81Ax 04 920,46 ± 50,47By 1.670,04 ± 94,46Ax 18,14 ± 0,28Dx 22,01 ± 0,84Ax 05 258,79 ± 7,64Fx 347,13 ± 3,31CDx 5,75 ± 0,29Jx 7,8 ± 0,05Dx 06 285,46 ± 6,88Fx 332,54 ± 9,38Dx 4,5 ± 0,05Kx 7,42 ± 0,14Dx 07 375,88 ± 23,15Ex 336,29 ± 19,78Dx 6,35 ± 0,09IJx 8,05 ± 0,09Dx 08 203,79 ± 2,60Fx 288,79 ± 6,29Dx 6,13 ± 0,29IJx 7,58 ± 0,34Dx 09 1.017,54 ± 48,56Ax 1.098,38 ± 76,94Ax 52,86 ± 0,50Ax 39,31 ± 0,14Ay 10 120,04 ± 8,78Gx 182,13 ± 16,39Ex 5,13 ± 0,25Jx 5,53 ± 0,22Ex 11 408,79 ± 12,14DEx 439,21 ± 24,54BCDx 9,37 ± 0,57FGx 10,03 ± 0,25BCx 12 246,29 ± 5,05Fy 495,04 ± 23,92Bx 9,34 ± 0,71FGx 11,13 ± 0,3Bx 13 438,38 ± 23,85CDEx 433,79 ± 37,8BCDx 9,94 ± 0,25Fx 10,66 ± 0,8BCx 14 393,79 ± 0,72DEx 349,63 ± 31,25CDx 8,77 ± 0,14Fx 5,94 ± 0,27Ex
15 (C) 433,79 ± 10,1CDEx 475,88 ± 38,75Bx 9,75 ± 0,65Fx 10,13 ± 0,19BCx 16 (C) 438,79 ± 3,61CDEx 469,63 ± 28,15BCx 9,21 ± 0,43FGx 9,43 ± 0,11Cx 17 (C) 459,21 ±0,72CDx 395,46 ± 19,86BCDx 7,2 ± 0,16HIx 9,47 ± 0,16Cx 18 (C) 483,38 ±4,33Cx 423,38 ± 3,31BCDx 8,33 ± 0,16GHx 7,83 ± 0,20Dx
EAG = equivalentes de ácido gálico. EQ = equivalentes de quercetina. Resultados expressos com a média de triplicatas ± desvio-padrão. Médias indicadas por letras maiúsculas (coluna) ou minúsculas (linha) não diferem entre si pelo teste de Bonferroni (p< 0,05).
Nos gráficos de pareto (FIG. 1) é possível verificar que o principal fator relevante para
a extração de compostos fenólicos foi o volume de água empregado, com correlação linear
79
negativa e significativa, sendo as maiores concentrações destes metabólitos observadas no
ensaio 9, para ambas as amostras, e também nos ensaios 1 a 4, para a amostra HS2. Entretanto,
nesta segunda amostra, cabe destacar que extração de compostos fenólicos ainda foi
influenciada significativamente pelos fatores temperatura, bem como por interações entre as
três variáveis estudadas. As superfície de resposta estão apresentadas nos anexos I e II.
Foram encontrados poucos relatos na literatura similares ao presente estudo, outros
autores já demonstram que o teor de compostos fenólicos totais pode variar dependendo das
condições experimentais empregadas na sua extração.Em amostras de hibiscos comercializadas
em Passo Fundo/RS, Brasil, Bergmeier et al. (2014), utilizando um delineamento DCCR com
cinco variáveis, verificaram que as maiores quantidades de compostos fenólicos foram obtidas
nas amostras sem agitação, com pH de 10,2, durante 110 minutos, na relação solvente/água de
50/50 (etanol ou acetona), a 56 ºC, considerando esse ponto com a de condição ótima para
extração destes metabólitos no tecido vegetal. Purbowati e colaboradores (2016) encontraram
condição ótima de extração dos compostos fenólicos totais utilizando micro-ondas na potência
de saída 250 W e 78,36%, utilizando etanol como solvente durante o tempo de para 4,91
minutos para amostras de hibisco obtidas na Alemanha.
Mohd-Esa et al. (2010), avaliando o teor de compostos fenólicos em amostra de
Hibiscus sabdariffa coletados na Malásia, relataram que os resultados variaram em função da
parte da planta (semente, cálice, folhas ou caule) e do tipo de solvente (água destilada ou
metanol a 80%) empregados na obtenção dos extratos, sendo que nas duas situações os maiores
valores encontrados foram no extrato metanólico de sementes (4,87 mg EAG/g de amostra).
Por outro lado, Formagio et al. (2015), em amostras de hibisco de Dourados/MS/Brasil,
afirmam que o teor de fenóis foi, em média, maior nos extratos metanólicos de cálices (463,34
mg.g-1) quando comparados aos das folhas (382,04 mg.g-1), independente do tipo de substrato
usado no cultivo das plantas (resíduos de granjas avícolas ou Organosuper®).
Já Anokwuru et al. (2011), em amostras de cálices de hibisico da Nigéria, reportaram
que o teor de compostos fenólicos, expressos em equivalentes de ácido gálico, foi distinto nos
diferentes solventes empregados, não observando diferenças significativas entre os extratos
metanólico (29,2 mg.g-1) e etanólico (27,6 mg.g-1) , os quais por sua vez foram superiores aos
valores de fenólicos totais dos extratos aquoso (20,2 mg.g-1) e de acetona (19,3 mg.g-1).
Estes resultados são corroborados pelo estudo de Obouayeba et al. (2015), que em
amostras coletadas na Costa do Marfim, reportaram teores de fenólicos de 23,21 mg EAG/g de
amostra, em extratos obtidos com metanol acidificado. Em contrapartida, Oboh (2008) apontam
80
valores de 13.3 mg g-1, em extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa, comercializados
em Santa Maria, RS, Brasil.
Provavelmente, as diferenças entre os estudos podem ser relacionadas com a origem do
material vegetal empregado, uma vez que as condições climáticas e de cultivo, aspectos
genéticos, grau de maturação e variedade das plantas, bem como presença de diferentes tipos
de insetos e microrganismos, são alguns fatores que podem causar variações na quantidade e
diversidade da composição química das plantas (HARTMANN, 2007; FREITAS; SANTOS;
MOREIRA, 2013; FORMAGIO et al., 2015).
Figura 1 – Gráficos de pareto para o teor de compostos fenólicos totais nos extratos
aquosos de cálices de Hibiscos sabdariffa, para as amostras HS1 (A) e HS2 (B)
A
B
81
82
Além disso, como bem relatado por Garcia-Sales et al. (2010), os compostos fenólicos
englobam moléculas com natureza química diversa, existindo no tecido vegetal de forma
isolada, polimerizada ou complexada com outras moléculas, como carboidratos e proteínas e,
neste sentido, não há um processo ideal para sua extração, em função da solubilidade variada.
Assim, estes autores indicam que diferentes solventes puros (metanol, etanol, propanol,
acetona, acetado de etila) ou em combinações com água devem ser usados para a melhor
caracterização do tipo de composto fenólico presente na amostra.
Todavia, ressalta-se que, o objetivo do presente estudo é avaliação do extrato para
consumo humano, considerando seu uso na forma de chá, sendo inviável o uso de outros
solventes em virtude de suas toxicidades.
3.4 Teor de flavonoides totais
O teor de flavonoides totais das amostras de chá de hibisco está apresentado na Tabela
3. Para a amostra HS1, foram observados valores variando de 4,50 a 52,86 equivalentes de
quercetina (mg. L-1), enquanto que para a amostra HS2, eles oscilaram entre 5,53 a 39,31
equivalentes de quercetina (mg. L-1), com diferenças significativas tanto para os diferentes
ensaios, quanto entre as amostras. Os gráficos de superfície de resposta estão apresentados no
anexo III e IV
A influência das variáveis volume de água, temperatura e tempo de extração nos teores
de flavonóides totais das amostras de hibisco está apresentada na Figura 2.
As maiores concentrações de flavonóides foram observadas no ensaio 9, para ambas as
amostras, e também nos ensaios 1 a 4, para a amostra HS2. Nos gráficos de pareto (FIG. 2) é
possível verificar que o principal fator relevante para a extração destes metabólitos foi o volume
de água empregado, para a amostra HS1 com correlação linear positiva e quadrática negativa,
ambas significativas, para a HS2, além do volume do agua ( correlação linear negativa e
quadrática positiva) também exerceram influência significativa o tempo de infusão ( linear
negativa) e a temperatura (quadrática postiva).
Maciel et al. (2018), avaliando influência da termperatura e do tempo de extração teor
de flavonóides em amostra de Hibiscus sabdariffa coletados em São Paulo/ Brasil, relataram
que a temperatura influenciou significativamente o teor de flavonoides, sendo o maior valor
obtido a 88, 2ºC e 20 mintuos ( 676 ± 1.1 mg QE .100 g−1 ).
Durante a avaliação da influência dos reagentes na extração de flavonoides em hibiscos
de três variedades obtidos em duas cidades do México, Vargas-Léon e colaboradores (2018)
83
observaram que o teor de flavonoides foi influenciado pela variedade, tipo de solvente e
aplicação de hidrolise ácida nas amostras. Neste estudo os maiores valores foram obtidos no
extrato aquoso, variando de 57.57 ± 1.55 a 143.23 ± 14.78 mg QE. 100 g−1.
Figura 2 – Gráficos de pareto para o teor de flavonoides totais nos extratos aquosos de cálices de Hibiscos sabdariffa, para as amostras HS1 (A) e HS2 (B)
Sobota, Pinho e Oliveira (2016) observaram que a maior concentração de flavonoides
foi obtida em extratos aquosos obtidos por infusão do que por decocção 128,23 a 138,07 mg
QE. g−1 em amostra de Hibiscus sabdariffa do Paraná/ Brasil.
A
B
84
Observa-se que os resultados encontrados para o teor de flavonoides do chá de hibisco HS1
e HS2 obtidos neste trabalho são inferiores aos apresentados na literatura recente, especialmente
considerando as infusões em solventes orgânicos.
Tal efeito pode se justificar pelos parâmetros de extração, principalmente o solvente
empregado. Sabe-se que solventes polares como água, metanol, etanol, acetona são os mais
comumente utilizados, porém cada amostra é constituída por polifenóis específicos e de polaridade
diversificada, sendo impossível determinar um consenso sobre um único e efetivo método de
extração padrão (AIRES, 2017).
A miscibilidade dos solventes orgânicos com os outros ou mesmo com outros tipos de
solventes é outro fato a ser considerado para melhorar o rendimento da extração dos polifenois,
porém em se tratando de uma bebida, optou-se pela utilização de água devido à toxicidade dos
demais solventes indicados na literatura (AIRES, 2017).
3.5 Avaliação da atividade antioxidante
Na Tabela 4 são apresentados os resultados para a análise de atividade antioxidante pelo
método DPPH das amostras HS1 e HS2.
Tabela 4 – Atividade antioxidante dos extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa
Ensaio DPPH (EAGmg. L-1) DPPH (% Inibição)
HS1 HS2B HS1 HS2B 01 1.436,14 ± 55,00Ax 528,5 ± 14,68DEFy 82,81 ± 1,83Ax 57,55 ± 0,78DEy 02 680,32 ± 10,13Bx 587,26 ± 13,32CDx 63,52 ± 1,15Cx 59,97 ± 0,85BCDx 03 276,09 ± 13,44Gy 553,86 ± 35,48CDx 45,36 ± 0,78Gy 58,6 ± 1,51CDx 04 868,59 ± 32,97Ax 420,41 ± 4,29FGy 69,73 ± 2,22Bx 52,7 ± 0,50Ey 05 116,62 ± 2,62Hy 320,14 ± 28,04Gx 35,92 ± 0,37Hy 47,7 ± 1,68Ex 06 425,79 ± 12,15DEy 505,86 ± 5,96DEFx 52,95 ± 1,38Fx 56,58 ± 0,37DEx 07 403,49 ± 7,9DEFx 418,76 ± 15,51FGx 51,90 ± 0,50Fx 52,62 ± 0,78Ex 08 626,82 ± 25,06BCx 532,25 ± 8,98DEy 61,50 ± 1,69CDx 57,71 ± 0,50DEx 09 112,84 ± 0,72Hy 714,07 ± 30,94ABx 35,67 ± 0,14Hy 64,65 ± 3,17ABx 10 465,78 ± 3,71DEy 801,80 ± 78,83Ax 54,80 ± 0,37EFy 67,64 ± 2,54Ax 11 279,00 ± 6,80FGy 406,82 ± 2,92Gx 44,71 ± 1,65Gy 52,06 ± 0,24Ex 12 563,24 ± 4,21BCx 387,21 ± 20,25Gy 59,00 ± 0,37CDEx 51,09 ± 1,69Ex 13 75,91 ± 2,8Hy 643,2 ± 6,19BCx 34,06 ± 1,22Hy 62,15 ± 0,7BCx 14 181,65 ± 0,00GHy 603,38 ± 3,13CDx 39,14 ± 1,44Hy 60,61 ± 0,14BCx
15 (C) 384,99 ± 63,91EFy 465,77 ± 5,45EFGx 50,93 ± 3,30Fx 54,8 ± 0,28Ex 16 (C) 541,21 ± 40,21CDx 429,07 ± 6,93EFGy 58,03 ± 2,68DEFx 53,11 ± 0,92Ex 17 (C) 558,26 ± 18,02BCx 370,45 ± 0,94Gy 58,76 ± 2,17CDEx 50,28 ± 0,14Ex 18 (C) 166,27 ± 13,89GHy 427,36 ± 11,82EFGy 38,34 ± 1,58Hy 53,03 ± 0,97Ex
DPPH = 2,2-difenil-1-picril-hidrazila. EAG = equivalentes de ácido gálico. Resultados expressos com a média de triplicatas ± desvio-padrão. Médias indicadas por letras maiúsculas (coluna) ou minúsculas (linha) não diferem entre si pelo teste de Bonferroni (p< 0,05).
85
Os valores foram expressos em ácido gálico equivalente (mg. L-1) e em porcentagem de
inibição, que representa a capacidade do referido composto inbir a oxidação do substrato, de
forma a compara-los com os resultados da literatura. Para a amostra HS1, foram observados
valores variando de 279,00 a 1436,14 equivalentes de ácidos gálico (mg. L-1) ou 44,71 a 82,81
% de Inbição, enquanto que para a amostra HS2, eles oscilaram entre 320,14 a 801,80
equivalentes de ácidos gálico (mg.L-1), ou 47,7 a 67,64 % de Inibição.
A maior atividade antioxidante foi demonstrada pelos ensaios 1,4 para HS1 e para os
ensaios 9,10 da amostra HS2. A influência das variáveis volume de água, temperatura e tempo
de extração na atividade antioxidante das amostras de hibisco está apresentada nas Figuras 3 e
4. Os gráficos de superfície de resposta estão apresentados nos anexos V, VI, VII e VIII.
Figura 3 – Gráficos de pareto para a atividade antioxidante dos extratos aquosos de
cálices de Hibiscos sabdariffa da amostra HS1 expressos em % Inibição (A) e
EAGmg. L-1 (B)
A
B
86
Figura 4 – Gráficos de pareto para a atividade antioxidante dos extratos aquosos de
cálices de Hibiscos sabdariffa da amostra HS2 expressos em % Inibição (A) e
EAGmg. L-1 (B)
Nos gráficos de pareto (FIG. 3) é possível verificar que os principais fatores relevantes
na atividade antioxidante das infusões do chá HS1 pelo método DPPH foi a interação da
temperatura com o volume de água empregado e o binômio tempo e temperauta, ambos com
correlação linear positiva e significativa, considerando as unidades expressas em equivalentes
de ácido gálico. Quando se analisa os resultados em % de inibição pode se observar que a
mesma obteve correlação linear positiva e significativa para a interação entre volume de água
e temperatura.
A
B
87
A amostra HS2 (FIG. 4), independente da forma de apresentação dos dados (% inibição
ou ácido gálico equivalente), a atividade antioxidante foi influenciada pelo volume de água
(quadrática e positiva), tempo de infusão (quadrática e positiva), temperatura (quadrática e
negativa) bem como pela interação entre as variáveis (linear e positivamente)
Em estudo que objetivou a avaliação da atividade antioxidante, pelo método DPPH, de
amostra de Hibiscus sabdariffa coletados na Malásia, Mohd-Esa e colaboradores (2010)
constatatam que os resultados variaram entre os solventes utilizados, sendo maior na extração
metanólica do cálice (87.9 % de Inibição) que em água destilada (30.8 %de Inibição).
Anokwuru e colaboradores (2011), analisaram a atividade antioxidante de extratos de
cálices de hibisico da Nigéria, com diferentes solventes e concluíram que o extrato metanólico
(78%) apresentou valores de porcentagem de inibição significativamente maiores que os
extratos etanólico (69%), aquoso (63%) e em acetona (37%).
Maciel et al. (2018), avaliando influência da termperatura e do tempo de extração na
atividade antioxidante de amostra de Hibiscus sabdariffa coletados em São Paulo/ Brasil,
relataram que a temperatura influenciou significativamente a atividade antioxidante dos
extratos, pois elevadas temperaturas combinadas com longo tempo de extração podem provocar
a degradação dos compostos fenólicos. A maior porcentagem de inibição observada foi a do
ensaio realizado a 60ºC e 34,1 mintuos (67,1 %).
Vargas-Léon e colaboradores (2018), em estudo da influência dos reagentes atividade
antioxidante em hibiscos de três variedades obtidos em duas cidades do México, concluíram
que a porcentagem de inibição dos extratos foi influenciada pela variedade, tipo de solvente e
aplicação de hidrolise ácida nas amostras. Neste estudo os maiores valores foram obtidos no
extrato etanólico da variedade criola, 1,86 miligramas equivalentes de ácido ascórbico por
grama.
As diferenças observadas nestes aspectos se devem tanto à variedade de Hibisco
analisada como também as características enfadoclimáticas como o clima, o relevo, a litologia,
a temperatura, a umidade do ar, a radiação, o tipo de solo, o vento, a composição atmosférica e
a precipitação pluvial (BORRÁS-LINARES et al., 2015)
Foi realizada a sobreposição dos gráficos do presente estudo no intuito de se obter uma
faixa de melhor extração das variáveis analisadas, porém esta avaliação não foi efetiva. Para
cada variável (fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante), os resultados apontaram faixas
ótimas de extração diferentes e distantes umas das outras tornando a sobreposição ineficiente.
Na Tabela 5 é apresentada a correlação de Pearson entre as variáveis resposta para as
amostras de chá de hibisco comercializadas na cidade de Diamantina-MG.
88
A partir desta análise é possível observar que o teor de compostos fenólicos apresenta
correlação significativa com o teor de flavonoides totais. Vargas-León e colaboradores (2018)
realizaram a correlação de Pearson para as variáveis: fenólicos totais, flavonoides totais e
expressos em catequina e quercetina, atividade antioxidante pelos métodos DPPH , ABTS
(ácido 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazoline-6-sulfonico), DMPD (N,N-Dimetil-p-
fenilenediamina) e inibição da enzima conversora de angiotensina e encontrou forte correlação
entre flavonoides totais e teor de compostos fenólicos (0,74, p < 0,05).
Tabela 5 – Correlação entre os teores de compostos fenólicos totais (CFT) e flavonoides totais (TFT) com a atividade antioxidante, para os extratos aquosos de Hibiscus
sabdariffa
Comparações Amostra HS1 Amostra HS2
r p r p
CFT x TFT 0,7350 0,0005 0,8162 <0,0001 CFT x DPPH (EAG mg.L-1) 0,3064 0,2161 0,0466 0,0650 CFT x DPPH (% inibição) 0,2253 0,3688 0,0631 0,8036 TFT x DPPH (EAG mg.L-1) -0,0010 0,9969 0,3092 0,3420 TFT x DPPH (% inibição) -0,0886 0,7266 0,3194 0,3582 DPPH (EAG mg. L-1) X DPPH (% inibição) 0,9744 <0,0001 0,9973 <0,0001
Já os demais parâmetros não apresentam forte correlação entre si, diferentemente do
encontrado por Vargas-León et al., 2018 que obteve correlação positiva entre DPPH e fenólicos
totais (0,88, p < 0,05) e flavonoides e DPPH (0,78, p < 0,05).
89
4 CONCLUSÃO
A partir dos resultados apresentados é possível observar que o chá de hibisco comercial
apresenta considerável teor de compostos fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante e que
estes são extraídos satisfatoriamente durante a infusão.
Observou-se pelos valores obtidos que, apesar de não se haver uma otimização exata das
variáveis de preparo, os melhores desempenhos seja no teor dos compostos, bem como em sua
atividade antioxidante, forma obtidos em faixa de temperatura de 68,1ºC a 91,9ºC, de 50 a 141
mililitros de água com duração de infusão de 4,42 a 8,58 minutos (Amostras 1, 2, 3, 4, 9).
Estudos complementares de otimização poderão ser realizados dentro das faixas
propostas e também considerando a presença de outras classes de compostos como taninos e
antocianinas que atuam como antioxidantes, mas não foram quantificados no presente estudo.
REFERENCIAS
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94
Anexo I– Graficos de superfície de resposta para para o teor de compostos fenólicos totais
nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa, para a amostra HS1 (A, B e C)
A
B
C
F
95
Anexo II– Graficos de superfície de resposta para para o teor de compostos fenólicos totais
nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa, para a amostra HS2 (A, B e C)
A
B
C
96
Anexo III – Graficos de superfície de resposta para para o teor de flavonóides totais nos
extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa, para as amostras HS1 (A, B e C)
A
B
C
97
Anexo IV – Graficos de superfície de resposta para para o teor de flavonóides totais nos
extratos aquosos de cálices de Hibiscus sabdariffa, para as amostras HS2 (A, B e C)
A
B
C
98
xAnexo V – Graficos de superfície de resposta para para o teor de atividade antioxidante
pelo método DPPH expresso em % de Inibição nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus
sabdariffa, para as amostras HS1 (A, B e C)
A
B
C
99
Anexo VI – Graficos de superfície de resposta para para o teor de atividade antioxidante
pelo método DPPH expresso em % de Inibição nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus
sabdariffa, para as amostras HS2 (A, B e C)
A
B
C
100
Anexo VII – Graficos de superfície de resposta para para o teor de atividade antioxidante
pelo método DPPH expresso em EAGmg. L-1 nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus
sabdariffa, para as amostras HS1 (A, B e C)
A
B
C
101
Anexo VIII – Graficos de superfície de resposta para para o teor de atividade antioxidante
pelo método DPPH expresso em EAGmg. L-1 nos extratos aquosos de cálices de Hibiscus
sabdariffa, para as amostras HS2 (A, B e C)
A
B
C