anÁlise quantitativa e morfometria de neurÔnios do...

UNIVERSIDADE PARANAENSE

ANÁLISE QUANTITATIVA E MORFOMETRIA DE NEURÔNIOS DO PLEXO MIENTÉRICO DO ÍLEO E

CÓLON DESCENDENTE DE RATOS INFECTADOS POR Toxoplasma gondii

ELAINE YAE YAMASHITA SUGAUARA

UMUARAMA, 2008

UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR Mestrado em Ciência Animal




Orientador: Prof. Dr. EDUARDO JOSÉ DE ALMEIDA ARAÚJO

Dissertação apresentada a Universidade Paranaense como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.

UMUARAMA - PR

FEVEREIRO DE 2008

S947a Sugauara, Elaine Yae Yamashita Análise quantitativa e morfométrica de neurônios do plexo

mientérico do íleo e cólon descendente de ratos infectados por toxoplasma gondii / Elaine Yae Yamashita Sugauara.

Umuarama: Universidade Paranaense - UNIPAR, 2008. 72 f.

Orientador: Prof. Dr.Eduardo José de Almeida Araújo.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Paranaense - UNIPAR

1. Ciências médicas 2. Toxoplasmose. 3.

Sistema nervoso

1.

entérico. 4. Morfologia. I. Universidade Paranaense

2.

UNIPAR. II. Título. 3.

(21 ed) CDD:

Bibliotecária Responsável Inês Gemelli CRB 9/966





ORIENTADOR: Prof. Dr. Eduardo José de Almeida Araújo

Aprovada em: 27/02/2008

EXAMINADORES:

Prof. Dr. Eduardo José de Almeida Araújo - Presidente ________________________ Profa. Dra. Sandra Regina Stabille ________________________________________ Profa. Dra. Sônia Lucy Molinari ___________________________________________

Umuarama, 27 de Fevereiro de 2008

Dedico este trabalho ao esposo Takeshi e

as minhas filhas Regina, Rosângela e Elisângela, que foram à essência da minha luta e perseverança.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço a Deus por ter me dado a oportunidade de estar no mundo, abençoar-me, iluminando o caminho trilhado, dado a sabedoria durante todo este período, assim como condições de superar dificuldades e contemplar a vitória.

Aos meus pais Hissayoshi e Yoshino (in memoriam) por ter me dado a vida e, proporcionado uma educação.

A toda minha família, principalmente, ao meu esposo Takeshi, minhas filhas Regina, Rosângela e Elisângela, que representaram para mim a união nos momentos

importantes, ampararam-me e acompanharam todo o desenvolvimento deste trabalho, incentivando e tornando possível a realização desse sonho.

Ao meu orientador Prof. Dr. Eduardo José de Almeida Araújo, que foi mais que um orientador, foi um amigo, com quem aprendi o verdadeiro significado de

companheirismo, tendo compartilhado minhas angústias nos momentos de dificuldades, durante estes dois últimos anos, incentivando-me a ser persistente diante das dificuldades, das minhas limitações, orientando-me com dedicação, com demonstrações de amor e confiança, para a concretização deste sonho que se torna realidade.

Ao Prof. Dr. Aristeu Vieira da Silva, como exemplo de pessoa, com uma forma toda especial pela atenção e prestatividade no esclarecimento de dúvidas e na valiosa contribuição para a realização deste trabalho.

À Profa. Dra. Débora de Mello Gonçales Sant Ana, de argüir as idéias dos artigos apresentados neste trabalho, com a sua valiosa contribuição.

Ao Prof. Dr. José Ricardo Pachaly, pela importante contribuição na anestesia dos animais.

Ao Prof. Jean Michel Rezende pela tradução dos artigos para a língua inglesa.

À Profa. Tatiane Henrique Sousa Machado pela revisão da língua portuguesa. À Sra. Inês Gemelli, bibliotecária da Universidade Paranaense, pela confecção

da ficha catalográfica. A todo o corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da

UNIPAR. À minha amiga Susiana Galli, com seu jeito meigo de ser, foi uma

incentivadora durante esse período. Aos secretários da Pós-Graduação Stricto Sensu pela atenção e dedicação. À colaboração da Ana Lucia Sartori pela ajuda na formatação da dissertação,

com dedicação e entusiasmo. Aos alunos de iniciação científica do Laboratório de Neurogastroenterologia

Experimental da UNIPAR: Anderson, Barbara, Elisângela, Elton, Janaina e Neide, pelo

auxílio na coleta de dados. Meus sinceros agradecimentos, sem vocês não seria possível à concretização deste trabalho.

Meus agradecimentos especiais a Universidade Paranaense (UNIPAR), campus sede (Umuarama), pela oportunidade concedida ao ingresso neste programa

de mestrado.

A todos que colaboraram direta ou indiretamente para a concretização desta pesquisa, expresso minha eterna gratidão. Essa pesquisa não seria realizada sem a significativa contribuição de vocês. Muito Obrigada!

A cada dia que nasce levanta-se um

grupo de pessoas que estão dando de si para fazer uma significativa diferença neste mundo. Elas estão apresentando novas idéias, buscando soluções e evidenciando uma força de compromisso incomum. Essas pessoas simplesmente não sabem o que é desistir; mesmo quando diante de

uma iminente derrota, continuam a persistir com os olhos fixos no forte senso de

alcançar a tão desejada realização. São essas pessoas que movem o

mundo em vanguarda. Elas não são pessoas famosas e nem trazem consigo a aurora dos astros e das estrelas. Em sua

grande maioria continuarão a permanecer no anonimato e sem nenhuma celebração especial. Elas são aquelas pessoas que estão fazendo o que devem fazer. Elas têm a habilidade de ver as possibilidades e simplesmente não conseguem ficar estáticas e, persistentemente, correm em busca das possibilidades que estão à sua

frente. Nós podemos ver com clareza e

evidência a realização do trabalho dessas pessoas através do seu compromisso e das suas realizações. Essa gente é gente muito especial. Elas são especiais porque sinceramente estão buscando por uma real e significativa diferença e estão a pagar o preço por criar um legado significativo e de máximo valor.

Essa gente especial nos ensina que coisas significativas e valiosas é aquilo que

qualquer pessoa pode fazer, bastando simplesmente a evidência de um

compromisso para com esse fim.

(Gilson Hino)


SUGAUARA, E. Y. Y., ARAÚJO, E. J. A. Análise quantitativa e morfométrica de neurônios do plexo mientérico do íleo e cólon descendente de ratos infectados por Toxoplasma gondii. DISSERTAÇÃO (MESTRADO) MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL. UNIVERSIDADE PARANAENSE, 2008, 72p.

RESUMO

Objetivou-se avaliar as alterações causadas por duas cepas de Toxoplasma gondii, uma do tipo II e outra do tipo III, sobre os neurônios do plexo mientérico do íleo terminal e do cólon descendente de ratos através de quantificação e morfometria. Para tanto, utilizou-se vinte e seis ratos (Rattus norvegicus) Wistar machos com sessenta dias de idade mantidos em caixas com grades individuais num biotério com temperatura constante de 25º C e alternância de ciclos claro-escuro de 12 horas. Todos os animais receberam ração comercial para roedores (NUVITAL®) e água ad libitum. Os animais foram divididos em seis grupos. Quatro grupos participaram do experimento com infecção aguda e crônica causada por uma cepa genótipo III (Experimento A): grupo controle agudo (GCA, n = 4), grupo experimental agudo (GEA, n = 4), grupo controle crônico (GCC, n = 5) e grupo experimental crônico (GEC, n = 5). Os animais do GEA e GEC receberam 104 taquizoítos por via oral. Dois grupos participaram do experimento com infecção aguda causada por uma cepa genótipo II (Experimento B): grupo controle (GC, n = 4) e grupo experimental (GE, n = 4), sendo este inoculado por via oral com 20 cistos teciduais da cepa ME-49. Os animais pertencentes aos grupos GCA e GEA do Experimento A, assim como todos os grupos do experimento B, foram submetidos à eutanásia 24 horas após a infecção (fase aguda), e os grupos GCC e GEC do Experimento A 30 dias após a infecção (fase crônica). No momento da eutanásia, cada animal foi anestesiado visando laparotomia para retirada do íleo terminal e do cólon descendente, e colheita de sangue através de punção através do plexo retro-orbital, no caso dos animais do GCC e GEC. Através do método de aglutinação direta, o sangue coletado foi processado para detecção da presença de anticorpos anti-T. gondi. Após retirada, os segmentos intestinais descritos acima foram lavados e fixados utilizando formol acético. Em seguida, foram dissecados, com retirada da túnica mucosa e tela submucosa, restando preparados totais formados pela túnica muscular e serosa, os quais foram corados pela técnica de Giemsa. De cada animal foi contado o número total de neurônios mientéricos em 120 campos microscópicos (ampliados 400 vezes) distribuídos uniformemente por toda a circunferência intestinal. Além disso, foi mensurado a área do pericário, do núcleo ecitoplasma de 300 neurônios do plexo mientérico de cada animal. Os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov para verificar o tipo de distribuição, sendo expressos como média ± desvios-padrão, os dados de distribuição normal e os demais como mediana e percentis 25 e 75 (P25 e P75). Para comparar os dados entre os grupos controle e experimental, utilizou-se o teste t de Student para dados com

distribuição normal e o teste de Mann-Whitney para os de distribuição livre. De

acordo com o exame sorológico, todos os animais do GEC tiveram resultado positivo para presença de anti-T. gondii, enquanto os do GCC tiveram resultado negativo. Quanto aos resultados, para o experimento A: não foram observadas alterações nas dimensões dos segmentos intestinais coletados, exceto redução no comprimento, largura e área do jejuno-íleo dos animais do grupo GEC (p

UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR

Mestrado em Ciência Animal

SUGAUARA, E. Y. Y., ARAÚJO, E. J. A. Morphometric and quantitative analyses of neurons of the myenteric plexus in the ileum and descending colon of rats infected by

Toxoplasma gondii. DISSERTAÇÃO (MESTRADO) MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL. UNIVERSIDADE PARANAENSE, 2008, 72p.

ABSTRACT Alterations caused by two Toxoplasma gondii strains

type II and III

on the neurons of the myenteric plexus in the terminal ileum and descending colon of rats through quantification and morphometrics were assessed. Therefore, 26 male 60-day-old Wistar rats were kept in boxes with individual grids in a bioterium constantly at 25°C with 12-hr light/12-hr dark alternate cycles. All animals received rat chow-fed (NUVITAL®) and water ad libitum. They were divided into six groups. Four groups with acute or chronic infection caused by the genotype III strain (Experiment A) took part in the experiment: Acute Control Group (ACG, n = 4); Acute Experimental Group (AEG, n = 4); Chronic Control Group (CCG, n = 5), and the Chronic Experimental Group (CEG, n = 5). The animals from the ACG and ECG received 104 tachyzoites orally. Two groups with acute infection caused by a genotype II strain (Experiment B) took part in the experiment: Control Group (CG, n = 4) and Experimental Group (EG, n = 4), which was orally inoculated with 20 tissue cysts from the ME-49 strain. Animals belonging to the ACG and GEA from Experiment A, as well as all the groups from Experiment B, were submitted to euthanasia 24 hour after the infection (acute phase), and the CCG and ECG from Experiment A 30 days after the infection (chronic phase). At the moment of euthanasia, each animal was anesthetized for laparotomy in order to remove the terminal ileum and descending colon, as well as collecting blood by puncture through the retro-orbital plexus for the animals from the CCG and ECG. The collected blood was processed for the detection of the presence of anti-T. gondii antibodies by the direct agglutination method. After the removal, the intestinal segments described above were washed and fixed by using acetic formol. Then, they were dissected; the mucosa and submucosa were removed, leaving the whole mounted formed by the muscle and serous which were stained with Giemsa. The total number of myenteric neurons of each animal was cut into 120 microscopic fields (extended 400 times) was counted and distributed uniformly all around the intestinal circumference. Besides, the nucleus, cytoplasm and soma areas from 300 neurons in the myenteric plexus of each animal were measured. Data were submitted to the Kolmogorov-Smirnov test in order to verify the distribution type being expressed as mean ± standard deviation, and the normal distribution data and others were expressed as median and percentiles 25 and 75 (P25 and P75). In order to compare data among the control and experimental groups, the Student-t test was used for normal distribution data, and the Mann-Whitney test for the free distribution data. According to the serologic, all the animals from the ECG presented positive results regarding the presence of anti-T.gondii, whereas the CCG presented negative results. With respect to the results for Experiment A: alterations on the dimensions of the collected intestinal segments were not observed, except the reduction of the length, width, and area of the ileum-jejunum from the animals from

ECG (p

SUMÁRIO / SUMMARY

Paper I - ALTERATIONS OF THE MYENTERIC PLEXUS OF THE ILEUM AND THE DESCENDING COLON CAUSED BY Toxoplasma gondii (GENOTYPE III)

p. 12

Artigo I - ALTERAÇÕES DO PLEXO MIENTÉRICO DO ÍLEO E CÓLON DESCENDENTE CAUSADAS POR Toxoplasma gondii (GENÓTIPO III)

p. 28

Paper II - HYPERTROPHY OF THE NEURONS IN THE ILEUM FROM RATS INFECTED WITH CYSTS OF Toxoplasma gondii (GENOTYPO II)

p. 44

Artigo II - HIPERTROFIA DE NEURÔNIOS DO ÍLEO DE RATOS INFECTADOS COM CISTOS DE Toxoplasma gondii (GENÓTIPO II)

p. 59

Paper presented as part of the first author´s dissertation to the UNIPAR Animal Science Master; Experimental Neurogastroenterology Laboratory

UNIPAR, Umuarama, PR, Brazil; 2 Preventive Veterinary Medicine Laboratory

UNIPAR, Umuarama, PR, Brazil. Financial Support: UNIPAR.

Dr. Eduardo José de Almeida Araújo

Experimental Neurogastroenterology Lab. Universidade Paranaense (UNIPAR) Praça Mascarenhas de Moraes s/n 87502-210 Umuarama PR Brazil.

12

ALTERATIONS OF THE MYENTERIC PLEXUS OF THE ILEUM AND THE DESCENDING COLON CAUSED BY Toxoplasma gondii (GENOTYPE III)

Elaine Yae Yamashita Sugauara1, Débora de Mello Gonçales Sant Ana1, Elton Carlos de Almeida1; Anderson Brunetti Reis1; Aristeu Vieira da Silva2, Eduardo José de Almeida Araújo1

ABSTRACT

Alterations caused by a genotype III strain of Toxoplasma gondii were assessed with respect to the number and the morphometry of the myenteric neurons in the terminal ileum and the descending colon. Eighteen rats were divided into four groups: Acute Control Group (ACG, n = 4); Acute Experimental Group (AEG, n = 4); Chronic Control Group (CCG, n=5) and Chronic Experimental Group (CEG, n = 5). NaCl solution was administered through gavage to the animals in the ACG and CCG. Toxoplasma gondii tachyzoites (104) from a genotype III strain were orally administered to the AEG and CEG. Acute Groups were submitted to euthanasia after 24 hours, and the Chronic Groups after 30 days. Neuronal loss was not observed in both organs. The neurons atrophied in the terminal ileum as the opposite occurred with the neurons at the descending colon during the chronic phase of infection.

KEY WORDS: Enteric Nervous System; Toxoplasmosis; Morphology.

Alterações do plexo mientérico do íleo e cólon descendente causadas por Toxoplasma gondii (genótipo III)

RESUMO

Objetivou-se avaliar as alterações causadas por uma cepa genótipo III de Toxoplasma gondi, sobre o número e a morfometria de neurônios mientéricos, do íleo terminal e do cólon descendente. Dividiu-se dezoitos ratos em quatro grupos: controle agudo (GCA, n = 4), experimental agudo (GEA, n = 4), controle crônico (GCC, n = 5) e experimental crônico (GEC, n = 5). Os animais do GCA e GCC receberam solução de NaCl por gavagem, e os animais do GEA e GEC 104 taquizoítos de uma cepa genótipo III de T. gondii por via oral. Os grupos agudos após 24 horas foram submetidos à eutanásia e os crônicos após 30 dias. Observou-se que não houve perda neuronal em ambos os órgãos. No íleo terminal, os neurônios atrofiaram-se, enquanto o oposto ocorreu com os do cólon descendente durante a fase crônica da infecção.

PALAVRAS-CHAVE: Sistema Nervoso Entérico; Toxoplasmose; Morfologia.

13

The Enteric Nervous System (ENS) is a complex net of intramural innervation of the

digestive tube capable of regulating the motility reflexes and coordinating the processes including

secretion and absorption, controlling the blood flow and modulating the immune and endocrine

functions. Besides, it presents a number of plexus, two ganglionic: myenteric and submucosal. The

ENS distinguishes itself from the rest of the peripheral nervous system as it presents a great deal of

neurons (similar to those found at the spinal cord) which form circuits capable of interacting with

the internal environment of the digestive tube independently of the central nervous system (CNS).

This is due to its having sensitive neurons, intrinsic primary afferent neurons, interneurons, and

excitatory and inhibitory motor neurons, structurally interconnected even more complexly by

considering the animals evolutionary scale1. Neurons are cells which may have their functioning

altered by elements of the diet and by inflammatory processes which may develop focalized

necrosis2 and/or alter its metabolism3. There are reports of some parasites which can break out

some of these problems within the ENS such as Trypanosoma Cruzi4, Schistosoma mansoni5 e, and

Schitosoma japonicum6. On the other hand, there are no descriptions of studies assessing the

consequences of infections by Toxoplasma gondii for enteric neurons even though there a number

of researches and clinical reports indicating the pathogenicity of this parasite for the CNS

neurons2.

The Toxoplasma gondii is a protozoan phylum apicomplexa which may be located at

the intestinal epithelium of felidae (definite hosts) and in different tissue of homeothermic animals,

including men. The felidae are the only definite hosts as they are the only animals presenting an

enteroepithelial cycle with sexual reproduction of the parasite, with the formation of oocytes which

are eliminated through the feces. Millions of oocytes may be eliminated at a single evacuation,

remaining viable at the environment for a long period depending on the environmental conditions

and humidity. Another cycle of the development of the parasite is the extraintestinal manifestation

either for the definite host or the intermediary here there is asexual development of the parasite

14

with the formation of tachyzoites and bradyzoites. The intermediary host is infected by ingesting

raw or undercooked meat containing tissue cysts as well as by ingesting water or food

contaminated with oocytes. After ingestion, the walls of the cysts or oocytes are ruptured by the

enzymatic degradation and the infectious form of the parasite is released within the intestinal

lumen, which quickly invades and multiplies inside the host cells, where they differ into

tachyzoites7. The T. gondii holds a population structure highly clonal8 based on the three lines I, II,

and III. Strains isolated in Brazil have demonstrated that Genotypes I and III are highly virulent9.

The initial symptoms of toxoplasmosis may include skin irritation, fever, increase of

lymph node, and visual perturbation, such as chorioretinitis and uveitis10. With respect to the

congenital infection, it usually occurs when the woman is exposed to the infection during

pregnancy as the parasites easily cross the placenta. As most of these infections are asymptomatic,

a few of the cases may result in abortion, stillbirths, or lesions of the fetal nervous system.

Children severely taken ill present chorioretinitis and brain necrosis and there may be

hepatosplenomegaly, hepatic insufficiency, convulsions, and hydrocephalus11. It is an

opportunistic infection which strikes immunocompromised individuals such as those infected with

the HIV7. In animals

such as cats and dogs, toxoplasmosis primarily affects the nervous system,

the gastrointestinal tube, the ocular region, and the respiratory system; besides other clinical

manifestations including fever, depression, diarrhea, respiratory difficulty, convulsion,

hyperexcitability, tremor, psychological weakness, vomiting, and oral ulceration12. Myocarditis,

lynphonopathy, chorioretinitis, pancreatitis, anemia, intestinal granuloma were associated with

toxoplasmosis12. It may also cause abortion in sheep, pigs, and rabbits infected during pregnancy7.

Rats infected with T. gonddi develop good humoral and cell immune response within a short

length of time13. In relation to the clinical evolution and the placental transmission, toxoplasmosis

in rats and humans is alike; therefore, infection in rats may be used as a model for human

toxoplasmosis14.

15

As a result of such neurological and gastrointestinal alterations caused by T. gondii,

this paper assesses the possible alterations caused by the Genotype III strain of this parasite in the

number and morphometry of the myenteric neurons of the terminal ileum and the descending colon

of rats.

METHOD

Experimental Groups

The experimental protocol was previously approved by the UNIPAR Ethics

Committee in Researches Involving Animal Experimentation.

Eighteen male, 60-day-old Wistar rats (288.3 ± 74.6g), kept in boxes with individual

grids, in a bioterium constantly at 25°C with 12-hr light/12-hr dark alternate cycles, were used. All

the animals received rat chow (NUVITAL®) and water ad libitum.

The animals were divided into 4 groups: Acute Control Group (ACG, n = 4); Acute

Experimental Group (AEG, n =4); Chronic Control Group (CCG, n=5) and Chronic Experimental

Group (CEG, n = 5). NaCl solution was administered through gavage to the animals in the ACG

and CCG. Toxoplasma gondii tachyzoites (104) from a Genotype III strain isolated from dog brains

with neurological symptomatology9 were orally administered to the AEG and CEG. Acute Groups

were submitted to euthanasia after 24 hours, and the Chronic Groups after 30 days.

The animals were intramuscularly anesthetized at the moment of the euthanasia by

using the following protocol: Acepram® 1,26 mL/kg + Ketalar® (10 mL) 1,26 mL/kg + Rompum®

(2%) 0,42 mL/kg + Atropina® (1%) 0,22 mL/kg15 in order to collect blood by puncturing the retro-

orbital plexus (only from CCG and CEG groups), and laparotomy for the removal of the terminal

ileum and the descending colon. The terminal ileum was considered as the distal portion to the

initial ileocecal fold Then, the animals were submitted to euthanasia by anesthetic deepening.

16

The blood collected was centrifuged and the serum was used to detect the presence of

antibodies against T. gondii by the direct agglutination method16.

Obtaining the Whole-Mount Preparations

The terminal ileum and the descending colon from each animal were measured with

respect to length and width by using a tape measure and a millimetric ruler as they were removed.

Because of the difficulty on automatically distinguishing the terminal ileum of the jejunum, these

measurements were made by considering these two organs together. Then, they were washed in a

9%-NaCl solution, filled and immersed in a fixation solution containing acetic formol for 48 hours.

Next, they were dissected with the aid of a stereomicroscope by removing the mucosa and the

submucosa. The whole-mounted

consisting of serous and mucosa

were stained according with

the Giemsa technique17.

Quantitative Analysis

The total number of myenteric neurons was counted in 120 microscopic fields,

uniformly distributed all over the intestinal circumference of each specimen, totalizing an area of

25.2mm2 per animal. For that, a Motic BL220A binocular microscope with 40x objective was

used. The neurons positioned at the edges of each field were counted in alternated fields.

Morphometric Analysis

The area of the soma, cytoplasm, and the nucleus of 300 neurons of the myenteric

plexus of the terminal ileum and the descending colon (uniformly distributed all over the intestinal

circumference) of the animals from each group was measured with the software Image Motic Plus,

version 2.0. A microscope with a 2.0 Megapixel digital camera (MOTICAM 2000) connected to a

17

computer was used for that. From these values, neurons were divided into classes by considering

the soma area (50µm2 interval) and the nucleus-soma ratio (0.10 intervals).

Statistic Analysis

All the data were initially submitted to the Kolmogorov-Smirnov test for the

verification of their distribution type. Normal distribution data were expressed as mean±standard

deviation, and the free distribution ones were expressed as median and percentiles 25 and 75 (P25;

P75). The Student s test (normal distribution data) and Mann-Whitney (free distribution data)

were used in order to compare Control and Experimental Group, by considering P

18

clonal lines: I, II and III18. There is a prevalence of Genotype I, followed by III, in isolated from

pigs19, dogs9, and cats20 in Brazil. Genotype III strains isolated in the North Hemisphere have

presented low virulence enabling the development of a chronic infection with the formation of

tissue cysts in mice8; on the other hand, the ones isolated in Brazil are might be lethal for them9.

Besides, in vitro, bradyzoites develop spontaneously within the neurons, astrocytes, and microglias

isolated from rats central nervous system fetus indicating that these three cellular types may be

hosts for the of the parasite encystation21. However, there are no reports on the literature whether

the neurons and/or glias of the enteric nervous system are also affected by the T. gondii. Thus, this

study assesses possible alterations of the myenteric rats infected by an isolated Genotype III strain

from dogs with neurological symptomatology in Brazil9.

The dimensions of the ileum jejunum and the total colon, as well as the total number of

myenteric neurons of these intestinal segments, observed in this study during the acute phase of the

infection (24hr after inoculation), were not altered. On the other hand, it was observed that, in the

terminal ileum, the nucleus of the myenteric neurons tended to occupy a smaller portion of the

soma (p

19

of ~30.8% of the soma area, ~23.6% of the area of the nucleus and of ~ 35.1% of the area of the

cytoplasm (p

20

of the ones smaller than 100µm2 and an increase in the numbers of neurons between 151 and

250µm2 in the descending colon.

The distribution of the frequency by considering the nucleus-soma area ratio, that is, the

proportion that the nucleus occupies in the soma, most of the neurons in the terminal ileum

presented nuclei occupying 30-40% of the soma; in the descending colon, the area the nuclei

occupied 41-60%. There were no significant differences among the experimental groups.

Thus, in general, it was observed that the myenteric neurons of the terminal ileum

suffered more morphometric alterations than those of the descending colon, what may be related to

the organization of the immune system of these organs. It is extremely common to observe

lymphoid nodules (Peyer s patches) in the terminal ileum in relation to the colon. Considering the

immune system, studies have noted that the intraperitonial infection with T. gondii recruits

inflammatory cells (especially neutrophils) in the inoculation area22. Molecularly, it is reported that

the NF- transcription factor has a central role on the regulation of the immune, antiapoptotic and

inflammatory response in animals infected with T. gondii18. It is worth pointing out that the

activation of the NF- translocation by the T. gondii is a controversial area, that is, depending on

the strain, host cell and species, the T. gondii may block the NF- translocation and inhibit the

transcription of the genes involved with the inflammatory response, mainly the 12p40 interleukin

(IL) and the tumor necrosis factor (TNF- )18, thus it is possible to observe the differences

regarding the virulence of the parasite.

There are a number of reports on the literature that the increase of the immunological

effector cells and their products are responsible for alterations in the neuronal elements5,6. In the

central nervous system, the microglias attack T. gondii with the dependent mechanisms of the

interferon (IFN- ) and the nitric oxide (NO)21. The IFN-

is a key cytosine for the resistance

against T. gondii23.

21

Most of the studies related to the immune system/enteric nervous system interaction

involves the irritable bowel syndrome. Through them, it is known that a number of products

released from the infiltrated and/or resident leukocytes have demonstrated potential to sensibilize,

and even directly activate myenteric neurons and primary afferent intestinal neurons24. Within the

resident group are the mast cells and muscle macrophages. Mast cells produce bradykinin which

eases the enteric secretion of acetylcholine25, besides increasing the excitability of the myenteric

neurons26 and primary intestinal afferents27. The muscle macrophages secrete cytokines such as IL-

1 and IL-6, which act directly on the increase of the excitability of the myenteric neurons28 and

module the secretion of norepinephrine29. Moreover, the intestinal inflammation induces the

secretion of cytokines such as IL-1 , TNF- , IFN- , and TGF- from the myenteric neurons;

however, the identity of the cells which secrete cytokines, neuronal and glias, is not known24. It is

worth pointing out that the vasoactive intestinal peptide (VIP) plays an important neuroprotector

role, either for the central30 or enteric31 neurons.

This study demonstrated that rats infected either for 24 or 30 hours did not present

myenteric neuron loss; however, these cells became atrophic in the terminal ileum whereas the

opposite happened in the descending colon. By considering the possibility of the T. gondii infect

cells from the ENS, as well as these cells being morphologically altered by the cells secreted by

the immune system, or even by themselves because of the infection. Complementary studies are

necessary in order to understand the mechanisms involved which explain the morphometric

alterations observed on the myenteric neurons overviewed in this study.

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25

Table 1

Length, width and area of the ileum-jejunum and the total colon from healthy rats

(Control Group

CG) and submitted to infection by a Genotype III T. gondii strain (Experimental

Group EG).

Organ Group Lenght (cm) Width (cm) Area (cm2)

ACG 107.25 2.36 0.08 8.27

AEG 102.75 3.77 0.15 15.77

CCG 109.16 5.62* 0.08* 11.92*

Ileum-

jejunum

CEG 100.94 3.31* 0.12* 151.18 9.26*

ACG 15.45 1.32 2.15 0.37 33.11 5.74

AEG 14.88 2.78 1.73 0.30 26.15 9.38

CCG 15.86 1.18 2.16 0.29 34.31 5.84 Total Colon

CEG 16.08 3.13 2.10 0.30 33.93 8.54

Values presented as mean±standard deviation. Values denoted by asterisks on the same column are significantly different (p

26

Table 3

Soma area, nucleus area, cytoplasm area, and the nucleus-soma area ratio of myenteric

neurons of the terminal ileum and descending colon from healthy rats (Control Group

CG) and

the submitted to a Genotype III T. gondii strain (Experimental Group EG).

Organ Group Soma area ( m2)

Nucleus area ( m2)

Cytoplasm area ( m2)

Soma-nucleus area ratio

ACG 238.9 (134.2; 826.5) 95.3 (47.8; 330.2) 145.3 (79.9; 466.0) 0.39 (0.31; 0.49)* AEG 258.4 (134.3; 828.2) 99.0 (48.6; 290.8) 155.2 (78.9; 496.2) 0.38 (0.29; 0.48)*

CCG 333.2 (164.4; 845.2)* 123.81 (58.4; 309.5)* 207.7 (100.0; 511.8)* 0.37 (0.30; 0.46)

Terminal ileum

CEG 161.5 (95.7; 515.8)* 56.4 (33.2; 202.5)* 104.2 (58.7; 289.5)* 0.36 (0.29; 0.45)

ACG 135.0 (98.3; 185.4)* 69.8 (50.7; 94.6)* 60.9 (42.4; 94.2)* 0.52 (0.44; 0.59)* AEG 124.4 (87.6; 170.1)* 62.9 (43.8; 84.8)* 57.7 (39.7; 88.7)* 0.50 (0.42; 0.58)*

CCG 120.2 (74.1; 182.9)* 60.5 (38.0; 86.1)* 55.8 (34.9; 93.9)* 0.49 (0.41; 0.57)

Descending colon

CEG 157.3 (115.8; 209.9)* 74.8 (55.3; 97.8)* 75.4 (50.8; 114.3)* 0.49 (0.40; 0.57)

Values presented as median (P25; P75). Values denoted by asterisks on the same column are significantly different (p

27

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1001

Classes ( m 2)

Rel

ativ

e F

req

uen

cy (

%)

GCA GEA GCC GEC

Figure 1

Histogram of the soma area of the myenteric neurons of the terminal ileum from

healthy rats (Control Group

CG) and the infected by a Genotype III T. gondii strain

(Experimental Group - EG). Columns with asterisks differ significantly (*p

28

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0.71

Classes

Rel

ativ

e F

req

uen

cy (

%)

ACG AEG CCG CEG

Figure 3 Histogram of the nucleus-soma are ratio of the myenteric neurons of the terminal ileum

from healthy rats (Control Group) and the infected by a Genotype III T. gondii strain

(Experimental Group). Columns with asterisks differ significantly (*p

Este trabalho é parte da dissertação apresentada ao Mestrado em Ciência Animal da Universidade Paranaense (UNIPAR) da primeira autora. 1Laboratório de Neurogastroenterologia Experimental. Universidade Paranaense (UNIPAR)

Umuarama PR, Brasil; 2Laboratório de Medicina Veterinária Preventiva. Universidade Paranaense (UNIPAR) Umuarama PR, Brasil. Apoio financeiro: UNIPAR.

Dr. Eduardo José de Almeida Araújo

Laboratório de Neurogastroenterologia Experimental, Universidade Paranaense (UNIPAR) Praça Mascarenhas de Moraes s/n 87502-210 Umuarama PR Brasil.

29

ALTERAÇÕES DO PLEXO MIENTÉRICO DO ÍLEO E CÓLON DESCENDENTE

CAUSADAS POR Toxoplasma gondii (GENÓTIPO III)

Elaine Yae Yamashita Sugauara1, Débora de Mello Gonçales Sant Ana1, Elton Carlos de

Almeida1; Anderson Brunetti Reis1; Aristeu Vieira da Silva2, Eduardo José de Almeida Araújo1

RESUMO

Objetivou-se avaliar as alterações causadas por uma cepa genótipo III de Toxoplasma

gondi, sobre o número e a morfometria de neurônios mientéricos, do íleo terminal e do cólon

descendente. Dividiu-se dezoitos ratos em quatro grupos: controle agudo (GCA, n = 4),

experimental agudo (GEA, n = 4), controle crônico (GCC, n = 5) e experimental crônico (GEC, n

= 5). Os animais do GCA e GCC receberam solução de NaCl por gavagem, e os animais do GEA e

GEC 104 taquizoítos de uma cepa genótipo III de T. gondii por via oral. Os grupos agudos após 24

horas foram submetidos à eutanásia e os crônicos após 30 dias. Preparados totais do íleo terminal e

cólon descendente foram corados com Giemsa. Observou-se que não houve perda neuronal em

ambos os órgãos, tanto nos grupos agudos como nos crônicos. No íleo terminal, os neurônios

atrofiaram-se, enquanto o oposto ocorreu com os do cólon descendente durante a fase crônica da

infecção.

PALAVRAS-CHAVE: Sistema Nervoso Entérico; Toxoplasmose; morfologia.

O sistema nervoso entérico (SNE) é uma complexa rede de inervação intramural do

tubo digestório, capaz de regular os reflexos de motilidade e coordenar os processos que incluem

secreção e absorção, controlar o fluxo sanguíneo e modular as funções imune e endócrina. Além

disso, possui vários plexos, sendo que dois são ganglionares: mientérico e submucoso. O SNE

destaca-se em relação ao restante do sistema nervoso periférico, por possuir um grande número de

neurônios (semelhante ao encontrado na medula espinhal) que formam circuitos capazes de

30

interagir com o ambiente interno do tubo digestório, de forma independente do sistema nervoso

central (SNC). Isto se deve ao fato de possuírem neurônios sensitivos, neurônios aferentes

primários intrínsecos, interneurônios e neurônios motores excitatórios e inibitórios, estruturalmente

interconectados de forma cada vez mais complexa, considerando a escala evolutiva dos animais1.

Os neurônios são células que podem ter seu funcionamento alterado por elementos da dieta e por

processos inflamatórios, que podem desenvolver necrose focalizada2 e/ou alterar seu

metabolismo3. Há relatos de alguns parasitos que podem desencadear no SNE alguns destes

problemas, como o Trypanosoma cruzi4, Schistosoma mansoni5 e Schistosoma japonicum6. Por

outro lado, não há descrição de estudos, avaliando as conseqüências da infecção por Toxoplasma

gondii para os neurônios entéricos, mesmo havendo pesquisas e relatos clínicos apontando a

patogenicidade deste parasito para neurônios do SNC2.

O Toxoplasma gondii é um protozoário do filo Apicomplexa, que se aloja no epitélio

intestinal dos felídeos (hospedeiros definitivos) e em diferentes tecidos de animais homeotérmicos,

incluindo o homem. Os felídeos são os únicos hospedeiros definitivos, pois somente nesses

animais há ciclo enteroepitelial com reprodução sexuada do parasito, com formação de oocistos

que são eliminados pelas fezes. Os oocistos podem ser eliminados aos milhões numa só evacuação,

permanecendo viáveis no ambiente por um longo período dependendo das condições ambientais e

umidade. O outro ciclo de desenvolvimento do parasito é o extra-intestinal de ocorrência, tanto no

hospedeiro definitivo como nos intermediários, neste caso há desenvolvimento assexuado do

parasito, com formação de taquizoítos e bradizoítos. O hospedeiro intermediário infecta-se por via

oral, por intermédio da ingestão de carne crua ou mal-cozida contendo cistos teciduais, e também

por ingestão de água ou alimentos contaminados com oocistos. Depois da ingestão, as paredes dos

cistos ou oocistos são rompidas pela degradação enzimática e a forma infectante do parasito é

liberada dentro do lúmem intestinal, que invade rapidamente e se multiplica dentro das células,

onde se diferenciam em taquizoítos7. O T. gondii possui uma estrutura populacional altamente

31

clonal8, que consiste de três linhagens designadas I, II e III. Cepas isoladas no Brasil têm

demonstrado que os genótipos I e III são altamente virulentos9.

Os sintomas iniciais da toxoplasmose podem incluir irritação na pele, febre, aumento

de linfonodos e perturbações visuais, tais como coriorretinite e uveíte10. Em relação à infecção

congênita, geralmente ocorre quando a mulher é exposta à infecção durante a gestação, pois os

parasitos têm facilidade de cruzar a placenta. Enquanto a maioria dessas infecções é assintomática,

poucos casos podem resultar em abortos, natimortos ou lesões do sistema nervoso do feto. As

crianças gravemente acometidas apresentam coriorretinite e necrose cerebral e pode haver

hepatoesplenomegalia, insuficiência hepática, convulsões e hidrocefalia11. É uma doença

oportunista, que acomete indivíduos imunocomprometidos, como aqueles infectados pelo vírus

HIV7. Já nos animais, como cães e gatos, a toxoplasmose afeta primariamente o sistema nervoso,

tubo gastrointestinal, região ocular e sistema respiratório. Além de outras manifestações clínicas

incluindo febre, depressão, diarréia, dificuldade respiratória, convulsão, hiperexcitabilidade,

tremores, debilidade, vômito e ulceração oral12. Miocardite, linfonopatia, coriorretinites,

pancreatites, anemia e granuloma intestinal foram associadas também com toxoplasmose12. Ainda

pode causar aborto em ovelhas, cabras, porcas e coelhas se infectadas durante a prenhez7. Ratos

infectados por T. gondii desenvolvem boa resposta imune humoral e celular dentro de um curto

período13. Em relação à evolução clínica e a transmissão placentária, a toxoplasmose em ratos e

humanos é similar, portanto, a infecção em ratos pode servir como um modelo para toxoplasmose

humana14.

Em função das alterações neurológicas e gastrointestinais causadas pelo T. gondii,

objetivou-se neste estudo avaliar as possíveis alterações causadas por uma cepa genótipo III deste

parasito, sobre o número e a morfometria de neurônios mientéricos do íleo terminal e do cólon

descendente de ratos.

32

MÉTODO

Grupos Experimentais

Todo protocolo experimental foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa Envolvendo Experimentação Animal (CEPEEA) da Universidade Paranaense (UNIPAR).

Utilizaram-se dezoito ratos (Rattus norvegicus) Wistar jovens machos com 60 dias de

idade (288,3

74,6 g), mantidos em caixas com grades individuais, num biotério com temperatura

constante de 25ºC e alternância de ciclos claro-escuro de 12 horas. Todos os animais receberam

ração comercial para roedores (NUVITAL®) e água ad libitum.

Os animais foram divididos em quatro grupos: controle agudo (GCA, n = 4),

experimental agudo (GEA, n = 4), controle crônico (GCC, n = 5) e experimental crônico (GEC, n

= 5). Os animais do GCA e GCC receberam solução de cloreto de sódio por gavage e os animais

do GEA e GEC receberam, por via oral, 104 taquizoítos de uma cepa genótipo III de Toxoplasma

gondii isolada do cérebro de cães com sintomatologia neurológica9. Os grupos agudos após 24

horas foram submetidos à eutanásia e os crônicos após 30 dias.

No momento da eutanásia, os animais foram anestesiados pela via intramuscular,

utilizando o seguinte protocolo: Acepram® 1,26 mL/kg + Ketalar® (10 mL) 1,26 mL/kg +

Rompum® (2%) 0,42 mL/kg + Atropina® (1%) 0,22 mL/kg15, visando colheita de sangue através

de punção do plexo retro-orbital (apenas dos animais dos grupos GCC e GEC) e laparotomia para

retirada do íleo terminal e do cólon descendente. Considerou-se como íleo terminal, a porção distal

ao início da prega íleo-cecal. Em seguida, os animais foram submetidos à eutanásia por

aprofundamento anestésico.

O sangue coletado foi centrifugado e o soro foi utilizado para detectar a presença de

anticorpos contra T. gondii pelo método de aglutinação direta16.

33

Obtenção dos Preparados Totais

Logo que retirados, o íleo terminal e o cólon descendente de cada animal foram

mensurados quanto ao comprimento e largura, utilizando fita métrica e régua milimetrada. Em

função da dificuldade de distinguir anatomicamente o íleo terminal do jejuno, estas medidas foram

feitas considerando estes dois órgãos sem separá-los. Em seguida, foram lavados em solução de

NaCl 0,9%, preenchidos e imersos numa solução fixadora contendo formol acético por 48 horas. A

seguir foram dissecados com auxílio de um estereomicroscópio, retirando a túnica mucosa e a tela

submucosa. Os preparados totais, formados pela túnica muscular e serosa, foram corados segundo

a técnica de Giemsa17.

Análise Quantitativa

Foi contado o número total de neurônios mientéricos em 120 campos microscópicos,

distribuídos uniformemente por toda a circunferência intestinal de cada espécime, totalizando uma

área de 25,2 mm2 por animal. Para tanto, utilizou-se um microscópio binocular Motic BL220A

através da objetiva de 40X. Neurônios posicionados nos limites de cada campo foram contados em

campos alternados.

Análise Morfométrica

A área do pericário, do citoplasma e do núcleo de 300 neurônios do plexo mientérico

do íleo terminal e cólon descendente (distribuídos uniformemente por toda a circunferência

intestinal) de todos os animais de cada grupo, foi medida por intermédio do software analisador de

imagens Image Motic Plus, versão 2.0. Para isso, utilizou-se um microscópio equipado com

câmera digital (MOTICAM 2000, 2.0 Megapixel) acoplado a um microcomputador. A partir

desses valores, os neurônios foram divididos em classes, considerando a área do pericário

(intervalos de 50 m2) e a razão entre a área do núcleo e do pericário (intervalos de 0,10).

34

Análise Estatística

Todos os dados foram inicialmente submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov,

para verificação do tipo de distribuição. Dados com distribuição normal foram expressos como

média

desvio-padrão, e os de distribuição livre foram expressos como mediana e percentis 25 e

75 (P25; P75). Para comparar dados entre os grupos controle e experimental, utilizou-se teste t de

Student (para dados que tinham distribuição normal) e Mann-Whitney (para os que tinham

distribuição livre), considerando-se significantes valores de P menores que 0,05.

RESULTADOS

De acordo com o exame sorológico, os animais do GEC tiveram resultado positivo

para presença de anti-T. gondii, enquanto os do GCC tiveram resultado negativo. Os valores

obtidos quanto às dimensões dos órgãos coletados, a análise quantitativa e morfométrica dos

neurônios mientéricos estão apresentados, respectivamente, nas Tabelas 1, 2 e 3. O grau de

correlação entre área do pericário, núcleo e citoplasma mesurada dos neurônios mientéricos está

apresentado na Tabela 4. As Figuras 1 e 2 apresentam a distribuição de freqüência dos neurônios

mientéricos, divididos em classes de acordo com a área do pericário e, nas Figuras 3 e 4, de acordo

com a razão entre a área do núcleo e a área do pericário.

DISCUSSÃO

O Toxoplasma gondii é um dos protozoários parasitos mais bem sucedidos devido sua

habilidade de manipular o sistema imune e estabelecer uma infecção crônica. Há várias cepas de T.

gondii, sendo que a maioria foi identificada na Europa e América do Norte, enquadrando-se em

três linhagens clonais distintas: I, II e III18. No Brasil, isolados de suínos19, cães9 e gatos20 têm

demonstrado maior prevalência do genótipo I, seguido do III. Cepas genótipo III isoladas no

35

hemisfério norte têm apresentado baixa virulência, permitindo o desenvolvimento de uma infecção

crônica com formação de cistos teciduais em camundongos8. Já as isoladas no Brasil podem ser

letais ou não para camundongos9. Além disso, in vitro, bradizoítos se desenvolvem

espontaneamente dentro de neurônios, astrócitos e micróglias isolados do sistema nervoso central

de feto de ratos, indicando que estes três tipos celulares podem servir como hospedeiros para

encistamento do parasito21. Contudo, não há relatos na literatura se neurônios e/ou glias do sistema

nervoso entérico também são infectadas pelo T. gondii. Em função disto, avaliou-se no presente

estudo as possíveis alterações de neurônios mientéricos de ratos infectados por uma cepa genótipo

III isolada de cães com sintomatologia neurológica no Brasil9.

Observou-se neste estudo que durante a fase aguda da infecção (24 horas após a

inoculação), as dimensões do jejuno-íleo e do cólon total, assim como o número total de neurônios

mientéricos destes segmentos intestinais, não foram alterados. Por outro lado, observou-se que, no

íleo terminal, o núcleo dos neurônios mientéricos tenderam a ocupar uma menor proporção do

pericário (p

36

(p

37

enquanto que no cólon descendente houve uma redução do número de neurônios menores que 100

m2 e um aumento do número de neurônios entre 151 e 250 m2.

Já a distribuição de freqüência considerando a razão entre a área do núcleo e a área do

pericário, ou seja, a proporção que o núcleo ocupa no pericário, no íleo terminal a maior parte dos

neurônios possuem núcleos que ocupam entre 30 e 40% do pericário, já no cólon descendente os

núcleos ocupam entre 41 a 60%. Não houve diferença significativa entre os grupos experimentais.

Assim, de uma forma geral, observa-se que os neurônios mientéricos do íleo terminal

sofreram mais alterações morfométricas do que os do cólon descendente, o que pode estar ligado à

organização do sistema imune destes órgãos. No íleo terminal é extremamente comum se observar

nódulos linfóides (placas de Peyer), diferentemente do cólon. Considerando-se o sistema imune,

vários estudos têm notado que a infecção intraperitoneal com T. gondii recruta células

inflamatórias (especialmente neutrófilos) no local da inoculação22. Molecularmente relata-se, que o

fator de transcrição NF-

tem um papel central na regulação da resposta inflamatória, imune e

anti-apoptótica em animais infectados por T. gondii18. Vale destacar que a ativação da translocação

NF-

pelo T. gondii é uma área controversa, ou seja, dependendo da cepa, célula hospedeira e

espécie, o T. gondii pode bloquear a translocação de NF-

e inibir a transcrição de genes

envolvidos na resposta proinflamatória, sobretudo a interleucina (IL)-12p40 e o fator de necrose

tumoral TNF- 18 e desta forma pode-se observar diferenças na virulência do parasito.

Há vários relatos na literatura de que um aumento de células imunologicamente efetoras

e seus produtos, sejam responsáveis por alterações em elementos neurais5,6. No sistema nervoso

central, micróglias combatem o T. gondii através de mecanismos dependentes de interferon IFN-

e óxido nítrico (NO)21. O INF- é uma citocina chave na resistência para infecção de T. gondii23.

A maioria dos estudos relacionados à interação entre o sistema imune e o sistema

nervoso entérico, envolve a síndrome do intestino irritável. Através destes, sabe-se que vários

produtos liberados a partir de leucócitos infiltrados e/ou residentes têm demonstrado potencial em

38

sensibilizar e até ativar diretamente neurônios mientéricos e neurônios aferentes primários

intestinais24. Dentro do grupo dos residentes, estão os mastócitos e os macrófagos musculares. Os

mastócitos produzem bradicinina, a qual facilita a secreção entérica de acetilcolina25, além de

aumentar a excitabilidade de neurônios mientéricos26 e aferentes primários intestinais27. Os

macrófagos musculares secretam citocinas como IL-1

e IL-6, as quais agem diretamente

aumentando a excitabilidade de neurônios mientéricos28 e modula a secreção de norepinefrina29.

Além disso, a inflamação intestinal induz a secreção de citocinas tais como IL-1 , TNF- , IFN- e

TGF-

a partir de gânglios mientéricos, contudo não se sabe ainda a identidade das células

secretoras dessas citocinas: neurônios ou glias24. Vale ainda destacar que o peptídeo vasoativo

intestinal (VIP) tem um importante papel neuroprotetor, tanto para neurônios centrais30 como

entéricos31.

No presente estudo demonstrou-se que ratos infectados tanto por 24 horas como por 30

dias não tiveram perda de neurônios mientéricos, contudo no íleo terminal estas células se

tornaram atróficas, enquanto o oposto ocorreu no cólon descendente. Considerando a possibilidade

do T. gondii infectar células do SNE, assim como destas células serem alteradas

morfofisiologicamente por moléculas secretadas pelo sistema imune, ou mesmo por si próprias, em

função da infecção, estudos complementares se fazem necessários, no intuito de compreender os

mecanismos envolvidos, que expliquem as alterações morfométricas observadas nos neurônios

entéricos visualizadas neste estudo.

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42

Tabela 1

Comprimento, largura e área do jejuno-íleo e do cólon total de ratos hígidos (Grupo

Controle

GC) e submetidos à infecção por uma cepa genótipo III de T. gondii (Grupo

Experimental GE).

Órgão Grupo Comprimento (cm) Largura (cm) Área (cm2)

GCA 107,25 2,36 0,08 8,27

GEA 102,75 3,77 0,15 15,77

GCC 109,16 5,62* 0,08* 11,92*Jejuno-íleo

GEC 100,94 3,31* 0,12* 151,18 9,26*

GCA 15,45 1,32 2,15 0,37 33,11 5,74

GEA 14,88 2,78 1,73 0,30 26,15 9,38

GCC 15,86 1,18 2,16 0,29 34,31 5,84 Cólon Total

GEC 16,08 3,13 2,10 0,30 33,93 8,54

Valores apresentados como média desvio-padrão. Valores marcados numa mesma coluna são significativamente diferentes (p

43

Tabela 3 Área do pericário, área do núcleo, área do citoplasma e razão entre a área do núcleo e o

pericário de neurônios mientéricos do íleo terminal e cólon descendente de ratos hígidos (Grupo

Controle

GC) e submetidos à infecção por uma cepa genótipo III de T. gondii (Grupo

Experimental GE).

Órgão Grupo Área do pericário

( m2) Área do Núcleo

( m2) Área do

citoplasma ( m2)

Razão entre a área do núcleo e do pericário

GCA 238,9 (134,2; 826,5) 95,3 (47,8; 330,2) 145,3 (79,9; 466,0) 0,39 (0,31; 0,49)*

GEA 258,4 (134,3; 828,2) 99,0 (48,6; 290,8) 155,2 (78,9; 496,2) 0,38 (0,29; 0,48)*

GCC 333,2 (164,4; 845,2)* 123,81 (58,4; 309,5)* 207,7 (100,0; 511,8)* 0,37 (0,30; 0,46)

Íleo terminal

GEC 161,5 (95,7; 515,8)* 56,4 (33,2; 202,5)* 104,2 (58,7; 289,5)* 0,36 (0,29; 0,45)

GCA 135,0 (98,3; 185,4)* 69,8 (50,7; 94,6)* 60,9 (42,4; 94,2)* 0,52 (0,44; 0,59)* GEA 124,4 (87,6; 170,1)* 62,9 (43,8; 84,8)* 57,7 (39,7; 88.7)* 0,50 (0,42; 0,58)*

GCC 120,2 (74,1; 182,9)* 60,5 (38,0; 86,1)* 55,8 (34,9; 93,9)* 0,49 (0,41; 0,57)

Cólon descendente

GEC 157,3 (115,8; 209,9)* 74,8 (55,3; 97,8)* 75,4 (50,8; 114,3)* 0,49 (0,40; 0,57)

Valores apresentados como mediana (P25; P75). Valores marcados numa mesma coluna são significativamente diferentes (p

44

Todos os valores são significativos considerando 5% como nível de significância.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1001

Classes ( m2)

Fre

qü

ênci

a R

elat

iva

(%)

GCA GEA GCC GEC

Figura 1

Histograma da área do pericário de neurônios mientéricos do íleo terminal de ratos

hígidos (Grupo Controle

GC) e infectados por uma cepa genótipo III de Toxoplasma gondii

(Grupo Experimental

GE). Colunas marcadas com asterisco diferem significativamente (*p <

0,05).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

501

Classes ( m2)

Fre

qü

ênci

a R

elat

iva

(%)

GCA GEA GCC GEC

Figura 2

Histograma da área do pericário de neurônios mientéricos do cólon descendente de

ratos hígidos (Grupo Controle GC) e infectados por uma cepa genótipo III de Toxoplasma gondii

*

*

*

*

*

45

(Grupo Experimental

GE). Colunas marcadas com asterisco diferem significativamente (*p <

0,05).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0,71

Classes

Fre

qü

ênci

a R

elat

iva

(%)

GCA GEA GCC GEC

Figura 3

Histograma da razão entre a área do núcleo e a área do pericário de neurônios

mientéricos do íleo terminal de ratos hígidos (Grupo Controle) e infectados por uma cepa genótipo

III de Toxoplasma gondii (Grupo Experimental). Colunas marcadas com asterisco diferem

significativamente (*p < 0,05).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0,71

Classes

Fre

qü

ênci

a R

elat

iva

(%)

GCA GEA GCC GEC

Figura 4

Histograma da razão entre a área do núcleo e a área do pericário de neurônios

mientéricos do cólon descendente de ratos hígidos (Grupo Controle) e infectados por uma cepa

46

genótipo III de Toxoplasma gondii (Grupo Experimental). Colunas marcadas com asterisco

diferem significativamente (*p < 0,05).

47

HYPERTROPHY OF THE NEURONS IN THE ILEUM FROM RATS INFECTED 1

WITH CYSTS OF Toxoplasma gondii (GENOTYPO II) 2

3

Toxoplasmosis and enteric neurons 4

5

Elaine Yae Yamashita Sugauara1, Débora de Mello Gonçales Sant Ana1, Aristeu Vieira da 6

Silva2, Elisângela Aparecida de Souza1, Eduardo José de Almeida Araújo1 7

8

Paper presented as part of the first author s MA dissertation submitted to the UNIPAR 9

Animal Science Master. 1Experimental Neurogastroenterology Laboratory. Universidade 10

Paranaense (UNIPAR)

Praça Mascarenhas de Moraes s/n

87502-210 Umuarama PR

11

Brasil; 2Preventive Veterinary Medicine Laboratory. Universidade Paranaense (UNIPAR)

12

Umuarama PR, Brasil. Financial Support: UNIPAR. Author for correspondence: 13

[email protected] 14

15

ABSTRACT. This paper verified possible alterations caused by a genotype II Toxoplasma 16

gondii strain with respect to the total number and morphometry of the myenteric neurons in 17

the terminal ileum and descending colon of rats. Eight rats were divided into two groups: 18

control (n = 4) and experimental (n = 4). This group was inoculated orally with 20 tissue cysts 19

of T. gondii from a genotype II strain (ME-49). Whole mounted from the terminal ileum and 20

the descending colon were stained with Giemsa. There was not any neuronal loss on both 21

organs. The neurons became hypertrophied in the terminal ileum, whereas morphometric 22

alterations were not observed for the neurons in the descending colon. 23

Key words: Enteric Nervous System; Toxoplasmosis; Morphology. 24

25

RESUMO. Hipertrofia de neurônios do íleo de ratos infectados com cistos de 26

Toxoplasma gondii (genótipo II). Objetivou-se verificar as possíveis alterações causadas por 27

uma cepa genótipo II de Toxoplasma gondii, sobre o número total e a morfometria de 28

neurônios do plexo mientérico, do íleo terminal e do cólon descendente de ratos. Oito ratos 29

foram divididos em dois grupos: controle (n = 4) e experimental (n = 4), sendo este inoculado, 30

por via oral, com 20 cistos teciduais de T. gondii de uma cepa genótipo II (ME-49). 31

Preparados totais do íleo terminal e cólon descendente foram corados com Giemsa. Não 32

houve perda neuronal em ambos os órgãos. Os neurônios se tornaram hipertróficos no íleo 33

48

terminal, enquanto nenhuma alteração morfométrica foi observada nos neurônios do cólon 34

descendente. 35

Palavras-chave: Sistema Nervoso Entérico; Toxoplasmose; Morfologia. 36

37

INTRODUCTION 38

Toxoplasmosis is concerned by public health and animal production. It is usually 39

asymptomatic in humans; however, it may cause blindness, severe neurological disorders, 40

hepatitis, and pneumonia in immunocompromised patients, as well as severe damage to 41

fetuses (Ascenzi et. Al., 2005). On animals such as dogs, toxoplasmosis may cause fever 42

associated with lassitude, anorexia, diarrhea, pneumonia, and neurological manifestations. In 43

small ruminants, clinical toxoplasmosis is associated with fever, dyspnea, nervous 44

symptomatology, and abortion, generally in sheep and perinatal mortality in lambs (Urquhart, 45

1998) whereas it presents diarrhea, cough, and dyspnea in pigs (Wingstrand et al., 1997). 46

This disease is caused by an obligate intracellular protozoan parasite named 47

Toxoplasma gondii, which is world-widely scattered (Dubey & Beattie, 1988). Its life cycle is 48

facultatively heteroxen: Felidae are definite hosts where the sexual reproduction of the 49

parasite occurs with the formation of oocytes which are eliminated via feces. All 50

homoeothermic animals are to be intermediary hosts, where the asexual reproduction of the 51

parasite occurs with the formation of tachyzoites and bradyzoites (Jacobs, 1967; Dubey, 52

1994). Tachyzoites present a high proliferation rate, what favors their dissemination within 53

the host, characterizing the acute phase of the disease. Tissue cysts, full of bradyzoites, last 54

for a long amount of time, sometimes the entire life of the host, what characterizes the chronic 55

phase of the disease (Ferreira et al., 2003). 56

The infection by T. gondii may occur as a result of: (1) ingestion of food or 57

water contaminated with oocytes from cat feces, (2) ingestion of tissue cysts in raw or 58

undercooked meat, (3) via transplacentary (Barragan & Sibey, 2003), (4) blood transfusion 59

(Dubey & Beattie, 1988), or (5) accidental inoculation during laboratorial manipulation. 60

When oral infection occurs, the parasite crosses the intestinal epithelium, disseminates to 61

other tissues, and may cross other biological barriers such as the placenta and the 62

hematoencephalic barrier, and reach immunologically privileged sites. The course of the 63

parasitic infection is highly variable mainly according to the type of host, immunological 64

situation, the path and level of the infection, and the parasite constitution (Johnson, 1984). 65

The T. gondii presents a highly clonal population structure (Howe & Sibley, 66

1995), which predominantly consists of three lines named type I, II, and III. As type I samples 67

49

are often isolated from infections in human being, samples from infections in animals are 68

predominantly from either type II or III (Howe & Sibley, 1995; Howe et al., 1997; 69

Mondragon et al., 1998; Owen & Trees, 1999). Type II strains present low virulence (Howe 70

& Sibley, 1995) and high prevalence

either for human or animals

all around the world 71

(Howe et al., 1997; Mondragon et al., 1998; Fuenes et al., 2001). There is a considerable 72

interest in determining how genotypes of T. gondii may differ concerning the capacity to 73

induce pathologies or their occurrence in a certain animal species (Saeij et al., 2005). 74

It is common to observe signs and symptoms of alterations in the Central 75

Nervous System (CNS) from patients infected with T. gondii; most of all, headache, focal 76

neurologic signs, confusion attacks evolving to coma, coriorretinitis, hydrocephalus, and 77

encephalitis (Daubener & Hadding, 1997). Moreover, the tissue cyst rupture may release the 78

parasite and destroy the nervous tissue resulting in meningoencephalitis (Gazzinelli et al., 79

1993). On the other hand, it is also common to observe diarrhea in animals infected by T. 80

gondii (Hass et al., 1989; Urquhart, 1998). Thus, a possible alteration caused by the parasite 81

on the Enteric Nervous System (ENS)

responsible for the digestive tube intrinsic 82

innervation (Furness, 2006)

may be related to the diarrhea pathophysiology. Therefore, this 83

study was carried out in order to assess possible alterations caused by a genotype II 84

Toxoplasma gondii strain on the total number and morphometry of the neurons of the 85

myenteric plexus in the terminal ileum and the descending colon of rats. 86

87

MATERIAL AND METHODS 88

Experimental Groups 89

The experimental protocol as previously approved by the UNIPAR Ethics 90

Committee in Researches Involving Animal Experimentation. 91

Eight male 60-day-old Wistar rats (220.2±24.5g) were kept inside boxes with 92

individual grids in a bioterium constantly at 25°C with 12-hr light/12-hr dark alternate cycles 93

were used. Animals were divided into two groups: Control (n = 4) and Experimental (n =4). 94

In this, twenty genotype II (ME-49) Toxoplasma gondii strain tissue cysts were orally 95

administered. All animals received rat chow (NUVITAL®) and water ad libitum. After 24 96

hours, each specimen was anesthetized intramuscularly by using the following protocol: 97

Acepram® 1.26 mL/kg + Ketalar® (10 ml) 1.26 mL/kg + Rompum® (2%) 0.42 mL/kg + 98

Atropina® (1%) 0.22 mL/kg (Pachaly et al., 2003), for the removal of the terminal ileum and 99

descending colon by laparotomy. The distal portion towards the ileocecal fold was considered 100

50

as the terminal ileum. Then, the animals were submitted to euthanasia by anesthetic 101

deepening. 102

103

Collecting Whole Mount Preparations 104

The terminal ileum and the descending colon from each animal were measured 105

with respect to its length and width by using a millimetric ruler right after being removed. As 106

a result of the difficulty of anatomically distinguishing the terminal ileum of the jejunum, 107

these measurements were performed by considering these two organs together. Then, they 108

were washed in a 0.9%-NaCl solution, filled and immersed in a fixing solution containing 109

ascetic formal for 48 hours. They were thus dissected with the aid of a stereomicroscope by 110

removing the mucosa and the submucosa. The whole mounted

composed by muscle and 111

serous were stained according to the Giemsa technique (Barbosa, 1978). 112

113

Quantitative Analysis 114

The total number of myenteric neurons in 120 microscopic fields, uniformly 115

distributed around the entire intestinal circumference of each specimen, totalizing 25.5mm2 116

per animal, was counted. Therefore, a Motic BL220A binocular microscope with 40x 117

objective was used. The neurons positioned at the edges of each field were counted in 118

alternated fields. 119

120

Morphometric Analysis 121

The area of the soma, cytoplasm, and the nucleus of 300 neurons of the 122

myenteric plexus of the terminal ileum and the descending colon (uniformly distributed all 123

over the intestinal circumference) of the animals from each group was measured with the 124

software Image Motic Plus, version 2.0. A microscope with a 2.0 Megapixel digital camera 125

(MOTICAM 2000) connected to a computer was used for that. From these values, neurons 126

were divided into classes by considering the soma area (100µm2 interval) and the nucleus-127

soma ratio (0.10 intervals). 128

129

Statistic Analysis 130

51

All data were first submitted to the Kolmogorov-Smirnov test in order to verify 131

the type of distribution. Data with normal distribution were expressed in mean ± standard 132

deviation. Data with free distribution were expressed as median and percentiles 25 and 75 133

(P25; P75). In order to compare the data among the Control Group and the Experimental 134

Group, Student t- test (normal distribution data) and Mann-Whitney (free distribution data) 135

were used by considering significant P-values lower than 0.05. 136

137

RESULTS 138

The results of the measure of the dimensions of the collected organs through the 139

quantitative and morphometric analysis are presented on Tables 1, 2, and 3, respectively. The 140

number of neurons was divided in classes according to the soma area and according to soma-141

nucleus area ratio is presented on Figures 1 and 2, respectively. 142

143

Table 1

Length, width, and area of the ileum-jejunum and the total colon of healthy rats 144

(Control Group

CG) and the submitted to the infection by a genotype II T. gondii strain 145

(Experimental Group EG). 146

Organ Group Lenght (cm) Width (cm) Area (cm2)

CG 107.25 ± 2.36 1.40 ± 0.08 150.10 ± 8.27 Ileum-

jejunum EG 102.75 ± 3.77 1.33 ± 0.13 136.40 ± 16.97

CG 15.45 ±1.32 2.15 ±0.37 33.11 ±5.74 Total colon

EG 14.75 ± 1.55 1.98 ± 0.34 28.75 ± 2.54

Values presented as mean ± standard deviation. Values denoted by asterisks in the same 147

column are significantly different (p

52

EG colon 4,772.3 200.8

153

Table 3

Soma area, nucleus area, cytoplasm area, and the nucleus-soma area ratio of the 154

myenteric neurons in the terminal ileum and descending colon of healthy rats (Control Group 155

CG) and the submitted to the infection by a genotype II T. gondii strain (Experimental 156

Group EG). 157

158

Organ Group Soma area

( m2)

Nucleus area

( m2)

Cytoplasm area

( m2)

Nucleus- soma

area ratio

CG 238.9 (134.2; 826.5)* 95.3 (47.8; 330.2)* 145.3 (79.9; 466.0)* 0.39 (0.31; 0.49) Terminal

ileum EG 309.2 (142.3; 900.0)* 119.7 (55.3; 326.0)* 191.9 (85.5; 544.2)* 0.38 (0.31; 0.47)

CG 135.0 (98.3; 183.4) 69.9 (50.7; 94.6) 60.9 (42.8; 94.2) 0.52 (0.44; 0.59) Descending

colon EG 132.1 (88.3; 216.4) 69.4 (46.7; 101.2) 60.2 (36.4; 121.6) 0.52 (0.42; 0.61)

Values presented as mean ± standard deviation. Values denoted by asterisks in the same 159

column are significantly different (p

53

0

20

40

60

80

100

120

140

0.71

Classes

Ab

solu

te F

req

uen

cy

CG (Ileum) GE (Ileum) CG (Descending colon) EG (Descending colon)

167

Figure 2

Histogram of the nucleus-soma area ratio of the myenteric neurons in the terminal 168

ileum and descending colon of healthy rats (Control Group

CG) and the infected by a 169

genotype II T. gondii strain (Experimental Group

EG). Columns denoted by asterisks differ 170

significantly (*p

54

well as the number of the myenteric neurons in these organs. That is possibly due to the fact 189

that the organs were collected after being infected for 24 hours, therefore, there was not 190

enough time to cause a proliferative inflammatory response which would release an increase 191

of the intestinal area, mostly its width. Thus, it is possible to consider that the time of 192

infection did not result in either necrosis or apoptosis of the nervous cells, what would be 193

plausible since the immunological effector cells and their products are responsible for 194

alterations in the nervous cells (Szabo & Feher, 1991; Bela et al., 1997; Bogers et al., 2000; 195

Galeazzi et al., 2000; Balemba et al., 2001; Furness, 2006). Perhaps this is a peculiar 196

characteristic of T. gondii as in experimental studies on rat colitis a loss of up to 50% of the 197

myenteric neurons between 48 hours and 35 days after the disease induction is observed 198

(Sanovic et al., 1999). 199

On the other hand, significant increase of the cytoplasm and nucleus area 200

resulting from the increase of the soma and the myenteric neurons in the terminal ileum was 201

observed (p

55

organs probably occurred by an action of the immune system, and not by a direct action of the 222

parasite on the neurons. Moreover, the experiment length of time (24 hours) might have been 223

enough so that the infection would have altered the immune system of the descending colon 224

as to module its ENS. Thus, it is worth remarking that a little is known of the nature of the 225

interactions between the ENS and the gastrointestinal tube; however, it is notorious that the 226

response of the ENS is not uniform towards different stimuli of an inflammatory process 227

(Lomax et al., 2005). For instance, in patients with Crohn disease and ulcerative colitis, 228

alterations in enteric ganglions such as neuronal hypertrophy and glial hyperplasia were 229

observed (Geboes & Collins, 1998). 230

With respect to T. gondii, the NF-

transcription factor plays a core part 231

regarding the inflammatory, immune, and antiapoptotic response. The (type II) ME-49 strain 232

induces the translocation of the NF-

to the nucleus of the splenocytes of mice (Dobbin et 233

al., 2002) and macrophages from the bone marrow (Robben et al., 2004), thus stimulating the 234

transcription of the genes involved in the proinflammatory response such as those which 235

codify the Tumoral Necrosis Factor TNF- (Sinai et al., 2004), decreasing its pathogenicity. 236

TNF-

is mainly produced by macrophages and monocytes, and secondarily stimulates the 237

production of several other cytokines such as IL-6, IL-12 and IL-18 by developing a crucial 238

role in the initialization and amplification of the inflammatory reactions. 239

Genotype II T. gondii strains also induces high levels of IL-10, IL-1

anÁlise quantitativa e morfometria de neurÔnios do...

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