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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA PADRONIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Eugenia florida DC. E SEU ESTUDO TOXICOLÓGICO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM FITOTERÁPICO OU FITOFÁRMACO NITERÓI 2012

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS

PARA A SAÚDE

ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA

PADRONIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Eugenia florida DC. E SEU ESTUDO

TOXICOLÓGICO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM FITOTERÁPICO OU

FITOFÁRMACO

NITERÓI

2012

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ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA

PADRONIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Eugenia florida DC. E SEU ESTUDO

TOXICOLÓGICO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM FITOTERÁPICO OU

FITOFÁRMACO

Dissertação submetida como requisito para obtenção do grau de

Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade

de Farmácia da Universidade Federal Fluminense.

Orientadora: Profa. Dra. SELMA RIBEIRO DE PAIVA

Co-orientadora: Profa. Dra. GLAUCIA B. C. ALVES SLANA

NITERÓI

2012

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ANDRÉA BEZERRA DA NÓBREGA

PADRONIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Eugenia florida DC. E SEU ESTUDO

TOXICOLÓGICO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UM FITOTERÁPICO OU

FITOFÁRMACO

Dissertação submetida como requisito para obtenção do grau de

Mestre em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade

de Farmácia da Universidade Federal Fluminense.

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Selma Ribeiro de Paiva – Orientadora

Universidade Federal Fluminense – UFF

Profa. Dra. Magdalena do Nascimento Rennö

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ

Prof. Dr. José Luiz Pinto Ferreira

Universidade Federal Fluminense - UFF

Dra. Glaucia B. C. Alves Slana (Co-orientadora e suplente)

Instituto Nacional de Propriedade Industrial – INPI

Profa. Dra. Luciana Moreira Chedier (suplente e revisora)

Universidade Federal de Juiz de Fora - UFJF

NITERÓI

2012

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Dedico esta dissertação:

A minha avó (in memorian), mãe e irmãs

que sempre me deram muito amor, carinho,

educação, força, incentivo,

companheirismo e amizade. Sem elas nada

disso seria possível.

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AGRADECIMENTOS

À Deus por proporcionar a oportunidade de chegar até aqui e conquistar mais este

título em minha vida.

À minha mãe, exemplo de força e dedicação, e irmãs por tudo que sempre fizeram

por mim e por terem acreditado que conseguiria qualquer coisa que eu quisesse.

Às orientadoras Dra. Glaucia Slana e Dra. Selma Paiva, por acreditarem na minha

capacidade, pelo incentivo de sempre e grande aprendizado.

Ao Glauco Villas Boas pela compreensão e liberação para capacitação

Aos colegas da Plataforma Agroecológica de Fitomedicamentos, em especial Eliete,

Marcio, Cristiane, Sandra e Valério por compreenderem muitas vezes a minha ausência

durante este período de capacitação.

Ao Eloizio pela ajuda no processamento primário de algumas espécies.

Ao Sergio Monteiro por viabilizar coletas de plantas e depósitos de vouchers no

Jardim Botânico do Rio de Janeiro.

Aos colegas da Plataforma de Metodologia Analítica por me receberem tão bem e

ajudarem na realização deste trabalho.

Ao Bruno Lessa pelo apoio técnico excepcional e uma incansável disposição em

ajudar nos experimentos.

Aos estagiários Riethe, Juliana, Tamires, Flávio e Elaine, pelo auxílio em vários dos

trabalhos desenvolvidos durante o mestrado.

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À Dra. Isabel Paixão e Levino Menezes do Laboratório de Virologia Molecular do

Departamento de Biologia Celular e Molecular do Instituto de Biologia da Universidade

Federal Fluminense pelos ensaios citotóxicos.

Ao Dr. João Ernesto Carvalho e Ana Lúcia Ruis do Laboratório de Farmacologia e

Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da

Universidade Estadual de Campinas pelos ensaios toxicológicos.

Aos amigos por compreenderem os momentos de estresse e de isolamento para

estudar.

À grande amiga Ana Claudia pelo carinho, paciência, compreensão e incentivo de

sempre.

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SUMÁRIO

SUMÁRIO............................................................................................................... ................. I

LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................................ II

LISTA DE TABELAS ........................................................................................................... III

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ IV

RESUMO ............................................................................................................................... V

ABSTRACT ..................................................................................................................... VI

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Uso de Plantas Medicinais no Brasil ...................................................................................2

1.2 Plantas Medicinais X Indústria............................................................................................2

1.3 Aspectos Legais...................................................................................................................4

1.4 Família Myrtaceae ...............................................................................................................5

1.5 Gênero Eugenia L................................................................................................................5

1.6 Eugenia florida DC .............................................................................................................6

1.7 Triterpenos...........................................................................................................................9

1.7.1 Atividades Farmacológicas do Ácido Betulínico...................................................12

1.7.1.1 Atividade Anti-inflamatória ............................................................................12

1.7.1.2 Atividade Antimalárica....................................................................................12

1.7.1.3 Atividade Antitumoral.....................................................................................13

1.7.1.4 Atividades Antibacteriana e Antiviral .............................................................14

1.7.2 Citotoxidez e Mecanismo de Ação do Ácido Betulínico .......................................15

1.7.3 Obtenção do Ácido Betulínico ...............................................................................15

1.7.3.1 Obtenção por Fonte Natural ............................................................................16

1.7.3.2 Obtenção por Síntese.......................................................................................16

1.8 Estudo Químico de Plantas................................................................................................17

1.8.1 Escolha da Planta....................................................................................................17

1.8.2 Levantamento das Referências Bibliográficas .......................................................18

1.8.3 Coleta......................................................................................................................19

1.8.4 Identificação Botânica ............................................................................................21

1.8.5 Prospecção Preliminar da Composição Química....................................................21

I

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1.8.6 Extração..................................................................................................................22

1.8.6.1 Métodos de Extração .......................................................................................23

1.8.6.1.1 Maceração.................................................................................................25

1.8.6.1.2 Percolação.................................................................................................25

1.8.6.1.3 Soxhlet ......................................................................................................26

1.8.6.1.4 Ultrassom..................................................................................................26

1.8.7 Determinação Estrutural .........................................................................................27

1.8.8 Ensaios Biológicos e Farmacológicos ....................................................................27

1.2 Metodologias Analíticas....................................................................................................28

1.2.1.Cromatografia.........................................................................................................28

1.2.1.1 Cromatografia em Coluna ...............................................................................29

1.2.1.2 Cromatografia Gasosa (CG) ............................................................................30

1.2.1.3 Cromatografia em Camada Fina......................................................................31

1.2.1.4 Cromatografia de Camada Fina em Alta Eficiência (CCFAE /

Densitometria) .............................................................................................................31

1.2.2 Validação de Metodologias Analíticas...................................................................32

1.2.2.1 Especificidade/Seletividade.............................................................................34

1.2.2.2 Função de Resposta .........................................................................................34

1.2.2.3 Intervalo de Trabalho.......................................................................................35

1.2.2.4 Linearidade ......................................................................................................35

1.2.2.5 Exatidão...........................................................................................................35

1.2.2.6 Precisão............................................................................................................35

1.2.2.7 Limite de Detecção (Sensibilidade).................................................................36

1.2.2.8 Limite de Quantificação ..................................................................................36

1.2.2.9 Robustez ..........................................................................................................36

2 OBJETIVOS 37

2.1 Objetivos Gerais ................................................................................................................37

2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................................37

3 JUSTIFICATIVA 37

4 MATERIAIS E MÉTODOS 38

4.1 Solventes e reagentes.........................................................................................................38

4.2 Equipamentos ....................................................................................................................38

4.3 Vidrarias ............................................................................................................................39

4.4 Coleta e Processamento do Material Vegetal ....................................................................39

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4.5 Identificação Botânica .......................................................................................................42

4.6 Estudo Comparativo dos Métodos de Extração.................................................................43

4.6.1 Escolha do(s) Solvente(s) .......................................................................................44

4.6.2 Extração por Maceração Estática ...........................................................................44

4.6.3 Extração por Maceração Dinâmica.........................................................................44

4.6.4 Extração por Percolação .........................................................................................45

4.6.5 Extração por Soxhlet ..............................................................................................45

4.6.6 Extração por Ultrassom ..........................................................................................45

4.7 Avaliação de diferentes Granulometrias............................................................................46

4.8 Isolamento e Purificação do Ácido Betulínico ..................................................................46

4.9 Caracterização do Ácido Betulínico..................................................................................47

4.9.1 Espectrometria no Infravermelho ...........................................................................47

4.9.2 Ressonância Magnética Nuclear.............................................................................47

4.9.3 Ponto de fusão ........................................................................................................47

4.9.4 Espectrometria de Massas ......................................................................................47

4.10 Estudo de Variabilidade da Produção Metabólica...........................................................47

4.11 Extração de Outros Indivíduos de Eugenia florida DC...................................................48

4.12 Extração de Outras Espécies Produtoras de Ácido Betulínico ........................................48

4.13 Desenvolvimento de Metodologias Analíticas................................................................49

4.13.1 Metodologia Analítica Desenvolvida por Cromatografia em Fase Gasosa (CG-

DIC).................................................................................................................................49

4.13.2 Validação da Metodologia Analítica por CG-DIC...............................................50

4.13.3 Metodologia Analítica Desenvolvida por Cromatografia de Camada Fina (CCF /

Densitometria) .................................................................................................................50

4.13.4 Validação da Metodologia Analítica por CCF/Densitometria .............................51

4.14 Ensaios Citotóxicos .........................................................................................................51

4.15 Ensaios em Células Tumorais..........................................................................................52

4.15.1 Células ..................................................................................................................52

4.15.1.1 Descongelamento celular...............................................................................52

4.15.1.2 Congelamento celular ....................................................................................52

4.15.2 Repiques Celulares ...............................................................................................53

4.15.2.1 Células em Suspensão ...................................................................................53

4.15.2.2 Células aderidas.............................................................................................53

4.15.2.3 Contagem celular...........................................................................................54

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4.15.3 Ensaio para a determinação da atividade antiproliferativa das frações dos extratos

vegetais ............................................................................................................................54

4.15.3.1 Diluição das amostras....................................................................................54

4.15.3.2 Ensaio de SRB...............................................................................................55

4.15.3.3 Análise dos resultados ...................................................................................55

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 56

Capítulo 1: Desenvolvimento de Metodologias Analíticas Quantificação e Identificação 57

1.1 Isolamento e Purificação do Ácido Betulínico ..................................................................58

1.2 Caracterização do ácido betulínico....................................................................................59

1.3 Desenvolvimento e Validação de Metodologia Analítica .................................................68

1.3.1 Derivatização..........................................................................................................68

1.3.2 Cromatografia com Fase Gasosa com Detecção por Ionização de Chamas (CG-

DIC).................................................................................................................................70

1.3.3 Cromatografia em Camada Fina acoplada a Densitometria Ótica

(CCF/Densitometria). ......................................................................................................75

Capítulo 2: Avaliação das técnicas de extração na obtenção dos extratos 78

2.1. Processo de Extração........................................................................................................79

Capítulo 3: Obtenção dos extratos de indivíduos de E. florida e de outras espécies que

contém ácido betulínico. 94

3.1. Estudo da Variação Metabólica........................................................................................96

3.1.1 Temperatura e disponibilidade hídrica ....................................................................98

3.1.2 Desenvolvimento da planta .....................................................................................99

3.2 Outras Espécies que Contém Ácido Betulínico...............................................................102

Capítulo 4: Avaliação in vitro dos extratos obtidos nas diversas etapas de trabalho 104

4.1. Ensaios Citotóxicos ........................................................................................................105

4.2 Ensaios em Células Tumorais..........................................................................................110

4.3 Índice de Seletividade......................................................................................................116

6 CONCLUSÃO 121

6.1 Conclusões Gerais ...........................................................................................................121

6.2 Conclusões Específicas....................................................................................................121

7 SUGESTÃO E PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS 124

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 125

APÊNDICE A ...............................................................................................................137

Protocolo de Validação de CG-DIC ......................................................................137

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APÊNDICE B................................................................................................................147

Protocolo de Validação de CCF/Densitometria ....................................................147

APÊNDICE C................................................................................................................157

Relatório de Validação de CG-DIC.......................................................................157

APÊNDICE D ...............................................................................................................182

Relatório de Validação de CCF/Densitometria .....................................................182

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AB – Ácido Betulínico

ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas

AcOEt – Acetato de Etila

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ASTM – American Society for Testing and Materials

AZT – Azidotimidina

BSTFA – N, O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida

CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CC50 – Concentração Citotóxica Média

CCF – Cromatografia em Camada Fina

CCFAE – Cromatografia em Camada Fina de Alta Eficiência

Células VERO – linhagem celular derivada do rim do macaco

CG – Cromatografia Gasosa

CG-EM – Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas

CG-DIC – Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama

CI50 – Concentração média necessária para inibição celular

CI50b - Concentração média que inibe crescimento das células do linfócito

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

cm - centímetro

CPQBA – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas

CPTEC – Centro de Previsão de Tempo e Estudos Climáticos

ºC – grau Celsius

COX-2 - Ciclo-oxigenase-2

DCFM – Extrato obtido da casca do fruto maduro de Dilenia indica

DCFV – Extrato obtido da casca do fruto verde de Dilenia indica

DEPT-135 - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DPFM – Extrato obtido da polpa do fruto maduro de Dilenia indica

DPFV – Extrato obtido da polpa do fruto verde de Dilenia indica

DTC – Detetor de Condutividade Térmica

DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium

II

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DMSO – Dimetilsulfóxido

EC50a - Concentração média que inibe a replicação viral

EFA – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila

EFC – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com Clorofórmio

EFE – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com Etanol

EFH – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com n-Hexano

EFM – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com Metanol

EFHM – Extrato obtido das folhas de Eugenia florida com n-Hexano /Metanol

EUA – Estados Unidos da América

g – grama

HaCat – célula normal de queratinócito humano

HIV – Human Immunodeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana)

HL-60 - Human Promyelocytic Leukemia Cells (Células Humanas de Leucemia

Promielocítica)

HSV-1 – Vírus da Herpes Simples tipo 1

IS – Índice de Seletividade

JBRJ - Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro

LFOH – Extrato obtido das folhas de Licania tomentosa com n-Hexano

LFOM – Extrato obtido das folhas de Licania tomentosa com Metanol

LFRH – Extrato obtido dos frutos de Licania tomentosa com n-Hexano

LFRM – Extrato obtido dos frutos de Licania tomentosa com Metanol

m – metro

min – minuto

mL – mililitro

µL - microlitro

mm – milimetro

msm –metros sobre o mar

MTT - 3 - (4,5 –dimetil tiazol -2-il) -2,5-difenil brometo de tetrazólio

NBR – Normas Brasileiras

NCI – National Câncer Institute of the EUA

NCSE – Extrato obtido do rizoma de Nelumbo nucifera com Etanol

nm – nanômetro

NRE – Extrato obtido da raiz de Nelumbo nucifera com Etanol

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OMS – Organização Mundial de Saúde

p.a. – Puro para análise

PNPIC – Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares

PNPMF – Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos

PROPLAM - Programa Estadual de Plantas Medicinais

PUC – Pontifícia Universidade Católica

r – coeficiente de correlação

RDC – Resolução de Diretoria Colegiada

Rf – Fator de Retenção

RMN13C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono

RMN1H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

rpm – rotações por minuto

RPMI – meio de cultura enriquecido por 18 aminoácidos, 11 vitaminas, 6 sais inorgânicos,

glutation e vermelho de fenol.

S – Coordenada Sul

SFB – Soro Bovino Fetal

SIMERJ – Sistema de Meteorologia do Estado do Rio de Janeiro

SRB – sulforrodamina B

SUS – Sistema Único de Saúde

TCA – Ácido tricloroacético

T.Ic - Índice terapêutico

TMCS – trimetilclorosilano

UFF – Universidade Federal Fluminense

UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina

UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas

UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo

UV – Ultravioleta

WO – Coordenada Oeste

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Extratos de plantas mais prescritos na Alemanha (HOSTETTMANN et al., 2003). .... 3 Tabela 2 Estudos realizados com o ácido betulínico e/ou seus derivados frente à linhagem de células tumorais (SAMI et al., 2006). ......................................................................................... 13 Tabela 3 Ácido betulínico (I) e seus derivados (II a VIII). Efeito inibitório sobre HIV (µM) das substâncias I a VIII em comparação com o AZT (JUNGES, 1997). .................................... 15 Tabela 4 Algumas fontes naturais de obtenção do ácido betulínico descritas na literatura. ...... 16 Tabela 5 Recomendações gerais de coleta para plantas expontâneas e plantas cultivadas (MARTINS et al., 2000). ............................................................................................................ 20 Tabela 6 Uma forma geral de redução do peso em plantas medicinais submetidas à secagem (MARTINS et al., 2000). ............................................................................................................ 20 Tabela 7 Processo de separação dos constituintes de um extrato versus resolução obtida em cromatografia em camada fina (MATOS, 1997)......................................................................... 22 Tabela 8 Solventes usados para extração X substâncias extraídas (SIMÕES et al., 2007)........ 24 Tabela 9 Tamanhos e capacidades das separações das colunas “flash” (STILL et al., 1978).... 30 Tabela 10 Classificação dos testes para validação de métodos analíticos, segundo sua finalidade (BRASIL, 2003a). ...................................................................................................... 33 Tabela 11 Ensaios necessários para validação do método analítico, segundo sua finalidade (BRASIL, 2003a). ....................................................................................................................... 33 Tabela 12 Coleta de Eugenia florida DC para o estudo de variação Sazonal. ........................... 40 Tabela 13 Dados referentes à coleta de outros indivíduos de Eugenia florida DC para estudo comparativo. ................................................................................................................................ 41 Tabela 14 Dados referentes à coleta de outras espécies que contém ácido betulínico para estudo comparativo...................................................................................................................... 41 Tabela 15 Espécies utilizadas na pesquisa desta dissertação, registros e localização. ............... 43 Tabela 16 Material usado para obter diferentes granulometrias das folhas de E. florida.......... 46 Tabela 17 Linhagens celulares empregadas na avaliação de atividade antiproliferativa. .......... 53 Tabela 18 Sinais assinalados no espectro de infravermelho do ácido betulínico. ...................... 67

III

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Tabela 19 Solventes selecionados para os estudos dos métodos de extração (SMITH, 1994). . 80 Tabela 20 Efeito citotóxico (CC50) de extratos do estudo Sazonal das folhas de Eugenia florida DC e substâncias puras em células VERO. ................................................................... 106 Tabela 21 Efeito citotóxico (CC50) de extratos de outras espécies que contém ácido betulínico e substâncias padrões em células VERO................................................................................... 109 Tabela 22 Efeito citotóxico de extratos do estudo Sazonal de folhas de Eugenia florida DC e substâncias padrões em células neoplásicas. ............................................................................. 111 Tabela 23 Efeito citotóxico de extratos de outras espécies que contém ácido betulínico e substâncias padrões em células neoplásicas. ............................................................................. 115 Tabela 24 Resultados de CI50 obtidos por Kumar et al. (2010) para linhagens leucêmicas, utilizando Dillenia indica. ......................................................................................................... 116 Tabela 25 Índice de Seletividade nas linhagens testadas nos extratos de Eugenia florida. ..... 117 Tabela 26 Índice de Seletividade (IS) nas linhagens testadas nas outras espécies que contém ácido betulínico e substâncias padrões em células neoplásicas................................................. 119

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Diferentes fontes de agentes terapêuticos (HOSTETTMANN et al., 2003). ................ 1 Figura 2 Exemplo fotográfico de Eugenia florida DC. (a) Hábito arbóreo; (b) Detalhe da inflorescência, (c) Detalhe dos frutos, (d) Detalhe das sementes (LORENZI, 2000). .................. 7 Figura 3 Detalhes da morfologia de Eugenia florida DC. 01. Ramo com inflorescência. 02. Folha. 03 Inflorescência. 04. Botão Floral. 05. Disco estaminal. 06. Fruto (ROMAGNOLO & SOUZA, 2006). ............................................................................................................................. 8 Figura 4 Estruturas básicas dos triterpenos isolados das folhas de Eugenia florida (JUNGES, 1997).............................................................................................................................................. 9 Figura 5 Isopreno: unidade básica formadora dos terpenos. ........................................................ 9 Figura 6 Formação de terpenóides a partir do ácido mevalônico (ALVES, 2001). ................... 10 Figura 7 Estrutura química do ácido ursólico (MAURYA & SRIVASTAVA, 2012)............... 11 Figura 8 Estrutura química do ácido boswélico (CSUK et al., 2010)........................................ 11 Figura 9 Estrutura química do ácido betulínico (PATOCKA, 2003)......................................... 12 Figura 10 Estrutura base do ácido betulínico (I) e seus derivados produzidos a partir da inserção de substituintes em R1 e R2 (JUNGES, 1997). ............................................................ 14 Figura 11 Síntese do ácido betulínico proposta por Csuk et al, 2006. ....................................... 17 Figura 12 Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).............................................................................................................. 19 Figura 13 Esquema para purificação de substâncias isoladas de material vegetal (HOSTETTMANN et al., 2003).................................................................................................. 23 Figura 14 Representação de cromatografia: (a) em coluna aberta (DEGANI et al., 1998); (b) cromatografia “flash” (HOSTETTMANN et al., 2003).............................................................. 30 Figura 15 Proposta do mecanismo de fragmentação molecular do Betulinato. ......................... 59 Figura 16 Espectro de CG-EM do extrato metanólico de folhas de E. florida. ......................... 60 Figura 17 Espectro de CG-EM do padrão de ácido betulínico Sigma Aldrich. ......................... 61 Figura 18 Espectro de Ressonância Magnética de 1H do ácido betulínico. ............................... 62

IV

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Figura 19 Assinalamento no RMN de 1H do ácido betulínico. .................................................. 63 Figura 20 Assinalamento no RMN de 13C do ácido betulínico. ................................................. 63 Figura 21 Espectro de RMN1H do ácido betulínico................................................................... 64 Figura 22 Espectro de RMN13C do ácido betulínico.................................................................. 65 Figura 23 Espectro de DEPT-135 do ácido betulínico............................................................... 66 Figura 24 Espectro de infravermelho do ácido betulínico.......................................................... 67 Figura 25 Mecanismo da derivatização do ácido betulínico por diazomentano. ....................... 69 Figura 26 Cromatograma gasoso do padrão do ácido betulínico derivatizado por diazometano.69 Figura 27 Mecanismo da derivatização de um ácido por BSTFA.............................................. 69 Figura 28 Cromatograma gasoso do acido betulínico após derivatização com BSTFA + TMCS. ......................................................................................................................................... 70 Figura 29 Unidade Polimérica da Coluna DB-1. ....................................................................... 71 Figura 30 Cromatograma gasoso do ácido betulínico derivatizado por diazometano em Coluna DB-1 por CG-DIC........................................................................................................... 71 Figura 31 Unidade Polimérica da Coluna DB-5. ....................................................................... 71 Figura 32 Cromatograma gasoso do ácido betulínico derivatizado por diazometano em Coluna DB-5 por CG-DIC........................................................................................................... 72 Figura 33 Avaliação da influência no gás make-up na resolução do ácido betulínico derivatizado por diazometano: (a) Makeup maior; (b) Makeup menor. ...................................... 73 Figura 34 Avaliação do pulso de pressão no desempenho cromatográfico do ácido betulínico metilado. ...................................................................................................................................... 74 Figura 35 Cromatograma obtido com o ácido betulínco metilado e com variações de temperaturas................................................................................................................................. 74 Figura 36 Densitograma do ácido betulínico com a fase móvel MeOH:CHCl3 (1:9)................ 76 Figura 37 Densitograma do ácido betulínico com fase móvel Hexano:AcOEt (4:6)................. 77 Figura 38 Estrutura do ácido betulínico, com a porção polar destacada em vermelho. ............. 80 Figura 39 Resultados da extração por soxhlet das folhas de Eugenia florida (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. .................................................... 81

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Figura 40 Resultados da extração por Maceração Estática das folhas de Eugenia florida (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. ............................. 84 Figura 41 Resultados da extração por Maceração Dinâmica das folhas de Eugenia florida (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. ............................. 85 Figura 42 Resultados da extração por Percolação das folhas de Eugenia florida (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo............................................ 87 Figura 43 Resultados da extração por Ultrassom das folhas de Eugenia florida (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo............................................ 89 Figura 44 Comparação dos percentuais de ácido betulínico obtidos no estudo dos métodos de extração e solventes. .................................................................................................................... 90 Figura 45 Resultados da extração por ultrassom com diferentes granulometrias das folhas de Eugenia florida (a) teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo.92 Figura 46 Comparação dos rendimentos extrativos de folhas de E. florida obtidos nos diferentes solventes e técnicas estudadas. ................................................................................... 95 Figura 47 Resultado do estudo de variação sazonal das folhas de E. florida extraídas com n-Hexano /Metanol por soxhlet (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. AB (ácido betulínico). ............................................................................ 97 Figura 48 Parâmetros observados durante o estudo de variação metabólica das folhas de E. florida. ......................................................................................................................................... 98 Figura 49 Comparação entre diferentes indivíduos de E. florida (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo. ................................................................... 100 Figura 50 Diferentes indivíduos de Eugenia florida que foram usados neste estudo (a) Indivíduo usado para o estudo Sazonal; (b) 2º Indivíduo do campus da Fiocruz; (c) Indivíduo do Jardim Botânico.................................................................................................................... 101 Figura 51 Rendimento de ácido betulínico em outras espécies e órgãos, analisados por CG-DIC. ........................................................................................................................................... 102 Figura 52 Avaliação do efeito citotóxico em relação ao percentual de ácido betulínico e rendimento extrativo dos ensaios de sazonalidade das folhas de E. florida.............................. 107 Figura 53 Avaliação do efeito citotóxico com o percentual de ácido betulínico e rendimento extrativo dos ensaios de variação metabólica das folhas de E. florida...................................... 108 Figura 54 Avaliação da atividade citotóxica do ácido betulínico em extratos obtidos de outras espécies...................................................................................................................................... 110 Figura 55 Avaliação da concentração média de inibição celular (CI50) do extrato do estudo Sazonal de folhas de Eugenia florida DC em linhagens tumorais. ........................................... 112

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Figura 56 Avaliação da concentração média de inibição celular (CI50) do extrato de outras espécies em linhagens tumorais................................................................................................. 114 Figura 57 Índice de Seletividade dos extratos de folhas de Eugenia florida usados estudo de sazonalidade e dos outros indivíduos (a) avaliação do IS das linhagens U251, MCF-7, NCI-ADR/RES, 786-0, NCI-H460, HT29; (b) avaliação da linhagem OVOCAR-3........................ 118 Figura 58 Índice de Seletividade (IS) dos extratos de outras espécies (a) avaliação do IS das linhagens U251, MCF-7, NCI-ADR/RES, 786-0, NCI-H460, HT29; (b) avaliação da linhagem OVOCAR-3. .............................................................................................................................. 120

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RESUMO

O objetivo deste trabalho foi padronizar os extratos de Eugenia florida DC. e estudar

suas atividades farmacológicas visando o desenvolvimento de um quimioterápico de origem

vegetal. Para tanto, foram realizados estudos com diferentes métodos de extração, estudo de

variação metabólica da planta, desenvolvimento e validação de metodologias analíticas,

ensaios citotóxicos e ensaios em células tumorais. Os dados obtidos no trabalho apontaram a

percolação no tempo de 2 horas como o método que apresentou o melhor percentual de

extração de ácido betulínico a partir das folhas de E. florida. Apesar de saber que a

granulometria influencia diretamente na eficiência da extração, não foram observadas grandes

diferenças percentuais nos teores de ácido betulínico para os diferentes tamanhos de partículas

utilizados na extração por ultrassom, porém constatou-se que a homogeneidade dos tamanhos

de partículas aumenta a eficiência da extração. No estudo de variação metabólica observaram-

se variações durante o ano que devem ser consideradas na qualidade da matéria-prima vegetal.

Os extratos de E. florida apresentaram baixa citotoxidez em células VERO e apresentaram

índice de seletividade alto o que representa uma maior afinidade pelas células tumorais do que

pelas células sadias (VERO). Nos ensaios com células tumorais os extratos apresentaram

atividade mais potente contra a linhagem de ovário (OVOCAR-3), muito mais que os padrões

de ácido betulínico (comercial e isolado), o que confirma a presença de outra(s) substância(s)

com atividade antitumoral presente(s) no extrato o que corrobora para a pesquisa e o

desenvolvimento de um fitoterápico ao invés de um fitofármaco para ser utilizado no

tratamento do câncer de ovário.

Palavra-chave: Eugenia florida DC.; ácido betulínico; antitumoral.

V

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ABSTRACT

The objective of this study was the standardize of Eugenia florida DC. leaves extracts

and study their pharmacological activities aiming the development of a chemoterapic. To

achieve this goal, studies were performed using different particle sizes, metabolic profile, as

well as development and validation of analytical methodologies, cytotoxic assays and assays

on tumor cells. The data obtained on this study showed that the percolation extraction method

in the time of 2 hours showed the better rate of betulinic acid extraction from E. florida leaves.

Despite the knowledge that the particle size directly affects the efficiency of ultrasound

extraction, major differences were not observed in the percentage of betulinic acid for the

different particle sizes used, however the uniformity of the particle size increases the

efficiency of extraction. In the metabolic profile study, variations were observed during the

year which should be considered in the quality of the vegetable raw material. E. florida

extracts showed lower citotoxicity in VERO cells, and showed high selectivity index which

represents a greater affinity for tumor cells than for healthy cells. In tumoral cells assays, the

extracts showed stronger activity against the ovarian line (OVOCAR-3), much more than the

standards of betulinic acid (commercial and isolated), which confirms the influence of (an)

other substance (s) presented in the extract with antitumoral activity in the extract which

defines the development of a herbal medicine instead of a herbal drug to be used for the

treatment of ovarian cancer.

Keyword: Eugenia florida DC.; betulinic acid, antitumoral.

VI

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1

1 INTRODUÇÃO

As plantas medicinais representam um recurso terapêutico há muito tempo utilizado

pela população mundial e em vários casos é o único meio disposto para o tratamento de

algumas doenças em diferentes comunidades (MACIEL et al., 2002).

Com o crescimento da química farmacêutica, no início do século XIX, as plantas

passaram a representar a primeira fonte de substâncias para o desenvolvimento de

medicamentos. A Figura 1 mostra que apesar da síntese orgânica representar um maior

percentual de fonte de agentes terapêuticos, uma boa parte dos medicamentos industrializados

é de origem vegetal (HOSTETTMANN et al., 2003).

Figura 1 Diferentes fontes de agentes terapêuticos (HOSTETTMANN et al., 2003).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 60% da população mundial fazem

uso de medicamentos tradicionais, sendo que a maioria é à base de plantas medicinais (OMS,

2002a). Em muitos países a utilização de plantas medicinais é bastante comum, sendo a OMS

uma grande incentivadora desta prática. Países membros da OMS têm desenvolvido políticas

referentes à medicina tradicional e/ou complementar e alternativa (OMS, 2002b).

Um terço da população mundial não tem acesso a medicamentos essenciais, sendo

necessário que se invista na medicina tradicional como forma de ajudar a melhorar a saúde

pública. Estas diretrizes apontam para uma necessidade de se identificar práticas seguras e

eficazes, a fim de proporcionar uma base sólida que fomente e promova a medicina tradicional

(OMS, 2002b).

Produtos sintéticos 56%

Biológicos 5%

Produtos naturais

6% Derivados

de produtos naturais 24%

Produtos sintéticos modelados a partir de produtos naturais 9%

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2

1.1 Uso de Plantas Medicinais no Brasil

No Brasil, a utilização de plantas medicinais teve sua origem relacionada com a cultura

dos índios que habitavam o país. Depois, sofreu influência dos colonizadores e de outros

povos que vieram mais tarde (BALUNAS & KINGHORN, 2005). Segundo Bertoni, um

botânico do século XIX, a tribo Guarani teve o melhor conhecimento sobre as plantas

medicinais, mais do que os europeus no século XVI (MELLO, 1980) e que foi significativo

para o uso de plantas com a finalidade terapêutica por brasileiros e europeus. A partir do

século XVII, as culturas africana e européia foram introduzidas no Brasil, sobrepondo-se à

indígena. Entre 1823 a 1831, von Martius e outros botânicos coletaram várias plantas

brasileiras, e posteriormente publicaram o “Systema Materiae Medicae Vegetabilis

Brasilienses” que descreve 470 plantas (MELLO, 1980).

Levantamentos entre 1949 a 1992, mostram que a submissão de resumos em encontros

científicos no Brasil, abordando o tema plantas medicinais, ocorreu regularmente neste

período, porém menos de 10% das substâncias bioativas de extratos vegetais foram

quimicamente investigadas (SOUZA BRITO & SOUZA BRITO,1993).

Mais de 20% da flora mundial está representada no Brasil, entretanto poucos estudos

foram feitos para investigar o potencial de novas drogas ou matéria-prima para as preparações

farmacêuticas (PETROVICK et al., 1999).

Várias iniciativas têm sido empenhadas no intuito de viabilizar o uso de fitoterápicos

na saúde pública. Em 1983, foi criado o Projeto Farmácias Vivas pelo professor Dr. Francisco

José de Abreu Matos da Universidade Federal do Ceará, com o objetivo de estimular o uso

racional de plantas medicinais com finalidade terapêutica, principalmente na saúde pública.

(BALUNAS & KINGHORN, 2005). No Rio de Janeiro, existe um Programa Estadual de

Plantas Medicinais (PROPLAM) que vigora desde 1996 pela Lei Estadual n° 2.537 que tem

como objetivo estabelecer políticas públicas nas áreas de preservação, pesquisa e utilização

terapêutica das plantas medicinais (VICTÓRIO & LAGE, 2008).

1.2 Plantas Medicinais X Indústria

O uso de plantas medicinais é uma alternativa para o tratamento de muitas doenças em

vários países em desenvolvimento. Entre as vantagens no uso de plantas medicinais tem-se a

redução nas taxas de importação de medicamentos (GARLET & IRGANG, 2001).

Pequenas e grandes empresas têm incluído fitoterápicos na linha de produção, em vista

disto, parcerias entre instituições de ensino e empresas são bem vindas na busca de novos

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fitoterápicos (LIMA et al., 2001). Um bom exemplo destas parcerias é o Acheflan® do

Laboratório Aché, primeiro antiinflamatório feito com base no extrato de uma planta nativa

brasileira, Cordia verbenacea DC. Os estudos para o desenvolvimento do medicamento

levaram sete anos e foram conduzidos com parcerias entre a UFSC, UNIFESP, PUC-

Campinas e UNICAMP (http://www.redetec.org.br/inventabrasil/acheflan.htm, 2011).

O ginkgo (Ginkgo biloba L.) é utilizado na medicina chinesa desde 2.800 a.C. e

atualmente é o fitoterápico mais vendido no mundo, sendo indicado para o tratamento dos

problemas ligados à insuficiência de circulação cerebral e periférica (HOBBS, 1991). A

eficácia do ginkgo é atribuída aos gincolídeos, diterpenos que inibem a agregação plaquetária

(BRAQUET, 1987).

A Tabela 1 mostra alguns extratos vegetais que são prescritos na Alemanha,

evidenciando o mercado de fitoterápicos.

Tabela 1 Extratos de plantas mais prescritos na Alemanha (HOSTETTMANN et al., 2003).

. Plantas Indicação Vendas (milhões em $ DM*)

Ginkgo biloba L. Insuficiência vascular cerebral periférica

461

Aesculus hippocastanum L. Insuficiência venosa 114 Crataegus spp. Cardiotônico 65 Hypericum perforatum L. Depressão 59 Urtica dioica L. Problemas urológicos 35 Echinacea sp. Imunoestimulante 34 * marco alemão

Em meados do século XX, a química de produtos naturais passou a ser a principal

fonte de pesquisa para novos agentes anticancerígenos. Nos Estados Unidos da América 60%

dos medicamentos anticancerígenos aprovados eram de origem natural (CRAGG et al., 1997).

No final dos anos 60 os alcalóides bisindólicos vimblastina e vincristina foram isolados de

Catharanthus roseus G. Don e foram considerados como medicamentos indispensáveis para o

tratamento da leucemia (HOSTETTMANN et al., 2003). Outra substância isolada no final dos

anos 60 foi o diterpeno paclitaxel, inicialmente chamado como taxol, extraído das cascas do

Taxus brevifolia Nutt. Foi descoberto pelo National Cancer Institute (NCI), tendo sido

caracterizado também em outras espécies do gênero Taxus (HOSTETTMANN et al., 2003).

Várias substâncias obtidas de plantas estão em fase de estudo para tratamento do

câncer. Um exemplo de substância que se mostrou ativa contra vários tipos de leucemia é a

homoarringtonina, uma substância isolada de Cephalotaxus harringtonia Var. Nana (ZHOU et

al., 1995).

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Não só as substâncias novas (inéditas) são promissoras, algumas substâncias

conhecidas vêm mostrando grande potencial terapêutico. O ácido betulínico é um constituinte

comumente encontrado em algumas espécies de Betula spp. Este triterpeno mostrou uma

potente atividade antitumoral principalmente para tratamento de melanomas (ZUCO et al.,

2002).

É importante salientar que o mecanismo de ação dos componentes ativos presentes em

muitas plantas ainda são desconhecidos. Até hoje muitas espécies e preparados vegetais

medicinais são estudados na busca de entendimento do seu mecanismo de ação e do

isolamento dos princípios ativos (BARREIRO et al., 2006). Muitas vezes os próprios

constituintes são conhecidos, mas não desempenham o efeito isoladamente. Esta situação se

deve aos fitocomplexos presentes na planta, em muitos casos com mais de 50 substâncias.

1.3 Aspectos Legais

Fitoterápico, segundo a ANVISA é: “Todo medicamento tecnicamente obtido e

elaborado, empregando-se, exclusivamente, matérias primas ativas vegetais com a finalidade

profilática, curativa ou para fins de diagnóstico, com benefício para o usuário. É caracterizado

pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e

constância de sua qualidade; é o produto final acabado, embalado e rotulado. Na sua

preparação podem ser utilizados adjuvantes farmacêuticos permitidos pela legislação vigente.

Não podem estar incluídas substâncias ativas de outras origens, não sendo considerado

produto fitoterápico quaisquer substâncias ativas, ainda que de origem vegetal, isoladas ou

mesmo suas misturas.” (BRASIL, 1995).

O Brasil possui um arcabouço legal para plantas medicinais e fitoterápicos, bem como

programas de incentivo à pesquisa desses. Até 2004, as espécies vegetais medicinais podiam

ser regulamentadas como medicamentos, seguindo as instruções normativas para registro de

medicamentos fitoterápicos, o que deixou de ser permitido com a publicação da RDC 48/2004

(BRASIL, 2004). Políticas governamentais voltadas para o setor, foram publicadas em 2006: a

Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) e a Política Nacional de

Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde (SUS)

(BRASIL, 2006a; BRASIL, 2006b).

Em 2010 a ANVISA publicou uma norma para melhor regulamentar a produção e o

uso de espécies vegetais medicinais, a RDC (Resolução de Diretoria Colegiada) 10/2010. Para

cada espécie, foram padronizadas indicações terapêuticas, forma de uso, quantidade a ser

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ingerida e os cuidados e restrições a serem observados no seu uso, conforme o uso tradicional

(BRASIL, 2010a), além da RDC 14/ 2010 que atualiza os procedimentos de registro de

fitoterápicos no país (BRASIL, 2010b).

1.4 Família Myrtaceae

Myrtaceae pertence à ordem Myrtales e compreende cerca de 131 gêneros com

aproximadamente 4620 espécies. Os gêneros de Myrtaceae mais representativos são Eugenia

(cerca de 1115 espécies), Syzygium (1045 espécies), Eucalyptus (680 espécies), Myrcia (cerca

de 400 espécies), Malaleuca (220 espécies) e Psidium (100 espécies) (STEVENS, 2001).

Myrtaceae é formada por um grande número de plantas que incluem desde

representantes de matas rasteiras a grandes árvores. Esta família é uma das mais importantes

da Mata Atlântica brasileira. O uso medicinal de muitas de suas espécies tem sido

comprovado, como a atividade antimicrobiana de óleos essenciais e atividades antiviral,

hipoglicemiante, antioxidante e anticancerígena (BOLZANI et al., 2002).

1.5 Gênero Eugenia L.

Este gênero se distribui em áreas que vão do México a Argentina. Na América tropical

e subtropical são referidas mais de 500 espécies (BACCHI et al., 2003). O gênero Eugenia

apresenta-se bem representado nas diversas formações vegetais do Brasil, com ocorrência

abundante e freqüente. Além disso, muitas espécies produzem frutos comestíveis muito

apreciados, não só por animais, mas também pelo homem, como por exemplo, a pitanga

(Eugenia uniflora L.). Do ponto de vista químico, vale ressaltar a produção de ácido

betulínico e derivados, que atraem muita atenção por apresentarem atividades biológicas, anti-

HIV, antitumoral, antimalárica e anti-inflamatória (LUNARDI et al., 2001).

As folhas de algumas espécies de Eugenia são usadas na medicina popular para

diversas finalidades terapêuticas. O uso da infusão de folhas de Eugenia uniflora L. em água,

por exemplo, pode servir para controle da hipertensão, diminuição do colesterol e ácido úrico,

emagrecimento e também como adstringente e digestivo (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al.

1987), outro exemplo é o uso das folhas da Eugenia dysenterica DC., planta característica do

Cerrado, que são muito usadas na medicina popular como antidiarréico (LIMA et al., 2007).

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Óleos essenciais e substâncias como flavonóides e taninos, especialmente constituídos

de mono- e sesquiterpenos, já foram isolados do gênero Eugenia e estão descritos na literatura

(FRIGHETTO et al., 2005a; FRIGHETTO et al., 2005b).

1.6 Eugenia florida DC

Eugenia florida DC., conhecida popularmente pelo nome de guamirim-cereja ou

pitanga preta, é comumente encontrada em quase todo território brasileiro, na maioria das

formações vegetais arbóreas, sendo recomendada para paisagismo e para a composição de

reflorestamento. Os frutos são muito apreciados por várias espécies de pássaros o que ajuda na

dispersão das sementes (LORENZI, 2000).

Eugenia florida é uma árvore, com 5-9 m de altura, dotada de copa arrendondada e

pouco densa, com folhagem avermelhada após a brotação (Figura 2a). Inflorescências em

rácemos axilares de 1-2 cm de comprimento, com pilosidade hirta e flores perfumadas de cor

branca. Floresce em mais de uma época do ano, predominando, o período compreendido entre

os meses de agosto e setembro (Figura 2b). O fruto é constituído por uma baga globosa,

glabra, brilhante, com cálice persistente, de cor vermelha ou preta quando madura, com polpa

carnosa, adocicada, contendo uma única semente, com amadurecimento principalmente em

dezembro e janeiro (Figuras 2c e 2d) (LORENZI, 2000).

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Figura 2 Exemplo fotográfico de Eugenia florida DC. (a) Hábito arbóreo; (b) Detalhe da

inflorescência, (c) Detalhe dos frutos, (d) Detalhe das sementes (LORENZI, 2000).

Os dados morfológicos e anatômicos da folha de E. florida reúnem características

comuns à família Myrtaceae, podendo-se destacar algumas de importância diagnóstica para a

espécie como, por exemplo, árvores ou arbustos, as folhas simples, geralmente opostas e com

margens inteiras. Como características da família, citam-se: a ocorrência de cavidades

secretoras, a presença de floema interno ao xilema e alto teor de tanino (DONATO &

MORRETES, 2009).

A Figura 3 mostra alguns detalhes morfológicos de Eugenia florida DC.

(a) (b)

(c) (d)

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Figura 3 Detalhes da morfologia de Eugenia florida DC. 01. Ramo com inflorescência. 02.

Folha. 03 Inflorescência. 04. Botão Floral. 05. Disco estaminal. 06. Fruto (ROMAGNOLO &

SOUZA, 2006).

O perfil químico das folhas de Eugenia florida DC. apresenta especialmente

triterpenos dos esqueletos lupânico, nor-lupânico, ursânico e oleanânico. A Figura 4 mostra os

esqueletos dos triterpenos encontrados em E. florida (JUNGES, 1997).

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LUPÂNICO NOR-LUPÂNICO

URSÂNICO OLEANÂNICO

Figura 4 Estruturas básicas dos triterpenos isolados das folhas de Eugenia florida (JUNGES,

1997).

1.7 Triterpenos

Os triterpenos pertencem à larga e estruturalmente diversa classe química conhecida

como terpenos, que são substâncias constituídas basicamente por átomos de hidrogênio e

carbono, com uma unidade formadora de 5 carbonos, chamada de isopreno C5 (Figura 5)

(FREIRE, 2009).

Figura 5 Isopreno: unidade básica formadora dos terpenos.

A biossíntese dos terpenos é oriunda da via do ácido mevalônico, através da união de

unidades isoprênicas ligadas de uma maneira específica conhecida como “cabeça-cauda”. A

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Figura 6 mostra que duas unidades isoprênicas (C5) unidas cabeça-cauda produzem os vários

esqueletos monoterpênicos (C10), enquanto o encandeamento de três unidades resulta na classe

dos sesquiterpenos (C15) (ALVES, 2001). Os triterpenos apresentam como precursor o

esqualeno, um hidrocarboneto com 30 átomos de carbono que é formado a partir da união

cauda-cauda de dois grupos trans-farnesila (FREIRE, 2009).

Figura 6 Formação de terpenóides a partir do ácido mevalônico (ALVES, 2001).

Os triterpenos apresentam diversas propriedades medicinais descritas, principalmente

anti-inflamatórias e cardiovasculares, além das atividades antibacteriana, antiviral e

analgésica. Devido à sua grande aplicabilidade e a variedade de espécies que contém

triterpenos em sua composição, o seu estudo tem sido de grande interesse na tentativa de

novas e reais aplicações (PATOCKA, 2003).

Existe cerca de 4000 triterpenos conhecidos distribuídos na natureza, a maioria deles

na forma livre, mas outros ocorrem como glicosídeos (saponinas) ou em especial como formas

combinadas (PATOCKA, 2003).

Os triterpenos de estrutura pentacíclica possuem grande atividade anticancerígena, o

que pode ser avaliado observando alguns triterpenos pentacíclicos bastante estudados como o

ácido ursólico, ácido boswélico e ácido betulínico (FREIRE, 2009).

O ácido ursólico (Figura 7) é um triterpeno pentacíclico presente em diversas plantas e

apresenta importantes atividades farmacológicas como: analgésico, antitumoral,

Ácido Mevalônico

Pirofosfato de Isopentenila

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antibacteriano, diurético, antidiabético, inibidor da COX-2, anti-inflamatório, hepatoprotetor e

anti-HIV para vários tipos de linhagens (MAURYA & SRIVASTAVA, 2012).

Figura 7 Estrutura química do ácido ursólico (MAURYA & SRIVASTAVA, 2012).

O ácido boswélico (Figura 8) é encontrado, sobretudo na resina de Boswellia serrata

Triana & Planch, usado na medicina tradicional como analgésico e para tratamento de

inchaço. Estudos recentes mostram atividade antitumoral (CSUK et al., 2010). Estudos in

vitro comprovaram que o ácido boswélico induz apoptose em células leucêmicas humanas

(HL-60) e inibe a topoisomerase I (SHAO et al., 1998; HOERNLEIN et al., 1999).

Figura 8 Estrutura química do ácido boswélico (CSUK et al., 2010).

O ácido betulínico (Figura 9) é um triterpeno pentacíclico pertencente ao grupo dos

lupanos. Possui diversas atividades biológicas, tais como, anti-inflamatório e antimalárico

testadas in vitro (SIMÕES et al., 2007). Entretanto, a atividade que mais tem sido estudada é a

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ação anticancerígena (SAMI et al., 2006). Estudos demonstraram o potencial citotóxico do

ácido betulínico para as células de melanoma, não só em ratos, mas também em células

humanas (PISHA et al., 1995). O crescimento de tumores foi observado por 40 dias e o ácido

betulínico mostrou-se responsável por uma redução acentuada da massa tumoral e não induziu

quaisquer efeitos secundários, tais como perda de peso (PATOCKA, 2003).

Figura 9 Estrutura química do ácido betulínico (PATOCKA, 2003).

1.7.1 Atividades Farmacológicas do Ácido Betulínico

1.7.1.1 Atividade Anti-inflamatória O ácido betulínico apresenta atividade anti-inflamatória contra edema induzido em

patas de ratos por carragenina e serotonina, foram testados doses de 50 e 100 mg/kg de ácido

betulínico, apresentando atividade anti-inflamatória significativa, comparável a agentes como

fenilbutazona e dexametasona, conhecidos fármacos anti-inflamatórios (MUKHERJEE et al.,

1997).

Também foi encontrada atividade inibidora para a fosfolipase A2, que desempenha um

papel crucial no processo inflamatório (SAMI et al., 2006).

1.7.1.2 Atividade Antimalárica O ácido betulínico foi testado in vitro contra cepas de Plasmodium falciparum

sensíveis a cloroquina, e se mostrou ativo com valores de CI50 entre 19,6 µg/mL e 25,9

µg/mL. (SAMI et al., 2006).

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1.7.1.3 Atividade Antitumoral Segundo Pisha et al. (1995), o ácido betulínico é um inibidor que apresenta afinidade

por melanoma humano, através da indução da apoptose. Ratos tratados com ácido betulínico

(doses de 50, 250 e 500 mg/kg) parecem ser resistentes a melanomas humanos transplantados

e apresentam regressão do tumor de 0,2 a 0,6 cm3, enquanto as células saudáveis foram

resistentes aos efeitos do ácido betulínico.

Posteriormente foi descoberto que o ácido betulínico atua também em outras células

tumorais como neuroblastoma, tumores cerebrais e leucemia (SCHMIDT et al., 1997;

FULDA et al., 1999; EHRHARDT et al.,2004). Sua atividade tumoral tem sido o alvo de

muitos estudos. A Tabela 2 mostra algumas destas atividades em linhagens de células

tumorais.

Tabela 2 Estudos realizados com o ácido betulínico e/ou seus derivados frente à linhagem de

células tumorais (SAMI et al., 2006).

Patologia Referências Melanoma Pisha et al. (1995), Fulda et al. (1997), Kim et al. (1998),

Jeong et al. (1999), Selzer et al. (2000), Kim et al. (2001), Hata et al. (2002, 2003), Zuco et al. (2002), Symon et al. (2003), Sarek et al. (2003), Tan et al. (2003), You et al. (2003), Sawada et al. (2004), Urban et al. (2004), Liu et al. (2004), Zanon et al. (2004), Fulda et al. (2004), Fulda & Debatin (2005), Kasperczyk et al. (2005).

Carcinoma pulmonar Fulda et al. (1997), Zuco et al. (2002), Sarek et al. (2003), Urban et al. (2004), You et al. (2003), Mukherjee et al. (2004b).

Câncer de cólon Fulda et al. (1997), Kim et al. (2001), Baglin et al. (2003b), Sarek et al. (2003), Mukherjee et al. (2004b), Urban et al. (2004).

Carcinoma de próstata Kim et al. (2001), Sarek et al. (2003), Mukherjee et al. (2004b), Urban et al. (2004).

Leucemia Fulda et al. (1997), Noda et al. (1997), Deng and Snyder (2002), Hata et al. (2003), Ehrhardt et al. (2004), Urban et al. (2004).

Carcinoma de ovário Deng & Snyder (2002), Zuco et al. (2002), Sarek et al. (2003), Mukherjee et al. (2004b).

Carcinoma endotelial Mukherjee et al. (2004a,b). Carcinoma de epiderme oral Kim et al. (1998), Jeong et al. (1999). Glioblastoma Fulda et al. (1999), Sarek et al. (2003), Jeremias et al.

(2004), Fulda et al. (2004), Fulda & Debatin (2005), Kasperczyk et al. (2005).

Câncer de mama Fulda et al. (1997), Sarek et al. (2003), Urban et al. (2004). Neuroblastoma Fulda et al. (1997), Schmidt et al. (1997), Fulda et al.

(1998a), Hata et al. (2003), Fulda et al. (2004), Fulda & Debatin (2005), Kasperczyk et al. (2005).

Câncer de coluna vertebral Fulda et al. (1997, 1999, 2004), Fulda & Debatin (2005). Carcinoma de cérvix Zuco et al., 2002 Carcinoma hepatocelular Sarek et al., 2003 Osteosarcoma Sarek et al., 2003 Rabdomiosarcoma Sarek et al., 2003

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1.7.1.4 Atividades Antibacteriana e Antiviral

A atividade antiviral do ácido betulínico e seus derivados foram também estudados

contra a gripe, herpes simples tipo 1 (HSV-1), gripe FPV/Rostock e ECHO-6 enterovírus

(PAVLOVA et al., 2003). Foi observado que na molécula do ácido betulínico quando o grupo

carboxílico do C28 foi substituído por um grupo amida primário, houve um aumento na

atividade antiviral. (BALTINA et al., 2003). O ácido betulínico apresentou atividade antiviral

contra o vírus ECHO-6, porém foi inativo contra as bactérias Staphylococcus aureus,

Escherichia coli (HESS et al., 1995), Bacillus subtilis e Micrococcus luteus (SAMI et al.,

2006).

Vários autores descrevem a capacidade de triterpenos pentacíclicos em inibir a

replicação do HIV in vitro. O ácido betulínico apresentou CI50 de 1,4 µM (CICHEWICZ &

KOUZI, 2004).

Um estudo comparativo entre o efeito da Azidotimidina (AZT) e o ácido betulínico e

seus derivados demonstrou uma maior ação dos triterpenos contra o vírus HIV. A atividade

relativa ao ácido betulínico (I) e seus derivados (II-VIII) (Figura 10 e Tabela 3) comparada

com o AZT, expressa na concentração de cada substância, é mostrada na Tabela 3 (JUNGES,

1997).

Figura 10 Estrutura base do ácido betulínico (I) e seus derivados produzidos a partir da

inserção de substituintes em R1 e R2 (JUNGES, 1997).

R2

R1O

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Tabela 3 Ácido betulínico (I) e seus derivados (II a VIII). Efeito inibitório sobre HIV (µM)

das substâncias I a VIII em comparação com o AZT (JUNGES, 1997).

Substância R1 R2 EC50a IC50

b T.I c I H COOH 1,4 13 9,3 II H CH2OH 23 45 1,9 III H COOCH2COOCH3 17 26 1,5 IV Ac COOH 25 20 0,8 V COC6H5 COOH 15 15 1,0 VI COCH=CHCH3 COOH 19 48 2,5 VII SO3K COOH 20 35 1,7 VIII CO(CH2)2COOH COOH 4 16 4,0 AZT - - 0,04 2000 50000

R1 – derivados do ácido betulínico com substituição do radical na posição R1. R2 – derivados do ácido betulínico com substituição do radical na posição R2. EC50

a – Concentração média que inibe a replicação viral IC50

b – Concentração média que inibe crescimento das células do linfócito T.Ic – Índice terapêutico

1.7.2 Citotoxidez e Mecanismo de Ação do Ácido Betulínico

Em princípio pensou-se que o ácido betulínico apresentava uma afinidade citotóxica

somente por linhagens de melanoma (linhagem MEL-1-4) com a indução da apoptose de

células cancerosas, por ter sido inativo contra várias outras linhagens celulares de câncer, tais

como: mama (linhagem BC-1), cólon (linhagem COL-2), carcinoma epidermóide, próstata

(linhagem LNCaP), pulmão (linhagem LU - 1) e cancro (PISHA et al., 1995). Porém, estudos

posteriores confirmaram sua ampla citotoxidez contra várias outras linhagens de células

cancerígenas. Verificou-se ser citotóxico contra outras linhagens celulares de neuroblastomas

(SCHMIDT et al., 1997).

O ácido betulínico apresenta efeito direto sobre mitocôndrias com a indução da

permeabilidade mitocondrial (FULDA et al., 1999) e despolarização do potencial de

membrana mitocondrial (LIU et al., 2004). Também induz a liberação de citocromo C

(FULDA et al., 1999) e a formação de espécies reativas de oxigênio, além do aumento da

fosforilação padrão e, portanto, ativação da proteína p38 por estresse (LIU et al., 2004).

1.7.3 Obtenção do Ácido Betulínico

O ácido betulínico pode ser obtido por duas maneiras, por extração a partir de

diferentes espécies vegetais, como pode ser observado na Tabela 4, ou por síntese orgânica.

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1.7.3.1 Obtenção por Fonte Natural

São observadas na literatura diversas citações relativas à obtenção deste produto

natural, utilizando-se variadas espécies vegetais para a extração, bem como metodologias

diferentes para este fim, como podem ser observadas na Tabela 4.

Tabela 4 Algumas fontes naturais de obtenção do ácido betulínico descritas na literatura.

Droga Solvente de extração

Método de extração Referência

Cascas da raiz de Morus alba L. Etanol (70%) Maceração estática Signab et al , 2005 Frutos de Dillenia indica L. Metanol Maceração estática Kumar et al , 2010 Frutos e folhas de Licania tomentosa (Benth.) Fritsch

n-Hexano Metanol

Maceração estática Castilho & Kaplan, 2008a

Rizoma de Nelumbo nucifera Gaertn.

Etanol (70%) Maceração estática Mukherjee et al , 2010

Folhas de Ugni molinae Turcz n-Hexano Diclorometano Acetato de etila Metanol.

Maceração estática Aguirre et al., 2006

Casca de Platanus occidentalis L. Metanol n-Hexano Diclorometano

Maceração estática Partição

Jayasuriya et al., 2005

Folhas de Eugenia florida DC. Etanol Maceração estática Frighetto, et al., 2005b

Caules de Doliocarpus dentatus (Aubl.) Standl.

Éter de Petróleo Soxhlet Sauvain et al., 1996

Caule de Davilla rugosa Poir. Metanol Maceração estática David et al., 2006

1.7.3.2 Obtenção por Síntese

Existem diversas rotas sintéticas propostas na literatura, porém em rotas longas com

rendimento global baixo. Uma rota sintética proposta é a partir da betulina, um triterpeno de

ocorrência natural que parece ser matéria-prima ideal para a síntese (FREIRE, 2009).

A betulina pode ser encontrada em altas quantidades em algumas espécies, chegando a

constituir, por exemplo, cerca de 22% da casca de Betula alba (KESSLER et al., 2006) . Essa

substância tem sido convertida no ácido por duas diferentes rotas sintéticas (FREIRE, 2009)

A primeira abordagem utiliza uma oxidação da betulina, seguida por uma redução.

Embora estas duas reações forneçam boas a moderados rendimentos, a redução resultou na

formação de uma mistura de epímeros, de difícil separação (FREIRE, 2009). Assim, em uma

segunda via sintética, o uso de proteção de grupos funcionais tem sido sugerido, levando ao

material puro, embora toda seqüência agora envolva cinco reações químicas (FREIRE, 2009).

Uma rota utilizando permanganato de potássio e óxido de cromo foi sugerido, e ainda

mais recentemente, uma abordagem eletroquímica foi concebida. Ambas as abordagens, no

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entanto, são de pequena escala e a preparação obteve rendimento apenas moderado (FREIRE,

2009).

Csuk et al (2006) sugerem nova forma de obtenção do ácido betulínico com

rendimento de 86% a partir da betulina, conforme a reação apresentada na Figura 11:

Figura 11 Síntese do ácido betulínico proposta por Csuk et al, 2006.

1.8 Estudo Químico de Plantas

O estudo químico das plantas geralmente compreende algumas etapas principais e

complementares (MATOS, 1997 e LOCK de UGAZ, 1994):

• Escolha da planta a ser estudada;

• Levantamento bibliográfico;

• Coleta da planta escolhida;

• Identificação botânica da planta;

• Prospecção preliminar da sua composição química;

• Isolamento e a purificação dos constituintes principais;

• Determinação estrutural;

• Ensaios biológicos e farmacológicos.

1.8.1 Escolha da Planta

Sem dúvida, existe uma dificuldade muito grande em escolher uma planta para estudo

dentro de um universo de cerca de oitocentos e cinqüenta mil (número de espécies vegetais

estimadas a mais de duas décadas por Farnsworth em 1987), considerando que cada espécie é

formada por um conjunto de milhões de indivíduos com variações biológicas, morfológicas e

na composição química o que torna difícil a escolha (MATOS, 1997).

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Existem vários processos de seleção que foram desenvolvidos ao longo da história da

fitoquímica, entretanto os aspectos de maior importância para a seleção de plantas para estudo

químico são: o conhecimento da flora da região a ser pesquisada; o conhecimento popular

sobre o uso das plantas e a quimiossistemática (MATOS, 1997; SIMÕES et al., 2007).

A quimiossistemática se baseia no levantamento de dados da literatura que permitem a

avaliação da produção metabólica do táxon estudado, seja este o gênero, a família, ordem,

entre outros. A partir destes dados é possível eleger marcadores quimiossistemáticos, devido,

não somente ao seu grande número de ocorrências, mas também pela sua elevada diversidade

estrutural (CASTILHO & KAPLAN, 2008b).

A escolha da planta a partir de informações do conhecimento popular pode conduzir a

descoberta de substâncias promissoras, principalmente quando se trabalha nas regiões

tropicais e subtropicais do planeta, que são ricas em diversidade botânica e química

(HOSTETTMANN et al., 2003).

Outro aspecto importante na escolha da planta é o conhecimento da flora da região a

ser pesquisada, ou seja, um levantamento prévio da vegetação existente na região. Assim é

possível descobrir quais espécies são predominantes e concentrar a escolha nos constituintes

químicos presentes nas mesmas (MATOS, 1997).

1.8.2 Levantamento das Referências Bibliográficas

O levantamento das referências bibliográficas é o ponto de partida de qualquer estudo,

por isso, é de extrema importância uma busca de informações que tenham sido publicadas

sobre o tema do trabalho a ser executado. No caso do estudo químico de plantas, a pesquisa

bibliográfica sobre seus constituintes é iniciada em geral pela consulta ao Chemical Abstracts

ou outras coletâneas de sumários de trabalhos publicados (MATOS, 1997).

Realizar uma pesquisa bibliográfica faz parte do cotidiano de todos os estudantes e

pesquisadores. É uma das tarefas que mais impulsionam o trabalho de aprendizado e

amadurecimento na área de estudo. Atualmente, as bibliotecas digitais têm facilitado e

simplificado muito essa tarefa, pois trazem recursos de busca e cruzamento de informações

que facilita a vida de todos. Uma iniciativa de extrema importância para a pesquisa no Brasil é

o Portal de Periódicos da CAPES que disponibiliza para membros de 268 instituições de

ensino superior e de pesquisa brasileiros o acesso a mais de treze mil revistas (nacionais e

internacionais) com resumos de documentos em todas as áreas do conhecimento. As bases de

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dados mais utilizadas são: Web of science, Scopus, Scifinder scholar, Medline/Pubmed,

Google acadêmico, Lilacs e Scielo (TRAINA & TRAINA Jr., 2009).

1.8.3 Coleta

As espécies vegetais apresentam alta variabilidade no que se refere à produção de

substâncias com atividade terapêutica. A produção metabólica pode variar dependendo do

órgão da planta, estágio de desenvolvimento, a época do ano e hora do dia e muitos outros

fatores que estão descritos na Figura 12 (MARTINS et al., 2000).

Figura 12 Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários (GOBBO-

NETO & LOPES, 2007).

A distribuição das substâncias numa planta pode ser bem irregular, pois alguns grupos

podem se localizar preferencialmente em partes específicas da planta. Portanto, há a

necessidade de se conhecer que parte deve ser coletada para estudo. Outro fator importante na

coleta é o estágio de desenvolvimento da planta, isso se deve à concentração máxima da

substância desejada ser atingida a partir de determinada idade ou fase de desenvolvimento. As

concentrações das substâncias podem variar durante o dia e/ou durante o ano. A Tabela 5

apresenta algumas recomendações de coleta, de forma a garantir uma melhor qualidade

(MARTINS et al., 2000), entretanto não representa uma regra a ser seguida.

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Tabela 5 Recomendações gerais de coleta para plantas expontâneas e plantas cultivadas

(MARTINS et al., 2000).

Parte a ser coletada Ponto de Coleta

Casca e entrecasca Quando a planta estiver florida

Flores No início da floração

Frutos e sementes Quando maduros

Raízes Quando a planta estiver adulta

Talos e folhas Antes do florescimento

A coleta deve ser realizada com o tempo seco. A coleta de plantas doentes, manchadas,

fora do padrão, com terra, poeira, órgãos deformados ou outros defeitos devem ser evitados

(MARTINS et al., 2000).

O material coletado pode ser utilizado fresco ou seco. O consumo de plantas

medicinais frescas nem sempre é possível, por isso, utiliza-se o processo de secagem do

material vegetal como um método de conservação. A secagem do material vegetal visa

impedir a ação enzimática e consequentemente deterioração. Após a secagem, geralmente,

ocorre a redução do peso do material coletado conforme descrito na Tabela 6 (MARTINS et

al., 2000).

Tabela 6 Uma forma geral de redução do peso em plantas medicinais submetidas à secagem

(MARTINS et al., 2000).

Órgão Vegetal Redução do Peso (%)

Folhas 20 - 75 Cascas 40 – 65

Lenho de árvores 30 – 70 Raízes 25 – 80

Flores em geral 15 – 80 Flor de camomila 66 Flor de borragem 90

A secagem pode ocorrer de forma lenta ao natural à sombra, em local ventilado,

protegido de poeira e do ataque de insetos e/ou outros animais, mas deve-se ter cuidado para

que o material vegetal não apresente fungos devido a secagem lenta. Outro método de

secagem é o artificial com o auxilio de estufas ou secadores, este método é mais rápido

podendo-se controlar a temperatura e umidade durante o processo, nesse caso deve-se

controlar adequadamente a temperatura para que as substâncias de interesse não degradem

(MARTINS et al., 2000).

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1.8.4 Identificação Botânica

A planta escolhida para estudo deve ser seguramente identificada antes mesmo de

iniciar o estudo químico. Segundo Matos (1997), o processo de identificar uma planta

significa reconhecer um determinado espécime integrante de um conjunto como sendo

semelhante a uma descrição existente, ou a outra planta já identificada em publicações e

coleções especializadas em taxonomia botânica. Assim sendo, o pesquisador depende de um

especialista para identificar a planta a ser estudada. Uma identificação errada ou a falta da

mesma pode anular todo o trabalho do pesquisador.

Antes da coleta, no entanto, faz-se necessário a obtenção das autorizações e licenças,

que podem variar dependendo do local onde se deseja coletar. Estas podem ser solicitadas

junto ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis

(IBAMA), Instituto Estadual do Meio Ambiente (INEA), Prefeituras, detre outros.

Para que ocorra a identificação é necessário coletar pequenos ramos de 20 a 30 cm

com folhas, flores e frutos. Esse material deve ser preparado adequadamente em forma de

exsicatas e depositados em herbário. Assim não se poderá por em dúvida a origem das

substâncias isoladas e identificadas pelo pesquisador (MATOS, 1997).

1.8.5 Prospecção Preliminar da Composição Química

Uma espécie vegetal apresenta múltiplos constituintes químicos, muitas vezes os

constituintes de interesse se apresentam em pequenas quantidades o que dificulta o seu

isolamento e purificação. Essas dificuldades podem ser minimizadas definindo objetivos

específicos para o estudo químico e aplicando-se técnicas de prospecção preliminar (MATOS,

1997).

O planejamento da prospecção preliminar deve atender a três princípios: a rapidez de

execução; a precisão dos resultados; e a amplitude de informações. O pesquisador vai avaliar

os seus objetivos e as condições de trabalho para definir os limites da influência destes

princípios. A cromatografia em camada fina (CCF) é uma técnica bastante utilizada para

estudo de espécies vegetais. O cromatógrafo com fase gasosa acoplado ao espectrofotômetro

de massa, por exemplo, é um equipamento que geralmente atende de forma satisfatória aos

princípios do planejamento da prospecção preliminar (MATOS, 1997). Outros equipamentos

também podem ser utilizados dependendo da natureza dos extratos que estão sendo avaliados.

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1.8.6 Extração

Antes de iniciar o processo de isolamento e purificação dos constituintes químicos das

plantas deve-se preparar um extrato bruto. Para isso é necessária a escolha adequada do

solvente e método de extração. Com uma extração que utilize solventes de baixa polaridade

obtêm-se substâncias mais lipofílicas e com solventes alcoólicos obtêm-se um amplo espectro

de material polar e apolar. Se for utilizado um solvente mais polar para o primeiro passo da

extração, os fracionamentos posteriores permitem uma divisão mais fina em frações de

distintas polaridades (HOSTETTMANN et al., 2003).

Depois da obtenção do extrato pode-se dar início aos métodos de partição entre

solventes que eliminam uma grande parte do material indesejável. Quando se utiliza esse

método combinado com testes biológicos pode-se obter, frações enriquecidas com o

componente desejado (HOSTETTMANN et al., 2003).

A Tabela 7 apresenta de uma forma geral processos de separação dos constituintes de

um extrato, a partir dos resultados obtidos no estudo preliminar em cromatografia de camada

fina (MATOS, 1997).

Tabela 7 Processo de separação dos constituintes de um extrato versus resolução obtida em

cromatografia em camada fina (MATOS, 1997).

Resolução em placa Processo de separação Resolução regular em placa, quantidade até 0,5g. Usar cromatografia em placa preparativa Ótima resolução em placa, 2-4 constituintes, quantidades entre 0,1 a 1,0 g.

Usar cromatografia de média pressão.

Boa resolução em placa, vários constituintes, quantidade maior que 0,5 g.

Usar cromatografia em coluna (de preferência com gradiente de eluição).

Má resolução em placa (o material não migra ou não separa).

Usar cromatografia em coluna filtrante de gel Sephadex apropriado (LH-20). Acetilar e/ou metilar o material e repetir o exame em cromatoplaca.

No isolamento de substâncias podem-se utilizar algumas técnicas cromatográficas

como (HOSTETTMANN et al., 2003):

• Cromatografia em camada fina;

• Cromatografia em coluna;

• Cromatografia líquida de alta eficiência;

• Cromatografia de partição;

Substâncias isoladas devem ser purificadas, geralmente por cromatografia em coluna

preenchida com gel de sílica, nos casos de difícil purificação deve-se empacotar a coluna com

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partículas menor ou igual a 10 µm para a purificação final. A Figura 13 mostra as etapas para

conseguir uma substância pura (HOSTETTMANN et al., 2003).

Figura 13 Esquema para purificação de substâncias isoladas de material vegetal

(HOSTETTMANN et al., 2003).

1.8.6.1 Métodos de Extração

Antes de iniciar um processo de extração deve-se definir a seletividade do solvente a

ser empregado no processo. Dependendo da finalidade a que se destina, pode-se obter um

extrato cuja composição contenha a maior parte das substâncias químicas da planta, ou um

extrato que apresente, apenas, substâncias com características semelhantes (SHARAPIN et al.,

2000).

Quando o material vegetal é colocado em contato com o solvente, ocorre a penetração

do mesmo na célula vegetal, expulsando o ar contido no citoplasma, começando o processo

extrativo. A penetração do solvente na célula induz um momento dipolar nas moléculas das

substâncias a serem extraídas. Assim as substâncias são associadas mais ou menos fortemente

às moléculas do solvente. A capacidade de associação pode ser expressa em termos de

constante dielétrica, que é uma função derivada das propriedades eletrônicas do solvente

(SHARAPIN et al., 2000).

A escolha do solvente para extração deve ser feita tendo-se em vista os objetivos do

estudo e os resultados da prospecção preliminar. O solvente escolhido deve ser o mais seletivo

possível. Por causa da seletividade podem-se extrair apenas as substâncias desejadas ou em

maior quantidade. Como a seletividade depende da polaridade, é necessário o conhecimento

do grau de polaridade do solvente que mais se aproxima do ótimo de seletividade para extrair

a substância desejada.

Quando não se conhece previamente o conteúdo do material a ser analisado, costuma-

se submeter a droga vegetal a sucessivas extrações, com solventes de polaridade crescente,

conseguindo-se assim, uma extração fracionada, em que as diferentes frações contêm

substâncias de polaridades também crescente. Na Tabela 8 estão descritos os solventes mais

utilizados e as substâncias que são extraídas (SIMÕES et al., 2007).

Separação

preparativa

Separação Semi-

preparativa

Separação

analítica

Substância

Pura

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Tabela 8 Solventes usados para extração X substâncias extraídas (SIMÕES et al., 2007).

Solvente Tipos de substâncias preferencialmente extraídas Éter de petróleo, n-Hexano Lipídios, ceras, pigmentos, furanocumarinas Tolueno, Diclorometano, Clorofórmio Bases livres de alcalóides, antraquinonas livres, óleos

voláteis. Acetato de etila, n-butanol Flavonóides, cumarinas simples Etanol, Metanol Heterosídeos em geral Misturas hidroalcoólicas, água Saponinas, taninos Água acidificada Sais de Alcalóides Água alcalinizada Saponinas

Além da seletividade do solvente, existem outros fatores que podem influenciar na

extração das substâncias desejáveis do material vegetal: características do material vegetal, o

seu grau de divisão e a metodologia de extração (SHARAPIN et al., 2000; SIMÕES et al.,

2007).

• Características do material vegetal: A estrutura histológica das diversas partes

componentes de uma planta é bastante heterogênea; existem órgãos, como algumas

raízes e caules, cujos tecidos estão extraordinariamente compactados, ao passo que em

folhas e flores os tecidos podem apresentar estruturas e tecidos mais delicados. O

poder de penetração dos solventes depende, entre outros fatores, da consistência dos

tecidos que formam o material a extrair (SIMÕES et al., 2007).

• Grau de divisão: O grau de divisão do material pode influenciar diretamente na

eficiência da extração. As características do material vegetal descritas anteriormente

apresentam influência direta. Para que ocorra a penetração adequada dos solventes em

cada tipo de órgão utilizado na extração é necessário considerar que quanto mais rígido

for o material menor deve ser a sua granulometria (SIMÕES et al., 2007).

• Tempo de extração: o tempo de extração varia em função: da rigidez dos

tecidos do material vegetal, do seu grau de divisão, da natureza da substância a extrair,

do solvente, e da utilização ou não de temperatura e/ou agitação (SIMÕES et al.,

2007).

• Temperatura: o aumento de temperatura na extração aumenta a solubilidade

das substâncias, mas o calor nem sempre pode ser empregado já que muitas

substâncias são instáveis em altas temperaturas (SIMÕES et al., 2007).

• Agitação: a agitação pode abreviar consideravelmente a duração do processo

extrativo (SIMÕES et al., 2007).

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Na escolha do método de extração deve-se avaliar alguns fatores importantes: a

eficiência do método, a estabilidade das substâncias extraídas e a disponibilidade dos

solventes e equipamentos a serem utilizados (SIMÕES et al., 2007).

1.8.6.1.1 Maceração

A maceração é um método de extração muito utilizado que consiste em colocar em

contato o material a ser extraído e o líquido extrator, em quantidades preestabelecidas, por um

período prolongado de horas ou dias consecutivo, em recipiente fechado, âmbar ou que não

permita contato com a luz, à temperatura ambiente (SHARAPIN et al., 2000)

Pela sua natureza, não conduz ao esgotamento da matéria-prima vegetal, seja devido à

saturação do líquido extrator ou ao estabelecimento de um equilíbrio difusional entre o meio

extrator e o interior da célula. Quando houver necessidade pode-se realizar a re-maceração,

que consiste na repetição da maceração utilizando o mesmo material vegetal, renovando-se

apenas o líquido extrator (SIMÕES et al., 2007).

Existem dois tipos de maceração: maceração estática e maceração dinâmica. A

diferença entre as duas é a agitação, na maceração estática é realizada somente uma vez ao dia

ou a cada troca de solvente, e na maceração dinâmica a agitação é constante durante todo o

processo de extração.

• Maceração Estática - consiste na operação na qual a extração da matéria-prima

vegetal é realizada em recipiente fechado, em temperatura ambiente, durante um

período prolongado (horas ou dias), com ou sem renovação do líquido extrator

(SIMÕES et al., 2007).

• Maceração Dinâmica – neste tipo de extração a planta deve ficar em contato

com o solvente em mesa agitadora (shaker) ou algum tipo de agitador mecânico.

Dessa forma, o solvente permanece em agitação durante o período de extração

(SIMÕES et al., 2007).

1.8.6.1.2 Percolação

Denomina-se percolação o processo de passar o solvente através de uma camada do

material a ser extraído, até o seu completo esgotamento. A percolação simples consiste no

processo em que ocorre uma extração exaustiva da droga sempre com o solvente renovado. O

material deve ser umedecido previamente com o liquido extrator por duas horas em recipiente

fechado (SHARAPIN et al., 2000).

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Em escala de bancada, a percolação é conduzida em extratores, denominados

percoladores, de corpo cilíndrico ou cônico, providos de torneira na parte inferior, para regular

o fluxo do solvente. A camada do material a ser extraído deve ser igual a cinco vezes o

diâmetro médio do equipamento (SHARAPIN et al., 2000).

1.8.6.1.3 Soxhlet

A extração em soxhlet é um método contínuo muito utilizado na extração de

substâncias orgânicas. As vantagens deste processo de extração são: uma extração contínua e

um volume reduzido de solvente e as desvantagens são: o solvente deve ser volátil, a

substância de interesse a ser extraída não pode ser volátil ou termolábil, pois o material

extraído permanece em contato com o solvente em ebulição durante todo o processo e, em

alguns casos, isto pode provocar degradações nos componentes extraídos (MELECCHI,

2005).

1.8.6.1.4 Ultrassom

A extração por ultrassom é um processo que utiliza a energia de ondas sonoras. Estas

ondas criam uma variação na pressão do líquido empregado no processo, gerando cavitações.

Cavitações consistem na formação espontânea de bolhas num líquido abaixo do seu ponto de

ebulição, resultante do esforço dinâmico (LIST & SCHMIDT, 1989).

A utilização de ondas ultra-sônicas de alta freqüência (20 a 100 kHz) causa mudanças

físicas e químicas permanentes por produzirem cavitações e microfluxos nos líquidos,

aquecimento e ruptura nos sólidos e instabilidade na interface de sistemas líquido-líquido e

líquido-gás (BARBOZA & SERRA, 1992; BERLAN & TIMOTHY, 1992).

A utilização do ultrassom pode ser dividida em duas principais áreas: alta potência e

baixa potência. Elevada freqüência, pequenas translocações, moderada velocidade e alta

aceleração são algumas características do ultrassom de alta potência. Na biologia a técnica de

ultrassom de alta potência é utilizada na homogeneização de células, esterilização, extração de

componentes em tecidos de plantas ou animais (BARBOZA & SERRA, 1992).

As ondas ultra-sônicas de baixa freqüência e baixa amplitude de propagação são

usadas em muitos campos da ciência, engenharia e medicina, para ensaios e diagnósticos

técnicos.

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Esta técnica é citada como sendo igual, ou melhor, do que a técnica de extração por

soxhlet, apresentando vantagens de alta reprodutibilidade, possibilitando a utilização em uma

ampla gama de tamanhos de amostra, rapidez de processamento e baixo custo (KOH, 1983;

SARGENI & VICHNEWSI, 2000).

Os principais efeitos do ultrassom, empregado como técnicas de extração são: aumento

da permeabilidade da parede celular; produção de cavitação; e aumento da tensão mecânica

das células (LIST & SCHMIDT, 1989).

Os efeitos do ultrassom no processo de extração dependem da freqüência e capacidade

do equipamento e do tempo empregado na extração. Alguns autores informam a ocorrência de

transformações químicas nos extratos, resultante da utilização de longos tempos de extração

(VINATORU, 2001; SCHINOR et al., 2004).

1.8.7 Determinação Estrutural

A determinação estrutural de uma substância pode ser feita através da interpretação de

vários espectros obtidos em aparelhagem específica, dentre estes se citam: espectrofotômetros

de absorção das radiações ultravioleta, visível e infravermelho, espectrômetro de ressonância

magnética protônica e de carbono 13 e espectrômetro de massas. As amostras destinadas à

obtenção de espectros devem atender, principalmente, a duas condições rotineiras (MATOS,

1997):

Pureza – o material deve ser o mais puro possível, avaliado através de ponto de fusão,

ressonância magnética nuclear, infravermelho, espectrometria de massas e avaliado o

comportamento por cromatografia em camada fina;

Umidade – a presença de água no material pode provocar alterações desvantajosas nos

espectros, por isso, é necessária a sua retirada por completo da amostra sempre que

possível. O aquecimento do material em estufa com temperatura de 5-10 ºC abaixo do

ponto de fusão da substância e depois deixar o material esfriar em dessecador a vácuo,

pode ser uma maneira de se conseguir retirar a água do material.

1.8.8 Ensaios Biológicos e Farmacológicos

No estudo de uma planta com atividade medicinal, o pesquisador não tem como

identificar todos os constituintes químicos devido ao número grande dos mesmos em uma

única espécie e na maioria das vezes somente uma ou algumas substâncias são responsáveis

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pela atividade terapêutica ou tóxica. Por outro lado, em alguns casos, a atividade terapêutica

pode ser resultado de uma atuação sinérgica de diversas substâncias. Segundo Hostettmann et

al., 2003, os principais alvos para testes biológicos e farmacológicos são:

• Organismos inferiores: microorganismos (bactérias, fungos, etc.);

• Invertebrados: insetos, crustáceos, moluscos;

• Sistemas sub-celulares isolados: enzimas, receptores;

• Culturas de células de origem animal ou vegetal;

• Órgãos isolados: vertebrados;

• Animais vivos.

Os ensaios de culturas de células são extremamente importantes na pesquisa de

anticancerígenos. A primeira etapa deste ensaio consiste na busca por substâncias citotóxicas

ou que inibem o crescimento de células tumorais de origem humana. Muitas substâncias

apresentam atividade in vitro para as células cancerosas isoladas, mas nem todas se tornam

medicamentos utilizáveis em quimioterapia. Isto ocorre, na maioria das vezes, devido a

toxidez destas substâncias para as células sadias ou por não atingirem o local de ação

(HOSTETTMANN et al., 2003).

Para a descoberta de novas substâncias antitumorais utiliza-se o isolamento guiado por

testes de citotoxidez em células KB (células do carcinoma da epiderme humana) e Vero

(células da epiderme de rim do macaco verde africano Cercopithecus aethiops), que são

bastante utilizados por conduzirem ao isolamento de uma série de acetogeninas citotóxicas

(HOSTETTMANN et al., 2003).

A última etapa de ensaios farmacológicos ocorre em animais vivos, onde realmente

poderá ser testada a atividade biológica do medicamento. Neste ensaio poderão ser observados

efeitos secundários e eventual toxidez (HOSTETTMANN et al., 2003).

1.2 Metodologias Analíticas

1.2.1.Cromatografia

A cromatografia é um método físico-químico de separação que se fundamenta na

migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interações entre

duas fases imiscíveis: fase móvel (gás, líquido ou fluído supercrítico) e a fase estacionária

(fixa, colocada em uma coluna ou numa superfície sólida) (DEGANI et al., 1998).

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1.2.1.1 Cromatografia em Coluna

A metodologia de cromatografia em coluna aberta é muito utilizada devido à

simplicidade de operação (HOSTETTMANN et al., 2003). É uma técnica bastante utilizada

para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas. As fases

estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir

simplesmente como suporte para uma fase estacionária liquida. Fases estacionárias sólidas

levam a separação por adsorção e fases estacionárias liquidas por partição. Estes suportes são

acondicionados em tubos cilíndricos geralmente de vidro, de diâmetros variados, os quais

possuem uma torneira em sua extremidade inferior (DEGANI et al., 1998).

A cromatografia em coluna aberta apresenta algumas limitações como:

• Separações lentas;

• Adsorção irreversível de algumas substâncias;

• Incompatibilidade com partículas de granulometria pequena.

Surgiram algumas técnicas alternativas de cromatografia preparativa, com o objetivo

de superar estas desvantagens: cromatografia “flash”, a cromatografia em coluna seca e a

cromatografia líquida a vácuo (HOSTETTMANN et al., 2003).

Os adsorventes possuem partículas na faixa de 60-230 mesh, de modo a possibilitar um

fluxo razoável do solvente através da coluna. O uso de sílica de partícula menor (230-400

mesh) como adsorvente para essas colunas requer a utilização de um sistema de bombeamento

para o empacotamento e eluição, sendo conhecido como cromatografia “flash” (DEGANI et

al., 1998).

A cromatografia “flash” é muito utilizada entre os pesquisadores para problemas de

separação simples e por serem muito fáceis de realizar, utilizando-se material de laboratório

barato e de fácil acesso (HOSTETTMANN et al., 2003). Na cromatografia “flash” é aplicado

uma pressão de ar e as colunas são mais curtas do que a coluna aberta convencional, tornando

o processo de separação mais rápido (STILL et al., 1978). Na Figura 14, pode-se observar a

diferença entre a cromatografia em coluna aberta e a cromatografia em coluna “flash”. Na

Tabela 9 estão descritas variações de tamanho de partícula gel de sílica, vazão do eluente e

tamanho da amostra (STILL et al., 1978).

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Figura 14 Representação de cromatografia: (a) em coluna aberta (DEGANI et al., 1998); (b)

cromatografia “flash” (HOSTETTMANN et al., 2003).

Tabela 9 Tamanhos e capacidades das separações das colunas “flash” (STILL et al., 1978).

Diâmetro da coluna (mm)

Volume de eluente (mL)

Amostra: __Carregamento típico (mg)__

∆ Rf ≥ 0,2 ∆ Rf ≥ 0,1

Tamanho típico da fração (mL)

10 100 100 40 5 20 200 400 160 10 30 400 900 360 20 40 600 1600 600 30 50 1000 2500 1000 50

1.2.1.2 Cromatografia Gasosa (CG)

A cromatografia com fase gasosa é uma das técnicas analíticas mais utilizadas. Como

uma ferramenta analítica, a cromatografia gasosa pode ser usada para análise de amostras

gasosas, líquidas e sólidas voláteis. Se a amostra a ser analisada não é volátil ou estável

termicamente, podem-se utilizar técnicas de derivatização ou pirólise. Além de possuir alto

poder de resolução, é muito atrativa devido à possibilidade de detecção em escala de nano a

picogramas (10-9 a 10-12 g) (DEGANI et al., 1998; GROB & BARRY, 2004).

Os gases utilizados como fase móvel devem ter alta pureza e ser inerte em relação à

fase estacionária, os mais utilizados são hidrogênio, nitrogênio e hélio. A injeção da amostra é

feita através de microseringas ou válvulas. As colunas são tubos longos de metais como aço

ou cobre, vidro ou teflon com diâmetro de 0,15-3 mm e comprimento em torno de 3-100 m.

Os detectores de maior aplicação são o Detector por Ionização em Chama (DIC) e o Detector

de Condutividade Térmica (DCT). Muito utilizado também são os Cromatógrafos acoplados a

(a) (b)

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Espectrômetros de Massa (CG-EM). Os dados podem ser obtidos através de um registrador

potenciométrico, um integrador ou um microcomputador (DEGANI et al., 1998).

1.2.1.3 Cromatografia em Camada Fina

A cromatografia em camada fina é uma técnica de adsorção líquido-sólido. Neste caso,

a separação dos componentes da mistura ocorre em função da migração diferencial sobre uma

camada fina de adsorvente, fixo numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um

líquido ou misturas de líquidos) (DEGANI et al., 1998).

Por ser um método simples, rápido, visual e econômico, é uma técnica bastante usada

para acompanhamento de reações orgânicas, purificação de substâncias e para identificação de

frações coletadas em cromatografia líquida clássica (DEGANI et al., 1998).

O parâmetro mais importante a ser considerado na cromatografia em camada fina é o

fator de retenção (Rf), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão

e a distância percorrida pela fase móvel. Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6. As

amostras a serem analisadas devem ser aplicadas a aproximadamente 1 cm da base inferior da

placa, com a ajuda de um capilar. Após a aplicação da(s) amostra(s) sobre a placa, a mesma

deve ser introduzida numa cuba contendo a fase móvel adequada (DEGANI et al., 1998).

A escolha da fase móvel, que geralmente é constituída por um ou mais solventes, não é

tarefa simples. No entanto, uma vez que as fases estacionárias mais usadas são extremamente

polares, não devem ser utilizados solventes pouco polares, que não removeriam as substâncias

do ponto de aplicação, nem solventes muito polares, capazes de arrastar os componentes da

amostra até o topo da placa. Em vista disso, melhores resultados são obtidos com misturas de

solventes, de modo a se obter uma polaridade média em relação à polaridade dos componentes

da amostra (DEGANI et al., 1998).

A revelação das placas de cromatografia em camada fina pode ser feita por meio de luz

UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico, tiocianoferrato de potássio, fluorescências,

radioatividade, dentre outras (DEGANI et al., 1998).

1.2.1.4 Cromatografia de Camada Fina em Alta Eficiência (CCFAE / Densitometria)

Esta é uma técnica avançada da cromatografia em camada fina, onde foi feita uma

série de melhorias para automatizar as diferentes etapas do processo, aumentando assim a

resolução e permitindo medições quantitativas mais precisas. A automação é útil para superar

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a incerteza no tamanho das gotas e a posição quando a amostra é aplicada sobre a placa com o

auxílio somente de um capilar (REICH & SCHIBLI, 2006).

A cromatografia em camada fina de alta eficiência é uma técnica bastante utilizada

para estabelecer a identidade, pureza, qualidade e estabilidade de matérias-primas, extratos

vegetais e produtos acabados (MUKHEJEE et al., 2010).

Na identificação química de uma amostra botânica uma impressão digital pode ser

gerada. O extrato é obtido e em seguida cromatografado, apresentando uma seqüência de

sinais ou zonas que representam os componentes conhecidos ou desconhecidos da amostra

(REICH & SCHIBLI, 2006).

1.2.2 Validação de Metodologias Analíticas O termo validar, em análise química, significa estar com o objetivo voltado à

confiabilidade analítica do método escolhido ou desenvolvido para se obter resultado (LEITE,

1996).

O objetivo de uma validação é demonstrar que o método é apropriado para a finalidade

pretendida, o que é um fator de importância fundamental, visto que tais métodos são

normalmente utilizados em laboratórios de análise para a determinação qualitativa, semi-

quantitativa e/ou quantitativa de fármacos, produtos acabados, matérias-primas e amostras

biológicas em todas as fases de desenvolvimento do fármaco desde a pesquisa até o controle

de qualidade (SWARTZ & KRULL, 1998; BRASIL, 2003a).

Os parâmetros de validação de métodos analíticos envolvem (BRITO et al., 2003,

BRASIL, 2003a):

• Especificidade/Seletividade;

• Função de resposta (gráfico analítico);

• Intervalo de Trabalho;

• Linearidade;

• Exatidão;

• Precisão (repetitividade, precisão intermediária e reprodutividade);

• Limite de detecção (Sensibilidade);

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• Limite de Quantificação;

• Robustez;

Todos os equipamentos utilizados na validação devem estar devidamente calibrados e

os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados (BRASIL, 2003a).

As Tabelas 10 e 11 mostram a classificação dos testes e os ensaios necessários para

validação dos métodos analíticos.

Tabela 10 Classificação dos testes para validação de métodos analíticos, segundo sua

finalidade (BRASIL, 2003a).

Categoria Finalidade do teste

I Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias–primas.

II Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas.

III Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo).

IV Testes de identificação.

Tabela 11 Ensaios necessários para validação do método analítico, segundo sua finalidade

(BRASIL, 2003a).

Categoria II Parâmetro Categoria I

Quantitativo Ensaio Limite

Categoria III Categoria IV

Especificidade Sim Sim Sim * Sim

Linearidade Sim Sim Não * Não

Intervalo Sim Sim * * Não

Repetibilidade Sim Sim Não Sim Não

Precisão Intermediária ** ** Não ** Não

Limite de detecção Não Não Sim * Não

Limite de quantificação Não Sim Não * Não

Exatidão Sim Sim * * Não

Robustez Sim Sim Sim Não Não

*Pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico.

**Se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária a comprovação da Precisão Intermediária.

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1.2.2.1 Especificidade/Seletividade

Este parâmetro define a capacidade do método em detectar a substância de interesse na

presença de outros componentes da matriz (BRITO et al., 2003, BRASIL, 2003a). Em outras

palavras, seria a capacidade de avaliar de forma inequívoca a substância em questão, sem que

a presença de uma mistura complexa interfira na sua determinação. Na área farmacêutica essa

mistura complexa pode ser: excipientes, impurezas, produtos de degradação e componentes da

matriz (SWARTZ & KRULL, 1998).

Existem algumas ferramentas usadas para demonstrar a especificidade do método, por

exemplo, a adição de padrão analítico, muito empregado em análises de espectrometria de

absorção atômica, ou a comparação com padrão externo (BRITO et al., 2003). Em métodos

cromatográficos, podem-se utilizar testes de pureza de pico, por exemplo, com auxilio de

detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas, para demonstrar que o sinal

cromatográfico é atribuído a um só componente (BRASIL, 2003a).

1.2.2.2 Função de Resposta

O gráfico analítico deve apresentar os dados estatísticos de intersecção, da equação da

regressão linear, o coeficiente de correlação ou de determinação e a concentração estimada

das soluções padrão. Por isso, é necessário o uso de número suficiente de soluções padrão para

definir adequadamente a relação entre a concentração e a resposta. O gráfico deve ser

construído com no mínimo cinco valores de concentração (BRITO et al., 2003).

Espera-se que o gráfico de calibração apresente a resposta instrumental linearmente

relacionada com a concentração do padrão. A linearidade do gráfico é satisfatória quando o

coeficiente de correlação da reta obtida não é estatisticamente diferente da unidade. No caso,

considera-se que (BRITO et al., 2003):

R = 1 Correlação perfeita

0,91 < R < 0,99 Correlação fortíssima

0,61 < R < 0,91 Correlação forte

0,31 < R < 0,60 Correlação média

0,01 < R < 0,30 Correlação fraca

R = zero Correlação nula

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Apesar de o objetivo ser sempre obter uma relação linear entre a propriedade a ser

medida e a concentração ou a quantidade do analito, pode-se também admitir a relação não-

linear (por exemplo, nas análises eletroquímicas, utilizando eletrodos de íon seletivo ou

biossensores) (BRITO et al., 2003).

1.2.2.3 Intervalo de Trabalho

O intervalo de trabalho do método analítico corresponde à faixa do maior ao menor

nível que possa ser determinado com precisão e exatidão, usando a linearidade do método

(BRITO et al., 2003).

1.2.2.4 Linearidade

A linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar que os

resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra. No

mínimo cinco concentrações diferentes devem ser usadas para determinar a linearidade da

análise. Após exame visual do gráfico, se houver relação linear aparente, os resultados dos

testes deverão ser tratados por métodos estatísticos apropriados para determinação do

coeficiente de correlação, intersecção com o eixo Y, coeficiente angular, soma dos quadrados

mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo. Se não houver relação linear, realizar

transformação matemática. O critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve

ser de 0,99 (BRASIL, 2003a).

1.2.2.5 Exatidão

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo

método em estudo em relação ao valor verdadeiro (BRASIL, 2003a).

1.2.2.6 Precisão

Corresponde a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de

medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. A precisão é considerada em

três níveis: Repetibilidade; Precisão intermediária e Reprodutibilidade (BRASIL, 2003a).

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36

Repetibilidade

É considerada a precisão intra-corrida, ou seja, a concordância entre os resultados

dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e a mesma instrumentação

(BRASIL, 2003a).

Precisão intermediária

É considerada a precisão inter-corridas, ou seja, a concordância entre os resultados do

mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou

equipamentos diferentes (BRASIL, 2003a).

Reprodutibilidade

É considerada a precisão inter-laboratorial, ou seja, a concordância entre os resultados

obtidos em laboratórios diferentes (BRASIL, 2003a).

1.2.2.7 Limite de Detecção (Sensibilidade)

O limite de detecção é considerado a menor quantidade do analito presente em uma

amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições

experimentais estabelecidas (BRASIL, 2003a).

1.2.2.8 Limite de Quantificação

O limite de quantificação é considerado a menor quantidade do analito em uma

amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições

experimentais estabelecidas (BRASIL, 2003a).

1.2.2.9 Robustez

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a

pequenas variações dos parâmetros analíticos.

Pode-se destacar algumas variações de importância para este estudo:

• Preparo de amostras: estabilidade das soluções analíticas e tempo de extração;

• Cromatografia gasosa, diferentes lotes ou fabricantes de colunas, temperatura e

velocidade do gás de arraste (BRASIL, 2003a).

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37

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivos Gerais

O presente estudo tem como objetivo principal a padronização de extratos de Eugenia

florida DC e seu estudo farmacológico, visando o desenvolvimento de um quimioterápico de

origem vegetal.

2.2 Objetivos Específicos

- Desenvolvimento da metodologia para a obtenção do extrato das folhas de Eugenia

florida;

- Desenvolvimento da metodologia de isolamento, purificação e identificação do ácido

betulínico a partir do extrato das folhas de Eugenia florida;

- Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para a quantificação do ácido

betulínico por CG-DIC e Densitometria.

- Obtenção de extratos vegetais a partir de outras fontes vegetais,

- Estudo da variação sazonal dos extratos das folhas de Eugenia florida;

- Avaliação da atividade farmacológica dos extratos obtidos das folhas de E. florida e

de outras fontes vegetais frente às células tumorais, através de ensaios “in vitro” , dos

extratos e do ácido betulínico isolado;

- Avaliação toxicológica dos extratos obtidos das folhas de E. florida e de outras fontes

vegetais e do ácido betulínico.

3 JUSTIFICATIVA

Apesar de vários fármacos serem estudados e utilizados na terapia anticâncer, uma

grande parte destes não pode ser administrada em vários casos em decorrência dos efeitos

colaterais que apresentam.

Em trabalhos prévios realizados por Freire (2009) foi possível observar que o ácido

betulínico, isolado a partir Eugenia florida (Myrtaceae) e seus derivados, apresentaram

atividades farmacológicas “in vitro” avaliadas em linhagens celulares tumorais como

B16F10, Melan-A, MCF7 e Ma104, revelando-se um excelente agente antitumoral.

Substâncias utilizadas atualmente na terapia de câncer, como: taxol, camptotecina,

elipticina, vimblastina, vincristina, entre outras, são muito tóxicas e apresentam efeitos

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adversos. Não existe descrição na literatura de efeitos colaterais sistêmicos associados ao

ácido betulínico. Atualmente a terapia anticâncer de inibidores de topoisomerase custa ao

paciente de R$ 685,00 a 1325,00 (dose e/ou mensal). Acredita-se que o custo da terapia com

ácido betulínico tenha um custo mais reduzido, principalmente se esta terapia for baseada a

partir da fabricação de um fitoterápico em um laboratório oficial.

Resultados in vitro associados a sua afinidade por linhagens melanomas, a abundância

do material vegetal renovável e custo relativamente baixo, motivaram este trabalho de

pesquisa com o propósito de padronizar o método de extração das folhas de Eugenia florida a

serem utilizadas no desenvolvimento de um fitoterápico ou fitofármaco para o tratamento do

câncer. O desenvolvimento deste quimioterápico terá continuidade no doutorado onde serão

realizados estudos in vivo, desenvolvimento farmacotécnico e estabilidade do medicamento de

origem vegetal.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Solventes e reagentes

Os solventes utilizados foram acetato de etila, clorofórmio, etanol, n-hexano 95% e

metanol (Tedia).

O padrão utilizado foi o ácido betulínico 90% (Sigma Aldrich).

Como derivatizante para as análises de CCF, utilizou-se a vanilina do tipo puríssima;

Metanol grau CLAE e Ácido Sulfúrico (VETEC),

Para preparo do diazometano foi utilizado o Diazald (Sigma Aldrich), éter etílico,

álcool etílico e hidróxido de sódio (VETEC).

Todos os reagentes e solventes utilizados estavam dentro do prazo de validade.

4.2 Equipamentos

- Estufa Elétrica Nova Ética LBC 420/7 de 770 litros;

- Liquidificador FAET Liquifácil II;

- Moinho de Facas Marconi MA 680;

- Moinho de Bolas Marconi MA 021;

- Triturador Nogueira DPM de Martelos;

- Manta de Aquecimento WEA MA-1/500;

- Agitador (Shaker) IKA KS 501 digital

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- Percolador de Aço Inox

- Evaporador rotatório Buchi R-114 com banho Buchi B-480 com faixa de temperatura

de 20-180ºC;

- Balança Analítica Sartorius CP 225 D

- Balança Eletrônica Gehaka BG 2000

- Banho de Ultrassom Bransonic 5510R-DTH;

- Banho de Ultrassom Sanders Modelo Soniclean 2PS

- Espectrofotômetro de Infravermelho Magma IR-760-Nicolet;

- Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear BRUCKER-300 MHz (FT);

- Ponto de Fusão MEL-TEMPII;

- Cromatógrafo com fase Gasosa com Detector de Ionização em Chama AGILENT

6890N, com injetor do tipo Split/Splitless;

- Cromatógrafo com fase Gasosa AGILENT 6890N acoplado ao Espectrofotômetro de

Massas 5973N

- Aplicador Automático ATS4 CAMAG;

- Scanner CCF III CAMAG;

- CCF visualizer acoplado a uma câmera DXA 252;

- Placa de Aquecimento CAMAG.

4.3 Vidrarias

Todas as vidrarias utilizadas neste trabalho encontravam-se em conformidade com as

normas NBR 13073/2003 e ASTM E 542-01/2007 de limpeza, secagem e calibração de

vidraria volumétrica.

4.4 Coleta e Processamento do Material Vegetal

Para a realização das coletas, foram solicitadas previamente as autorizações junto às

Instutuições onde as coletas seriam realizadas, no caso, Fundação Oswaldo Cruz, Instituto de

Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro (JBRJ) e Embaixada de Portugal.

Folhas adultas e aparentemente sadias de Eugenia florida DC foram coletadas de

indivíduos espontâneos no Campus da Fundação Oswaldo Cruz – Manguinhos/RJ durante o

período de Agosto de 2010 a Julho de 2011 para o estudo. Foram coletadas, mensalmente de

um único indivíduo, estabelecendo o mesmo período de cada mês e o mesmo horário do dia.

Após a coleta as folhas foram acondicionadas em sacos plásticos limpos e identificadas, e

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encaminhadas para seleção no laboratório. A seleção teve como objetivo excluir as folhas

afetadas por doenças, parasitas, ou qualquer outra alteração que pudesse intervir na sua

integridade, adulterando seu aspecto físico.

Após a seleção do material, o mesmo foi pesado e submetido à secagem em estufa

elétrica à 40 °C, com circulação de ar, para retirada da água e, com isso, impedir reações de

hidrólise e/ou crescimento microbiano. A secagem das folhas ocorreu até 15 dias, obtendo

peso constante e umidade de 7 %. A Tabela 12 apresenta os períodos de coleta para o estudo

da variação de produção metabólica.

Tabela 12 Coleta de Eugenia florida DC para o estudo de variação Sazonal.

Data Horário T. ambiente

(ºC)

T. do

solo (ºC)

UR

(%)

Quant. de

folhas frescas

(g)

Quant. de

folhas secas (g)

Período de

secagem

(dias)

24/08/2010 13:30 29 26 51 351,78 172,00 10

23/09/2010 13:40 34 26 37 889,69 468,98 11

25/10/2010 14:00 29 25 60 168,98 59,49 14

22/11/2010 13:30 27 24 74 105,70 66,63 15

17/12/2010 14:00 33 27 36 320,00 136,76 10

26/01/2011 13:00 21 28 52 499,47 232,55 09

25/02/2011 12:15 29 29 70 322,50 257,08 14

25/03/2011 12:30 29 28 42 450,00 209,30 11

29/04/2011 14:00 28 24 69 640,75 279,45 11

30/05/2011 13:00 19 22 73 640,00 259,00 14

30/06/2011 15 00 25 23 61 97,85 37,39 12

22/07/2011 13:35 29 26 68 576,45 206,70 13

As folhas secas foram moídas em liquidificador, para a redução mecânica do material

vegetal a fragmentos de pequenas dimensões, o que aumenta a área de contato facilitando o

processo de extração. Depois foram armazenadas em potes plásticos opacos e fechadas,

limpos e identificados, para que o material vegetal ficasse armazenado ao abrigo de luz e

umidade até o processo de extração.

Para o desenvolvimento da metodologia de extração, isolamento, quantificação e

purificação foram coletados, deste mesmo indivíduo, um lote único de folhas de 1800 g.

Outros indivíduos de Eugenia florida foram coletados no campus da Fiocruz e no

Jardim Botânico do Rio de Janeiro e outras espécies também foram coletadas, a Dillenia

indica nos jardins da Embaixada de Portugal em Botafogo, a Licania tomentosa no campus da

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Colônia Juliano Moreira em Jacarepaguá e a Nelumbo nucifera no Jardim Botânico do Rio de

Janeiro, contando com a colaboração do botânico Sérgio Monteiro, colaborador de

Farmanguinhos/Fiocruz. As espécies foram coletadas e exsicatas foram encaminhadas para

depósito no Herbário do Jardim Botânico RJ e Herbário Farmácias Verdes de

Farmanguinhos/Fiocruz. Foram solicitadas coletas de aproximadamente 600 g de material

vegetal para cada espécie. A seleção das outras espécies foi feita a partir do levantamento na

literatura de espécies com ácido betulínico na sua composição e disponibilidade para coleta no

Rio de Janeiro. As Tabelas 13 e 14 apresentam os outros indivíduos e espécies usadas neste

trabalho.

Tabela 13 Dados referentes à coleta de outros indivíduos de Eugenia florida DC para estudo

comparativo.

Local de

Coleta

Data Horário T. ambiente

(ºC)

T. do solo

(ºC)

UR (%) Quant. de

folhas

frescas (g)

Quant. de

folhas secas

(g)

Período de

secagem

(dias)

Fiocruz 25/10/2010 14:30 29 24 60 164,87 59,70 14

Jardim

Botânico RJ

24/05/2011 9:00 25 19 59 1.122,00 651,80 15

Tabela 14 Dados referentes à coleta de outras espécies que contém ácido betulínico para

estudo comparativo.

Espécie Local de Coleta

Data Horário T. ambiente

(ºC)

T. do solo (ºC)

UR (%)

Quant. planta fresca

(g)

Período de secagem (dias)

Quant. planta seca (g)

Dillenia indica L. (frutos verdes)

Embaixada de Portugal

25/08/2010 14:30 31,5 27 39 Frutos: 8.697,3 Casca: 7.343,1 Polpa: 1.354,2

Casca – 17 Polpa - 23

Casca – 831,7 Polpa – 193,7

Dillenia indica L. (frutos maduros)

Embaixada de Portugal

05/10/2010 11:30 23 19 73 Frutos: 7.343,0 Casca: 5.874,4 Polpa: 1.468,6

Casca – 19 Polpa - 24

Casca – 646,2 Polpa – 205,6

Licania tomentosa (Benth) Fritsch (frutos

maduros)

Colônia Juliano Moreira

21/03/2011 13:00 29 20 62 990,28 (sem sementes)

* *

Licania tomentosa (Benth) Fritsch (folhas)

Colônia Juliano Moreira

08/06/2011 11:30 22 19 77 1000,00 15 564,9

Nelumbo nucifera (Gaertn) (Raiz)

Jardim Botânico RJ

06/09/2011 9:00 20 ** 67 12,91 24 9,90

Nelumbo nucifera (Gaertn) (Rizoma)

Jardim Botânico RJ

06/09/2011 9:00 20 ** 67 13,35 24 12,80

*Foram utilizados os frutos frescos para extração. ** Planta aquática.

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Para as outras espécies o período de secagem utilizado variou conforme a necessidade

de cada órgão atingir o peso constante e umidade de 7 % (frutos, folhas, raiz e caule

subterrâneo).

Nelumbo nucifera, segundo metodologia descrita por Mukherjee et al., 2010, deveria

ser seca a sombra em temperatura ambiente, mas para evitar o aparecimento de fungos,

utilizou-se uma sala climatizada de 30 a 35 ºC com dois desumidificadores. Após secagem as

partes foram moídas separadamente em Moinho de Facas com malha 0,85 mm.

Os frutos de Dillenia indica foram secos em estufa elétrica, com circulação de ar a 40

ºC. Na moagem das cascas de Dillenia indica utilizou-se o Moinho de Facas com malha 0,85

mm e para a polpa foi necessário utilizar o Triturador de Martelos com malha 5,0mm e após

trituração o material foi moído no Moinho de Facas com malha 0,85 mm.

As folhas de Licania tomentosa foram secas em estufa elétrica, com circulação de ar a

40 ºC e trituradas em liquidificador e os frutos foram picados e utilizados frescos.

4.5 Identificação Botânica

Exemplares férteis do indivíduo Eugenia florida DC., que foi utilizado para o estudo

de variação metabólica, foram coletados e herborizados para identificação taxonômica e

depositados no herbário indexado e fiel depositário Herbário do Jardim Botânico do Rio de

Janeiro, sob o registro RB328.061.

Outros indivíduos de Eugenia florida DC., que foram utilizadas neste trabalho de

pesquisa, foram depositados no Herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, bem como no

Herbário Farmácias Verdes de Farmanguinhos, Fiocruz. Os números de registro e as

coordenadas estão descritos na Tabela 15, bem como as outras espécies que foram utilizadas.

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Tabela 15 Espécies utilizadas na pesquisa desta dissertação, registros e localização.

Coordenadas Espécie Nº. Registro no Herbário do

Jardim Botânico

Nº. Registro no Herbário Farmácias

Verdes de Farmanguinhos/Fiocruz

S W Altitude

Eugenia florida

DC. (coletado na

Fiocruz e usado

para estudo sazonal

e lote único)

RB-328.061 - 22°52´38.13” 43°14´47.45” 21 msm

Eugenia florida

DC. (coletado na

Fiocruz e usado

para comparação na

produção de ácido

betulínico)

RB-441.443 FFAR-229 22°52´38.50” 43°14´46.14” 21 msm

Eugenia florida

DC. (coletado no

Jardom Botânico e

usado para

comparação na

produção de ácido

betulínico)

RB-336.681 FFAR-443 22º58’02.45” 43º13’24.67” 16 msm

Dillenia indica L. RB-504.027 FFAR-425 22°57´05.17” 43°11´43.38” 22 msm

Licania tomentosa

(Benth) Fritsch

RB-511.135 FFAR-437 22°56´10.59” 43°23´55.40 24 msm

Nelumbo nucifera

(Gaertn)

RBv-6300 - 22°58´07.03” 43°13´18.51 13 msm

4.6 Estudo Comparativo dos Métodos de Extração

Visando a produção do extrato em escala industrial das folhas de Eugenia florida, bem

como a natureza do material vegetal foi escolhida alguns métodos para o estudo de

padronização do extrato de Eugenia florida: maceração estática, maceração dinâmica,

percolação simples, extração por soxhlet e ultrassom. Tentou-se utilizar a mesma proporção

de material botânico e de solvente para todos os métodos extrativos estudados, mas cada

método exigiu quantidades de solventes e materiais vegetais específicos que correspondem ao

equipamento utilizado, portanto, em alguns métodos ocorreram variações nas proporções.

Todos os extratos obtidos foram concentrados em evaporador rotatório.

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4.6.1 Escolha do(s) Solvente(s)

Esta etapa do processo serviu para definir o solvente que apresentaria maior poder

seletivo de extração do ácido betulínico. Os parâmetros que foram utilizados na seleção do

solvente foram: a) polaridade; b) toxidez; c) rendimento.

Na escolha dos solventes para obtenção do ácido betulínico, também foram

considerados os dados descritos na literatura (Tabela 4).

Após avaliar os parâmetros e a literatura, foram escolhidos os seguintes solventes para

extração: etanol, metanol, acetato de etila, clorofórmio, n-hexano. Estes solventes foram

testados em diversos métodos de extração e os extratos obtidos foram concentrados e

submetidos à análise de teor do ácido betulínico por CG-DIC e por CCF/Densitometria.

4.6.2 Extração por Maceração Estática

Para a maceração estática 10g do material vegetal seco e triturado, foram colocados em

erlenmeyers de 250 mL tendo sido adicionado 100 mL de cada solvente. Os frascos foram

tampados e vedados com veda-junta. A extração ocorreu por 72 horas em temperatura

ambiente. Ao término deste período observou-se que a matéria-prima vegetal não havia

atingido o seu esgotamento, por isso, a renovação do líquido extrator foi realizada por três

vezes, a cada 72 horas, para garantir um melhor esgotamento do material vegetal. Ao término

de cada período de extração, o extrato foi filtrado e levado à concentração sob pressão

reduzida.

4.6.3 Extração por Maceração Dinâmica

Para a maceração dinâmica 10g do material vegetal seco e triturado foram colocados,

juntamente com 100 mL de cada solvente, em erlenmeyers de 250 mL com tampa e vedados

com veda-junta. Neste tipo de extração a planta ficou em contato com o solvente em mesa

agitadora (shaker) por 72 horas, sendo 8 horas/dia sob agitação com o shaker ligado e 16

horas/dia desligado, isso ocorreu devido ao equipamento permanecer ligado somente durante

o horário de expediente de trabalho. Da mesma forma que na maceração estática, a renovação

do solvente foi realizada por três vezes, a cada 72 horas, para esgotamento da matéria-prima

vegetal. Ao término, o extrato foi filtrado e levado à concentração sob pressão reduzida.

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4.6.4 Extração por Percolação

Essa extração iniciou-se com o intumescimento prévio do material vegetal com o

liquido extrator, durante 1 a 2 horas, fora do percolador, de forma que as forças de expansão

resultantes não viessem a afetar a estrutura deste. Após o intumescimento seguiu-se a fase

mais crítica, que é o empacotamento homogêneo e não muito compacto do percolador. A

altura do enchimento foi calculada em 5:1 em relação ao diâmetro médio do recipiente (8 cm),

o que correspondeu a 40 g de planta triturada. A velocidade de fluxo foi moderada (1 a 2

mL/min) durante 3 horas de extração, utilizando sempre solventes novos, mantendo um nível

de cerca de 1cm acima do disco perfurado do percolador. A quantidade total de cada solvente

utilizada na percolação foi de 600 mL. Ao término do processo, o resíduo de planta foi

prensado, retirando todo o solvente e levado à concentração sob pressão reduzida.

4.6.5 Extração por Soxhlet

Na extração por soxhlet foi pesado 32 g do material vegetal seco e triturado e colocado

em aparelho soxhlet juntamente com 300 mL do solvente. Este método de extração foi

realizado até que o solvente ficasse límpido indicando que todo material foi extraído, o que

durou dois dias com 8 horas diárias de refluxo. Ao término da extração, o extrato foi levado à

concentração sob pressão reduzida.

4.6.6 Extração por Ultrassom

Empregou-se um equipamento de ultrassom modelo Bransonic, potência de 135 W

com uma freqüência de 42 KHz e com uma intensidade de radiação de 0,19 W/cm2. As

dimensões do banho foram de 29,2 cm x 24,13 cm x 15,2 cm. A água do banho do

equipamento foi mantida por 25 ºC, para evitar que a mesma tivesse influência no processo.

Neste experimento, pesou-se cerca de 4 g do material vegetal seco e triturado num

tubo de centrífuga (Falcon) e adicionou-se 40 mL do solvente. Após tampar, o tubo, foi

colocado no ultrassom. Avaliou-se o rendimento de extração em três tempos 10, 20 e 30

minutos.

Ao término de cada extração, o extrato foi filtrado e levado à concentração sob pressão

reduzida.

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4.7 Avaliação de diferentes Granulometrias

O ensaio com diferentes granulometrias do mesmo material vegetal foi realizado para

avaliar o efeito de diferentes tamanhos de partícula na extração. Para obter os diferentes

tamanhos de partícula foram utilizados os moinhos descritos na Tabela 16.

Tabela 16 Material usado para obter diferentes granulometrias das folhas de E. florida.

Nº malha Equipamento

utilizado

Quantidade de

planta seca

Quantidade de

planta moída

Tempo de

moagem

Pulverizada Moinho de

Bolas

100 g 96,95 g 3 minutos

0,5 mm Moinho de

Facas

100 g 99,30 g 18 minutos

0,85 mm Moinho de

Facas

100 g 98,05 17 minutos

1,7 mm Moinho de

Facas

100 g 98,05 gg 17 minutos

A técnica escolhida para esta avaliação foi extração por ultrassom com o tempo de 20

minutos, por ser uma técnica rápida e eficiente. Os cincos solventes foram testados para

verificar alguma interferência no tamanho de partícula com a afinidade do solvente.

4.8 Isolamento e Purificação do Ácido Betulínico

A purificação do ácido betulínico foi realizada por cromatografia em coluna de gel de

sílica tipo “flash”, utilizando-se coluna de vidro de 50 mm X 15 cm recheada com gel de sílica

(Dowex 1X8 RC1, malha 200-400). Adicionou-se na coluna, 1 g do extrato que foi eluído no

seguinte sistema: 200 mL 5 % acetato de etila/n-hexano , 100 mL de 10 % acetato de etila/n-

hexano e 1400 mL de 20 % de acetato de etila/n-hexano, momento em que se pode observar a

separação do ácido betulínico nas frações 39 até 66. A fração coletada correspondente a 39-66

foi transferida para um balão volumétrico e concentrada em evaporador rotatório. A obtenção

do ácido betulínico foi acompanhada por CCF, utilizando-se cromatofolhas de alumínio em

gel de sílica 60 F254 (Merck) de espessura 0,2 mm e solução de paranisaldeído como solução

reveladora em temperatura superior de 120 °C. O ácido betulínico foi recristalizado em uma

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mistura de CHCl3 : MeOH (v/v), e obtido em 98,5 % de rendimento e caracterizado pelas

técnicas descritas no item 5.7.

4.9 Caracterização do Ácido Betulínico

4.9.1 Espectrometria no Infravermelho

Os espectros, obtidos em espectrômetro de infravermelho, foram realizados utilizando

pastilhas de KBr para as amostras sólidas. Os valores para as absorções foram referidos em

número de ondas e a unidade atribuída foi centímetro recíproco (cm-1).

4.9.2 Ressonância Magnética Nuclear

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H) e de

carbono (RMN13C), com desacoplamento completo de prótons, foram obtidos em

espectrômetro, utilizando o tetrametilsilano (TMS) como referência interna, CDCl3

(ISOTECinc.) como solvente. Os deslocamentos químicos (δ) foram referidos em parte por

milhão (ppm), tendo como referência o TMS (δTMS=0) e as constantes de acoplamento (J),

em Hertz (Hz).

4.9.3 Ponto de fusão

O ponto de fusão foi determinado no equipamento MEL-TEMP, sendo as temperaturas

relatadas em grau centígrados (ºC).

4.9.4 Espectrometria de Massas

O método utilizado para confirmar a presença do ácido betulínico no extrato obtido da

Eugenia florida foi a CG-EM. A análise foi realizada para o extrato e padrão de ácido

betulínico, e comparadas com a biblioteca de espectros de massas.

4.10 Estudo de Variabilidade da Produção Metabólica

Este estudo foi feito para avaliação da variabilidade da produção metabólica de E.

florida, com destaque para o ácido betulínico. Houve a preocupação em observar a influência

dos fatores climáticos nestas análises.

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48

As variações anuais, mensais e diárias na temperatura constituem um dos fatores que

afetam a produção de metabólitos secundários. Como no Brasil estas variações são muito

freqüentes foram realizadas coletas mensais durante 12 meses, onde foram observados os

seguintes parâmetros a cada mês:

Temperatura ambiente – esta informação foi obtida a partir dos sites: Sistema de

Meteorologia do Estado do Rio de Janeiro (SIMERJ 2010) e do Centro de Previsão de

Tempo e Estudos Climáticos (CPTEC);

Temperatura do solo – a cada coleta, houve a medição da temperatura do solo com o

auxílio de um termômetro, que foi colocado no solo ao lado do indivíduo coletado;

Umidade Relativa - esta informação também foi obtida nos seguintes sites: Sistema de

Meteorologia do Estado do Rio de Janeiro (SIMERJ 2010) e do Centro de Previsão de

Tempo e Estudos Climáticos (CPTEC);

As folhas foram selecionadas, secas em estufas com circulação de ar, trituradas e

armazenadas em lugar protegido de umidade e luz.

4.11 Extração de Outros Indivíduos de Eugenia florida DC

Foram utilizados três indivíduos no estudo, sendo dois do campus da Fiocruz e um do

Jardim Botânico do Rio de Janeiro, para que a produção metabólica de ácido betulínico fosse

comparada entre eles.

O método de extração e os solventes utilizados foram os mesmos usados nos estudo de

variação de produção metabólica, os extratos obtidos foram armazenados para análise até que

a metodologia analítica estivesse validada e os resultados pudessem ser comparados.

4.12 Extração de Outras Espécies Produtoras de Ácido Betulínico

A metodologia de extração e os solventes usados para este estudo seguiram a descrição

da literatura. O material vegetal foi coletado, selecionado, processado e extraído. Os extratos

obtidos foram armazenados para análise até que a metodologia analítica estivesse validada.

Para este estudo foram utilizadas três espécies:

• Frutos verdes e maduros de Dillenia indica foram extraídos por maceração estática

com metanol trocando o solvente a cada 72 horas até esgotamento do material

vegetal, sendo três trocas de solvente. Foram feitas extrações separadas da polpa e

casca;

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49

• Frutos maduros e folhas de Licania tomentosa foram extraídos por maceração

estática com troca de solventes (n-hexano e metanol) a cada 72 horas até

esgotamento do material vegetal, neste caso foram três trocas de solventes;

• Raiz e Rizoma de Nelumbo nucifera foram extraídos por maceração estática com

etanol 70% trocando o solvente a cada 72 horas até esgotamento do material

vegetal, sendo três trocas de solvente. Foram feitas extrações separadas da raiz e do

rizoma.

4.13 Desenvolvimento de Metodologias Analíticas

4.13.1 Metodologia Analítica Desenvolvida por Cromatografia em Fase Gasosa (CG-

DIC)

Preparo da solução padrão

1 mg de padrão analítico de ácido betulínico foi pesado em um balão volumétrico de

1,0 mL, avolumado com metanol. 100 µL da solução foram transferidos para um vial e o

solvente foi evaporado. Foi adicionado 1,0 mL de diazometano, aguardou-se até evaporação

total e adicionou-se 1,0 mL de metanol. Homogeneizou-se a solução e reservou-se o vial.

Preparo da solução amostra

1 mg de extrato seco de Eugenia florida foi pesado em um vial. Adicionou-se 1,0 mL

de diazometano, aguardou-se até evaporação total e adicionou-se 1,0 mL de metanol.

Homogeneizou-se a solução e reservou-se o vial. Todas as amostras foram guardadas em

freezer à –18 °C e em frascos de vidro âmbar silanizados.

Equipamento

Cromatógrafo com fase Gasosa, com injetor do tipo Split/Splitless, Coluna

Cromatográfica DB-5 (30 m X 320 µm X 1.5 µm); detector de ionização de chamas.

Parâmetros de Análise

Injetor em taxa de split de 5:1; 300 ºC. Programação da coluna: Isoterma inicial de 200

ºC por 2 minutos; rampa de 15 ºC/min até 350 ºC; isoterma final de 13 minutos; fluxo

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50

constante de 1,0 mL/min; detector a 350 ºC; fluxo de Hidrogênio e ar sintético de 35 e 350

mL/min respectivamente e Hélio como gás de arraste.

4.13.2 Validação da Metodologia Analítica por CG-DIC

O protocolo de validação utilizado está descrito no Apêndice A - Protocolo de

Validação de Metodologia Analítica para o Teor de Ácido Betulínico em Extratos Sazonais de

Eugenia florida DC por CG-DIC.

4.13.3 Metodologia Analítica Desenvolvida por Cromatografia de Camada Fina (CCF /

Densitometria)

Preparo da solução padrão

1 mg de padrão analítico de ácido betulínico foi pesado em balão volumétrico de 10,0

mL e avolumado com metanol. Uma alíquota de 1,0 mL foi retirada com o auxílio de pipeta

volumétrica, transferida para balão volumétrico de 10,0 mL e avolumada com metanol.

Preparo da solução amostra

1 mg de extrato metanólico seco de Eugenia florida, foi pesado em balão volumétrico de

10,0 mL e avolumado com metanol.

Parâmetros de Análise

Para esta análise, foram utilizadas cromatofolhas de CCF Merck de gel de sílica 60 F254,

no tamanho de 5 x 10 cm, com 0,2 mm de espessura, 5 mm de banda, espaçamento de 4,2 mm e

margens de 10 mm.

Cuba cromatográfica: Cuba de vidro para placas de 10 x 20 cm.

Configuração: Saturação por 20 minutos, com o sistema de fase móvel.

Solventes: CHCl3:MeOH (9:1).

Equipamento

Sistema de densitometria planar CAMAG composto pelo aplicador automatizado,

scanner, visualizer acoplado a uma câmera e software WinCats 1.4.4.

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4.13.4 Validação da Metodologia Analítica por CCF/Densitometria

O protocolo utilizado para validar a metodologia analítica desenvolvida por

CCF/Densitometria está descrita no Apêndice B - Protocolo de Validação de Metodologia

Analítica para o Teor de Ácido Betulínico em Extratos Sazonais de Eugenia florida DC por

CCF/Densitometria.

4.14 Ensaios Citotóxicos

A avaliação da citotoxidez foi realizada em colaboração com o Laboratório de

Virologia Molecular do Departamento de Biologia Celular e Molecular do Instituto de

Biologia da Universidade Federal Fluminense.

Preparação das soluções-estoque

Os extratos vegetais e as substâncias puras foram solubilizados em DMSO 100 %

estéril. Os extratos foram estocados na concentração de 30 mg/mL a 4 °C e as substâncias

puras foram estocadas na concentração de 50 mM, também a 4 ºC.

Ensaio de Citotoxidade (CC50)

Para o procedimento deste ensaio, células Vero foram mantidas em placas de 96 poços

em uma densidade de 1 x 104 células/poço. Todos os materiais testes foram diluídos em

DMEM 5 % SFB em 4 concentrações: 200 µg/mlL, 100 µg/mL, 50 µg/mL e 25 µg/mL. Para

garantir a confiabilidade dos resultados, três ensaios independentes com triplicatas para cada

concentração foram realizados em experiências distintas. As diluições foram acrescentadas ou

não (controle celular) às células, e mantidas por 72 horas a 37 °C em ambiente com 5 % de

CO2. Após 72h, adicionou-se 50 µL de MTT (5 mg/mL) diluído em meio DMEM em cada

poço e deixado por 4 horas a 37 °C com 5 % de CO2. Após as 4 horas de incubação, cada

poço recebeu 100 µL de DMSO e a placa foi incubada por mais 15 minutos a 37 °C com 5 %

de CO2, protegida da luz. Após esse período, a absorbância foi analisada através de

espectrofotômetro em comprimento de onda correspondente a 545 nm.

A porcentagem de citotoxidez foi calculada como [(A-B)/Ax100], onde A e B são as

absorvâncias do controle e células tratadas, respectivamente. A CC50 foi definida como a

concentração que reduz a absorvância das células tratadas em 50 % quando comparadas com

as células controle.

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4.15 Ensaios em Células Tumorais

Os ensaios em células tumorais foram realizados em colaboração com o Laboratório de

Farmacologia e Toxicologia do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e

Agrícolas (CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

As metodologias utilizadas pelo CPQBA foram desenvolvidas segundo as referências

MONKS et al., 1991 e SKEHAN et al., 1990.

4.15.1 Células

As linhagens celulares cedidas pelo National Cancer Institute (NCI) dos EUA, e

utilizadas na triagem da atividade antiprolioferativa estão relacionadas na Tabela 17. Estas

foram cultivadas em meio de cultura denominado RPMI-1640 suplementado com 5 % de soro

fetal bovino inativado (SFB).

Todos os procedimentos descritos foram realizados sob condições estéreis.

4.15.1.1 Descongelamento celular

Como todas as linhagens celulares foram enviadas congeladas para o laboratório. Logo

em seguida foram realizados o descongelamento das células e a proliferação das mesmas.

Estas células foram fotografadas para uma avaliação geral de sua morfologia.

O criotubo que continha as células foi mantido à temperatura ambiente para

descongelamento sendo seu conteúdo transferido para um tubo de centrifuga de 15 mL. O

volume foi completado para 10 mL com RPMI/SFB. O tubo foi centrifugado a 2000 rpm e 4

ºC por 4 minutos. O sobrenadante foi aspirado e o “pellet celular” foi ressuspendido

cuidadosamente para evitar a formação de grumos com 5 mL de RPMI/SFB. A solução celular

foi transferida para frascos de 25 cm2 (T25) com 5 mL de RPMI-1640 /SFB e incubada a 37 ºC

em atmosfera de 5 % de CO2 e 100 % de umidade.

4.15.1.2 Congelamento celular

As células da suspensão que foram congeladas foram contadas e transferidas para um

tubo de centrífuga de 50 mL. O tubo foi centrifugado a 4 ºC e 2000 rpm por 4 minutos, o

sobrenadante foi aspirado e o “pellet celular” ressuspendido em RPMI/SFB acrescidos de 10

% de glicerol a 4 ºC, resultando numa suspensão de concentração final equivalente a 1 x 106

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cel/mL. O frasco foi mantido a 4 ºC e 1 mL da suspensão celular foi transferido para criotubos

rotulados que foram armazenados na fase gasosa do nitrogênio líquido por 24 horas. Após este

período, os criotubos foram submersos no nitrogênio líquido.

4.15.2 Repiques Celulares

4.15.2.1 Células em Suspensão

Um volume previamente determinado foi retirado do frasco de manutenção e

transferido para outro frasco, sendo completado o volume para 5 mL no caso de frascos de

culturas de 25 cm2 (T25) e 10 mL para os frascos de 75 cm2 (T75). A diluição utilizada foi

dependente das características de cada linhagem celular ou ainda dos objetivos dos

experimentos realizados. Estes frascos foram incubados a 37 ºC em atmosfera de 5 % de CO2

e 100 % de umidade.

4.15.2.2 Células aderidas

Quando a monocamada celular atingiu cerca de 80 % de confluência, estas foram

repicadas, sendo mantidos sempre dois frascos de cada linhagem celular. Para estas células

cujo crescimento ocorre em monocamada, foi necessário a tripsinização, ou seja, o

desprendimento das mesmas do frasco através de ação enzimática.

Após a aspiração do meio de cultura, foi adicionado 0,5 mL de tampão de Hank’s

banhando toda a monocamada celular por 10 vezes consecutivas. Este líquido foi aspirado e

então adicionado 0,5 mL de tripsina a 37 ºC. O frasco foi incubado de 25 a 30 segundos.

Quando as células se desprenderam da parede do frasco de cultura, este foi banhado com

RPMI/SFB. A partir deste ponto, quando as células se apresentaram em suspensão, foi

utilizado o mesmo procedimento do item 4.15.2.1

Tabela 17 Linhagens celulares empregadas na avaliação de atividade antiproliferativa.

Linhagem Órgão/Doença Origem Embrionária Densidade de Inoculação (104 cel/mL)

U251 SNC; glioma Ectoderme 4,0 MCF-7 Mama; adecarcinoma Ectoderme 6,0 NCI-ADR/RES * Ovário; adenocarinoma Ectoderme 5,0 786-O Rim; adenocarcinoma Mesoderme 5,0

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NCI-H460 Pulmão; carcinoma tipo não pequenas células

Endoderme 4,0

PC-3 Próstata; adenocarcinoma Mesoderme 4,5 OVOCAR-3 Ovário; adenocarcinoma Mesoderme 7,0 HT-29 Cólon; adenocarcinoma Endoderme 5,0 HaCat Queratinócito humano, célula

normal imortalizada Epitelial -

Vero Linhagem celular sadia derivada do rim do macaco

Mesoderme -

* esta linhagem apresenta resistência a múltiplos fármacos

4.15.2.3 Contagem celular

Para as células em suspensão, os frascos foram agitados delicadamente e uma alíquota

foi retirada e colocada na Câmara de Newbauer para contagem. Os quatro quadrantes externos

foram contados e determinados a média aritmética. Este valor foi multiplicado pelo fator de

correção da câmara, equivalente a 104, estipulando assim o quanto de células e meio de cultura

deveriam ser inoculados nas placas de 96 compartimentos para a avaliação da atividade

antiproliferativa.

4.15.3 Ensaio para a determinação da atividade antiproliferativa das frações dos

extratos vegetais

Foram plaqueados 100 µL de células, em meio RPMI/SFB/gentamicina, nas suas

respectivas densidades de inoculação em placas de 96 compartimentos. Estas foram incubadas

por 24 horas a 37 ºC em atmosfera de 5 % de CO2 e 100 % de umidade. Para cada linhagem

foram utilizados uns números estipulados de placas, além da placa T0 (Placa Controle),

dependendo da quantidade de células obtidas na contagem.

4.15.3.1 Diluição das amostras

As amostras foram diluídas em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 1 g/mL

resultando em soluções estoques. Estas soluções foram diluídas 400 vezes em

RPMI/SFB/gentamicina. Foram adicionados 100 µL dos extratos nas placas de 96 poços,

exceto na T0, nas doses de 0,25; 2,5; 25; 250 µg/mL, sendo realizada no mesmo momento, a

fixação e posterior leitura da placa T0, determinando assim a quantidade de células presentes

no momento em que os extratos foram colocados. As demais placas foram incubadas por 48

horas. Após este período, foram realizadas as leituras pelo ensaio do SRB.

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4.15.3.2 Ensaio de SRB

A sulforrodamina B (SRB) tem sido amplamente empregada para a avaliação da

citotoxidade e proliferação celular em ensaios em microplacas (LIN et al. 1999). A SRB é um

corante arroxeado que, em condições moderadamente ácidas, se liga a aminoácidos básicos da

proteína celular, e se dissocia em condições básicas. A ligação da SRB é estequiométrica, e a

quantidade de corante extraído de células pigmentadas é diretamente proporcional à massa

total de proteína e, portanto, correlacionada com o número de células (PAPAZISIS et al.

1997, VICHAI & KIRTIKARA, 2006).

As placas de 96 poços foram centrifugadas pôr 3 minutos a 2000 rpm, e foram fixadas

com 50 µL de ácido tricloroacético a 50 % (TCA) para as células aderidas e 80 % para as

células em suspensão. Para completar a fixação celular, as placas foram incubadas por 1 hora

a 4 ºC. Após esse tempo, foram submetidas a quatro lavagens consecutivas com água destilada

para a remoção dos resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários. Estas placas

foram mantidas à temperatura ambiente até a secagem completa.

Em seguida, as placas foram coradas pela adição de 50 µL de SRB a 0,4 %

(peso/volume) dissolvido em ácido acético a 1 %. Estas foram incubadas a 4 ºC, durante 30

minutos. Após esse período, as placas foram lavadas por 4 vezes consecutivas com uma

solução de ácido acético 1 %. O resíduo da solução de lavagem foi removido e as placas

foram novamente secas à temperatura ambiente.

O corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com uma solução de Trizma

Base na concentração de 10 µM e pH 10,5 por 5 minutos em ultrassom. A leitura

espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 560 nm em um leitor de microplacas.

4.15.3.3 Análise dos resultados

Foram calculadas as médias das absorbâncias descontadas de seus respectivos brancos

e através da fórmula abaixo, foi determinada a inibição de crescimento (IC) de cada amostra

testada.

Se T > C a droga estimulou o crescimento, não apresenta IC.

Se T ≥ T0 mas < C, a droga é citostática e a fórmula utilizada é 100 X [(T-To)/(C-T0)].

Se T< T0 a droga é citotóxica e a fórmula utilizada é 100 X [(T-T0)/(C-T0)]

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Sendo que T é a média da absorbância da célula tratada; C é o controle de célula; T0 é

o controle das células no dia da adição das drogas. O resultado obtido foi subtraído de 100%

obtendo-se então a porcentagem de inibição de crescimento. As amostras foram consideradas

ativas quando apresentaram inibição de crescimento maior que 50 % e ainda de forma

dependente da dose.

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

Conforme dito anteriormente, a matéria-prima vegetal é o fator de maior importância

no processamento de produtos à base de plantas medicinais. As plantas, no que diz respeito à

sua composição química, apresentam variações devido à influência de múltiplos fatores como

por exemplo,origem, secagem, condições de estocagem, dentre outras.

Geralmente, o material vegetal bruto é processado a fim de se obter um extrato, porém

devido à sua complexa composição, o processamento é um passo crucial na manutenção da

constância da qualidade.

De forma a garantir a uniformidade da composição dos extratos e determinar a sua

influência para o desenvolvimento de um medicamento, fornecendo os requisitos de

qualidade, efetividade e segurança, foi estabelecida uma estratégia de trabalho para a

padronização dos extratos de Eugenia florida DC. que envolveu as seguintes etapas:

1) Desenvolvimento de Metodologias Analíticas que permitiram a análise do ácido

betulínico de forma qualitativa e quantitativa nos extratos vegetais obtidos de Eugenia florida,

em espécies e indivíduos diferentes, bem como o isolamento e purificação do ácido betulínico;

2) Avaliação das técnicas de extração na obtenção dos extratos;

3) Obtenção dos extratos de indivíduos de E. florida e de outras espécies que contém

ácido betulínico;

4) Avaliação in-vitro dos extratos obtidos nas diversas etapas do trabalho;

Estas etapas serão discutidas nos capítulos seguintes.

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Capítulo 1 Desenvolvimento de Metodologias Analíticas

Quantificação e Identificação

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A etapa inicial do trabalho foi o desenvolvimento e validação de metodologias

analíticas robustas por CG-DIC e CCF/Densitometria, que permitam a quantificação e

identificação do ácido betulínico nas diversas formas de apresentação do trabalho, seguida da

obtenção do extrato a partir das folhas de E. florida, isolamento, purificação e quantificação

do ácido betulínico.

1.1 Isolamento e Purificação do Ácido Betulínico

Eugenia florida utilizada no estudo está localizada no Campus da Fundação Oswaldo

Cruz – Manguinhos/RJ. A escolha de Eugenia florida como espécie de estudo foi em função

da facilidade de acesso e de apresentar o ácido betulínico nas folhas, o que torna todo o estudo

viável sem que haja o esgotamento do material vegetal.

a) Obtenção dos extratos

A técnica por soxhlet foi escolhida por ser uma extração contínua num sistema fechado

apresentando menos interferentes de manipulação e utilizando uma menor quantidade de

solvente. Os solventes escolhidos foram: o hexano, extração até que o solvente ficasse

límpido, para que a parte “graxa” (ceras, ácidos graxos, pigmentos...) fossem eliminados; e o

segundo solvente foi o metanol, a extração também ocorreu até que o solvente ficasse límpido,

por ser o solvente que apresentou maior rendimento extrativo em todos os métodos de

extração testados. O extrato bruto foi obtido a partir de duas extrações seqüenciais por

solvente utilizando:

a - Extração com hexano;

b - Extração com metanol.

b) Isolamento

A mistura acetato de etila/n-hexano foi a que apresentou melhor eficiência no

isolamento do ácido betulínico, definidos a partir do teste cromatografia de camada fina

(CCF), tendo como eluente a mistura acetato de etila/n-hexano nas seguintes proporções: 10,

20, 30, 40, 50 e 60 %. Observou-se que a mistura 30 % de acetato de etila/n-hexano foi a que

apresentou o Rf mais próximo de 0,5, onde o ácido betulínico se apresentou de forma isolada.

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c) Purificação

Após as frações de ácido betulínico serem isoladas foram purificadas com

recristalização em uma mistura de CHCl3:MeOH (v/v) e obtido um rendimento de 98,5%. A

substância purificada foi caracterizada confirmando o isolamento e purificação do ácido

betulínico.

1.2 Caracterização do ácido betulínico

a) Espectrometria de massas

Os espectros de CG-EM do derivado metilado do padrão ácido betulínico e do extrato

obtido da Eugenia florida confirmando a presença do ácido betulínico no extrato. Os espectros

foram comparados com a biblioteca de espectros de massa Wiley7n. m/z: M.+470; 262 (10 %);

208 (5 %); 207 (15 %); 190 (10 %); 189 (100 %).

Na Figura 15 pode-se observar uma proposta da fragmentação de resultados não

publicados pelo nosso grupo de pesquisa. E na Figura 16 e 17 pode-se observar os espectros

obtidos por CG-EM do extrato de Eugenia florida e do padrão de ácido betulínico Sigma

Aldrich.

Figura 15 Proposta do mecanismo de fragmentação molecular do Betulinato.

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Figura 16 Espectro de CG-EM do extrato metanólico de folhas de E. florida.

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Figura 17 Espectro de CG-EM do padrão de ácido betulínico Sigma Aldrich.

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b) Ressonância Magnética Nuclear

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H),

Ressonância Magnética Nuclear de Carbono (RMN13C) e DEPT-135 confirmaram o

isolamento e purificação do ácido betulínico das folhas de E. florida (Figuras 18 a 23).

RMN 1H (CDCl3-) (ppm) 0.83 (1H, m, H-1a), 1.57 (1H, m, H-1b), 1.45 (2H, m, H-2), 2.98

(1H, dd, J = 5.0, 11.2 Hz, H-3), 0.60 (1H, m, H-5), 1.44 (1H, m, H-6a), 1.32 (1H, m, H-6b),

1.31 (2H, m, H-7), 1.22 (1H, m, H-9), 1.36 (1H,m, H-11a), 1.18 (1H, m, H-11b), 0.96 (1H, m,

H-12a), 1.62 (1H, m, H-12b), 2.24 (1H, m, H-13), 1.08 (2H, m, H-15), 1.33 (1H, m, H-16a),

2.14 (1H, m, H-16b), 1.49 (1H, m, H-18), 2.96 (1H, ddd, J = 4.5, 10.6 Hz, H-19), 1.32 (1H, m,

H-21a), 1.82 (1H, m, H-21b), 1.38 (1H, m, H-22a), 1.82 (1H, m, H-22b), 0.87 (3H, s, H-23),

0.65 (3H, s, H-24), 0.76 (3H, s, H-25), 0.87 (3H, s, H- 26), 0.92 (3H, s, H-27), 4.66 (1H, d, J =

1.8 Hz, H- 29a), 4.53 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-29b), 1.63 (3H, s, H-30).

RMN 13C (CDCl3)δ ppm: 179,242 (COOH); 150,672 (C-isopropil); 109,393 (=CH2); 78,802

(COH).

Figura 18 Espectro de Ressonância Magnética de 1H do ácido betulínico.

Os sinais assinalados no RMN de 1H com seus respectivos acoplamentos, são descritos

na Figura 19.

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63

OH

HH

O

OH20

28

27

23

24

H25

20 H

H29bH29a

4,58(4,68)

4,69(4,77)

1,66 (1,62)

3,16 (3,28)H30

Figura 19 Assinalamento no RMN de 1H do ácido betulínico.

Os sinais com deslocamento químico em 4,58 e 4,69 são referentes aos prótons

metilenicos e foram selecionados como os marcadores para a identificação do ácido

betulínico, por estarem isolados e serem característicos do ácido.

Já o assinalamento dos carbonos na molécula do ácido betulínico foi realizado com a

técnica de RMN 13C Dept, onde os carbonos secundários e quaternários são descritos na parte

de baixo e os primários e terciários na parte de cima do espectro, onde se destaca o CH2 do

grupo etileno em δ:110,60 (Figura 20).

180.3

56.8 30.6

31.5

43.918.5

41.032.7

29.647.5

47.0

17.0

78.127.7

30.9 38.2

50.523.2

26.144.9

49.3

51.2

21.7

110.6

27.0 31.8

18.8

19.1

17.0

15.7

OH

HH

O

OH

H

H

H

H

Figura 20 Assinalamento no RMN de 13C do ácido betulínico.

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64

Figura 21 Espectro de RMN1H do ácido betulínico

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65

Figura 22 Espectro de RMN13C do ácido betulínico.

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66

Figura 23 Espectro de DEPT-135 do ácido betulínico

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67

c) Infravermelho

O espectro de infravermelho confirma o isolamento do ácido betulínico, pode-se

observar na Figura 24. Freqüência (cm-1): 3070 (O-H); 2918(CH2); 2830 (CH2); 1679 (C=O);

1611(C=C); 1419 (C-O-H); 1321 (O-H); 1286 C-O).

Figura 24 Espectro de infravermelho do ácido betulínico.

Tabela 18 Sinais assinalados no espectro de infravermelho do ácido betulínico.

Freqüência (cm-1) Tipo de deformação

3076 Deformação axial O-H 2943 Deformação axial assimétrica de grupo metileno (vs CH2)

2869 Deformação axial simétrica de grupo metileno (vs CH2)

1700 Deformação axial C=O

1641 Deformação axial C=C

1489 Deformação angular no plano C-O-H

1259 Deformação angular no plano O-H

1323 Deformação axial C-O

d) Ponto de Fusão

Ponto de Fusão (760mmHg): 295-298ºC.

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68

1.3 Desenvolvimento e Validação de Metodologia Analítica

A presença de somente dois grupos cromóforos, o acetileno e a carboxila, limita a

utilização da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), portanto duas técnicas

analíticas foram selecionadas para a determinação e quantificação do ácido betulínico neste

trabalho. A primeira foi a Cromatografia com fase Gasosa com Detector de Ionização de

Chama (CG-DIC) por ser uma ferramenta analítica poderosa para identificar e/ou monitorar a

presença de substâncias em extratos brutos. Utilizada rotineiramente nos laboratórios de

produtos naturais, apresenta restrições quanto a substâncias com pouca volatilidade, sendo

necessária a obtenção dos respectivos derivados. Desta forma, foi também desenvolvida uma

metodologia de análise por CCF/Densitometria.

1.3.1 Derivatização

O pré-requisito necessário para análise em cromatografia com fase gasosa é que o

analito de interesse seja volátil e termicamente estável. Quando não for o caso, a derivatização

pode ser usada para superar esta limitação. Tradicionalmente, a cromatografia com fase

gasosa necessita do uso de derivados para determinar compostos estrogênicos. Freire (2009)

obteve uma série de derivados do ácido betulínico por várias técnicas, uma delas foi a

diazotação. A reação de ácidos com diazometano é um bom método de preparação de ésteres

metílicos em pequenas quantidades, pois ocorre em condições brandas com excelente

rendimento. O ácido betulínico apresenta um ponto de fusão de 285 oC enquanto o betulinato

derivado de 225 oC.

A reação do diazometano com o ácido betulínico ocorre em duas fases. Primeiramente

ocorre a transferência de um próton ácido do ácido betulínico para o diazometano (Fase 1).

Essa reação produz o íon carboxilato, que é um bom nucleófilo, e um substrato ao qual está

ligado o grupo de saída, o nitrogênio. Em seguida ocorre a formação de uma nova ligação

carbono-oxigênio e a liberação do gás nitrogênio (Fase 2). O resultado é a metilação do ácido

betulínico conforme descrito na Figura 25 e na Figura 26 pode-se observar o cromatograma

obtido do ácido betulínico derivatizado com o diazometano.

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69

OH

HH

O

OH

H

H

H

H

NN

H2C+-

OH

HH

O

o-

H

H

H

H

NN

H3C+

OH

HH

O

OCH3

H

H

H

H

Figura 25 Mecanismo da derivatização do ácido betulínico por diazomentano.

Figura 26 Cromatograma gasoso do padrão do ácido betulínico derivatizado por diazometano.

Outros reagentes utilizados para a derivatização de grupos ácidos ou fenólicos, são os

sililizantes como é o caso do BSTFA (N, O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida) + TMCS

(trimetilclorosilano). A combinação do BSTFA e TMCS resulta em um produto versátil, que

reage com uma grande quantidade de substâncias orgânicas substituindo o hidrogênio ativo

pelo grupo (-Si-(CH3)3). O TMCS aumenta a reatividade do BSTFA. O mecanismo de

derivatização está exemplificado na Figura 27.

Figura 27 Mecanismo da derivatização de um ácido por BSTFA

Fase 1 Fase 2

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70

O cromatograma obtido (Figura 28) demonstra que o processo de derivatização não foi

suficiente, resultando na degradação do ácido betulínico com uma possível silanização não

seletiva na porção ácida.

Figura 28 Cromatograma gasoso do acido betulínico após derivatização com BSTFA +

TMCS.

1.3.2 Cromatografia com Fase Gasosa com Detecção por Ionização de Chamas (CG-

DIC)

a) Desenvolvimento Analítico

Com base na estrutura predominantemente apolar do ácido betulínico, durante o

desenvolvimento dos métodos foram utilizadas colunas cromatográficas apolares de diferentes

composições (DB-1 e DB-5). Outros parâmetros experimentais que influenciam na análise da

substância estudada, como programação de temperatura do forno, temperatura do injetor e

fluxo de gás de make up foram otimizados para a análise.

a.1. Coluna

Inicialmente, utilizou-se uma coluna do tipo “DB-1, 30 metros” (Figura 25). A coluna

DB-1 (100 % dimetilpolissiloxano) tem aplicações típicas, entre outras, para hidrocarbonetos

e álcoois, e foi selecionada em função do ácido betulínico ter uma porção polar e apolar, além

de suportar temperaturas acima de 300 °C, numa programação exploratória, sendo a

temperatura inicial de 100 ºC, rampa de 10 ºC/min até 300 ºC, fluxo constante de 1,00

mL/min, temperatura do injetor e detector em 250 ºC; tendo como amostra, uma solução a

1mg/mL de acido betulínico padrão metilado. Na Figura 29 pode-se observar a influência

desta coluna na análise.

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71

SiO100%

Figura 29 Unidade Polimérica da Coluna DB-1.

Figura 30 Cromatograma gasoso do ácido betulínico derivatizado por diazometano em

Coluna DB-1 por CG-DIC.

Com resultados insatisfatórios, utilizou-se uma coluna do tipo DB-5 (Poli 5 % fenil –

95 % metilsiloxano) (Figura 31), amplamente utilizada na análise de hidrocarbonetos,

alcaloides aromáticos, anabolizantes, flavorizantes e fragrâncias, sendo mantida as mesmas

condições cromatográficas utilizadas anteriormente.

SiO95%

SiO

5%

Figura 31 Unidade Polimérica da Coluna DB-5.

Após a mudança da fase estacionária, notou-se uma melhor resposta nos

cromatogramas (um ganho em resolução e tempo de análise). A Figura 32 apresenta o

cromatograma obtido com a coluna DB-5.

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72

Figura 32 Cromatograma gasoso do ácido betulínico derivatizado por diazometano em

Coluna DB-5 por CG-DIC.

A partir destes resultados, alguns parâmetros cromatográficos foram ajustados para

melhorar a resolução das amostras de extrato derivatizados. Sendo assim a DB-5 foi a coluna

cromatográfica que permitiu a melhor separação de todos os componentes em um menor

tempo de análise.

a.2. Gás Make-up

Inicialmente foram feitos testes para verificar a influência do gás de make up (N2), gás

responsável por atingir o fluxo ideal para o detector, empregando-se para isto um fluxo menor

10 mL min-1, em relação ao inicialmente testado (30 mL min-1).

A condição de 10 mL min-1 foi considerada a mais apropriada devido à obtenção das

melhores intensidades do sinal para o ácido betulínico em estudo e, por esta razão, nos

experimentos posteriores essa condição foi mantida. A diminuição de fluxo de gás de make up

faz com que o efeito de diluição da substância no detector seja minimizado, com conseqüente

diminuição na largura da base dos sinais, apresentando melhor desempenho no processo

cromatográfico, por proporcionar uma melhora na eficiência da coluna, assim como permite a

redução da pressão e dos tempos de separação. Na Figura 33 pode-se avaliar a influência do

gás make-up.

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73

Figura 33 Avaliação da influência no gás make-up na resolução do ácido betulínico

derivatizado por diazometano: (a) Makeup maior; (b) Makeup menor.

a.3. Pulso de pressão

Foi avaliada a influência da variação de fluxo e pulso de pressão em diferentes

períodos de duração. Na transferência mais rápida para o interior da coluna, em pressão

constante a 9,38 psi, a eluição do ácido betulínico metilado aumentou a intensidade do sinal,

bem como, o estreitamento da mesma. O que é explicado pelo aumento da velocidade de

transferência do analito com elevado ponto de ebulição das substâncias que possam ser

adsorvidas no injetor, redução do tempo de residência da amostra no injetor e aumento da

capacidade do mesmo, em função do volume de vapor ser inversamente proporcional. Desta

forma, a pressão resulta em um gerenciamento adequado destes fenômenos, proporcionando

uma condição cromatográfica satisfatória. Na Figura 34 pode-se avaliar a influência no pulso

da pressão na análise do ácido betulínico

(b)

(a)

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74

Figura 34 Avaliação do pulso de pressão no desempenho cromatográfico do ácido betulínico

metilado.

a.4. Temperatura

As injeções foram realizadas com volume de 1 µL, com divisão de fluxo e fluxo de

coluna constante. Com base no ponto de fusão do betulinato de metila (PF: 225 °C), durante

todas as análises, a temperatura do detector foi mantida entre 55-100 °C acima da temperatura

mais alta do forno, a fim de evitar e/ou diminuir o efeito de cauda nos sinais e manter a célula

do detector limpa.

De acordo com a Figura 35, os dados indicaram que, de forma geral, não há diferença

significativa nas alturas relativas dos picos nas temperaturas do injetor entre 280 e 350 °C.

Contudo, a temperatura de 350 °C foi escolhida por ter propiciado maior intensidade do sinal

cromatográfico.

Figura 35 Cromatograma obtido com o ácido betulínco metilado e com variações de

temperaturas.

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75

Desta forma, a metodologia definida foi: Cromatógrafo AGILENT modelo 6890N,

com injetor do tipo Split/Splitless, Coluna Cromatográfica DB-5 (30 m X 320 µm X 1.5 µm);

detector de ionização de chamas. Injetor em taxa de split de 5:1; 300 ºC. Programação da

coluna: Isoterma inicial de 200 ºC por 2 minutos; rampa de 15 ºC/min até 350 ºC; isoterma

final de 13 minutos; fluxo constante de 1.0 mL/min; detector a 350 ºC; fluxo de Hidrogênio e

Ar sintético de 35 e 350 ml/min respectivamente e Hélio como gás de arraste.

a.5. Validação da Metodologia Analítica por CG-DIC

O relatório com os resultados de validação da metodologia analítica desenvolvida por

CG-DIC está descrito no Apêndice D - Relatório de Validação de Metodologia Analítica para

o Teor de Ácido Betulínico (AB) em Extratos Sazonais de Eugenia florida DC por CG-DIC.

1.3.3 Cromatografia em Camada Fina acoplada a Densitometria Ótica

(CCF/Densitometria).

A técnica de cromatografia em camada fina (CCF) pode ser aplicada, tanto na

separação, quanto na purificação de constituintes vegetais, visando à obtenção de substâncias

de referência e de padrões, principalmente quando se almeja baixar custos operacionais, por

intermédio da diminuição do tempo de análise e da utilização de solventes sem alto grau de

pureza.

A CCF é uma técnica de adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação se dá pela

diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.

a.1 Fase estacionária

O gel de sílica é uma fase estacionária com habilidade de realizar ligações de

hidrogênio. Cetonas, ésteres e éteres, entre outros, ficam mais tempo retidos na fase

estacionária através de ligações de hidrogênio do tipo aceptor. Já álcoois e ácidos carboxílicos,

interagem com a fase estacionária duplamente, ou seja, são doadores e aceptores de

hidrogênios, o que aumenta o tempo de retenção no gel de sílica (SKOOG et al., 2005). Desta

forma o gel de sílica 60 F254 foi a fase estacionária selecionada para o desenvolvimento da

metodologia por CCF/Densitometria.

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76

a.2 Fase Móvel

A escolha dos solventes foi baseada de forma que estes reduzam a extração de clorofila

nos extratos e condicionada à conformação do esqueleto do ácido betulínico.

Uma série de experimentos foi realizada de forma a selecionar o melhor sistema de

solventes. Uma metodologia cromatográfica foi proposta, utilizando como fase móvel, uma

solução de 10 % de metanol em clorofórmio e leitura por densitometria a 590 nm após a

derivatização da placa com uma solução de p-anisaldeído sulfúrico.

Figura 36 Densitograma do ácido betulínico com a fase móvel MeOH:CHCl3 (1:9).

No entanto, como pode ser observado na Figura 36 o densitograma apresenta bandas muito

largas para a comparação densitométrica. Sendo assim uma série de outros sistemas de

eluição, derivatização e leitura foram testados de forma a se obter uma melhor resolução e

assimetria da banda. Os sistemas de eluição utilizados foram: MeOH:CHCl3 9:1 e n-hexano:

acetato de etila nas seguintes proporções: 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 1:1 e 4:6. O sistema definido como

o ideal para as amostras utilizadas, foi uma solução de 40 % de n-hexano em acetato de etila,

leitura direta por densitometria a 190 nm e derivatização com uma solução de vanilina

sulfúrica e após revelação uma leitura a 560 nm (Figura 37).

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77

Figura 37 Densitograma do ácido betulínico com fase móvel Hexano:AcOEt (4:6).

Estes resultados credenciam o uso da técnica de densitometria acoplada a CCF, como

uma ferramenta útil para o sucesso dos experimentos de separação e purificação em

CCF/Densitometria, do ácido betulínico, a partir de extratos vegetais brutos ou semipurificados.

a. 3) Validação da Metodologia Analítica por CCF/Densitometria

O relatório com os resultados de validação da metodologia analítica desenvolvida por

CCF/Densitometria está descrito no Apêndice E - Relatório de Validação de Metodologia

Analítica para o Teor de Ácido Betulínico em Extratos Sazonais de Eugenia florida DC por

CCF/Densitometria.

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78

Capítulo 2 Avaliação das técnicas de extração na obtenção dos extratos

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79

Com a metodologia de quantificação e identificação do ácido betulínico definida, a

segunda etapa do trabalho consistiu em definir a metodologia de extração.

A extração é um método conveniente para retirar substâncias de órgãos ou de matrizes

onde são originadas e localizadas. A teoria da extração é baseada no fato que se uma

substância é solúvel em algum grau num solvente, ela pode ser extraída quando a matriz onde

se encontra é posta intimamente em contato com ele. Para uma proposta específica de extração

a escolha do solvente é certamente um dos problemas principais a ser considerado. Esse

agente extrator é geralmente um líquido orgânico volátil, que pode ser removido por

evaporação após ter extraído a quantidade de material desejada.

As etapas anteriores ao processo de extração são a coleta e processamento primário. O

estudo de avaliação do método de extração foi realizado com um único lote coletado de

Eugenia florida localizada no campus FIOCRUZ do indivíduo de registro RB-328.061.

Para permitir o armazenamento das folhas coletadas, em vista à manutenção dos

princípios ativos, a diminuição da atividade enzimática é necessária pela redução de umidade

no material vegetal. Os processos de secagem atualmente vêm sendo muito estudados e

avaliados, porém, são poucas as informações existentes de procedimento pós-colheita para as

plantas medicinais.

A secagem convectiva sob condições constantes de temperatura e umidade do ar foi

adotada neste trabalho, permitindo umidade até 7 %, até peso constante por um período de

secagem de até 15 dias.

2.1. Processo de Extração

O processo extrativo é também função do tempo em que o material fica em contato

com o solvente, do grau de trituração da planta, da temperatura, da polaridade do solvente, da

reatividade dessa frente aos produtos a serem extraídos, da quantidade de solvente usado

(LAVORENTI, 2002). Estes parâmetros serão discutidos abaixo.

a) Escolha do solvente:

Para uma proposta específica de extração a escolha do solvente é certamente um dos

problemas principais a ser considerado.

As substâncias químicas são extraídas em diferentes solventes em graus de intensidade

diferentes, os quais podem ser afetados por vários fatores, dos quais sobressai a temperatura

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80

(LAVORENTI, 2002). Temperaturas elavadas podem facilitar a extração de substâncias, mas

deve ser ontrolada para que não degrade a substância termolábel.

O ácido betulínico em questão apresenta uma porção polar e apolar (Figura 38), sendo

insolúvel em água. Tendo em mente a produção em larga escala de um possível produto e da

estrutura química do ácido, a escolha dos solventes selecionados foi baseada em sua

polaridade (Tabela 19), custo e efeito ambiental.

Figura 38 Estrutura do ácido betulínico, com a porção polar destacada em vermelho.

A polaridade pode ser dada pela constante dielétrica. Solventes com constantes

dielétricas menor que 15 são geralmente considerados apolares (SMITH, 1994).

Tecnicamente, as medidas de constante dielétrica de um solvente são a capacidade que

estes têm de reduzir a intensidade do campo elétrico existente em torno de uma partícula

carregada que esteja imersa nele. Esta redução é então comparada com a intensidade do

campo da partícula carregada em um vácuo. Em termos leigos, a constante dielétrica do

solvente pode ser pensada como a sua capacidade de reduzir a taxa interna de soluto (SMITH,

1994).

Desta forma em função do ácido betulínico apresentar uma porção polar e apolar, para

o estudo da sua solubilidade foram selecionados solventes cuja constante dielétrica varia entre

1,88 a 33.

Tabela 19 Solventes selecionados para os estudos dos métodos de extração (SMITH, 1994).

Solvente Propriedades Constante dielétrica

n-Hexano 1,88

Clorofórmio 4,81 Acetato de Etila

Apolar

6,2 Etanol absoluto 99,8% 30 Metanol UV/HPLC 99,9%

Polar Prótico 33

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81

O método de extração selecionado para avaliar a solubilidade foi o soxhlet com

controle da temperatura para todos os ensaios para que não ocorresse degradação das

substâncias extraídas e para favorecer a extração pelo aumento da temperatura em tempo

adequado em relação aos outros métodos de extração descritos no trabalho. Os resultados

obtidos são descritos na Figura 39.

0

5

10

15

20

25

30

Teo

r de

AB

(%

)

EFH EFC EFA EFE EFM

Solventes

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Ren

dim

ento

ext

rativ

o (%

)

EFH EFC EFA EFE EFM

Solventes

Figura 39 Resultados da extração por soxhlet das folhas de Eugenia florida (a) Teor de ácido

betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo.

EFH (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano); EFC (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Clorofórmio); EFA (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila); EFE (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Etanol); EFM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Metanol); AB (ácido betulínico).

(a)

(b)

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82

Com relação à avaliação do rendimento extrativo observou-se que o metanol foi o

solvente que apresentou um maior percentual, isso significa que o extrato apresenta uma

característica polar, entretanto a participação dos grupamentos polares é minoritária no

processo de extração do ácido betulínico senão seria observado um alto teor do mesmo na

extração com solventes polares.

O rendimento extrativo que apresentou o maior percentual de extração foi o metanol,

esse fato indica a grande presença de substâncias de natureza polar no extrato.

Esperava-se que os resultados obtidos pelo teor de ácido betulínico fossem também

proporcionais ao aumento da constante dielétrica, isto por causa das porções polares presentes

na molécula do ácido betulínico, mas observou-se que a melhor extração de ácido betulínico

ocorreu com clorofórmio, acetato de etila e n-hexano, solventes de constante dielétrica

menores.

Sabe-se que a extração com solvente aplicado para plantas compreende a dissolução

seletiva da porção solúvel dos seus constituintes num solvente apropriado, sendo a quantidade

de material extraído proporcional à massa de planta imersa no solvente. Pode-se atribuir os

resultados obtidos ao poder de penetração do solvente nas folhas uma vez que o extrato

apresentou características polares. Desta forma, o baixo teor do ácido betulínico verificado na

extração com n-hexano pode estar relacionado à sua baixa permeabilidade nas células da

planta, extraindo mais substâncias superficiais como ceras e lipídeos ou outras substâncias de

natureza apolar. Este fato evidencia que a solubilidade das substâncias presentes nas plantas,

não dependem unicamente de sua natureza química e do solvente utilizado, mas também da

sua localização na planta.

Sendo assim, dois solventes foram utilizados no processo de extração para o estudo de

variação metabólica, um de natureza polar e outro apolar. O n-hexano foi utilizado para retirar

as substâncias superficiais e facilitar a extração com o metanol, solvente que apresentou

melhor rendimento extrativo.

b) Escolha do Método de Extração:

A extração de princípios ativos de plantas medicinais pode ser realizada por inúmeros

métodos extrativos que podem ser técnicas clássicas, como por exemplo, maceração,

percolação, decocção, infusão, extração contínua a quente (soxhlet), arraste com vapor, mas

também, técnicas avançadas como, por exemplo, microondas, ultrassom e fluidos

supercríticos.

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83

O poder de penetração e a natureza mais polar dos componentes do extrato,

aparentemente parecem influenciar a extração do ácido betulínico, desta forma foram

selecionadas técnicas que abrangiam parâmetros como temperatura, custo, tempo, quantidade

de solvente e dinâmica de extração. Sendo assim as técnicas selecionadas foram: Extração

Contínua a quente (soxhlet), Maceração Dinâmica e Estática, Percolação e Ultrassom.

b.1.Maceração

A Maceração explora o fenômeno de difusão do solvente através do tecido vegetal. Em

suas modalidades, a maceração pode ser estática ou dinâmica. No primeiro caso, o contato do

solvente com os fragmentos da planta é feito por um tempo estabelecido e em repouso. No

caso da maceração dinâmica, a mistura em extração é mantida sob agitação por um tempo

determinado (VINATORU, 2001). Na Figura 40 pode-se observar os resultados obtidos na

extração por maceração estática com as folhas de E. florida.

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84

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

Teo

r de

AB

(%

)

72 horas 144 horas 216 horasTempo de extração

EFH EFC EFA EFE EFM

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Ren

dim

ento

ext

rativ

o (%

)

72 horas 144 horas 216 horasTempo de extração

EFH EFC EFA EFE EFM

Figura 40 Resultados da extração por Maceração Estática das folhas de Eugenia florida (a)

Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo.

EFH (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano); EFC (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Clorofórmio); EFA (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila); EFE (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Etanol); EFM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Metanol); AB (ácido betulínico).

Na Figura 41 pode-se observar os resultados obtidos na extração por maceração

dinâmica com as folhas de E. florida.

(a)

(b)

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85

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Teo

r de

AB

(%

)

72 horas 144 horas 216 horas

Tempo de extração

EFH EFC EFA EFE EFM

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

Ren

dim

ento

ext

rativ

o (%

)

72 horas 144 horas 216 horasTempo de extração

EFH EFC EFA EFE EFM

Figura 41 Resultados da extração por Maceração Dinâmica das folhas de Eugenia florida (a)

Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo.

EFH (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano); EFC (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Clorofórmio); EFA (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila); EFE (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Etanol); EFM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Metanol); AB (ácido betulínico).

Observa-se que os solventes que extraíram melhor o ácido betulínico foram: acetato de

etila e clorofórmio, e o solvente que apresentou melhor rendimento extrativo foi o metanol

para os dois tipos de macerações. A diferença foi que na maceração estática demora mais a

extrair o ácido betulínico devido ao tempo de entumecimento do material vegetal e equilíbrio

intracelular e extracelular para liberação da susbtância, isto ocorre mais rápido na maceração

dinâmica por causa da agitação facilitar o processo de extração.

(a)

(b)

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86

Os resultados de extração dos solventes foram semelhantes à obtida por soxhlet, onde

observa-se acetato de etila e clorofórmio como melhores solventes para extrair o ácido

betulínico e o metanol como solvente de melhor rendimento extrativo.

b.2. Percolação

Na percolação, ao contrário da maceração, o solvente percola a camada de planta.

Nesse tipo de extração, o solvente é renovado continuamente em virtude do seu movimento

descendente e a planta estará sempre em contato com novas porções de solvente, o que reduz,

contudo, o tempo de equilíbrio entre os líquidos situados dentro e fora da célula (PACHÚ,

1994). Na Figura 42 pode-se observar os resultados obtidos na extração por percolação com as

folhas de E. florida.

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87

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Teo

r de

AB (%

)

1 hora 2 horas 3 horasTempo de extração

EFH EFC EFA EFE EFC

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Ren

dim

ento

extra

tivo

(%)

1 hora 2 horas 3 horas

Tempo de extração

EFH EFC EFA EFE EFM

Figura 42 Resultados da extração por Percolação das folhas de Eugenia florida (a) Teor de

ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo.

EFH (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano); EFC (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Clorofórmio); EFA (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila); EFE (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Etanol); EFM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Metanol); AB (ácido betulínico).

Os resultados obtidos pelo método de extração por percolação também apresentou os

solventes acetato de etila e clorofórmio como os melhores solventes para extrair o ácido

betulínico e o metanol o solvente de melhor rendimento extrativo, sendo este método o que

apresentou um maior percentual de extração tanto para o ácido betulínico como no rendimento

extrativo. Como na percolação a planta deve ser entumescida previamente facilita a

penetração do solvente, por isso, observa-se pequenas variações em relação à maceração,

corroborando com a idéia inicial de que dois fatores importantes na extração do ácido

(a)

(b)

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88

betulínico devem ser considerados, a polaridade do solvente e o tempo de penetração do

solvente na célula para que a extração seja eficiente.

b.3. Ondas Ultrassônicas

A sonoquímica, começa a aparecer regularmente na literatura como um método para

melhorar as velocidades de reações químicas e aumentar os rendimentos dos produtos das

reações fazendo o uso de ondas ultrassônicas. O princípio desse processo consiste no fato que

uma corrente de um líquido ou mistura líquida é empurrada sobre pressão para uma lâmina

metálica que vibra numa cavidade ressonante. O fenômeno consiste na conversão de energia

elétrica de alta freqüência, via vibrações mecânicas em ondas de pressão em solução. Essas

ondas criam um enorme número de bolhas microscópicas que implodem violentamente

ocasionando a agitação intensa das moléculas (THOMA et al., 2001).

Com o uso desta técnica as células de tecido vegetal nesse meio poderiam ter suas

membranas lisadas, deixando assim extravasar para a solução, os componentes moleculares

intracelulares, facilitando grandemente o processo de extração do solvente (THOMA et al.,

2001). Desta forma, seria possível avaliar a influência da polaridade do solvente na extração,

uma vez que o ácido betulínico estaria livre no meio extracelular. Em função da técnica

demandar uma renovação de solvente em função da saturação do solvente determinou-se

somente o tempo de saturação e extrapolou-se este valor para os tempos de extração das

demais técnicas. Na Figura 43 pode-se observar os resultados obtidos na extração por

ultrassom com as folhas de E. florida.

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89

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

Teo

r de

AB

(%

)

10 min. 20 min. 30 min.

Tempo de extração

EFH EFC EFA EFE EFM

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

Ren

dim

ento

ext

rativ

o (%

)

10 min. 20 min. 30 min.

Tempo de extração

EFH EFC EFA EFE EFM

Figura 43 Resultados da extração por Ultrassom das folhas de Eugenia florida (a) Teor de

ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo.

EFH (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano); EFC (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Clorofórmio); EFA (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila); EFE (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Etanol); EFM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Metanol); AB (ácido betulínico).

Observa-se na extração por ultrassom um perfil diferente na extração, os solventes que

apresentaram melhor extração de ácido betulínico foram hexano e clorofórmio e o solvente de

melhor rendimento extrativo foi o etanol, seguido do acetato de etila. Isto ocorreu, devido a

diferença do método de extração, as ondas sonoras rompem as células facilitando a liberação

das substâncias, por isso o hexano conseguiu extrair melhor o ácido betulínico por esse

método. Dependeno da substância e do tempo de exposição às ondas sonoras pode ocorrer

degradação por este método de extração.

(a)

(b)

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90

Conclusão do estudo comparativo das técnicas nos Métodos de Extração

Os resultados sugerem que os fatores importantes no processo de extração são:

temperatura, solvente e equilíbrio dinâmico. Na Figura 44 pode-se observar a comparação do

teor de AB nos diversos métodos de extração.

0 20 40 60 80 100 120 140

Percolação

Soxhlet

Dinâmica

Estática

Ultrassom

Teor de AB (%)

EFM

EFE

EFA

EFC

EFH

Figura 44 Comparação dos percentuais de ácido betulínico obtidos no estudo dos métodos de

extração e solventes.

EFH (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano); EFC (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Clorofórmio); EFA (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila); EFE (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Etanol); EFM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Metanol); AB (ácido betulínico).

Os resultados obtidos no ultrassom onde as células são lisadas revelam que o ácido

betulínico no meio extracelular é preferencialmente extraído por solventes apolares n-hexano

> clorofórmio > acetato de etila. A baixa solubilidade do ácido em água corrobora com estes

resultados.

Técnicas (percolação e maceração) onde ocorre processo de entumecimento do

material vegetal, solventes com constantes dielétricas menores foram mais favorecidos. Tal

fato sugere que uma vez que o ácido está localizado no meio intracelular, o tempo de

equilíbrio (fenômenos de difusão), entre o meio intracelular e extracelular foram os fatores

limitantes na velocidade da dissolução.

Como na percolação o processo de inchamento é maior do que na maceração a

extração foi maior.

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91

A baixa estabilidade de substâncias a temperaturas e a exposição a ondas ultrassônicas

pode ser comprovada observando o baixo rendimento nas técnicas por soxhlet e ultrassom

respectivamente, devido ao aquecimento e a energia de ondas sonoras pode facilitar a

degradação do ácido betulínico.

Os solventes polares apresentaram maior percentual de extrato bruto o que sugere que

o extrato apresenta um maior número de substâncias de caráter polar, o que talvez contribua

para o baixo teor de ácido betulínico nestes solventes em função da saturação.

c) Granulometria:

A avaliação granulométrica do material moído é uma etapa importante da

padronização, pois representa uma influência direta sobre a eficiência no processo extrativo.

Partículas com dimensões homogêneas aumentam a área de contato entre o material

sólido e o líquido extrator, podendo tornar, desta forma, mais eficiente o processo de extração.

É desejável que a granulometria seja homogênea para que a penetração de solventes no

material seja facilitada e consistente (SHARAPIN et al., 2000)

Nesse procedimento, o material botânico foi dividido em pequenos fragmentos e

pulverizado, de modo a provocar um aumento considerável da área oferecida à ação do

solvente que deve ser deixado em contato com o material vegetal por um determinado tempo.

É conveniente lembrar que nem sempre a pulverização muito fina é viável, já que há o risco

da formação de uma massa compacta, prejudicando a difusão do solvente.

Sendo assim a técnica escolhida foi ultrassom, por provocar o rompimento da célula e

pelo tempo de análise (conforme discutido anteriormente, a saturação do solvente é obtida a

partir dos 20 minutos).

Os cinco solventes foram testados para verificar alguma interferência no tamanho de

partícula com a afinidade do solvente e os resultados podem ser observados na Figura 45.

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92

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

50,00

Teo

r d

e A

B (

%)

Pulverizada 0.5 mm 0.85 mm 1.7 mm

Tamanho de partícula

EFH EFA EFC EFE EFM

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

Ren

dim

ento

ext

rativ

o (%

)

Pulverizada 0.5 mm 0.85 mm 1.7 mmTamanho de partícula

EFH EFA EFC EFE EFM

Figura 45 Resultados da extração por ultrassom com diferentes granulometrias das folhas de

Eugenia florida (a) teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo.

EFH (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano ); EFC (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Clorofórmio); EFA (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila); EFE (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Etanol); EFM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Metanol); AB (ácido betulínico).

No estudo com diferentes tamanhos de partícula do material vegetal, foi observado um

aumento significativo na extração tanto no rendimento de extrato, como no teor de ácido

betulínico. Isto já era esperado, pois quanto menor o tamanho da partícula, maior é a

superfície de contato o que facilita a extração. Outro fator que também ajuda na extração é a

homogeneidade da amostra. Mas pode-se observar um rendimento falso de percentual

extrativo, pois não existe extração que crie massa, nem que apresente extração de 100 %.

Logo se pode supor que a massa final extrativa apresenta água em sua composição.

Entretanto, observou-se que a diferença na quantidade de ácido betulínico extraído em

diferentes granulometrias utilizadas, não foi proporcional a diminuição do tamanho de

(a)

(b)

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93

partícula. Para a extração do ácido betulínico o tamanho que apresentou melhor resultado foi

0,85 mm, ou seja, conseguiu extrair maior quantidade de AB. Observa-se que mesmo para

tecidos de menor densidade como são as folhas a granulometria pode aumentar ou diminuir a

extração da substância desejada.

Os resultados do estudo com diferentes tamanhos de partículas para as folhas de E.

florida trituradas com o tamanho de partícula de 0,85 mm, evidenciaram um percentual de

ácido betulínico de até 45 %, com rendimento de extrativo de 54 % em acetato de etila,

solvente que melhor extraiu a substância de interesse (AB). Com o tamanho de partícula

pulverizado observou-se que na extração com metanol, solvente de melhor rendimento

extrativo, obteve-se 285,7 % de extrato, com 12,07 % de AB.

A faixa de tamanho de partícula também é uma variável importante. Por exemplo, as

partículas menores têm maior propensão à adsorção de umidade e, por conseguinte, podem

levar à formação de aglomerados de partículas (LACHMAN et al., 2001). Por isso, seria

interessante avaliar também os diferentes tamanhos de partículas após exposição à umidade.

A granulometria dos pós com outras propriedades paralelas interferem na qualidade

dos processos e do produto final. A mistura de pós, por exemplo, será mais fácil e mais

uniforme se as partículas dos materiais forem, aproximadamente, do mesmo tamanho, o que

conduz a uma maior uniformidade de dose (LACHMAN et al., 2001; MENDEZ et al., 2011).

No desenvolvimento de medicamentos esse fator é de extrema importância para garantir a

eficácia.

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94

Capítulo 3 Obtenção dos extratos de indivíduos de E. florida e de outras espécies

que contém ácido betulínico;

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95

Após a definição da influência do solvente e das técnicas de extração, no processo de

extração do ácido betulínico das folhas de Eugenia florida, estudos foram conduzidos para a

avaliação da influência da interação do vegetal com o meio ambiente na taxa de produção do

ácido betulínico nos extratos obtidos.

Acredita-se que o ácido betulínico seja o metabólito secundário em maior concentração

na planta, mas outros metabólitos secundários presentes nas folhas de E. florida também

podem influenciar na produção de ácido betulínico. Sendo assim, nesta etapa do trabalho, foi

analisada a concentração do ácido betulínico e o rendimento extrativo.

Dentre as técnicas discutidas anteriormente, os maiores rendimentos extrativos foram

obtidos na percolação e no soxhlet (Figura 46).

0 5 10 15 20

Percolação

Soxhlet

Dinâmica

Estática

Ultrassom

Rendimento extrativo (%)

EFM

EFE

EFA

EFC

EFH

Figura 46 Comparação dos rendimentos extrativos de folhas de E. florida obtidos nos

diferentes solventes e técnicas estudadas.

EFM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Metanol); EFE (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Etanol); EFA (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Acetato de Etila); EFC (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com Clorofórmio); EFH (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano)

Considerando a diminuição dos erros aleatórios associados a tempo e manuseio de

amostra, a técnica escolhida para esta etapa do projeto foi a extração por soxhlet.

Os solventes selecionados foram o metanol, solvente que apresentou baixo teor de

ácido betulínico e alto rendimento de extrativo e n-hexano, solvente que apresentou baixo teor

de ácido betulínico e baixo rendimento extrativo. Com essa composição de escolha avaliam-se

a possível presença de metabólitos secundários presentes no extrato de caráter polar e apolar e

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96

a influência dos mesmos no estudo sazonal. Para isso, as folhas de E. florida foram extraídas

sucessivamente com n-hexano até o esgotamento obtendo um extrato apolar e depois com

metanol obtendo um extrato polar.

3.1. Estudo da Variação Metabólica

O estudo da variação metabólica foi realizado por um período de 12 meses. As coletas

foram realizadas na parte da tarde, em horários próximos para que variações do ritmo

circadiano não influenciassem nos resultados.

Os resultados do estudo de variação sazonal da E. florida apresentaram uma variação

do teor do ácido betulínico ao longo dos meses do ano (Figura 47).

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97

19,20

12,37

18,8921,39

19,69

15,12

19,90

9,80

20,6422,15

27,6225,34

ago-10 set-10 out-10 nov-10 dez-10 jan-11 fev-11 mar-11 abr-11 mai-11 jun-11 jul-11

Teo

r de

AB

(%

)

56,3145,50

64,66 65,03

82,63 83,22

95,59 92,78

57,19 61,2254,41

63,22

ago-10 set-10 out-10 nov-10 dez-10 jan-11 fev-11 mar-11 abr-11 mai-11 jun-11 jul-11

Ren

dim

ento

ext

rativ

o (%

)

Figura 47 Resultado do estudo de variação sazonal das folhas de E. florida extraídas com n-

Hexano /Metanol por soxhlet (a) Teor de ácido betulínico analisado por CG-DIC; (b)

Rendimento extrativo. AB (ácido betulínico).

Segundo Alves (2001), os terpenóides são os principais constituintes que estão

envolvidos nas interações planta-inseto. Este fator não foi avaliado durante o estudo de

variação sazonal. Supõe-se que no verão (dezembro, janeiro e fevereiro) existe uma maior

incidência de insetos, mas foi no inverno (junho e julho) que o teor de ácido betulínico foi

maior, talvez esteja associado a temperaturas mais baixas nestes meses, que apresenta uma

maior influência do que a interação planta-inseto.

(a)

(b)

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98

3.1.1 Temperatura e disponibilidade hídrica

A temperatura exerce uma função muito importante na sobrevivência dos vegetais, por

estar ligada ao crescimento e desenvolvimento da planta (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).

Algumas plantas necessitam de algumas horas de luz por dia para o desenvolvimento e a

produção de alguns metabólitos (MARTINS et al., 2000).

A faixa em que ocorrem as variações anuais, mensais e diárias na temperatura é um

dos fatores que exerce maior influência no desenvolvimento, afetando, portanto, a produção

de metabólitos secundários (GOBBO-NETO & LOPES, 2007). A umidade relativa,

temperatura do solo e a ambiente foram avaliadas conforme Figura 48.

0

20

40

60

80

100

120

ago-10 set-10 out-10 nov-10 dez-10 jan-11 fev-11 mar-11 abr-11 mai-11 jun-11 jul-11

Período de coleta

(%)

de A

B e

ext

rativ

o

0

10

20

30

40

50

60

70

80

T.

ambi

ente

e d

o so

lo (

ºC)

e U

R (

%)

(%) AB (%) extrativo T. Solo (ºC) T. ambiente (ºC) UR (%)

Figura 48 Parâmetros observados durante o estudo de variação metabólica das folhas de E.

florida.

AB (ácido betulínico); T. (temperatura); UR ( umidade relativa).

Pode-se observar que no verão (dezembro até março) ocorreu aumento de rendimento

extrativo, porém uma diminuição do teor de ácido betulínico. Já no inverno (maio até julho)

observou-se um aumento no teor de ácido betulínico e o rendimento extrativo diminui.

Não foi possível observar uma correlação entre temperatura ambiente e o teor de ácido

betulínico, porém quando se correlaciona com a temperatura do solo observa-se um aumento

do teor do ácido betulínico com a diminuição da temperatura do solo que correspondem aos

meses de junho e julho. Como o indivíduo utilizado para o estudo de variação da produção

metabólica encontra-se numa área cercada de outras espécies, o solo está sempre à sombra, o

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99

que nos leva a fazer uma associação da temperatura do solo com a quantidade de

luminosidade recebida pelo indivíduo e que poderia chegar até o solo. Assim, quanto mais

luminosidade maior será a temperatura do solo. Observou-se que ocorreu uma menor

produção de ácido betulínico quando houve o aumento da temperatura do solo.

Com relação ao estresse hídrico, este freqüentemente tem conseqüências significantes

nas concentrações de metabólitos secundários em plantas, e há vários relatos de que estas

condições geralmente levam a um aumento na produção de vários tipos de metabólitos

secundários. Em curto prazo parecem levar a um aumento da produção metabólica, enquanto a

longo prazo é observado um efeito oposto(GOBBO-NETO & LOPES, 2007; MARTINS et

al., 2000). Efeito este que não foi diferente na produção do ácido betulínico.

3.1.2 Desenvolvimento da planta

A idade e o desenvolvimento da planta, também são de considerável importância e

podem influenciar não só a quantidade total de metabólitos produzidos, mas também as

proporções relativas dos componentes da mistura (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).

No estudo deste parâmetro três indivíduos foram analisados: dois do campus da

FIOCRUZ e um do Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Observa-se a produção do ácido

betulínico nos três indivíduos conforme Figura 49.

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100

18,8922,15

29,35

13,82

out-10 mai-11

Teo

r (%

) de

AB

Ind. Estudo Sazonal 2 Ind. Fiocruz Ind. Jard. Botânico

64,66 61,22

35,40

16,79

out-10 mai-11

Ren

dim

ento

(%

) ex

trativ

o

Ind. Estudo Sazonal 2 Ind. Fiocruz Ind. Jard. Botânico

Figura 49 Comparação entre diferentes indivíduos de E. florida (a) Teor de ácido betulínico

analisado por CG-DIC; (b) Rendimento extrativo.

AB (ácido betulínico); Ind. (Indivíduo); Jard. (Jardim).

É importante mencionar que estes resultados não podem ser avaliados isoladamente,

uma vez que os dois indivíduos coletados na Fiocruz estão expostos, teoricamente, aos

mesmos fatores extrínsecos por estarem próximos, mas mesmo assim foram verificadas

diferenças de percentuais de produção do metabólito AB. Já o indivíduo coletado no Jardim

Botânico – RJ está exposto a outros fatores devido à localização, altitude, temperatura,

interação planta-inseto, luminosidade e diferentes nutrientes no solo apresentando um

percentual menor do metabólito AB, como primeira hipótese, este indivíduo é menos

estressado do que os indivíduos da Fiocruz.

(b)

(a)

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101

Vários fatores podem ter influenciado na diferença da produção de ácido betulínico

nestes indivíduos: o estresse, idade do indivíduo, água e micronutrientes, localização,

herbivoria, luminosidade e radiação UV.

Estes fatores não foram estudados profundamente, devido a falta de informações

disponíveis, mas pode-se avaliar superficialmente a influência deles e sugerir a interferência

na maior ou menor produção do ácido betulínico na espécie.

Na Figura 50 podem ser observadas as fotos de cada indivíduo utilizado neste estudo.

Pode-se observar que o indivíduo utilizado para o estudo sazonal apresenta: um razoável

número de espécies ao redor e que este compete por luz. Tal fato faz com que o indivíduo

apresente menor ramificação, tendo investido seu metabolismo no crescimento em altura,

Além disso sofreu estresse em função das coletas mensais para o estudo. Pelo seu

desenvolvimento parece ser um indivíduo mais jovem, mas não havia registro de idade de

nenhum indivíduo para fazer uma comparação. Recebe maior luminosidade e radiação UV

somente na parte apical e compete também pela água disponível no solo. Esses fatores

favorecem a produção do ácido betulínico em relação ao indivíduo localizado no Jardim

Botânico. Mas em relação ao 2º Indivíduo da Fiocruz, que está próximo, apresenta uma

produção menor do metabólito AB. O 2º Indivíduo da Fiocruz também possui outras espécies

ao seu redor, mas por estar localizado numa praça dentro do campus recebe cuidados de

jardinagem constantes e não sofreu constantes coletas, portanto, aparentemente apresentou um

melhor desenvolvimento.

Figura 50 Diferentes indivíduos de Eugenia florida que foram usados neste estudo (a)

Indivíduo usado para o estudo Sazonal; (b) 2º Indivíduo do campus da Fiocruz; (c) Indivíduo

do Jardim Botânico.

(a) (c) (b)

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102

3.2 Outras Espécies que Contém Ácido Betulínico

Foram pesquisadas na literatura outras espécies que apresentavam em sua composição

o ácido betulínico, com a finalidade de avaliar as metodologias desenvolvidas para análise dos

extratos com ácido betulínico e para comparação dos ensaios farmacológicos.

Os extratos brutos das outras espécies foram obtidos, conforme descrito na literatura.

Na Figura 51 pode-se observar os resultados de teor de ácido betulínico encontrados em cada

espécie e órgão estudado.

2,923,08

3,61

1,41

0,85

1,95

0,78

1,51

0,38

3,8

Polpa FrMaduros

Polpa FrVerdes

Casca FrMaduro

Casca FrVerde

Folha MeOH FolhaHexano

Fruto MeOH Fruto Hexano Raiz Rizoma

D. indica L. tomentosa N. nucifera

Teo

r (%

) de

AB

Figura 51 Rendimento de ácido betulínico em outras espécies e órgãos, analisados por CG-

DIC.

AB (ácido betulínico); Fr (Fruto); MeOH (Metanol).

Pode-se observar que os percentuais de ácido betulínico foram menores nas outras

espécies do que os obtidos para a E. florida. Os extratos das outras espécies foram analisados

pela metodologia analítica desenvolvida por CG-FID para análise do ácido betulínico na

folhas de Eugenia florida, mesmo com constituintes diferentes nas outras espécies foi possível

analisar qualitativamente e quantitativamente a substância de interesse.

Nos resultados obtidos pode-se avaliar a variação do ácido betulínico, em uma mesma

espécie, em diferentes órgãos. Nos extratos de Nelumbo nucifera, por exemplo, ocorreu uma

diferença entre os percentuais do ácido betulínico na raiz e no rizoma, mesmo sendo coletados

juntos e passando pelos mesmos processamentos primário e secundário. Isto ocorreu por que a

mesma substância pode estar presente em concentrações diferentes nos diversos órgãos de

uma mesma espécie, por isso, pode ser interessante durante uma pesquisa avaliar a substância

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103

desejada nos diversos órgãos da espécie. Como na maioria das vezes a atividade fitoterápica

ocorre devido a um conjunto de substâncias que compõe o extrato e não somente por uma

substância isolada, seria adequado fazer também uma avaliação da atividade farmacológica.

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104

Capítulo 4 Avaliação in vitro dos extratos obtidos nas diversas etapas de trabalho

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105

Os resultados descritos anteriormente demonstram a complexidade da utilização dos

metabólitos secundários obtidos de plantas, na estratégia de obtenção de fitofármacos.

MACIEL et al. (2002) exemplifica a importância de estudos multidisciplinares com plantas

medicinais, envolvendo a etnobotânica, a química e a farmacologia.

Pode-se dizer que a variação das substâncias nas planas durante o ano, a interação da

planta com o meio ambiente e a tecnologia farmacêutica utilizada na obtenção das preparações

farmacêuticas, mostram a importância da discussão sobre a padronização dos princípios ativos

e da estabilidade desses para a eficácia terapêutica.

Os extratos obtidos foram avaliados farmacologicamente a partir dos estudos prévios

relativos aos aspectos botânicos, agronômicos e fitoquímicos.

Os extratos utilizados foram os obtidos dos seguintes estudos:

• Os extratos metanólicos das folhas de Eugenia florida do estudo sazonal;

• Os extratos metanólicos dos outros indivíduos de E. florida e as outras espécies

que contém ácido betulínico.

4.1. Ensaios Citotóxicos

O primeiro estudo in vitro realizado foi o ensaio citotóxico. Este é importante para

verificar a toxidez de novas substâncias, principalmente no desenvolvimento de

medicamentos, pois o equilíbrio entre os efeitos farmacológicos e toxicológicos de uma

substância é um requisito importante, para sua aplicabilidade como futuro agente terapêutico.

(MELO et al., 2000).

A citotoxidade foi definida por Nardone (1977) como sendo o conjunto de alterações

da homeostase celular que leva a uma série de modificações que interferem na capacidade

adaptativa das células, bem como na sobrevivência, multiplicação e realização de suas funções

metabólicas. A intensidade da lesão celular depende de vários fatores, tais como a

concentração do material testado, o tempo de exposição, o tipo de célula, a capacidade da

substância em penetrar na célula, entre outras (HU & HSIUNG, 1989).

Para avaliar a citotoxidez dos extratos brutos e substâncias puras foi utilizado o sal de

tetrazolium MTT [3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)2,5-difenil brometo de tetrazolio], um sal que

avalia a viabilidade celular através da enzima, conforme metodologia descrita por Mosmann

(1983), com modificações.

O MTT possui coloração amarela e é absorvido pelas mitocôndrias, as quais reduzem o

sal através da ação da redutase mitocondrial, a um produto chamado cristal formazan, de

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106

coloração púrpura, que fica acumulado na forma de cristais. Proporcionalmente, quanto maior

a formação do cristal de formazan, maior é a viabilidade da célula. A formazana é extraída

através da adição de DMSO (dimetilsulfóxido). Após a adição do solvente, a análise é

realizada através do espectrofotômetro. Os dados obtidos são analisados comparando a

absorbância dos poços tratados com controles celulares, por análise de regressão linear,

logarítmica ou polinomial, conforme o comportamento apresentado pelos extratos naturais e

substâncias puras. Assim, com coeficiente de determinação (R2) próximo de 1 é possível

buscar a concentração necessária dos materiais testes para inibir em 50% a viabilidade das

células VERO (CC50).

Os resultados dos ensaios citotóxicos in vitro dos extratos e substâncias isoladas frente

as células VERO, estão apresentados nas Tabelas 20 e 21 através de suas CC50, e podem ser

visualizados nas Figuras 52, 53 e 54.

a) Estudo de sazonalidade

No estudo de sazonalidade CC50 maiores foram obtidos em amostras de extratos com

rendimentos extrativos maiores. As substâncias presentes, entretanto não são tão citotóxicas

ou sua ação conjunta diminui a citotoxidez dos extratos, se comparado com o AB isolado.

Tabela 20 Efeito citotóxico (CC50) de extratos do estudo Sazonal das folhas de Eugenia

florida DC e substâncias puras em células VERO.

Extratos e substâncias puras

CC50 (µg/mL) R2

EFHM Ago/2010 136 0,98 EFHM Set/2010 169 0,91 EFHM Out/2010 109 0,91 EFHM Nov/2010 165 0,83 EFHM Dez/2010 250 0,87 EFHM Jan/2011 144 0,91 EFHM Fev/2011 199 0,96 EFHM Mar/2011 217 0,98 EFHM Abr/2011 188 0,91 EFHM Mai/2011 164 0,99 EFHM Jun/2011 253 0,93 EFHM Jul/2011 178 0,99 EFHM 2º IND. 195 0,99

EFHM JB 457 0,50 Branco 362 0,98

AB Padrão 58 0,99 AB Isolado 78 0,73 Aciclovir 922 0,94

EFHM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano /Metanol); EFHM 2º IND (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol 2º Indivíduo); EFHM JB (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol Jardim Botânico); AB Padrão (ácido betulínico padrão); AB Isolado (ácido betulínico isolado); CC50 (Concentração Citotóxica Média).

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107

0

50

100

150

200

250

300

350

400

ago/1

0

set/1

0

out/1

0

nov/1

0

dez/1

0

jan/11

fev/1

1

mar

/11

abr/1

1

mai/11

jun/11

jul/11

BRANCO

AB PADRÃO

AB ISOLA

DO

µg/m

L

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

%

CC50 (%) AB (%) extrativo

Figura 52 Avaliação do efeito citotóxico em relação ao percentual de ácido betulínico e

rendimento extrativo dos ensaios de sazonalidade das folhas de E. florida.

AB (ácido betulínico); CC50 (Concentração Citotóxica Média); EFHM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol); AB Padrão (ácido betulínico padrão); AB Isolado (ácido betulínico isolado).

Observa-se que os extratos de E. florida apresentaram certa citotoxidade, mas quando

comparados com o ácido betulínico padrão e isolado os extratos foram menos citotóxicos, isto

corrobora a possibilidade de apresentarem atividade antineoplásica.

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108

b) Indivíduos diferentes

050

100150200250300350400450500

EFHM ou

t/10

EFHM m

ai/11

EFHM 2º

IND

EFHM JB

BRANCO

AB PADRÃO

AB ISOLA

DO

µg/m

L

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

%

CC50 % de AB % extrativo

Figura 53 Avaliação do efeito citotóxico com o percentual de ácido betulínico e rendimento

extrativo dos ensaios de variação metabólica das folhas de E. florida.

AB (ácido betulínico); CC50 (Concentração Citotóxica Média); EFHM (Extrato de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol); EFHM 2º IND (Extrato de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol 2º Indivíduo); EFHM JB (Extrato de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol Jardim Botânico); AB Padrão (ácido betulínico padrão); AB Isolado (ácido betulínico isolado).

O valor de CC50 do extrato EFHMJB comparado em relação ao branco, sugere a

influência do extrato na diminuição da citotoxidade, observado também quando se comprara

os resultados obtidos nos extratos EFHM outubro e EFHM maio, este último apresentou um

CC50 maior e apresenta um rendimento de extrato maior para um mesmo teor de ácido

betulínico. O mesmo observado nas amostras AB padrão e AB isolado, na ausência de extrato

onde o CC50 é praticamente o mesmo para concentrações próximas.

c) Espécies diferentes

Uma segunda forma de avaliar a influência da composição dos extratos na atividade do

ácido betulínico foi a avaliação dos extratos obtidos em espécies diferentes. Os resultados

podem ser observados na Tabela 21.

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109

Tabela 21 Efeito citotóxico (CC50) de extratos de outras espécies que contém ácido betulínico

e substâncias padrões em células VERO.

Extratos e substâncias puras

CC50 (µg/mL) R2

DCFM 486 0,99 DCFV 1455 0,87 DPFM 347 0,90 DPFV 151 0,90 LFOH 1224 0,92 LFRH 194 0,91 LFOM 1719 0,97 LFRM 1324 0,82 NCSE 1221 0,73 NRE 252 0,92

Branco 362 0,98 AB Padrão 58 0,99 AB Isolado 78 0,73 Aciclovir 922 0,94

DCFM (Extrato obtido da casca dos frutos maduros de Dillenia indica); DCFV (Extrato obtido da casca dos frutos verdes de Dillenia indica); DPFM (Extrato obtido da polpa dos frutos maduros de Dillenia indica); DPFV (Extrato obtido da polpa de frutos verdes de Dillenia indica); LFOH (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com n-Hexano); LFRH (Extrato obtido de frutos de Licania tomentosa com n-Hexano); LFOM (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com Metanol); LFRM (Extrato obtido de frutos de Licania tomentosa com Metanol); NCSE (Extrato obtido do rizomade Nelumbo nucifera com etanol); NRE (Extrato obtido da raiz de Nelumbo nucifera com etanol); AB Padrão (ácido betulínico padrão); AB Isolado (ácido betulínico isolado); CC50 (Concentração Citotóxica Média).

Na Figura 54 é possível observar que, na presença do extrato, não existe uma tendência

linear entre a concentração de ácido betulínico e CC50.

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110

0

50

100

150

200

250

300

350

400

DCFMDCFV

DPFMDPFV

LFOH

LFRH

LFOM

LFRM

NCSENRE

BRANCO

AB padr

ão

AB isolad

o

µg/m

L

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

%

CC50 Teor de AB CG

Figura 54 Avaliação da atividade citotóxica do ácido betulínico em extratos obtidos de outras

espécies

DCFM (Extrato obtido da casca dos frutos maduros de Dillenia indica); DCFV (Extrato obtido da casca dos frutos verdes de Dillenia indica); DPFM (Extrato obtido da polpa dos frutos maduros de Dillenia indica); DPFV (Extrato obtido da polpa dos frutos verdes de Dillenia indica); LFOH (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com n-Hexano); LFRH (Extrato obtido de frutos de Licania tomentosa com n-Hexano); LFOM (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com Metanol); LFRM (Extrato obtido de frutos de Licania tomentosa com Metanol); NCSE (Extrato obtido do rizomade Nelumbo nucifera com etanol); NRE (Extrato obtido da raiz de Nelumbo nucifera com etanol); AB Padrão (ácido betulínico padrão); AB Isolado (ácido betulínico isolado); CC50 (Concentração Média Citotóxica); Teor de AB CG – teor de ácido betulínico por cromatografia com fase gasosa.

Em aspectos gerais observou-se que os extratos de outras espécies apresentaram CC50

maior do que os extratos obtidos a partir de E. florida DC, em sua grande maioria, o que

significa que apresentaram menos citotoxidade, o que era de se esperar, pois estas espécies

apresentaram menor teor de ácido betulínico.

4.2 Ensaios em Células Tumorais

Os resultados da avaliação antitumoral in vitro dos extratos e substâncias isoladas

frente a linhagens celulares, estão apresentados nas Tabelas 22 e 23 através de suas CI50.

Neste estudo foram avaliados os extratos de Eugenia florida utilizados no estudo

sazonal, os outros indivíduos e as outras espécies que apresentavam ácido betulínico na sua

composição. Como referência foi utilizada a doxorrubicina (antibiótico antitumoral que inibe

o desenvolvimento do tumor) e a vincristina (fármaco imunosupressor) dois fármacos

amplamente utilizados na quimioterapia antitumoral. Padrão do ácido betulínico 90% Sigma

Aldrich.

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111

O efeito sinérgico do ácido betulínico com outras substâncias usadas para tratamento

do câncer como: doxorrubicina, cisplastina, taxol, VP16 e actiomicina D, já foi estudado e

observou-se que o ácido betulínico cooperou na indução da apoptose e na inibição do

crescimento do tumor (FULDA & DEBATIN, 2005).

a) Estudo de sazonalidade

Tabela 22 Efeito citotóxico de extratos do estudo Sazonal de folhas de Eugenia florida DC e

substâncias padrões em células neoplásicas.

CI 50 (µg/mL) Substância U251 MCF-7 NCI-

ADR/RES 786-0 NCI-

H460 OVOCAR-

3 HT29 HaCaT

EFHM AGO/10 26,9 29,0 26,3 32,0 27,7 2,2 27,4 25,7 EFHM SET/10 69,4 72,3 28,9 126,6 136,3 25,3 55,3 58,0 EFHM OUT/10 24,9 26,6 3,9 27,4 40,1 2,5 26,9 25,8 EFHM NOV/10 26,1 27,0 24,8 26,2 28,0 2,6 26,2 26,5 EFHM DEZ/10 26,1 27,7 25,2 30,0 34,6 4,2 28,8 25,0 EFHM JAN/11 23,7 24,1 6,7 26,3 24,3 2,1 26,3 9,8 EFHM FEV/11 45,6 46,9 26,8 88,1 83,3 3,2 76,3 16,0 EFHM MAR/11 27,1 27,1 29,8 29,6 37,4 21,5 28,5 25,7 EFHM ABR/11 28,0 29,7 26,5 59,3 45,4 4,2 28,7 26,6 EFHM MAI/11 24,3 36,6 9,2 91,8 45,3 1,6 54,3 26,7 EFHM JUN/11 25,2 27,0 24,9 29,0 26,6 21,7 27,8 26,6 EFHM JUL/11 26,6 28,0 25,9 28,1 27,6 6,6 28,8 25,5 EFHM 2º IND 23,7 24,8 24,1 26,9 25,5 3,0 26,7 26,3

EFHM JB 23,8 25,0 23,9 28,8 25,9 2,4 26,5 25,4 Doxorrubicina 0,029 0,043 0,12 0,041 <0,025 0,089 0,19 0,028

Vincristina <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 Padrão AB 2,9 8,1 6,9 3,2 9,3 2,5 5,9 3,0

U251 (glioma, SNC); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); OVOCAR-3 (ovário); HT29 (colon); HaCaT (queratinócito humano, célula normal imortalizada); EFHM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol); EFHM 2º IND (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol 2º Indivíduo); EFHM JB (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol Jardim Botânico); Padrão AB (ácido betulínico padrão); CI50 (Concentração média de inibição celular).

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112

0

20

40

60

80

100

120

140

160

ago/

10

set/

10

out/

10

nov/

10

dez/

10

jan/

11

fev/

11

mar

/11

abr/

11

mai

/11

jun/

11

jul/1

1

Dox

orru

bici

na

Vin

cris

tina

AB

Pad

rão

CI5

0 (µ

g/m

L)

U251

MCF-7

NCI-ADR/RES

786-0

NCI-H460

OVOCAR-3

HT29

HaCaT

Figura 55 Avaliação da concentração média de inibição celular (CI50) do extrato do estudo

Sazonal de folhas de Eugenia florida DC em linhagens tumorais.

U251 (glioma, SNC); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); OVOCAR-3 (ovário); HT29 (colon); HaCaT (queratinócito humano, célula normal imortalizada); EFHM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-HexanoMetanol); AB Padrão (ácido betulínico padrão); CI50 (Concentração média de inibição celular).

Na Tabela 22 observa-se que os extratos de E. florida apresentaram atividade mais

potente contra a linhagem de ovário (OVOCAR-3) principalmente no extrato do mês de

Maio/2011 (CI50= 1,6 µg/mL), chegando a ser melhor que o padrão de ácido betulínico (CI50=

2,5 µg/mL). Isso sugere uma afinidade dos extratos por esta linhagem e que provavelmente

existe(m) outra(s) substância(s) com atividade antineoplásica ou com sinergismo com o ácido

betulínico. Esse fato pode ser confirmado quando se compara os resultados obtidos de CI50

com o teor de ácido betulínico e observa-se que os meses de maior teor de AB (Figura 43a)

não foram os que apresentaram melhor atividade frente às células neoplásicas.

O extrato do mês de Outubro/2010 apresentou um bom resultado também para a

linhagem tumoral de ovário com fenótipo de resistência a múltiplas drogas (NCI-ADR/RES)

com CI50 = 3,9 µg/mL.

Como os ensaios foram realizados com os extratos brutos do estudo de variação

metabólica observa-se que a atividade pode aumentar ou diminuir dependendo do período de

coleta, este é um fator importante a ser avaliado no desenvolviemnto de um fitoterápico, pois

não se pode obter um medicamento que apresente vaiações de atividade.

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113

Em comparação aos fármacos doxorrubicina e vincristina os extratos de E. florida

apresentaram menor atividade, mas são extratos brutos com vários componentes comparados

com substâncias puras. Considerando esta observação pode-se afirmar que são resultados

bastante incentivadores para que novos estudos sejam realizados em frações purificadas.

Zuca et al. (2002), realizou ensaios com linhagens diferentes de carcinoma de ovário

(IGROV-1; OVOCAR-5; A2780) e de pulmão (H460, POGB; POGB-DX) e obteve resultados

bastante promissores com CI50, de 1,8 a 4,5 µg/mL para as linhagens de carcinoma ovário e de

1,5 a 4,2 µg/mL para as linhagens carcinoma de pulmão, utilizando somente a substância

ácido betulínico. Para este trabalho de dissertação foram utilizados extratos brutos e mesmo

assim obteve-se resultados promissores para linhagens de carcinoma de ovário OVOCAR-3 de

1,6 µg/mL e NCI-ADR/RES 3,9 µg/mL de CI50. Já para as linhages de carcinoma de pulmão

obteve-se 24,3 a 136,3 µg/mL.

Pisha et al. (1995), utilizaram linhagens diferentes para carcinoma de mama BC-1,

glioma U373 e Cólon Col-2 obtendo para todas as linhagens resultados maiores que 20

µg/mL. Neste trabalho foram obtidos os seguintes resultados: MCF-7 (mama) = 24,1 a 72,3

µg/mL, U251 (glioma, SNC) = 23,7 a 69,4 µg/mL e HT29 (cólon) = 26,3 a 55,3 µg/mL.

b) Espécies diferentes

A atividade antitumoral dos extratos obtidos em espécies diferentes demonstrou mais

uma vez a influência das substâncias presentes no extrato. Conforme pode ser visto na Figura

52 os extratos obtidos na E. florida apresentaram menor valor de CI50, sendo superior somente

ao padrão de ácido betulínico.

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114

0

50

100

150

200

250

300

DCFMDCFV

DPFMDPFV

L FOHLFRH

LFOMLFRM

NCSENRE

Doxor rubic ina

V in cr isti n

a

Pad rão A B

EFHM JAN/ 11

CI5

0 (

µg/m

L)

U251

MCF-7

NCI-ADR/RES

786-0

NCI-H460

PC-3

OVOCAR-3

HT29

HaCaT

Figura 56 Avaliação da concentração média de inibição celular (CI50) do extrato de outras

espécies em linhagens tumorais.

U251 (glioma, SNC); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); PC-3 (próstata); OVOCAR-3 (ovário); HT29 (colon); HaCaT (queratinócito humano, célula normal imortalizada) DCFM (Extrato obtido da casca dos frutos maduros de Dillenia indica); DCFV (Extrato obtido da casca dos frutos verdes de Dillenia indica); DPFM (Extrato obtido da polpa dos frutos maduros de Dillenia indica); DPFV (Extrato obtido da polpa dos frutos verdes de Dillenia indica); LFOH (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com n-Hexano); LFRH (Extrato obtido de frutos de Licania tomentosa com n-Hexano); LFOM (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com Metanol); LFRM (Extrato obtido de frutos de Licania tomentosa com Metanol); NCSE (Extrato obtido de rizomade Nelumbo nucifera com etanol); NRE (Extrato obtido da raiz de Nelumbo nucifera com etanol); AB Padrão (ácido betulínico padrão); EFHM (Extrato de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol); CI50 (Concentração média de inibição celular).

Nos ensaios realizados frente às células neoplásicas para as outras espécies com ácido

betulínico (Tabela 23) pode-se observar também uma seletividade para a linhagem de ovário

(OVOCAR-3), sendo praticamente inativa para as demais linhagens testadas. A espécie/órgão

mais ativa foi a raiz de Nelumbo nucifera com CI50= 0,54 µg/mL, resultado próximo ao obtido

pela vincristina e muito menor do que o padrão de AB. Quando é correlacionado com o teor de

AB (Figura 47), observa-se que no rizoma o teor foi muito maior (3,80%) do que na raiz

(0,38%), mas apresentou um CI50 = 7,4 µg/mL. Esse comportamento confirma a presença de

substâncias com atividade antineoplásicas nos extratos.

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115

Tabela 23 Efeito citotóxico de extratos de outras espécies que contém ácido betulínico e

substâncias padrões em células neoplásicas.

CI50 (µg/mL) Substância U251 MCF-

7 NCI-

ADR/RES 786-0 NCI-

H460 PC-3 OVOCAR-

3 HT29 HaCaT

DCFM >250 >250 >250 >250 >250 >250 2,3 >250 >250 DCFV >250 >250 >250 >250 >250 >250 14,5 >250 >250 DPFM 54,2 78,4 30,5 39,7 57,6 28,9 1,8 50,3 33,2 DPFV 27,3 31,0 27,8 30,1 26,5 26,1 1,4 29,2 29,6 LFOH 27,2 70,3 28,1 52,1 28,9 13,0 24,0 20,5 26,5 LFRH 30,1 100,5 25,5 33,6 25,7 25,2 2,3 34,2 27,8 LFOM 26,4 31,4 25,0 30,6 30,4 27,1 27,1 27,2 27,2 LFRM >250 >250 >250 >250 >250 189,1 1,4 >250 >250 NCSE 133,0 107,5 46,1 97,7 55,4 92,8 7,4 51,7 218,2 NRE 244,3 >250 25,7 >250 >250 86,4 0,54 >250 208,8

Doxorrubicina 0,026 0,025 <0,025 0,082 0,025 0,13 0,027 0,22 0,025 Vincristina <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 <0,25 Padrão AB 2,9 8,1 6,9 3,2 9,3 2,6 2,5 5,9 3,0

U251 (glioma, SNC); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); PC-3 (próstata); OVOCAR-3 (ovário); HT29 (colon); HaCaT (queratinócito humano, célula normal imortalizada). DCFM (Extrato obtido da casca dos frutos maduros de Dillenia indica); DCFV (Extrato obtido da casca dos frutos verdes de Dillenia indica); DPFM (Extrato obtido da polpa dos frutos maduros de Dillenia indica); DPFV (Extrato obtido da polpa dos frutos verdes de Dillenia indica); LFOH (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com n-Hexano); LFRH (Extratos obtidos de frutos de Licania tomentosa com n-Hexano); LFOM (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com Metanol); LFRM (Extratos obtidos dos frutos de Licania tomentosa com Metanol); NCSE (Extratos obtidos de rizomade Nelumbo nucifera com etanol); NRE (Extrato obtido da raiz de Nelumbo nucifera com etanol); Padrão AB (ácido betulínico padrão); CI50 (Concentração média de inibição celular).

Licania tomentosa apresentou a melhor atividade para os frutos extraídos com metanol

CI50 = 1,4 µg/mL, se comparados com os frutos extraídos com n-hexano e com as folhas, mas

em relação ao teor de AB foi o que apresentou um menor percentual.

Os resultados obtidos para Dillenia indica também foram interessantes para a

linhagem OVOCAR-3, com exceção do extrato da casca dos frutos verdes que se mostrou

menos ativa, mas provavelmente se deve por ser o extrato de menor percentual de ácido

betulínico. Dillenia indica é uma planta usada, tradicionalmente, em regiões tribais da Índia

na forma de sucos das folhas, casca e frutos para tratamento de câncer e diarréia. Kumar et al.

(2010) avaliaram a atividade citotóxica do extrato dos frutos para linhagens leucêmicas e

observaram que atividade anticancerígena dos frutos ocorre devido à presença ácido betulínico

nos mesmos. Na Tabela 24 pode-se observar os resultados de CI50 obtidos no artigo com o

extrato bruto metanólico, fração purificada com acetato de etila e o ácido betulínico isolado

frente às linhagens leucêmicas. A comparação dos resultados descritos na literatura com os

resultados obtidos para as linhagens testadas neste trabalho evidenciou que estes últimos

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116

apresentaram melhores atividades, o que incentiva estudos com frações purificadas nestas

linhagens.

Tabela 24 Resultados de CI50 obtidos por Kumar et al. (2010) para linhagens leucêmicas,

utilizando Dillenia indica.

CI50 (µg/mL) Substância U937 HL60 K562

Extrato Metanólico

328,80 ± 14,77 297,69 ± 7,29 275,40 ± 8,49

Fração Acetato de etila

240,0 ± 4,36 211,80 ± 5,30 241,96 ± 8,04

AB isolado 13,73 ± 0,89 12,84 ± 1,23 15,27 ± 1,16 U937 (células leucêmicas); HL60 (células leucêmicas); K562 (células leucêmicas) CI50 (Concentração média de inibição celular).

4.3 Índice de Seletividade

Uma correlação entre os valores de CC50 (concentração do extrato que reduz em 50 %

o crescimento celular) e CI50 (concentração do extrato capaz de inibir em 50 % das células

tumorais) obtidos, foi possível determinar o índice de seletividade (IS).

IS = CC50 VERO

CI50 células neoplásicas

O que expressa o índice de segurança da substância testada e, dessa forma possibilita a

realização de estudos posteriores mais detalhados tanto in vitro, quanto in vivo, ou seja o

índice de seletividade (IS) pode indicar a seletividade de uma substância entre uma linhagem

neoplásica e uma normal, indicando o potencial uso deste composto em testes clínicos.

Os valores de IS acima de 4 são considerados positivos e quanto maior é esse valor,

mais promissor é considerado o extrato (AMOROS et al., 1992).

Foi considerado significativo um valor do índice de seletividade maior ou igual a 2,0

(SUFFNESS & PEZZUTO, 1991), ou seja, este valor significa que o composto é duas vezes

mais ativo na linhagem de células neoplásicas do que em células normais (VERO). As Tabelas

25 e 26 mostram os índices de seletividade obtidos. Nas Figuras 57 e 58 pode-se visualizar a

variação de índice de seletividade de cada linhagem.

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117

a) Extratos de obtidos do estudo de Sazonalidade de E. florida

Tabela 25 Índice de Seletividade nas linhagens testadas nos extratos de Eugenia florida.

IS Substância U251 MCF-7 NCI-

ADR/RES 786-0 NCI-

H460 OVOCAR-

3 HT29

EFHM AGO/10 5,06 4,69 5,17 4,25 4,91 61,82 4,96 EFHM SET/10 2,44 2,34 5,85 1,33 1,24 6,68 3,06 EFHM OUT/10 4,38 4,10 27,95 3,98 2,72 43,60 4,05 EFHM NOV/10 6,32 6,11 6,65 6,30 5,89 63,46 6,30 EFHM DEZ/10 9,58 9,03 9,92 8,33 7,23 59,52 8,68 EFHM JAN/11 6,08 5,98 21,49 5,48 5,93 68,57 5,48 EFHM FEV/11 4,36 4,24 7,43 2,26 2,39 62,19 2,61 EFHM MAR/11 8,01 8,01 7,28 7,33 5,80 10,09 7,61 EFHM ABR/11 6,71 6,33 7,09 3,17 4,14 44,76 6,55 EFHM MAI/11 6,75 4,48 17,83 1,79 3,62 102,50 3,02 EFHM JUN/11 10,04 9,37 10,16 8,72 9,51 11,66 9,10 EFHM JUL/11 6,69 6,36 6,87 6,33 6,45 26,97 6,18 EFHM 2º ind 8,23 7,86 8,09 7,25 7,65 65,00 7,30

EFHM JB 19,20 18,28 19,12 15,87 17,64 190,42 17,25 Padrão AB 20,00 7,16 8,41 18,13 6,24 23,20 9,83

U251 (glioma, SNC); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); OVOCAR-3 (ovário); HT29 (colon); EFHM (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol); EFHM 2º IND (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol 2º Indivíduo); EFHM JB (Extrato obtido de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol Jardim Botânico); Padrão AB (ácido betulínico padrão); IS (Índice de Seletividade).

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118

0

5

10

15

20

25

30

EFHM AGO/10

EFHM SET/10

EFHM OUT/10

EFHM NOV/10

EFHM DEZ/10

EFHM JAN/11

EFHM FEV/11

EFHM MAR/11

EFHM ABR/11

EFHM MAI/1

1

EFHM JUN/11

EFHM JUL/11

EFHM 2º ind

EFHM JB

Padrão AB

Indi

ce d

e S

elet

ivid

ade

MCF-7 NCI-ADR/RES 786-0 NCI-H460 HT29 U251

020406080

100120140160180200

EFHM AGO/10

EFHM SET/10

EFHM OUT/10

EFHM NOV/10

EFHM DEZ/10

EFHM JAN/11

EFHM FEV/11

EFHM MAR/11

EFHM ABR/11

EFHM MAI/1

1

EFHM JUN/11

EFHM JUL /11

EFHM 2º ind

EFHM JB

Padrão A

B

Indi

ce d

e S

elet

ivid

ade

OVOCAR-3

Figura 57 Índice de Seletividade dos extratos de folhas de Eugenia florida usados estudo de

sazonalidade e dos outros indivíduos (a) avaliação do IS das linhagens U251, MCF-7, NCI-

ADR/RES, 786-0, NCI-H460, HT29; (b) avaliação da linhagem OVOCAR-3.

U251 (glioma, SNC); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); OVOCAR-3 (ovário); HT29 (colon); EFHM (Extrato de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol); EFHM 2º IND (Extrato de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol 2º Indivíduo); EFHM JB (Extrato de folhas de Eugenia florida com n-Hexano/Metanol Jardim Botânico); Padrão AB (ácido betulínico padrão); IS (Índice de Seletividade).

(a)

(b)

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Somente o extrato EFHM set/2010 apresentou valores de IS inferiores a 2. Todos os

extratos obtidos apresentaram índice de segurança satisfatório. No entanto nas células

OVOCAR-3 todos os extratos apresentaram um índice de seletividade altamente promissor (IS

>90) e menores valores de CI.

b) Diferentes espécies

Tabela 26 Índice de Seletividade (IS) nas linhagens testadas nas outras espécies que contém

ácido betulínico e substâncias padrões em células neoplásicas.

IS Substância U251 MCF-

7 NCI-

ADR/RES 786-0 NCI-

H460 PC-3 OVOCAR-

3 HT29

DCFM 1,94 1,94 1,94 1,94 1,94 1,94 211,30 1,94 DCFV 5,82 5,82 5,82 5,82 5,82 5,82 100,34 5,82 DPFM 6,40 4,43 11,38 8,74 6,02 12,01 192,78 6,90 DPFV 5,53 4,87 5,43 5,02 5,70 5,79 107,86 5,17 LFOH 45,00 17,41 43,56 23,49 42,35 94,15 51,00 59,71 LFRH 6,45 1,93 7,61 5,77 7,55 7,70 84,35 5,67 LFOM 65,11 54,75 68,76 56,18 56,55 63,43 63,43 63,20 LFRM 5,30 5,30 5,30 5,30 5,30 7,00 945,71 5,30 NCSE 9,18 11,36 26,49 12,50 22,04 13,16 165,00 23,62 NRE 1,03 1,01 9,81 1,01 1,01 2,92 466,67 1,01

Padrão AB 20,00 7,16 8,41 18,13 6,24 1,94 23,20 9,83 U251 (glioma, SNC); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); PC-3 (próstata); OVOCAR-3 (ovário); HT29 (colon); DCFM (Extrato obtido da casca dos frutos maduros de Dillenia indica); DCFV (Extrato obtido da casca dos frutos verdes de Dillenia indica); DPFM (Extrato obtido da polpa dos frutos maduros de Dillenia indica); DPFV (Extrato obtido da polpa dos frutos verdes de Dillenia indica); LFOH (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com n-Hexano); LFRH (Extrato obtido de frutos de Licania tomentosa com n-Hexano); LFOM (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com Metanol); LFRM (Extrato obtido de frutos de Licania tomentosa com Metanol); NCSE (Extrato obtido do rizomade Nelumbo nucifera com etanol); NRE (Extrato obtido da raiz de Nelumbo nucifera com etanol); Padrão AB (ácido betulínico padrão); IS (Índice de Seletividade).

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120

0102030405060708090

100

DCFMDCFV

DPFMDPFV

LFOH

LFRH

LFOMLF

RMNCSE

NRE

Padrão

AB

Indi

ce d

e S

elet

ivid

ade

U251 MCF-7 NCI-ADR/RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29

0100200300400500600700800900

1000

DCFMDCFV

DPFMDPFV

LFOH

LFRH

LFOM

LFRM

NCSENRE

Padrã

o AB

Indi

ce d

e S

elet

ivid

ade

OVOCAR-3

Figura 58 Índice de Seletividade (IS) dos extratos de outras espécies (a) avaliação do IS das

linhagens U251, MCF-7, NCI-ADR/RES, 786-0, NCI-H460, HT29; (b) avaliação da linhagem

OVOCAR-3.

U251 (glioma, SNC); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); PC-3 (próstata); OVOCAR-3 (ovário); HT29 (colon); DCFM (extrato obtido da casca dos frutos maduros de Dillenia indica); DCFV (Extrato obtido da casca dos frutos verdes de Dillenia indica); DPFM (Extrato obtido da polpa de frutos maduros de Dillenia indica); DPFV (Extrato da polpa dos frutos verdes de Dillenia indica); LFOH (Extrato obtido de folhas de Licania tomentosa com n-Hexano); LFRH (Extrato obtido dos frutos de Licania tomentosa com n-Hexano); LFOM (Extrato obtido das folhas de Licania tomentosa com Metanol); LFRM (Extrato obtido dos frutos de Licania tomentosa com Metanol); NCSE (Extrato obtido do rizomade Nelumbo nucifera com etanol); NRE (Extrato obtido da raiz de Nelumbo nucifera com etanol); Padrão AB (ácido betulínico padrão).

(b)

(a)

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121

Os extratos de outras espécies também apresentaram um índice de seletividade

promissor principalmente para a linhagem OVOCAR-3 com resultados de até 945,71, o que

significa que apresenta uma seletividade muito grande pelas células tumorais.

Alguns autores descrevem que o ácido betulínico exerce citotoxidade seletiva em

linhagens de células tumorais, mas não sobre células humanas sadias (FULDA & DEBATIN

2005; ZUCO et al., 2002).

6 CONCLUSÃO

6.1 Conclusões Gerais

De forma geral e considerando que os extratos das folhas de Eugenia florida DC

apresentam várias substâncias na sua composição, os métodos desenvolvidos mostraram-se

eficientes para: extração, identificação, quantificação, isolamento e purificação do ácido

betulínico.

Os ensaios farmacológicos realizados conduziram à continuidade do desenvolvimento

de um fitoterápico antitumoral. Primeiramente pelo efeito sinérgico que pode ser observado no

extrato. Mesmo com variações de teor durante o ano pode-se verificar uma constância na

atividade nas linhagens tumorais, esse é um fato importante no desenvolvimento de um

fitoterápico.

6.2 Conclusões Específicas

Desenvolvimento de Metodologias Analíticas

� As duas metodologias analíticas desenvolvidas por CG-DIC e CCF/Densitometria,

atenderam os parâmetros de validação descritos na RE (Resolução da ANVISA) nº

899/2003, o que sugere a confiabilidade dos resultados de identificação e quantificação do

ácido betulínico, independente do método de extração e a espécie utilizada.

� O resultado de caracterização por CG-EM confirmou a presença do ácido betulínico na

matriz. O resultado de RMN comprovou a eficiência da metodologia desenvolvida por

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122

cromatografia tipo “flash” para o isolamento e a recristalização para purificação do ácido

betulínico a 98,5%, mais puro do que o padrão Sigma Aldrich de 90%.

Avaliação das Técnicas de Extração

� A matriz de E. florida apresenta uma característica polar, por isso o rendimento de

extração é maior com solventes polares como o metanol, mas o ácido betulínico por ser

uma substância com características polares e apolares e apresentou uma melhor extração

com os solventes de constante dielétricas menores como o acetato de etila e o clorofórmio.

� As técnicas que apresentaram um maior teor de ácido betulínico extraído foram:

percolação e maceração.

� As técnicas de ultrassom e soxhlet apresentaram menor teor de ácido betulínico

provavelmente pela degradação do mesmo pelas ondas ultrassônicas e uso de

temperaturas.

� No estudo de diferentes tamanhos de partículas para as folhas de E. florida, observou-se

que para extração do ácido betulínico, o melhor tamanho foi de 0,85 mm, apresentando um

maior percentual de ácido betulínico. Como os resultados com as linhagens de células

tumorais demonstraram que existem outras substâncias presentes nas folhas de E. florida

que também possuem atividade antitumoral, se faz necessário testar os extratos obtidos das

diferentes granulometrias de folhas de E. florida nas linhagens celulares para verificar se

realmente o melhor tamanho seria 0,85 mm com solvente acetato de etila (que apresentou

um maior percentual de AB) ou se a forma pulverizada (que apresentou um menor

percentual de AB, mas com um alto rendimento extrativo e consequentemente um maior

número de substâncias extraídas). Com este estudo pode-se concluir que é importante

diminuir o tamanho da partícula e obter uma amostra com granulometria homogênea, o

que facilita muito a solubilização das substâncias.

Obtenção dos Extratos

� No estudo de variação metabólica os meses de junho e julho apresentaram um maior

percentual de teor de ácido betulínico. Mas para afirmar que um determinado fator está

correlacionado a produção de AB, estudos mais específicos devem ser realizados

correlacionando conhecimentos ambientais, agronômicos e biológicos de diversos

indivíduos.

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123

� Os estudos realizados com as outras espécies que contém ácido betulínico em sua

composição apresentaram resultados de teor de AB abaixo de 4%, o que foi considerado

muito baixo em relação à média de 10,25% dos resultados obtidos com E. florida.

Avaliação in vitro dos extratos obtidos nas diversas etapas do trabalho

� Os extratos de Eugenia florida apresentaram citotoxidade menor do que o padrão de ácido

betulínico e a maioria apresentou o Índice de Seletividade maior que dois, significando

que o extrato apresenta mais afinidade para linhagens neoplásicas do que para as linhagens

sadias. A atividade antitumoral continua independente da variação de teor do ácido

betulínico no extrato o que sugere a existência de outras substâncias no extrato que

apresentam atividade antitumoral e/ou um efeito sinérgico com o ácido betulínico. Esses

resultados definem que, neste caso, seria melhor desenvolver um medicamento

fitoterápico do que um fitofármaco.

� Ressalta-se a afinidade pela linhagem OVOCAR-3, onde os resultados foram bastante

interessantes principalmente para o mês de Maio/2011 com CI50= 1,6 µg/mL, que foi

melhor do que o padrão do ácido betulínico com CI50= 2,5 µg/mL. Esse fato sinaliza a

novas pesquisas para o desenvolvimento de um antitumoral para câncer de ovário, no

entanto outros estudos devem ser desenvolvidos.

� Os extratos de E. florida apresentaram menor atividade em comparação aos fármacos

doxorrubicina e vincristina, mas é importante considerar que tratam-se de extratos brutos e

que são necessários mais estudos para obter frações purificadas que atendam a atividade

desejada.

� Para as outras espécies estudadas foram observados bons resultados de citotoxidade para

os extratos das cascas dos frutos verdes de D. indica; dos frutos extraídos com metanol e

das folhas extraídas com n-hexano e metanol de L. tomentosa e do rizomade N. nucifera,

que apresentaram valores de CC50>1.000 µg/ml. As espécies estudadas também

apresentam uma seletividade pela linhagem OVOCAR-3, a espécie/órgão mais ativa

contra esta linhagem foi a raiz de Nelumbo nucifera com CI50= 0,54 µg/mL. Como se

trata da raiz de uma planta torna-se menos vulnerável à variações sazonais, o que viabiliza

o desenvolvimento de um fitoterápico, sendo necessário uma programação anula de

cultivo.

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124

7 SUGESTÃO E PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS

O uso de folhas de E. florida como um fitoterápico associado à terapia para tratamento

de câncer, pode ser uma grande descoberta para a fitoterapia no Brasil e podendo apresentar

um custo muito menor do que os fármacos usados hoje para tratamento, no entanto mais

estudos devem ser realizados.

A partir dos resultados aqui apresentados e discutidos têm-se como metas para futuros

trabalhos:

1 - Continuidade do estudo de sazonalidade por mais um ou dois anos;

2 – Obtenção de frações purificadas do extrato das folhas de E. florida e avaliação da

atividade antitumoral destas in vitro, em linhagens tumorais e com linhagens celulares

normais;

3 – Avaliação da atividade in vitro dos extratos obtidos com diferentes tamanhos de

partículas;

4 – Estudo de estabilidade dos extratos;

5 – Estudos de pré-formulação;

6 – Ensaios de toxicidade in vivo dos extratos, frações e pré-formulações que

apresentarem atividade frente aos ensaios preliminares in vitro;

7 – Desenvolvimento de uma formulação.

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137

APÊNDICE A Protocolo de Validação de CG-DIC

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138

Protocolo de validação de metodologia analítica para determinação do teor de Ácido

Betulínico (AB) em extratos Eugenia florida DC (EF) por CG-DIC

1 – ABRANGÊNCIA

Este protocolo descreve o procedimento utilizado para validar um método por

cromatografia gasosa (CG) / detector de ionização de chama (DIC) para identificar e

quantificar o ácido betulínico em extratos de Eugenia florida DC, oriundos de diversas

técnicas extrativas e solventes.

2 – NORMAS E DOCUMENTOS A CONSULTAR

Normas de Validação - Re 899/03.

3 – DEFINIÇÕES Extrato – Extratos obtidos de folhas de Eugenia florida DC contendo ácido betulínico.

Teste de Grubbs (G) – É realizado para um valor suspeito, podendo este ser o maior ou o

menor valor. Valores aberrantes são valores diferentes, não necessariamente errados, são

valores que não pertencem à população que se está estudando.

Teste F – É utilizado para comparar variâncias.

Teste t – É utilizado para comparar médias.

Teste de Cochram (C) – Verifica a homogeneidade das variâncias. Consiste em calcular todas

as variâncias evolvidas no experimento e dividir a maior delas pela soma de todas. É utilizado

para verificar se um dado método é homocedástico.

Número de graus de liberdade (v) – É o número de desvios independentes.

Média (x) – É obtida dividindo-se a soma das observações pelo número delas.

Variância (s2) – É uma medida da dispersão estatística de uma variável aleatória, indicando

quão longe em geral os valores obtidos se encontram dos valores esperados.

Desvio-padrão (s) – É uma medida da dispersão dos dados, obtida pela raiz quadrada da

variância.

Desvio-padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação – É uma medida relativa da

dispersão dos dados, obtida pelo percentual que o desvio-padrão representa em relação à

média.

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4 – CRITÉRIOS DE DESEMPENHO

Injetar todas as amostras em triplicata, a menos que outro procedimento esteja descrito

para o teste. Em todas as análises da validação, utilizar uma isoterma inicial de 200 ºC por 2

minutos; rampa de 15 ºC/min até 350 ºC; isoterma final de 13 minutos.

A cada dia de análise, realizar um teste de adequação do sistema pelo

acompanhamento dos seguintes parâmetros:

• Desvio padrão relativo entre 3 injeções de uma mesma amostra: inferior a 1,00 %.

• Tempo de retenção do ácido betulínico: variação inferior a 5,00 %.

Pesquisar a presença de valores aberrantes por meio do teste de Grubbs em todos os conjuntos

de dados obtidos no processo de validação. Caso o valor obtido seja aberrante, desconsiderar o

resultado e refazer a análise. Utilizar nível de confiança de 95 % (α = 0,05) em todos os

ensaios.

Teste de Grubbs: Gcalculado = (xi-xm)

s

Onde: xi – valor individual (suspeito de ser aberrante)

xm – média aritmética de todos os valores

s – desvio-padrão

Média: xm = Σxi

n

Onde: Σxi – somatório dos valores individuais

n – número de dados

Desvio-padrão: √ Σ(xi – xm)2

(n-1)

Onde: (n-1) – número de graus de liberdade

Comparar o valor de Gcalculado com o valor de Gtabelado.,

Se Gcalculado > Gtabelado, o valor suspeito é aberrante

Gtabelado (n=3; α=0,05) 1,155

Gtabelado (n=9; α=0,05) 2,215

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4.1. SELETIVIDADE

É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em presença de outros

componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.

(Resolução RE 899, 29/05/03)

4.1.1. INTERFERÊNCIA DA MATRIZ (substâncias componentes do extrato)

Este teste é realizado para verificar a interferência das substâncias componentes do extrato na

análise.

Procedimento

Pesar em triplicata 1,0 mg do padrão analítico de ácido betulínico para um balão volumétrico

de 1,0 mL e avolumar com metanol. Transferir 100 µL da solução para um vial e aguardar o

solvente evaporar. Adicionar 1,0 mL de diazometano, aguardar evaporar e adicionar 1,0 mL

de metanol. Realizar o mesmo procedimento para preparo da amostra.

Resultados que devem ser apresentados

Cromatogramas das análises em comparação do extrato e padrão de ácido betulínico.

Teste F para comparação de variâncias (s2) e teste t para comparação de médias entre os

resultados obtidos nas análises do produto e do padrão.

Teste F: Fcalculado = s2maior

s2menor

Onde: s2maior – maior variância

s2menor – menor variância

Se as variâncias forem iguais (ver abaixo em critérios de aceitação):

Teste t: tcalculado = (xm1 – xm2)

(sag √ [(1/n1) + (1/n2)]

Onde: sag – desvio-padrão agrupado

xm1 – média dos dados do primeiro conjunto

xm2 – média dos dados do segundo conjunto

n1 – número de dados do primeiro conjunto

n2 – número de dados do segundo conjunto

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Desvio-padrão agrupado: sag = √ {[(n 1 – 1)s12] + [(n2 – 1)s2

2]}

(n1 + n2 – 2)

Se as variâncias forem diferentes (ver abaixo em critérios de aceitação):

Teste t: tcalculado = (xm1 – xm2)

√ [(s12/n1) + (s2

2/n2)]

Onde: s12 – variância dos dados do 1° conjunto

s22 – variância dos dados do 2° conjunto

Critérios de aceitação

A pureza espectral do sinal cromatográfico referente ao ácido betulínico deve ser superior a

0,99 em todos os testes.

As médias das áreas do ácido betulínico obtidas no extrato e no padrão devem ter variâncias e

médias iguais, demonstradas pelos testes F e t, respectivamente.

Comparar o valor de Fcalculado com o valor de Ftabelado.

Se Fcalculado > Ftabelado, as variâncias são diferentes.

Ftabelado (n=9/9;

α=0,05) 4,026

Comparar o valor de tcalculado com o valor de ttabelado.

Se tcalculado > ttabelado, as médias são diferentes.

ttabelado (n=9/9;

α=0,05) 2,120

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4.2. LINEARIDADE

A linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados

obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um

intervalo especificado. (Resolução RE 899, 29/05/03)

Procedimento

Preparar curvas de 6 níveis de concentrações igualmente espaçadas em triplicatas no intervalo

estudado. Preparar uma solução-estoque do produto pela pesagem de 1,0 mg de padrão de

ácido betulínico num balão volumétrico de 10,0 mL avolumar com metanol e reservar.

Preparar a curva pela adição do volume da solução-estoque descrito na Tabela 1 em balão de

1,0 mL.

Tabela 1 – preparo da curva para avaliação da linearidade

nível concentração (%)

concentração (mg/mL)

volume da solução-estoque (µL)

1 1 0,001 10

2 2 0,002 20

3 4 0,004 40

4 6 0,006 60

5 8 0,008 80

6 10 0,010 100

Resultados que devem ser apresentados

Cromatogramas das análises.

Teste de Cochram para avaliação da homocedasticidade, gráfico de resíduos, regressão linear,

equação da reta e coeficiente de correlação (r). Todos estes parâmetros são obtidos por meio

da Planilha em Excel. O coeficiente de correlação (r) é calculado pela raiz quadrada do

coeficiente de determinação (r2), fornecido pela planilha eletrônica.

Critérios de aceitação

Verificar se há homocedaticidade pelo teste de Cochram realizado pela planilha eletrônica.

Verificar se o gráfico de resíduos não apresenta tendência.

O coeficiente de correlação (r) mínimo deve ser 0,99.

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143

4.3. LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO

O limite de detecção é a menor quantidade de analito presente na amostra que pode ser

detectada, embora não necessariamente quantificada, independente do ruído. O limite de

quantificação, por sua vez, é a menor quantidade de analito presente na amostra que pode ser

quantificada com exatidão e precisão aceitáveis.

Procedimento

A mesma curva usada para Linearidade pode ser usada para avaliar o limite de detecção.

Resultados que devem ser apresentados

Cromatogramas das análises.

Planilha e gráficos com as curvas, conforme Planilha em Excel.

Determinar os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) por meio das fórmulas:

LD = 3,28 s / b

LQ = 10 s / b

Onde: s – desvio-padrão dos interceptos com o eixo y (coeficientes lineares) das três curvas

obtidas

b – inclinação média (média dos coeficientes angulares) das três curvas obtidas

Critério de aceitação

Não se aplica para Limites de detecção e quantificação.

4.4 ACURÁCIA

A acurácia é o valor de resultado mais próximo do valor real. As análises são realizadas em

triplicata em três níveis compreendidas entre 50 a 150 % do valor da concentração de análise.

Procedimento

Preparar uma solução-estoque do extrato em metanol pela pesagem de 2,0 mg e transferir para

um balão volumétrico de 10,0 mL, obtendo-se uma concentração na solução-estoque de 0,2

mg/mL.

Preparar uma solução-estoque do padrão em metanol pela pesagem de 1,0 mg e transferir para

um balão volumétrico de 5,0 mL, obtendo-se uma concentração na solução-estoque de 0,2

mg/mL.

Injetar em triplicata as amostras preparadas conforme o seguinte procedimento:

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Tabela 2 - Preparo das amostras para avaliação da acurácia

Amostra Volume de MeOH (µL)

Volume da solução-estoque (µL) de

extrato

Volume da solução-estoque (µL) de

padrão

Extrato 100,0 900,0 -

Mix 10 90,0 900,0 10,0

Mix 50 50,0 900,0 50,0

Mix 100 - 900,0 100,0

4.5 RECUPERAÇÃO

É calculada como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado

a amostra (Resolução RE 899, 29/05/03).

Procedimento

Preparar uma solução-estoque do extrato em metanol pela pesagem de 2,0 mg e transferir para

um balão volumétrico de 10,0 mL, obtendo-se uma concentração na solução-estoque de 0,2

mg/mL.

Preparar uma solução-estoque do padrão em metanol pela pesagem de 1,0 mg e transferir para

um balão volumétrico de 5,0 mL, obtendo-se uma concentração na solução-estoque de 0,2

mg/mL.

Injetar em triplicata as amostras preparadas conforme o seguinte procedimento:

Tabela 3 - Preparo das amostras para avaliação da recuperação

Amostra Volume de MeOH (µL)

volume da solução-estoque (µL)

Extrato 100,0 900,0

Padrão 900,0 100,0

Mistura - 900,0 extrato 100,0 padrão

Resultados que devem ser apresentados

Cromatogramas das análises.

Resultados de recuperação (%) obtidos por meio da fórmula:

recuperação (%) = (encontrado x 100)

adicionado

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145

Onde:

encontrado – concentração (mg/mL) calculada por meio da curva de calibração

adicionado – concentração (mg/mL) adicionada em cada amostra

Critério de aceitação

Comparar os resultados obtidos no teste de estabilidade para o padrão de referência e a

solução estoque do extrato. O teor de estabilidade deve ser no mínimo 99% do teor inicial da

solução-estoque.

Os resultados de recuperação devem ficar compreendidos entre 98,0 e 102,0%.

4.6 ROBUSTEZ

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas

variações dos parâmetros analíticos (Resolução RE 899, 29/05/03).

Procedimento

Pesar 1,0 mg do padrão analítico de ácido betulínico para um balão volumétrico de 1,0 mL e

avolumar com metanol. Transferir 100 µL da solução para um vial e aguardar o solvente

evaporar. Adicionar 1,0 mL de diazometano, aguardar evaporar e adicionar 1,0 mL de

metanol. Realizar o mesmo procedimento para preparo da amostra.

Injetar em triplicata as amostras preparadas do padrão e extrato, variando os seguintes

parâmetros:

• Aumento da temperatura em 5ºC do injetor;

• Diminuição da temperatura em 5ºC do injetor;

• Aumento do fluxo em 0,1 µL/min;

• Diminuição do fluxo em 0,1 µL/min;

• Aumento da temperatura em 5ºC do detector;

• Diminuição da temperatura em 5ºC do detector;

• Aumento de todos os parâmetros ao mesmo tempo;

• Diminuição de todos os parâmetros ao mesmo tempo.

Critério de aceitação

As pequenas variações não podem alterar de forma significativa os resultados.

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4.7 ESPECIFICIDADE E SELETIVIDADE

Este parâmetro define a capacidade do método em detectar a substância de interesse na

presença de outros componentes da matriz.

Procedimento

Pesar 1,0 mg do padrão analítico de ácido betulínico (AB) para um balão volumétrico de 1,0

mL e avolumar com metanol (solução-estoque). Transferir 100 µL da solução para um vial e

aguardar o solvente evaporar. Adicionar 1,0 mL de diazometano, aguardar evaporar e

adicionar 1,0 mL de metanol. Realizar o mesmo procedimento para preparo o padrão do ácido

ursólico (AU).

Injetar em triplicata as amostras preparadas conforme Tabela 4.

Tabela 4 - Preparo das amostras para avaliação da especificidade/seletividade.

Amostra volume da solução-estoque (µL) de AB

volume da solução-estoque (µL) de AU

Padrão ácido betulínico

1000,0 -

Padrão ácido ursólico

- 1000,0

Mistura ácido betulínico e

ursólico

400,0 600,0

Resultados que devem ser apresentados

Cromatogramas das análises.

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APÊNDICE B Protocolo de Validação de CCF/Densitometria

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Protocolo de validação de metodologia analítica para determinação do teor de

Ácido Betulínico (AB) em extratos de Eugenia florida DC por CCF/Densitometria

1 – ABRANGÊNCIA Este protocolo descreve o procedimento utilizado para validar o método por cromatografia de camada fina (CCF) / Densitometria para identificar e quantificar o ácido betulínico em extratos de Eugenia florida DC, oriundos de diversas técnicas extrativas e solventes. 2 – NORMAS E DOCUMENTOS CONSULTADOS Normas de Validação - Re 899/03.

3 – DEFINIÇÕES Extrato – Extratos obtidos de folhas de Eugenia florida DC contendo ácido betulínico.

Teste de Grubbs (G) – É realizado para um valor suspeito, podendo este ser o maior ou o

menor valor. Valores aberrantes são valores diferentes, não necessariamente errados, são

valores que não pertencem à população que se está estudando.

Teste F – É utilizado para comparar variâncias.

Teste t – É utilizado para comparar médias.

Teste de Cochram (C) – Verifica a homogeneidade das variâncias. Consiste em calcular todas

as variâncias evolvidas no experimento e dividir a maior delas pela soma de todas. É utilizado

para verificar se um dado método é homocedástico.

Número de graus de liberdade (v) – É o número de desvios independentes.

Média (x) – É obtida dividindo-se a soma das observações pelo número delas.

Variância (s2) – É uma medida da dispersão estatística de uma variável aleatória, indicando

quão longe em geral os valores obtidos se encontram dos valores esperados.

Desvio-padrão (s) – É uma medida da dispersão dos dados, obtida pela raiz quadrada da

variância.

Desvio-padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação – É uma medida relativa da

dispersão dos dados, obtida pelo percentual que o desvio-padrão representa em relação à

média.

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4 – CRITÉRIO GERAL DE ACEITAÇÃO

Para o método ser validado teve que atender aos seguintes critérios:

*O extrato foi obtido de uma amostra autêntica de Eugenia florida;

*Todos os critérios de aceitação especificados;

*Todos os desvios foram contemplados pela seção de “Robustez”

5 – CRITÉRIOS DE DESEMPENHO

Aplicar todas as amostras em triplicata. Em todas as análises da validação, foram

utilizadas placas de CCF de Gel de Sílica 60 F254 medindo 10 x 20 cm, aplicaçao de 10µL em

bandas de 5 mm com intervalos de 2 mm. Leitura a 190 nm, com slit de 5,00 mm X 0,1 mm.

A cada dia de análise, realizou-se um teste de adequação do sistema pelo

acompanhamento dos seguintes parâmetros para aplicação da solução padrão:

• O sinal da aplicação da solução padrão com um Rf de 0.6.

• Após a derivatização, aparecimento de uma coloração roxa.

• Desvio padrão relativo entre 3 aplicações de uma mesma amostra: inferior a 1,00 %.

Pesquisar a presença de valores aberrantes por meio do teste de Grubbs em todos os

conjuntos de dados obtidos no processo de validação. Caso o valor obtido fosse aberrante,

desconsiderar o resultado e refazer a análise. Utilizar nível de confiança de 95 % (α=0,05) em

todos os ensaios.

Teste de Grubbs: Gcalculado = (xi-xm)

s

Onde: xi – valor individual (suspeito de ser aberrante)

xm – média aritmética de todos os valores

s – desvio-padrão

Média: xm = Σxi

n

Onde: Σxi – somatório dos valores individuais

n – número de dados

Desvio-padrão: √ Σ(xi – xm)2

(n-1)

Onde: (n-1) – número de graus de liberdade

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Comparar o valor de Gcalculado com o valor de Gtabelado.

Se Gcalculado > Gtabelado, o valor suspeito é aberrante.

Gtabelado (n=3; α=0,05) 1,155

6. PREPARO DO SISTEMA

6.1 PREPARO DA FASE ESTACIONÁRIA

Eluir as cromatoplacas com metanol e secar a 110 ºC por 30 minutos em estufa.

Armazenar em dessecador até o uso.

6.2 PREPARO DA FASE MÓVEL

Preparar 100,0 mL de uma solução n-Hexano :Acetato de Etila:Ácido Acético

(7:3:0.3).

Colocar em uma cuba 20 x 10 cm e saturar por 5 minutos, antes da eluição da

cromatoplaca.

6.3 PREPARO DO REAGENTE DE DERIVATIZAÇÃO

Preparo da Solução A: Pesar 1 g de Vanilina e solubilizar em 100 mL de Metanol.

Acondicionar em frasco devidamente rotulado e armazenar.

Preparo da Solução B: Adicionar lentamente 10 mL de ácido sulfúrico a 90 mL de

Metanol sob resfriamento. Acondicionar em frasco devidamente rotulado e armazenar.

Preparar uma mistura de 5,0 mL da solução A com 5,0 mL da solução B, acondicionar

em um recipiente de vidro e proceder a imersão da cromatoplaca depois de eluida.

Revelar com aquecimento da cromatoplaca a 110 ºC por 5 minutos em placa de

aquecimento.

7. SELETIVIDADE

É a capacidade que o método possui de medir exatamente uma substância em presença de

outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.

(Resolução RE 899, 29/05/03)

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151

7.1. INTERFERÊNCIA DA MATRIZ (substâncias componentes do extrato)

Realizar este teste para verificar a interferência das substâncias componentes do extrato na

análise.

Procedimento

Pesar em triplicata 1,0 mg do padrão analítico de ácido betulínico para um balão volumétrico

de 1,0 mL e avolumar com metanol, ultrassonicar por 2 minutos e reservar em ambiente

refrigerado. Transferir a solução para um vial. Realizar o mesmo procedimento para preparo

da amostra.

Resultados apresentados

Densitogramas das análises e foto da placa derivatizada em comparação do extrato e padrão

de ácido betulínico.

Teste F para comparação de variâncias (s2) e teste t para comparação de médias entre os

resultados obtidos nas análises do produto e do padrão.

Teste F: Fcalculado = s2maior

s2menor

Onde: s2maior – maior variância

s2menor – menor variância

Se as variâncias forem iguais (ver em critérios de aceitação):

Teste t: tcalculado = (xm1 – xm2)

(sag √ [(1/n1) + (1/n2)]

Onde: sag – desvio-padrão agrupado

xm1 – média dos dados do primeiro conjunto

xm2 – média dos dados do segundo conjunto

n1 – número de dados do primeiro conjunto

n2 – número de dados do segundo conjunto

Desvio-padrão agrupado: sag = √ {[(n 1 – 1)s12] + [(n2 – 1)s2

2]}

(n1 + n2 – 2)

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152

Se as variâncias forem diferentes (ver em critérios de aceitação):

Teste t: tcalculado = (xm1 – xm2)

√ [(s12/n1) + (s2

2/n2)]

Onde: s12 – variância dos dados do 1° conjunto

s22 – variância dos dados do 2° conjunto

Critérios de aceitação

A pureza espectral do sinal densitográfico referente ao ácido betulínico deve ser superior a

0,99 em todos os testes.

As médias das áreas do ácido betulínico obtidas no extrato e no padrão devem ter variâncias e

médias iguais, demonstradas pelos testes F e t, respectivamente.

Comparar o valor de Fcalculado com o valor de Ftabelado.

Se Fcalculado > Ftabelado, as variâncias são diferentes.

Ftabelado (n=9/9;

α=0,05) 4,026

Comparar o valor de tcalculado com o valor de ttabelado.

Se tcalculado > ttabelado, as médias são diferentes.

ttabelado (n=9/9;

α=0,05) 2,120

8. LINEARIDADE

A linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados

obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um

intervalo especificado. (Resolução RE 899, 29/05/03)

Procedimento

Preparar curvas de 6 níveis de concentrações igualmente espaçadas em triplicatas. Preparar

uma solução-estoque do produto pela pesagem de 1,0 mg de padrão de ácido betulínico num

balão volumétrico de 10,0 mL avolumar com metanol e reservar.

Preparar a curva pela adição do volume da solução-estoque descrito na Tabela 1 em balão de

1,0 mL.

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153

Tabela 1 – Preparo da curva para avaliação da linearidade

Nível Concentração (%)

Concentração (mg/mL)

Volume da solução-estoque (µL)

Volume de metanol (µL)

1 10 0,01 100 900

2 20 0,02 200 800

3 40 0,04 400 600

4 60 0,06 600 400

5 80 0,08 800 200

6 100 0,10 1000 -

Resultados apresentados

Densitogramas das análises.

Teste de Cochram para avaliação da homocedasticidade, gráfico de resíduos, regressão linear,

equação da reta e coeficiente de correlação (r). Todos estes parâmetros foram obtidos por

meio da Planilha em Excel. O coeficiente de correlação (r) foi calculado pela raiz quadrada do

coeficiente de determinação (r2), fornecido pela planilha eletrônica.

Critérios de aceitação

Verificar se houve homocedaticidade pelo teste de Cochram realizado pela planilha eletrônica.

Verificar se o gráfico de resíduos não apresenta tendência.

O coeficiente de correlação (r) mínimo deve ser 0,99.

9. LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO

O limite de detecção é a menor quantidade de analito presente na amostra que pode ser

detectada, embora não necessariamente quantificada, independente do ruído. O limite de

quantificação, por sua vez, é a menor quantidade de analito presente na amostra que pode ser

quantificada com exatidão e precisão aceitáveis.

Procedimento

Usar o mesmo procedimento utilizado para Linearidade para avaliar o limite de detecção.

Resultados que devem ser apresentados

Densitogramas das análises.

Planilha e gráficos com as curvas, conforme Planilha em Excel.

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154

Determinar os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) por meio das fórmulas:

LD = 3,28 s / b

LQ = 10 s / b

Onde: s – desvio-padrão dos interceptos com o eixo y (coeficientes lineares) das três curvas

obtidas

b – inclinação média (média dos coeficientes angulares) das três curvas obtidas

Critério de aceitação

Não se aplica para Limites de detecção e quantificação.

10. EXATIDÃO

A exatidão de um método é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em

relação ao valor verdadeiro. É calculada como porcentagem de recuperação da quantidade

conhecida do analito adicionado a amostra (Resolução RE 899, 29/05/03).

Procedimento

Preparar uma solução-estoque do extrato em metanol pela pesagem de 2,0 mg e transferir para

um balão volumétrico de 10,0 mL, obtendo-se uma concentração na solução-estoque de 0,2

mg/mL.

Preparar uma solução-estoque do padrão em metanol pela pesagem de 1,0 mg e transferir para

um balão volumétrico de 5,0 mL, obtendo-se uma concentração na solução-estoque de 0,2

mg/mL.

Aplicar em triplicata as amostras preparadas conforme o procedimento apresentado na Tabela

2.

Tabela 2 - Preparo das amostras para avaliação da recuperação

Amostra Volume de MeOH (µL)

Volume da solução-estoque padrão

(µL)

Volume da solução estoque extrato

(µL)

Extrato 100,0 - 900,0

Padrão 900,0 100,0 -

Mistura - 100,0 900,0

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155

Resultados que devem ser apresentados

Densitogramas das análises.

Resultados de recuperação (%) obtidos por meio da fórmula:

recuperação (%) = (encontrado x 100)

adicionado

Onde:

encontrado – concentração (mg/mL) calculada por meio da curva de calibração

adicionado – concentração (mg/mL) adicionada em cada amostra

Critério de aceitação

Comparar os resultados obtidos no teste de estabilidade para o padrão de referência e a

solução estoque do extrato. O teor de estabilidade deve ser no mínimo 99% do teor inicial da

solução-estoque.

Os resultados de recuperação ficaram compreendidos entre 98,0 e 102,0%.

11. ROBUSTEZ

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas

variações dos parâmetros analíticos (Resolução RE 899, 29/05/03).

Procedimento

Pesar 1,0 mg do padrão analítico de ácido betulínico para um balão volumétrico de 1,0 mL e

avolumar com metanol. Realizar o mesmo procedimento para preparo da amostra.

Aplicar em triplicata as amostras preparadas do padrão e extrato, variando os seguintes

parâmetros:

• Tempo de leitura: Após a eluição de uma placa contendo aplicação em triplicata da

amostra, proceder a leitura da mesma em 0, 60 e 90 minutos.

• Mudança na Fase móvel: Proceder a eluição de uma placa em sistemas de fase móvel

com alteração de ± 5%.

Critério de aceitação

As pequenas variações não podem alterar de forma significativa os resultados.

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156

12 ESPECIFICIDADE E SELETIVIDADE

Este parâmetro define a capacidade do método em detectar a substância de interesse na

presença de outros componentes da matriz.

Procedimento

Pesar 1,0 mg do padrão analítico de ácido betulínico (AB) para um balão volumétrico de 1,0

mL e avolumar com metanol (solução-estoque). Realizar o mesmo procedimento para preparo

o padrão do ácido ursólico.

Aplicar em triplicata as amostras preparadas conforme Tabela 3.

Tabela 3 - Preparo das amostras para avaliação da especificidade/seletividade.

Amostra Volume da solução-estoque de ácido betulínico (µL)

Volume da solução-estoque de ácido

ursólico (µL)

Volume de metanol (µL)

Padrão ácido betulínico

500,0 - 500,0

Padrão ácido ursólico

- 500,0 500,0

Mistura ácido betulínico e

ursólico

500,0 500,0 -

Resultados apresentados

Densitogramas das análises.

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157

APÊNDICE C Relatório de Validação de CG-DIC

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158

Relatório de validação de metodologia analítica para determinação do teor de Ácido

Betulínico (AB) em extratos Eugenia florida DC (EF) por CG-DIC

1 - FINALIDADE DO MÉTODO VALIDADO

O método de identificação e quantificação do AB por CG-DIC poderá ser utilizado

para a avaliação de extratos de EF, oriundos de diversas técnicas extrativas e solventes.

2 - CRITÉRIO GERAL DE ACEITAÇÃO

O método será validado se:

*O extrato obtido de uma amostra autêntica de EF;

*Todos os critérios de aceitação especificados forem atingidos e

*Todos os desvios serem contemplados pela seção de “Robustez”

3 - DESCRIÇÃO DO MÉTODO A SER VALIDADO

3.1 – Preparo do reagente de derivatização

a) Síntese do Diazometano:

Para a síntese do diazometano, utiliza-se um aparato de destilação com juntas do tipo

Clear-seal (T 19/22).

Em um recipiente dissolver 5 g de hidróxido de potássio em 8 mL de água. Após

dissolução completa, adicionar 10 mL de Etanol 95 % até homogeneidade completa.

Transferir para o balão de 100 mL.

Em outro recipiente, dissolver 5 g de Diazald em 45 mL de éter. Transferir para o funil

de separação.

Montar a aparelhagem de destilação, conforme figura abaixo.

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159

Iniciar a destilação mantendo o balão de 100 mL a uma temperatura de 65 ºC e o balão de recolhimento a cerca de -20 ºC; gotejando-se lentamente a solução de diazald.

3.2 - Preparo da amostra

Pesar 1 mg do extrato a ser analizado, adicionar 1 mL de diazometano e aguardar

evaporação total. Adicionar 1 mL de Metanol, ultrassonicar por 2 minutos e reservar em

ambiente refrigerado

3.3 – Preparo da solução padrão

Pesar 1 mg do padrão comercial, adicionar 1 mL de diazometano e aguardar

evaporação total. Adicionar 1 mL de Metanol, ultrassonicar por 2 minutos e reservar em

ambiente refrigerado

3.4 – Fase Estacionária

Coluna Cromatográfica DB-5 (30m X 320 µm X 1.5 µm).

3.5 Equipamento

Cromatógrafo com fase Gasosa, com injetor do tipo Split/Splitless e detector de

ionização de chamas.

3.6 Parâmetros de Análise:

Injetor em taxa de split de 5:1; 300 ºC. Programação da coluna: Isoterma inicial de 200

ºC por 2 minutos; rampa de 15 ºC/min até 350 ºC; isoterma final de 13 minutos; fluxo

constante de 1.0 mL/min; detector a 350 ºC; fluxo de Hidrogênio e Ar sintético de 35 e 350

ml/min respectivamente e Hélio como gás de arraste.

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160

3.7 – Documentação

Cromatogramas e planilhas de cálculos.

3.8 – Avaliação dos resultados

O sinal do ácido betulínico deverá ter um tempo de retenção de 11,98 minutos.

3.9 – Adequação do sistema

O sistema estará corretamente adequado se o sinal referente ao padrão obedecer aos

critários do item 4.8.

4 - VALIDAÇÃO

4.1 - Materiais

4.1.1 - Reagentes e solventes

Nome Fabricante Grau de pureza

Metanol Merck CLAE / Espectroscópico

Diazald Sigma-Aldrich -

Hidróxido de Potássio Vetec -

Etanol 95% Vetec CLAE / Espectroscópico

Água deionizada - -

4.1.2 - Padrão

Nome Fabricante Grau de pureza

Ácido Betulínico Sigma-Aldrich 90,0 %

Ácido Ursólico Sigma-Aldrich ≥98,5 %

4.1.3 - Instrumentos

Nome Fabricante Part Nr

Cromatógrafo 6890N AGILENT US0032731

Banho ultrassônico Sanders DF000745

Balança analítica Sartorius 15910440

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161

4.1.5 - Software

Nome Fabricante Versão

GC Chemstation Agilent Technologies Rev. A 10.02 [1757]

Microsoft Excel Microsoft 2002 (10.6871.6870) SP3

5 - LINEARIDADE:

A linearidade deverá ser avaliada, com a preparação de uma solução-padrão de AB, em

cinco níveis diferentes de concentração. Esta curva deverá compreender pontos, na faixa de 10

a 100 µg/mL; em triplicata.

Critério de aceitação: R2 ≥ 0.99 e RSD% ≤ 2%

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162

Faixa Linearidade Inclinação da Reta Intercepto R2 Equação da reta 10 a 100 µg/mL 143,2189 2,6522 0,9995 y = 2,8005x - 2,6522 10 a 100 µg/mL 210,7098 17,434 0,9989 y = 3,9538x - 17,434 10 a 100 µg/mL 222,2867 10,772 0,9998 y = 4,2162x - 10,772

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

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163

5.1 Limite de Detecção (LD)

Calcular através da equação da reta obtida, o valor relativo a 3 (três) vezes a área do

ruído encontrado no spot relativo ao diluente do padrão.

LD = DPa x 3 IC Onde: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo Y de 3 curvas de calibração; IC é a inclinação da curva. LD = 7,402871 x 3 = 0,115627 192,0718

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

5.2 Limite de Quantificação (LQ)

Calcular da equação da reta obtida, o valor relativo a 10 (dez) vezes a área do ruído

encontrado no spot relativo ao diluente do padrão.

LQ = DPa x 10 IC

Onde: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo Y de 3 curvas de calibração; IC é a inclinação da curva.

LD = = 7,402871 x 10 = 0,385422 192,0718

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

6 – PRECISÃO

6.1 – Intra-dia

Avaliar o cromatograma de 5 replicatas seguidas no mesmo dia da mesma solução.

Critério de Aceitação: RSD%≤1%

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

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164

6.2 – Inter-dia

Avaliar o cromatograma de 5 replicatas seguidas em 3 dias seguidos, da mesma

solução.

Critério de Aceitação: RSD%≤2%

Area Media Desvio RSD % 33,2 33,1 33,4 32,9 D

ia 1

33,3

33,18 0,19 0,58

32,7 32,8 32,9 32,8 D

ia 2

33,1

32,86 0,15 0,46

33,5 33,2 33,8 33,6 D

ia 2

33,7

33,56 0,23 0,69

32,86 33,56

Inte

r-di

a

33,56 33,21 0,49 1,49

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

7 – RECUPERAÇÃO:

Para o estudo de recuperação, deverão ser preparadas as seguintes amostras:

Solução 1: 0,207 mg/mL do extrato de EF

Solução 2: 0,20 mg/mL do padrão comercial de AB

Amostra A: 900 µL da solução 1 + 100 µL de diluente;

Amostra B: 100 µL da solução 2 + 900 µL de diluente;

Amostra C: 900 µL da solução 1 + 100 µL da solução 2.

A recuperação deverá ser calculada de acordo com a seguinte fórmula:

%R = ((MC - MA) / MB) x 100

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165

Onde:

%R = Teor de recuperação

MA = Massa de AB encontrada na amostra A segundo a equação da reta

MB = Massa de AB encontrada na amostra B segundo a equação da reta

MC = Massa de AB encontrada na amostra C segundo a equação da reta

Critério de Aceitação: %R = 100 % ± 5 %

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

30

40

50

60

70

FID1 A, (ACBET11\12220002.D)

11

.99

8

Padrão

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220005.D)

11

.98

8

Extrato

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166

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220008.D)

11

.98

8

Padrão + Extrato

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

8 - ACURÁCIA

Para o estudo da acurácia, deverão ser preparadas as seguintes amostras:

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167

Solução 1: 0,207 mg/mL do extrato de EF

Solução 2: 0,20 mg/mL do padrão comercial de AB

Amostra A: 900 µL da solução 1 + 100 µL de diluente;

Amostra B: 900 µL da solução 1 + 10 µL da solução 2 + 90 µL de diluente;

Amostra C: 900 µL da solução 1 + 50 µL da solução 2 + 50 µL de diluente;

Amostra D: 900 µL da solução 1 + 100 µL da solução 2.

Critério de Aceitação: O RSD% de cada ponto deverá ser menor ou igual a 2%

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

30

40

50

60

70

FID1 A, (ACBET11\12220002.D)

11

.99

8

Amostra A

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220005.D)

11

.98

8

Amostra B

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168

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230006.D)

11

.97

7

Amostra C

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220008.D)

11

.98

8

Amostra D

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

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169

9 – ROBUSTEZ:

9.1 – Mudança na Temperatura do Injetor

Proceder à injeção do padrão de ácido betulínico e extrato com alteração de ± 5 ºC de

temperatura no injetor.

Critério de Aceitação: A variação do RSD do AB deverá ser de no máximo 2 %

Padrão Amostra

Temperatura

maior

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230021.D)

1.8

89

11

.97

4

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230025.D)

1.8

89

11

.97

3

Temperatura

normal

0 2 4 6 8 10 12

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220002.D)

11

.99

8

0 2 4 6 8 10 12

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220005.D)

11

.98

8

Temperatura

menor

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230012.D)

1.8

89

11

.97

6

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230016.D)

1.8

90

2.9

43

11

.97

5

9.2 – Mudança no Fluxo

Proceder à injeção do padrão de ácido betulínico e extrato com alteração de ± 0,1

mL/min. de fluxo.

Critério de Aceitação: A variação do RSD do AB deverá ser de no máximo 2 %

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170

Padrão Amostra

Fluxo

maior

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230040.D)

2.0

52

12

.29

7

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230045.D)

2.0

52

12

.30

0

Fluxo

normal

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220002.D)

11

.99

8

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220005.D)

11

.98

8

Fluxo

menor

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230030.D)

1.7

41

11

.65

3

min0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230035.D)

1.7

41

2.6

52

2.7

36

2.8

34

11

.65

2

9.3 Mudança na Temperatura do Detector

Proceder à injeção do padrão de ácido betulínico e extrato com alteração de ± 5 ºC de

temperatura no detector.

Critério de Aceitação: A variação do RSD do AB deverá ser de no máximo 2%

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171

Padrão Amostra

Temperaura

maior

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230060.D)

1.8

89

11

.95

0

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230065.D)

1.8

90

2.9

36

11

.95

2

Temperaura

normal

0 2 4 6 8 10 12

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220002.D)

11

.99

8

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220005.D)

11

.98

8

Temperaura

menor

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230050.D)

1.8

88

11

.95

1

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230055.D)

1.8

87

2.9

35

11

.95

2

9.4 Mudança em todos os Parâmetros

Proceder à injeção do padrão de ácido betulínico e extrato com alteração de ± 5 ºC de

temperatura no injetor, no detector e fluxo de ± 0,1 mL/min.

.

Critério de Aceitação: A variação do RSD do AB deverá ser de no máximo 2%

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172

Padrão Amostra

Parametros

aumentados

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230080.D)

2.0

52

12

.28

1

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230085.D)

2.0

53

3.1

50

12

.28

5

Parametros

normais

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220002.D)

11

.99

8

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12220005.D)

11

.98

8

Parametros

diminuidos

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230070.D)

1.7

41

11

.63

6

0 2 4 6 8 10 12 14

pA

20

40

60

80

100

120

140

160

180

FID1 A, (ACBET11\12230075.D)

1.7

41

2.7

27

2.8

27

11

.63

6

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

10 – ESPECIFICIDADE E SELETIVIDADE

Para o estudo da especificidade e seletividade, deverão ser preparadas as seguintes amostras:

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173

Solução 1: 0,20 mg/mL do padrão comercial de AB

Solução 2: 0,20 mg/mL do padrão comercial de ácido ursólico

Amostra A: 100 µL da solução 1 + 900 µL de diluente;

Amostra B: 100 µL da solução 2 + 900 µL de diluente;

Amostra C: 900 µL da solução 1 + 50 µL da solução 2 + 50 µL de diluente;

Amostra D: 900 µL da solução 2 + 50 µL da solução 1 + 50 µL de diluente.

Critério de Aceitação: O RSD% de cada ponto deverá ser menor ou igual a 2 %

Padrão de ácido ursólico.

min0 2 4 6 8 10 12 14 16

pA

20

30

40

50

60

70

FID1 A, (ACBET11\12220002.D)

1.8

85

11

.99

9

Padrão de ácido betulínico.

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174

Mistura do padrão de ácido betulínico com o padrão de ácido ursólico.

11 – CONCLUSÕES, APROVAÇÕES E ASSINATURAS

Método validado: ( X ) Sim ( ) Não

Problemas no método: ( ) Sim ( X ) Não

Analista

Data: ____/_____/_____ Assinatura:___________________________

Diretor de estudos

Data: ____/_____/_____ Assinatura:___________________________

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175

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176

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177

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178

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179

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180

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181

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182

APÊNDICE D Relatório de Validação de CCF/Densitometria

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183

Relatório de validação de metodologia analítica para determinação do teor de Ácido

Betulínico (AB) em extratos Eugenia florida DC (EF) por CCF / Densitometria

1 - FINALIDADE DO MÉTODO VALIDADO

O método de identificação e quantificação do AB por CCF poderá ser utilizado para a

avaliação de extratos de EF, oriundos de diversas técnicas extrativas e solventes.

2 - CRITÉRIO GERAL DE ACEITAÇÃO

O método será validado se:

*O extrato obtido de uma amostra autentica de EF;

*Todos os critérios de aceitação especificados forem atingidos e

*Todos os desvios serem contemplados pela seção de “Robustez”

3 - DESCRIÇÃO DO MÉTODO A SER VALIDADO

3.1 - Preparo da amostra

Pesar 1 mg do extrato a ser analizado, solubilizar em 1 mL de Metanol, ultrassonicar

por 2 minutos e reservar em ambiente refrigerado

3.2 – Preparo da solução padrão

Pesar 1 mg do padrão comercial, solubilizar em 1 mL de Metanol, ultrassonicar por 2

minutos e reservar em ambiente refrigerado

3.3 – Preparo do reagente de derivatização

Preparo da Solução A: Pesar 1 g de Vanilina e solubilizar em 100 mL de Metanol.

Acondicionar em frasco devidamente rotulado e armazenar.

Preparo da Solução B: Adicionar lentamente 10 mL de ácido sulfúrico a 90 mL de

Metanol sob resfriamento. Acondicionar em frasco devidamente rotulado e armazenar.

3.4 – Fase Estacionária

Placas de CCF de Gel de Sílica 60 F254 medindo 10 x 20 cm.

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184

3.5 – Aplicação da amostra

Aplicar 10 µL da solução padrão e 10 µL da solução amostra em bandas de 5 mm, com

intervalos de 2 mm, margem lateral e inferior de 10 mm.

3.6 – Cromatografia

Tipo da cuba: 20 x 10 cm, saturada por 5 minutos.

Sistema de fase móvel: Hexano : Acetato de Etila (4:6)

Distancia de eluição: 45 mm (35 mm a partir da aplicação)

Secagem: 2 minutos em estufa a 60 °C

3.7 – Derivatização

Preparar uma solução 1:1 da solução A e B, aplicar em toda a placa e aquecer por 5

minutos a 110 °C.

3.8 – Documentação

Leitura a 190 nm antes e 560 nm após a derivatização. Fotografia da placa após a

derivatização.

3.9 – Avaliação dos resultados

O sinal da aplicação da solução padrão deverá ter um Rf de 0.4 e após a derivatização,

deverá apresentar uma coloração roxa.

3.10 – Adequação do sistema

O sistema estará corretamente adequado se o sinal referente ao padrão obedecer aos

critários do item 4.9.

4 - VALIDAÇÃO

4.1 - Materiais

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185

4.1.1 - Reagentes e solventes

Nome Fabricante Grau de pureza

Metanol Merck CLAE / Espectroscópico

n-Hexano Merck CLAE / Espectroscópico

Acetato de Etila Merck CLAE/ Espectroscópico

4.1.2 - Padrão

Nome Fabricante Grau de pureza

Ácido Betulínico Carl Roth 90,0 %

4.1.3 - Placas

4.1.4 - Instrumentos

Nome Fabricante Part Nr

ATS 4 CAMAG 170202

CCF Scaner 3 CAMAG 170116

CCF Visualizer CAMAG 170222

Câmera Fotográfica DX252 Optronics 411530210

Cuba 20 x 10 CAMAG --

Placa de aquecimento CAMAG 030325

Banho ultrassônico Sanders DF000745

Balança analítica Sartorius 15910440

4.1.5 - Software

Nome Fabricante Versão

WinCats CAMAG 1.4.4

Microsoft Excel Microsoft 2002 (10.6871.6870) SP3

Nome Fabricante

Cromatofolha de alumínio com Gel de Sílica 60 F254 Merck

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186

5 - LINEARIDADE:

A linearidade deverá ser avaliada, com a preparação de uma solução-padrão de AB, em

cinco níveis diferentes de concentração. Esta curva deverá compreender pontos, na faixa de 1

a 10 µg/spot; em triplicata.

Critério de aceitação: R2 ≥ 0.99 e RSD% ≤ 2 %

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187

Faixa Linearidade Inclinação da Reta Intercepto R2 Equação da reta 1 a 10 µg/spot 8984,28462 448,755698 0,999867 y = -49,590433x2 +

1944,274634x - 448,755698 1 a 10 µg /spot 9034,48333 515,364486 0,999894 y = -54,879490x2 +

2011,995299x - 515,364486 1 a 10 µg /spot 9069,63853 466,607326 0,999883 y = -51,585951x2 +

1966,654609x - 466,607326

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

5.1 Limite de Detecção (LD)

Calcular através da equação da reta obtida, o valor relativo a 3 (três) vezes a área do

ruído encontrado no spot relativo ao diluente do padrão.

LD = DPa x 3 IC Onde: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo Y de 3 curvas de calibração; IC é a inclinação da curva. LD = 34,47867 x 3 = 0,011455 9029,469

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

5.2 Limite de Quantificação (LQ)

Calcular da equação da reta obtida, o valor relativo a 10 (dez) vezes a área do ruído

encontrado no spot relativo ao diluente do padrão.

LQ = DPa x 10 IC

Onde: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo Y de 3 curvas de calibração; IC é a inclinação da curva.

LD = 34,47867 x 10 = 0,038185 9029,469

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

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188

6 – PRECISÃO/ESTABILIDADE

6.1 – Intra-dia

Avaliar 6 µg/spot, em aplicação de três replicatas a cada hora, (n=3) da mesma

solução.

Critério de Aceitação: RSD% ≤ 1%

Tempo 1 Tempo 2 Tempo 3

Fo

tod

ocu

men

taçã

o

Den

sito

gra

ma

Tab

elas

ind

ivid

uai

s

Tab

ela

Glo

bal

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

6.2 – Inter-dia

Avaliar 6 µg/spot, em aplicação de três replicatas a cada dia (n=3) da mesma solução.

Critério de Aceitação: RSD% ≤ 2 %

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189

Dia 1 Dia 2 Dia 3 F

oto

do

cum

enta

ção

Den

sito

gra

ma

Tab

elas

ind

ivid

uai

s

Tab

ela

Glo

bal

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

7 – RECUPERAÇÃO:

Para o estudo de recuperação, deverão ser preparadas as seguintes amostras:

Solução 1: 2,50 mg/mL do extrato de EF

Solução 2: 1,01 mg/mL do padrão comercial de AB

Amostra A: 900 µL da solução 1 + 100 µL de diluente;

Amostra B: 100 µL da solução 2 + 900 µL de diluente;

Amostra C: 900 µL da solução 1 + 100 µL da solução 2.

A recuperação deverá ser calculada de acordo com a seguinte fórmula:

%R = ((MC - MA) / MB) x 100

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190

Onde:

%R = Teor de recuperação

MA = Massa de AB encontrada na amostra A segundo a equação da reta

MB = Massa de AB encontrada na amostra B segundo a equação da reta

MC = Massa de AB encontrada na amostra C segundo a equação da reta

Critério de Aceitação: %R = 100 % ± 5 %

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

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191

8 - ACURÁCIA

Para o estudo da acurácia, deverão ser preparadas as seguintes amostras:

Solução 1: 2,50 mg/mL do extrato de EF

Solução 2: 1,01 mg/mL do padrão comercial de AB

Amostra A: 900 µL da solução 1 + 100 µL de diluente;

Amostra B: 900 µL da solução 1 + 10 µL da solução 2 + 90 µL de diluente;

Amostra C: 900 µL da solução 1 + 50 µL da solução 2 + 50 µL de diluente;

Amostra D: 900 µL da solução 1 + 100 µL da solução 2.

Critério de Aceitação: O RSD% de cada ponto deverá ser menor ou igual a 2 %

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192

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

9 – ROBUSTEZ:

9.1 – Mudança na Fase móvel

Proceder a eluição de uma placa em sistemas de fase móvel com alteração de ± 5 %.

Critério de Aceitação: A variação do RSD do AB deverá ser de no máximo 2 %

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193

Aceitação : ( X ) Sim ( ) Não

10 – CONCLUSÕES, APROVAÇÕES E ASSINATURAS

Método validado: ( X ) Sim ( ) Não

Problemas no método: ( ) Sim ( X ) Não

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194

Analista

Data: ____/_____/_____ Assinatura:___________________________

Diretor de estudos

Data: ____/_____/_____ Assinatura:___________________________

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195

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