análise/comparação da estrutura genética de espécies ... · processo de desmatamento e...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SÃO PAULO ESCOLA SUPERIOR DE AGRONOMIA “Luiz de Queiroz” – Esalq/USP Depto de Ciências Florestais Programa de Pós-Graduação Interunidades em Ecologia de Agroecossistemas
Projeto de Pesquisa de Doutorado
Título: Diversidade e estrutura genética de espécies pioneiras em florestas primárias e
secundárias do Estado de São Paulo
Vinculado ao Processo FAPESP 99/09635-0
Milene Silvestrini MS Ecologia - UNICAMP
Orientador: Prof. Dr. Weber A. N. do Amaral
Co-orientador: Prof. Dr. Flavio Antonio Maës dos Santos
Piracicaba, agosto de 2002.
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RESUMO
As florestas tropicais brasileiras vêm sofrendo um intenso processo de
desmatamento e fragmentação antes mesmo do conhecimento desses ecossistemas.
A conservação da diversidade biológica presente nesses ecossistemas implica na
conservação da variabilidade genética das espécies, sendo necessário para isso o
conhecimento de como esta diversidade é mantida e distribuída em suas populações.
Vários trabalhos abordando a diversidade e a estrutura genética de espécies arbóreas
climácicas e intermediárias foram realizados, mas poucos estudaram espécies
pioneiras. Estudos envolvendo esse grupo de espécies são muito relevantes, porque
além de terem uma distribuição espacial diretamente ligada à dinâmica de clareiras,
processo no qual se baseia a regeneração da comunidade florestal, as espécies
pioneiras são altamente freqüentes em áreas secundárias em estádios iniciais de
sucessão, sendo determinantes para a continuidade do processo sucessional e
recuperação desses locais. Em áreas primárias espera-se encontrar uma alta
diversidade genética e uma estruturação das populações em função da sua ocorrência
em clareiras. Já em áreas secundárias em estádios iniciais de sucessão, a diversidade
e estrutura genética vão depender do nível de perturbação ocorrido na área e da
manutenção ou não de fluxo gênico com populações de outras áreas, principalmente
de áreas primárias e/ou do entorno. Com o objetivo de avaliar a diversidade e estrutura
genética de espécies pioneiras em áreas primárias e secundárias em estádios iniciais
de sucessão, serão selecionadas 3 espécies pioneiras que ocorram em uma das
unidades fitogeográficas avaliadas no projeto "Diversidade, dinâmica e conservação
em florestas do Estado São Paulo: 40ha de parcelas permanentes" (FAPESP
99/09635-0). As análises genéticas serão realizadas através de marcadores
microssatélites, estudando-se os seguintes parâmetros: número médio de alelos por
loco, proporção de locos polimórficos, heterozigosidade média observada (Ho),
heterozigosidade média esperada (He), estatísticas–F e distâncias genéticas de Nei.
Serão ainda realizadas análises de agrupamento e estudos de fluxo gênico.
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INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
Processo de ocupação e uso do solo e a conservação dos recursos genéticos
florestais
As florestas tropicais do Brasil foram e vêm sendo submetidas a um intenso
processo de desmatamento e fragmentação desde o início da colonização do país,
sendo que pouco se conhece sobre esses ecossistemas. A Floresta Tropical Atlântica
sensu latu, que compreende a Floresta Ombrófila Densa, Floresta Ombrófila Mista e
Floresta Estacional Semidecidual (IBGE 1992; Ivanauskas 1997), foi uma das mais
atingidas por esse processo, restando muito pouco da sua área de distribuição original.
No Estado de São Paulo, a percentagem de cobertura florestal natural em relação à
área total do Estado era de 81,8% antes do descobrimento do Brasil. Atualmente, esse
valor é de apenas 7,64% (Capobianco 1998), sendo constituída por formações
primárias e secundárias em estádio avançado de regeneração localizadas em sua
maioria em parques, áreas de conservação e regiões geralmente caracterizadas por
relevo íngreme, impróprio para uso agrícola (Leitão-Filho 1987). Além desses
remanescentes, existem ainda áreas cobertas por vegetação em estádios iniciais e
intermediários de sucessão (capoeiras) que compreendem aproximadamente 5% da
área total do Estado (Serra Filho et al. 1975).
Tendo em vista essa pequena área florestal, é fundamental a conservação e o
levantamento de informações tanto de áreas primárias quanto de secundárias em
diferentes estádios de sucessão. A conservação da biodiversidade seja de uma área
teoricamente intocada, seja de uma área submetida à interferência antrópica está
diretamente ligada à conservação da variabilidade genética. Isto porque, é através da
variação genética disponível que os organismos podem responder às possíveis
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mudanças ambientais, mantendo sua capacidade de adaptação e garantindo sua
sobrevivência e reprodução ao longo do tempo (Koskela e Amaral 2002; Namkoong et
al. 2002).
A manutenção dessa dinâmica evolutiva é a característica principal do método
de conservação in situ, uma vez que a conservação da variabilidade genética é
realizada concomitantemente à proteção de hábitats e à manutenção da interação
entre as espécies (Prance 1997). Normalmente os programas de conservação dos
recursos genéticos florestais in situ são delineados em nível de comunidade e/ou
ecossistemas. Entretanto, somente através das características genéticas populacionais
é que se pode garantir a conservação de cada espécie e assim do ecossistema como
um todo (Martins 1987). Desse modo, a conservação dos recursos genéticos florestais
in situ requer a manutenção dos processos que afetam a diversidade e estrutura
genética das populações e para isso é necessário que estas sejam conhecidas.
Espécies presentes em áreas primárias extensas, pouco ou não perturbadas,
geralmente apresentam maior diversidade genética que em áreas que sofreram
interferência antrópica, seja pelo processo de fragmentação, extrativismo, ou pelo
desmatamento para uso agropecuário (Young et al. 1996; Koskela e Amaral 2002).
Acredita-se que essa perda de variabilidade genética é causada pelos efeitos de
deriva, de gargalo genético e de endogamia relacionados à redução do tamanho de
suas populações e pela diminuição ou perda de fluxo gênico entre populações
anteriormente conectadas (Ellstrand e Elam 1993; Koskela e Amaral 2002). O grau de
influência desses eventos sobre a diversidade e estrutura genética das populações
está diretamente relacionado ao tamanho e ao grau de isolamento dos fragmentos e ao
nível de perturbação a que foram submetidos (Boshier e Lamb 1997). Em formações
secundárias, que são resultado da regeneração da floresta após perturbações mais
intensas, como uso agropecuário prolongado, a diversidade e estrutura genética das
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espécies devem estar mais relacionadas aos níveis de fluxo gênico mantidos com
populações das áreas primárias adjacentes, já que a maior fonte de propágulos para
recolonização dessas áreas deve ter sido externa. Uma possível exceção são as
espécies recrutadas por banco de sementes ainda presentes na área após a
perturbação, nos casos em que as alterações no uso do solo não causaram a sua total
eliminação (ver exemplo em Franceschinelli e Kesseli 1999).
Estudos comparando áreas com diferentes graus de perturbação podem elucidar
melhor esses possíveis efeitos do processo de desmatamento e fragmentação. Níveis
de fluxo gênico e de diversidade genética necessários para restabelecer e manter as
populações em áreas que sofreram interferência antrópica são informações que podem
ser obtidas em estudos desse tipo.
O recente avanço nas técnicas de biologia molecular tem contribuído
consideravelmente na caracterização da diversidade genética e análise da estrutura de
populações de espécies arbóreas tropicais (ver revisão de Amaral, 2001). Vários
trabalhos foram realizados, inicialmente utilizando marcadores alozimáticos (Eguiarte et
al. 1992; Wickneswari e Norwati 1993; Pérez-Nasser et al. 1993; Alvarez-Buylla e
Garay 1994; Alvarez-Buylla et al. 1996; Franceschinelli e Kesseli 1999; ver mais na
revisão de Amaral 2001) e mais recentemente marcadores baseados na variação de
seqüências de DNA (RAPD, AFLP e SSR) (Schierenbeck et al. 1997; Russell et al.
1999; Deshpande et al. 2001; Degen et al. 2001). Além desses estudos realizados em
áreas extensas de florestas primárias, alguns autores avaliaram a estrutura genética de
populações em áreas fragmentadas (Seoane 1998; Aldrich et al. 1998; Dayanandan et
al. 1999; White et al. 1999; Margis et al. 2002). Tais estudos têm apontado a perda da
variabilidade genética como principal efeito da fragmentação, principalmente em
fragmentos pequenos, isolados e/ou muito perturbados.
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A maioria desses trabalhos, porém, avaliou somente espécies climácicas ou
intermediárias, sendo raros os que analisaram a diversidade e estrutura genética de
espécies pioneiras (como Alvarez-Buylla e Garay 1994; Alvarez-Buylla et al. 1996;
Souza 1997; Franceschinelli e Kesseli 1999). Além disso, as áreas secundárias em
estádios iniciais de sucessão, as quais são ocupadas predominantemente por espécies
pioneiras, também foram pouco estudadas (Alvarez-Buylla e Garay 1994;
Franceschinelli e Kesseli 1999), de forma que são poucas as informações relacionando
aspectos genéticos dessas espécies e sua influência no processo sucessional.
A perda de variabilidade genética de espécies pioneiras e a conseqüente
limitação na habilidade de responderem a mudanças ambientais pode comprometer
sua persistência em determinadas áreas, bem como dificultar ou impedir a colonização
de ambientes muito alterados. Além disso, se as espécies pioneiras exercem papel
importante na chegada de animais e no estabelecimento de espécies de estádios mais
tardios (modelo de facilitação, ver exemplo em Uhl et al. 1991), tais alterações das
características genéticas e dinâmica evolutiva poderiam ter influência no processo
sucessional e, de modo mais amplo, na regeneração da comunidade florestal como um
todo.
Em resumo, pode-se dizer que o conhecimento dos níveis de diversidade,
estrutura genética e fluxo gênico de espécies pioneiras em áreas primárias e
secundárias em estádios iniciais de sucessão são fundamentais para a conservação
dos recursos genéticos florestais in situ e para a reintrodução de espécies florestais em
programas de recuperação de áreas degradadas.
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Diversidade e estrutura genética de espécies pioneiras
Em seu estado natural ou em florestas primárias, as espécies pioneiras
germinam e crescem somente em clareiras grandes, formando grupos de plantas de
mesma idade distribuídos pela floresta em função da formação das clareiras (Whitmore
1989; Alvarez-Buylla e Garay 1994; Whitmore 1996). Após a morte desses indivíduos,
as espécies de dossel (climácicas) tomam o seu lugar e ocorre o “fechamento” da
clareira. Em geral, essa extinção local acontece após período de tempo relativamente
curto, pois a maioria das pioneiras apresenta ciclo de vida comparativamente mais
curto que espécies não-pioneiras (Swaine e Whitmore 1988; Whitmore 1989). Por ser
contínuo e freqüente, esse processo de extinção e recolonização pode ter importantes
efeitos sobre a estrutura genética dessas espécies.
De acordo com Wright (1940) e Lovelless e Hamrick (1984), o efeito de
fundador, ou seja, a colonização das clareiras por um número geralmente pequeno de
indivíduos e a fixação de alelos neutros por deriva podem gerar uma estrutura genética
das populações locais ou sub-populações das espécies pioneiras (indivíduos de uma
mesma clareira). Já Slatkin (1985a; 1987) considerou que, por serem freqüentes, as
extinções e recolonizações dessas sub-populações podem impedir a fixação alélica por
deriva, funcionando como fluxo gênico que limitaria a diferenciação entre populações
locais ou sub-populações.
Alvarez-Buylla et al. (1996) encontraram uma correspondência entre a estrutura
genética de Cecropia obtusifolia e a distribuição espacial dos indivíduos em clareiras.
Entretanto, a estrutura genética foi detectada em sementes e plântulas, mas diminuiu
progressivamente em jovens e adultos. De acordo com esses autores, a perda de
estrutura genética nos estágios mais tardios do ciclo de vida da espécie pode ter
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ocorrido devido à mortalidade ao acaso durante o processo de recrutamento nas
clareiras ou à ocorrência de seleção favorável aos heterozigotos.
Alvarez-Buylla e Garay (1994) e Franceschinelli e Kesseli (1999) também
avaliaram a estrutura genética de espécies pioneiras, mas não consideraram a
influência da dinâmica de clareiras sobre os parâmetros genéticos. Estes trabalhos
diferiram na escala de amostragem das populações, o primeiro avaliou a estrutura
genética de populações abrangendo áreas de florestas primárias e secundárias em
estádios iniciais de sucessão e o segundo, uma população presente numa área
secundária em estádio inicial de sucessão.
Em áreas secundárias em estádios iniciais de sucessão, as espécies pioneiras
apresentam características demográficas diferentes da floresta primária, como a alta
densidade de indivíduos (Matthes 1992; Danciguer 1996). Isto ocorre em função das
alterações ambientais provocadas pelo tipo/nível de perturbação ocorrido na área.
Além dos fatores relacionados ao restabelecimento da espécie na área, como origem e
quantidade de propágulos, essa nova situação ambiental pode gerar diferentes
pressões de seleção que resultem em diferenças demográficas e genéticas. Além
disso, a manutenção ou não de fluxo gênico com outras populações, tanto de áreas
primárias quanto de secundárias, e o nível em que este acontece terão efeito
diferencial sobre a diversidade e estrutura genética da população nessas áreas.
Dependendo do nível de perturbação ocorrido na área, a disponibilidade de
propágulos para o restabelecimento das espécies pode ser afetada diferencialmente.
Em estudos realizados em pastagens abandonadas na Amazônia, Uhl et al. (1991)
apontaram que em áreas onde o uso do solo foi moderado, ou seja, com um bom
estabelecimento de gramíneas, pastejo regular, capina freqüente e abandono da área
após 6 a 10 anos, as espécies pioneiras surgiram por brotação, por banco de sementes
ou por sementes dispersas de outros locais. Em áreas muito degradadas por pastejo
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intensivo, gramíneas, mecanização, herbicidas e uso por período de 12 a 20 anos, a
maioria das espécies se estabeleceram por sementes dispersas de outros locais.
Nesse último caso, onde a perturbação foi muito intensa, o restabelecimento das
espécies dependeu da chegada de propágulos de outras áreas florestais. Portanto, a
diversidade genética das novas populações formadas será fortemente influenciada
pelos níveis de fluxo gênico com outras populações, já que as populações originais da
área foram totalmente extintas.
Uhl et al. (1991) mostraram ainda que em áreas muito degradadas, a
comunidade de herbívoros e patógenos (predadores e parasitas de sementes e
plântulas) foi bastante diferente de áreas primárias ou de áreas que sofreram uso
menos intensivo, interferindo consideravelmente no estabelecimento das espécies
florestais. Outro fator importante foi a presença de gramíneas e arbustos invasores,
que geraram forte competição durante o estabelecimento das espécies pioneiras
nesses locais (Uhl et al. 1991).
Os efeitos do nível de perturbação da área e de outros fatores que afetam a
diversidade e a estrutura genética das populações de espécies pioneiras são difíceis de
serem isolados e avaliados separadamente, mas em alguns casos eles podem ser
mais evidentes. Franceschinelli e Kesseli (1999) estudando uma espécie pioneira que
ocorre nas florestas de galeria do Estado de São Paulo encontraram estruturação
genética numa população de indivíduos adultos estabelecidos após corte total da
vegetação original da área. De acordo com os autores, a estrutura genética nos adultos
foi determinada pela estrutura genética do banco de sementes presente na área antes
da perturbação. Isto porque, não havia possibilidade de influência de fluxo gênico com
outras populações e de endogamia entre os indivíduos estudados, devido à restrita
dispersão de pólen e sementes caracterizada para a espécie e recente
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estabelecimento da população no local (menos de 20 anos) (Franceschinelli e Kesseli
1999).
Já em Alvarez-Buylla e Garay (1994) que compararam a diversidade genética de
Cecropia obtusifolia em áreas primárias e secundárias em estádios iniciais de
sucessão, o fluxo gênico parece ter sido o fator determinante dos resultados
encontrados. Cada população de área secundária estava localizada ao lado de uma
população de área primária e todas estavam muito próximas entre si, dentro da região
chamada de Los Tuxtlas. As autoras não constataram diferenças genéticas entre essas
populações, mas verificaram a maior distância genética e a menor taxa de fluxo gênico
em uma população de uma área secundária isolada, localizada fora da região de Los
Tuxtlas.
Como foram poucos os trabalhos abordando características genéticas de
pioneiras em áreas secundárias em estádios iniciais de sucessão, não se sabe
exatamente quais alterações podem ocorrer na diversidade e estrutura genética, quais
são os fatores determinantes desses parâmetros genéticos e que possíveis implicações
essas alterações teriam para as espécies pioneiras em estádios sucessionais mais
avançados. Mesmo com uma densidade populacional maior que em áreas primárias,
pode haver perda de variabilidade genética, principalmente se a colonização inicial se
deu por poucos indivíduos e se essas populações estiverem muito distantes de áreas
primárias e/ou a taxa de fluxo gênico seja baixa. Considerando-se que grande parte da
população será extinta com a continuidade do processo sucessional, é possível que
essa perda de diversidade seja maior ainda em estádios sucessionais mais avançados,
a menos que os poucos indivíduos remanescentes, e outros fatores como banco de
sementes e fluxo gênico com outras populações interfiram, mantendo a riqueza alélica
da espécie.
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Indicadores genéticos
Indicadores genéticos são variáveis relacionadas aos processos que mantêm a
diversidade genética das espécies (seleção, deriva, fluxo gênico e sistema reprodutivo)
e que podem ser utilizadas para acessar o estado de conservação da diversidade
genética das espécies em ecossistemas submetidos a qualquer tipo de interferência
antrópica ou forma de manejo (Boyle 2000; Namkoong et al. 2002). De acordo com
esses autores, informações sobre os processos que mantêm a diversidade genética ao
invés das medidas da diversidade genética em si seriam a forma mais eficiente de se
avaliar a manutenção da sustentabilidade genética das populações nesses
ecossistemas. Boyle (2000) e Namkoong et al. (2002) propuseram quatro indicadores
genéticos que podem ser verificados através de parâmetros populacionais e genéticos:
i) nível da variação (ii) mudança direcional das freqüências gênicas ou alélicas, iii) fluxo
gênico entre populações e iv) sistemas reprodutivos. Desses, o nível da variação e
fluxo gênico, poderão ser obtidos no presente trabalho, através da avaliação da
diversidade genética e do fluxo gênico.
Como a obtenção de indicadores para todas espécies é inviável, eles podem ser
baseados em apenas algumas espécies. Segundo Boyle (2000) e Namkoong et al.
(2002), essa seleção pode ser realizada de acordo com alguns critérios, tais como: ter
valor econômico e ser explorada comercialmente; apresentar distribuição espacial que
a torna suscetível aos efeitos adversos da intervenção antrópica; ter valor ecológico, ou
seja, ser uma “espécie-chave”; apresentar nicho reprodutivo que requer sombra.
A interdependência com a ocorrência de clareiras, o papel no processo
sucessional e a importância ecológica das espécies pioneiras para a fauna e para o
estabelecimento de outras espécies são características que as tornam recomendáveis
para o uso como espécies “indicadoras” do grau de alteração genética causado na
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comunidade florestal por diferentes distúrbios antrópicos. Além disso, a utilização de
informações genéticas a partir de pioneiras é importante e complementar, pois
indicadores genéticos baseados somente em espécies climácicas podem não refletir a
manutenção dos processos evolutivos dos demais grupos e assim serem insuficientes
para indicação da sustentabilidade do ecossistema manejado (Namkoong et al. 2002).
A obtenção dos níveis de diversidade e fluxo gênico em espécies pioneiras
através de um estudo comparativo entre áreas primárias não perturbadas e
secundárias em estádio inicial de sucessão pode contribuir para o entendimento de
como indicadores genéticos poderiam ser utilizados em áreas que sofreram
perturbação, tendo como estudo de caso as espécies pioneiras.
Projeto "Diversidade, dinâmica e conservação em florestas do Estado São Paulo:
40 ha de parcelas permanentes"
Com o objetivo de compreender a dinâmica e os processos geradores e
mantenedores da biodiversidade e adequar práticas de conservação, manejo e
restauração nas formações florestais do Estado de São Paulo, o projeto "Diversidade,
dinâmica e conservação em florestas do Estado de São Paulo: 40ha de parcelas
permanentes", vinculado ao Programa de Pesquisas em Conservação Sustentável da
Biodiversidade do Estado de São Paulo, denominado BIOTA-FAPESP, estará
caracterizando detalhadamente toda a comunidade arbórea de quatro unidades
fitogeográficas do Estado em parcelas permanentes de 10ha por unidade. Aspectos
florísticos, fitossociológicos e demográficos das espécies, além de características
edafo-climáticas serão estudadas em uma Floresta de Restinga (P. E. da Ilha do
Cardoso), uma Floresta Ombrófila Densa (E.E. de Carlos Botelho), uma Floresta
Estacional Semidecidual (E. E. de Caitetus) e uma área de Cerradão (E.E. de Assis).
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Também é objetivo desse projeto a identificação da estrutura genética e populacional
de grupos de espécies, além da definição de indicadores de avaliação da
sustentabilidade desses ecossistemas.
A caracterização da diversidade e estrutura genética das espécies pioneiras
nessas unidades pode contribuir significativamente para o entendimento de padrões e
processos que afetam a manutenção ou a perda da diversidade em cada uma delas,
permitindo a adoção de medidas mais apropriadas de conservação e manejo, um dos
objetivos centrais do projeto de parcelas permanentes.
Objetivos
Avaliar níveis de diversidade e estrutura genética de espécies pioneiras em
áreas de floresta primária e secundária em estádio inicial de sucessão, visando testar
as seguintes hipóteses:
i) Espécies pioneiras apresentam estruturação genética em florestas primárias em
escala espacial correspondente à escala espacial da distribuição dos indivíduos
em clareiras;
ii) A diversidade e a estrutura genética de populações de espécies pioneiras em
áreas primárias e secundárias em estádios iniciais de sucessão são diferentes;
iii) Os níveis de diversidade genética de populações de espécies pioneiras em
áreas secundárias em estádios iniciais de sucessão estão relacionados à
distância de populações de áreas primárias.
Adicionalmente, este projeto poderá contribuir para o estudo da viabilidade do
uso de indicadores genéticos para se acessar o estado de conservação da diversidade
genética de ecossistemas submetidos a diferentes graus de perturbação, utilizando-se
espécies pioneiras.
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MATERIAIS E MÉTODOS
Área de Estudo
Uma das três unidades fitogeográficas presentes nas unidades de conservação
descritas abaixo e avaliadas no projeto "Diversidade, dinâmica e conservação em
florestas do Estado São Paulo: 40ha de parcelas permanentes" será selecionada para
este estudo. As formações florestais das três áreas são primárias e apresentam bom
estado de conservação. A seleção da unidade de estudo será baseada na presença de
espécies pioneiras nas parcelas permanentes e em áreas secundárias em estádio
inicial de sucessão próximas, distantes e medianamente distantes da floresta primária.
A definição dessas distâncias será arbitrária, sendo considerada "a priori" a distância
entre áreas de até 1km como áreas próximas, de 1km a 10km como medianamente
distantes e acima de 10 km como áreas distantes. As espécies devem estar presentes
nas parcelas permanentes, mas o desenho experimental ou a amostragem de
indivíduos poderá ultrapassar os limites dessa área.
Serão consideradas áreas secundárias em estádio inicial de sucessão, as áreas
que sofreram corte total de sua vegetação original e que agora são ocupadas
predominantemente por espécies pioneiras. Para isso, serão obtidas informações a
respeito do histórico de uso da terra e características estruturais da vegetação, uma
vez que são desejáveis áreas sem limitações edafo-climáticas para a continuidade do
processo sucessional.
Tais informações estarão disponíveis após visitas às áreas e obtenção dos
resultados de campo do projeto “40ha de parcelas permanentes”.
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PARQUE ESTADUAL DA ILHA DO CARDOSO
A Ilha do Cardoso situa-se no extremo sul do litoral do Estado de São Paulo no
município de Cananéia, entre os paralelos 25o03’05“- 25o18’18” e os meridianos 47o
53’48 “-48o05’42”. A Ilha possui uma área de aproximadamente 22.500ha e foi
transformada em Parque Estadual pelo Decreto 40.319 de 1962 (Negreiros et al. 1974).
Dados climáticos coletados em baixa altitude (<200m) para o período de dois anos
(1990-1991) revelam que a média das temperaturas mínimas está em torno de 19oC, a
média das máximas em torno de 27oC e a precipitação anual entre 1800-2000mm
(Melo e Mantovani 1994).
A topografia é predominantemente montanhosa, sendo a região central da ilha
ocupada por um maciço que atinge mais de 800m de altura. Os solos das planícies
são resultado de sedimentação marinha recente e são de tipo podzol hidromórfico,
caracterizado pelo alto teor de areia, baixos teores de argila e silte e baixa fertilidade
(Giulietti et al. 1983). Nas meias encostas e morros isolados predominam o Latossolo
Vermelho-Amarelo-Orto (LV), e nas encostas mais acidentadas o Podzol Vermelho-
Amarelo com transição para Latossolo Vermelho-Amarelo (PVL). Estes solos,
geralmente profundos e bem drenados, são formados a partir de rochas granito-
gnaisse e apresentam alto teor de argila, baixo pH, coloração alaranjada, e baixa
fertilidade (Pfeifer et al. 1989).
Na Ilha são encontradas diferentes formações vegetais naturais, relacionadas
principalmente com as características do substrato: 1. campo de altitude nos altos dos
morros onde os solos são rasos e as rochas afloram; 2. floresta atlântica de encosta,
nos terrenos de maior declive; 3. vegetação de dunas próxima à zona de maré; 4.
floresta de restinga nos podzóis hidromórficos da planície litorânea e; 5. Manguezais
nos solos lodosos das várzeas dos rios periodicamente inundados por água salobra.
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A vegetação da Ilha do Cardoso foi alvo de projetos de pesquisa enfocando a
flora da restinga (De Grande e Lopes 1981) e também a produção de uma flora geral
(Barros et al. 1991). A composição e estrutura da floresta de encosta foram
investigadas e comparadas com outros estudos (Melo e Mantovani 1994). Os
resultados dessa comparação demonstraram que a floresta da Ilha do Cardoso
apresenta baixa diversidade local (alfa diversidade) e baixa diversidade gama em
comparação a outras florestas neotropicais (Tabarelli e Mantovani 1998).
PARQUE ESTADUAL DE CARLOS BOTELHO
O Parque Estadual de Carlos Botelho (PECB) possui área total de 37.793,63ha e
encontra-se na região sul do Estado de São Paulo (24o00’ a 24o15’S, 47o45’ a
48o10’W). Engloba parte dos municípios de São Miguel Arcanjo, Capão Bonito e Sete
Barras, com altitudes que variam de 30 a 1003m (Domingues e Silva 1988, Negreiros
et al. 1995).
A área do PECB compreende duas unidades geomorfológicas: o Planalto de
Guapiara, drenado pelos rios que formam a bacia hidrográfica do rio Parapanema, e a
Serra de Paranapiacaba, drenada pelos ribeirões Travessão, Temível e da Serra e
pelos rios Preto e Quilombo, todos formadores da bacia do rio Ribeira de Iguape.
Predominam no Parque as rochas graníticas, que definem um relevo altamente
acidentado e associado aos elevados índices pluviométricos, definem morfogênese
acelerada nas médias e altas vertentes, acumulando material nos sopés e canais
fluviais (Domingues e Silva 1988).
O parque está sob a influência de dois tipos climáticos diferentes, segundo a
classificação de Köppen: a) clima quente úmido sem estiagem (Cfa), que ocupa áreas
do Planalto de Guapiara com altitudes inferiores a 800 m, a média e a baixa escarpa da
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Serra de Paranapiacaba; possui temperaturas inferiores a 18oC no mês mais frio e
superiores a 22oC no mês mais quente e o total pluviométrico do mês mais seco é
superior a 30mm; b) clima temperado úmido sem estiagem (Cfb), nas partes mais
elevadas da Serra de Paranapiacaba e que difere do anterior apenas pela temperatura
média do mês mais quente, a qual não ultrapassa 22oC (Setzer, 1946).
Os solos são Hidromórficos e Podzólicos Vermelho-Amarelo intergrade
Latossolo Vermelho-Amarelo (Camargo 1972) com elevados teores de matéria
orgânica e de alumínio, baixos teores de bases trocáveis e ainda acidez elevada, como
a maioria dos solos da região serrana do litoral do Estado (Negreiros 1982).
No PECB ocorre a Floresta Ombrófila Densa Sub-Montana/Montana, (Veloso e
Góes-Filho 1982), onde foram realizados levantamentos florísticos (Custódio Filho et
al.1992, Moraes 1992 e 1993) e fitossociológicos (Dias 1993, Negreiros 1982,
Negreiros et al. 1995).
ESTAÇÃO ECOLÓGICA DE CAETETUS
A Estação Ecológica dos Caetetus possui uma área contínua de 2.178,84ha,
situada nos municípios de Gália e Alvilândia, Estado de São Paulo, entre as
coordenadas geográficas: 22o41’ e 22o46’S e 49o10’ e 49o16’W, dentro da bacia
hidrográfica do Médio Paranapanema. Predominam nas áreas mais elevadas da
Estação (altitude média de 650m) o Latossolo de textura média Álico, enquanto nas
partes mais baixas (altitude média de 550m) o Podzólico Vermelho-Amarelo Profundo
de textura arenosa/média (Mattos et al. 1996). O clima local, segundo a classificação
de Köppen, é Cwa, mesotérmico de inverno seco.
Este remanescente florestal foi enquadrado como área de preservação quando
da ocupação agrícola da Fazenda Paraíso, tendo passado a ser propriedade do Estado
18
em 1976. Segundo relatos históricos, a área nuclear da floresta, classificada
fisionomicamente como floresta primária alta, não sofreu qualquer tipo de exploração
antrópica, até pela dificuldade de acesso decorrente da topografia acidentada.
A E.E. de Caetetus se caracteriza como um grande remanescente de Floresta
Estacional Semidecidual do Planalto Ocidental do Estado de São Paulo. Esta
formação florestal revestia originalmente parte do Planalto Paulista, a Depressão
Periférica, a Cuesta Basáltica e parte do Planalto Ocidental do interior paulista,
certamente se constituindo hoje na formação florestal mais ameaçada do Estado de
São Paulo, devido ao processo de fragmentação a que foi submetida.
A despeito desta importância, sua vegetação foi pouco estudada. Trata-se de
uma floresta com trechos em excelente estado de preservação, que abrigam tanto
espécies arbóreas ameaçadas de extinção no Estado pela agressividade do
extrativismo nos últimos anos, como o guarantã (Esenbeckia leiocarpa Engl.), a
peroba-rosa (Aspidosperma polyneuron Müll. Arg.) e a cabreúva (Myroxylon peruiferum
L.f.), dentre outras, como espécies da fauna, destacando-se dentre outros, o mico-leão-
preto (Leonthopithecus chrysopygus).
Espécies
Serão selecionadas três espécies pioneiras para este estudo. Serão
consideradas espécies pioneiras somente as que reconhecidamente germinam e se
estabelecem em clareiras onde a luz solar atinge o chão da floresta pelo menos uma
parte do dia (Swaine e Whitmore 1988; Whitmore 1989). Para isso serão obtidas
informações na literatura sobre suas características de germinação e estabelecimento.
A escolha das espécies será definida com base na presença das mesmas na área de
estudo. Estas deverão apresentar número de indivíduos adultos superior a 30 (número
suficiente para as análises estatísticas), tanto na floresta primária quanto nas áreas
19
secundárias (ver delineamento experimental abaixo). Além desses critérios, será dada
preferência a espécies selecionadas para outros estudos dentro do projeto de parcelas
permanentes (FAPESP 99/09635-0), principalmente estudos demográficos.
Obtenção dos marcadores moleculares
Serão utilizados os marcadores microssatélites ou seqüências repetidas do
genoma (SSR – Simple Sequence Repeats) por serem co-dominantes, apresentarem
alta diversidade alélica e, conseqüentemente, maior poder de discriminação da
variabilidade genética (Dayanandan et al. 1997; Collevatti et al. 1999). Os
procedimentos para obtenção desses marcadores serão os descritos por Collevatti et
al. (1999), constituindo-se basicamente das seguintes etapas:
• construção de uma biblioteca de fragmentos genômicos pequenos (300 a 500 pares
de bases) enriquecida com seqüências repetidas;
• clonagem e seqüenciamento dos clones;
• síntese de primers específicos para cada loco microssatélite;
• seleção dos melhores primers e das condições de amplificação via reação de
polimerase em cadeia (PCR -Polimerase Chain Reaction);
• análise de herança dos locos microssatélites.
Extração de DNA genômico
O método de extração de DNA será definido a partir de protocolos disponíveis
na literatura que serão testados para cada espécie selecionada.
20
Visualização de polimorfismo
Os fragmentos microssatélites (alelos) serão visualizados em gel de
poliacrilamida desnaturantes corridos em seqüenciador automático e o método de
marcação será por fluorescência.
Delineamento Experimental
Na unidade fitogeográfica selecionada, serão amostrados no mínimo 180
indivíduos adultos de cada espécie: 90 indivíduos da área primária e 90 da área
secundária. As clareiras em fase de construção, denominadas assim por já
apresentarem indivíduos adultos de espécies pioneiras, serão identificadas conforme
Gandolfi (2000) e através dos resultados da classificação da posição/situação dos
indivíduos amostrados pelo projeto de parcelas permanentes (FAPESP 99/09635-0).
Cada clareira assim identificada será considerada uma unidade amostral para o estudo
da estrutura genética das populações em áreas primárias.
Dependendo da densidade e distribuição espacial dos indivíduos nas clareiras e
da distribuição das clareiras na área primária, serão definidas três réplicas com
aproximadamente 30 indivíduos cada (Figura 1). Nas áreas secundárias em estádio
inicial de sucessão serão selecionadas três sub-áreas com aproximadamente 30
indivíduos cada, uma próxima à área primária (até 1km de distância), uma distante
(mais de 10km) e outra com distância intermediária à área primária (entre 1 a 10 km).
Cada sub-área será considerada uma réplica e será sub-dividida mais uma vez em três
sub-réplicas para a avaliação do efeito da distância sobre a diversidade genética
(Figura 1).
21
Floresta Primária
x
Florestas Secundárias
X= 2 indivíduos
xx
x
x
xx
xx
x
x
xx
xx
x
x
x
x
x
xx
x
x
x
x xxx
xx
xx
xx
x
x
x x
x
x x xxx
x
xxx
x
x
xx
xx
xxx
xx
x
xxx
xx
xx
x
x
xx
x xx
x
x
x
x x
x
xx
x x
x
xxx
x
x x
x
xx
x
x
Réplica 1
Réplica 2
Réplica 3
Réplica 1 - próxima(sub-réplicas 1-3)
Réplica 2 - intermediária(sub-réplicas 4-6)
Réplica 3 - distante(sub-réplicas 7-9)
clareirasréplicas e sub-réplicas
Figura1: Representação esquemática da amostragem hipotética de uma espécie pioneira na unidade fitogeográfica em estudo. Nota: A figura não está em escala, ver detalhes no texto.
Serão medidas as distâncias geográficas (georeferenciadas) de cada réplica ou
sub-área da área secundária à floresta primária mais próxima e entre as réplicas. A
distância entre duas réplicas deverá ser maior que a distância de cada uma delas à
floresta primária.
Inicialmente as análises de estrutura genética e fluxo gênico serão realizadas
separadamente dentro de cada área. Na área primária, a análise será entre unidades
amostrais (clareiras). Na área secundária a análise será feita entre réplicas e entre sub-
réplicas. Dependendo das informações disponíveis na literatura sobre a biologia
reprodutiva das espécies em estudo (distâncias de dispersão de pólen e sementes),
22
será definida mais uma escala espacial de agrupamento de indivíduos para análise da
estrutura genética das populações em ambas as áreas. Para a avaliação da estrutura
genética e fluxo gênico entre áreas primárias e secundárias será utilizado o
agrupamento dos indivíduos nas clareiras e sub-réplicas.
Análise de dados
a) Diversidade genética
Para análise da diversidade genética serão estimados os seguintes
parâmetros: Número médio de alelos/loco (A), proporção de locos polimórficos (P),
heterozigosidade média observada (Ho) e heterozigosidade média esperada (He). O
número médio de alelos por loco será obtido pela média aritmética do número total de
alelos dividido pelo número total de locos. A proporção ou percentagem de locos
polimórficos será obtida pela razão entre o número de locos polimórficos e o número
total de locos. Será considerado como loco polimórfico aquele em que a freqüência do
alelo mais comum não ultrapasse 95%. Os valores da heterozigosidade observada
serão obtidos pela média do número de genótipos heterozigotos em relação ao total de
genótipos em cada loco. Para obter-se Ho será calculada a média para todos os locos.
He será obtida através da média da heterozigosidade esperada de todos os locos
(estimativa de multi-locos), calculadas de acordo com Nei (1978).
b) Estrutura genética
A estrutura genética das populações será estimada pelas estatísticas – F, que
serão calculadas de acordo com Weir e Cockerham (1984), e pelo cálculo das
distâncias genéticas e análise de agrupamento, após teste de equilíbrio de Hardy-
Weinberg (Futuyma 1992).
23
As distâncias genéticas serão calculadas de acordo com Nei (1978) a partir dos
dados de presença (1) ou ausência (0) de bandas ou alelos, sendo construída uma
matriz de distância genética. A partir dessa matriz será feita a análise de agrupamento,
utilizando-se o método hierárquico SAHN ((Sequential Aglomerative Hierarchial and
Nested Clustering Method), com algoritmos de UPGMA (Sneath e Sokal 1973).
c) Fluxo Gênico
O fluxo gênico será estimado de forma indireta, utilizando-se o método de
Slatkin (1985b) baseado na freqüência média de alelos encontrados em uma única
população, ou seja, na freqüência de alelos raros, menor que 0,05%.
24
CRONOGRAMA (semestral)
Semestres Atividades
2003/1 2003/2 2004/1 2004/2 2005/1 2005/2 2006/1 2006/2
1 X X X 2 X 3 X 4 X X X 5 X 6 X X X 7 X X X X 8 X
Nome da Atividade
1) Disciplinas
2) Definição de espécies e áreas de estudo
3) Teste de protocolos de extração de DNA
4) Obtenção dos marcadores moleculares
5) Seleção e marcação dos indivíduos; medição de distâncias entre áreas e coleta
de material vegetal
6) Extração de DNA e visualização de polimorfismo
7) Análise de dados
8) Redação de tese
25
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