Análise in vitro da participação do colesterol na interação

de macrófagos peritoneais de camundongos com

Bacteroides fragilis.

Kayo Cesar Bianco Fernandes

Rio de Janeiro

2012

ii

KAYO CESAR BIANCO FERNANDES

Aluno do Curso de Tecnologia em Biotecnologia

Matrícula 0913800113

Análise in vitro da participação do colesterol na interação

de macrófagos peritoneais de camundongos com

Bacteroides fragilis.

Rio de Janeiro

Julho de 2012

Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado ao Curso de

Graduação em Tecnologia em Biotecnologia da UEZO

como parte dos requisitos para a obtenção do grau de

Tecnólogo em Biotecnologia, sob a Orientação da Profª.

Jessica Manya Bittencourt Dias Vieira.

iii

Dedico esse trabalho aos meus pais que

me ajudaram durante esta caminhada.

iv

Agradecimentos

Gostaria de agradecer aos meus pais que estiveram ao meu lado me

apoiando em todos os momentos me dando carinho e suporte emocional para que

eu conseguisse vencer todos os desafios que surgiram durante todo este

percurso. Obrigado por sempre acreditarem na minha capacidade (mesmo

quando eu mesmo duvidava) e por me ensinarem que o esforço e a perseverança

são capazes de superar qualquer limitação. Ter vocês como pais é meu maior

orgulho, espero poder lhes trazer alegrias sempre.

Ao meu irmão, que me apoiou em cada passo da minha vida.

À minha namorada Meire Watanabe, por me apoiar em muitas decisões,

ouvir meus problemas, minhas inseguranças, meus medos e por sempre me

mostrar o caminho certo sem perder o sorriso no rosto.

Às minhas amigas e companheiras, Barbara Succar, Juliana Succar,

Juciara Batista, que sempre estiveram ao meu lado em todos os momentos bons

e ruins me ouvindo e dando apoio moral. Por me acompanhar ao longo dessa

jornada, exercitando a paciência, além de boas risadas.

À minha orientadora, Dr.ª Jéssica Manya, por ter me concedido um voto de

confiança. Tendo sempre se demonstrado gentil e compreensiva em todas as

vezes que precisei de sua ajuda. Obrigada por esta oportunidade, sei que ainda

tenho muito que aprender.

Ao meu co-orientador, Dr. Sérgio Seabra, por me ensinar tudo procurando

ter paciência nos momentos em que eu olhava para ele no final da explicação e

dizia “Não entendi nada” e pelos gritos de estímulo.

À Aline Lorete, minha companheira de Iniciação que sempre me ajudou no

trabalho além de ser uma ótima companhia.

A meu colega de estágio, Pedro Rodrigues, por dizer sempre a coisa

errada na hora certa.

Ao Prof. Fabio Fortes que sempre mostrou a solução óbvia dos problemas.

v

Ao Prof. Carlos Falcão, que sempre tinha uma frase épica, “O Quê?”.

Agradeço a minhas companheiras de laboratório, Juliana Chal, Adriana

Sacramento e Ezaine Torquato, por tornarem minha estada no laboratório muito

agradável com as gargalhadas que arrancaram de mim e pelo apoio que me

deram quando necessitei.

Agradeço a todos do LTBM, LTCC e do Setor de Microbiologia do LTCC,

que ajudaram na confecção deste trabalho.

vi

Lista de Figuras

Figura 1 – Classificação de cepas, produtoras e não produtoras de TBF 05

Figura 2 – Molécula de β-ciclodextrina 06

Figura 3 – Micrografia eletrônica de varredura de macrófago sadio apresentando

em sua superfície ondulações na membrana 07

Figura 4 – Representação do mecanismo de fagocitose em macrófago ativado por

interferon-Ɣ 08

Figura 5 – Representação do animal no lavado peritoneal para obtenção de

macrófagos 14

Figura 6 – Esquema representando os insertos de 0,4µm 16

Figura 7 – Ensaio de viabilidade celular após tratamento com βCD 19

Figura 8 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa de

B. fragilis ATCC 25285 20

Figura 9 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa

ELI1.1 21

Figura 10 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa

ES31.3 22

Figura 11 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa

078320 23

Figura 12 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa

ATCC 43859 24

Lista de Tabelas

Tabela 1: Classificação dos diferentes tipos de respiração 01

Tabela 2: Informações clínicas de algumas das espécies do genero Bacteroide 02

Tabela 3: Impacto do uso de antibióticos e sepse intra-abdominal e formação de

abscessos em ratos 03

Tabela 4: Cepas de B. fragilis utilizadas neste estudo 13

E F

E F

E F

vii

Tabela 5: Analise dos dados obtidos nos resultados 18

Lista de Siglas

TBF Toxina de B. fragilis

BFET B. fragilis enterotoxigênico

BFNT B. fragilis não-toxigênico

βCD β-ciclodextrina

MØ Macrófagos

INF-ɣ Interferon-ɣ

LPS Lipolissacarídeo

NO Óxido Nítrico

iNOS Enzima a síntese do óxido nítrico induzida

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

BHI–PRAS Brain Heart Infusion Pre-Reduced Anaerobically Sterilized

ATCC Ameican Type Cell Culture

ASS Ágar Sangue Suplementado

PBS Phosphate Buffered Saline

DMEM Dulbelco’s modified Eagle’s Médium

SFB Soro Fetal Bovino

DMSO Dimetilsulfóxido

CaCo Cacodilato de Sódio

viii

Resumo

Bacteroides é um gênero bacteriano composto por bastonetes gram-

negativos, não esporulados, anaeróbios estritos. A espécie B. fragilis é

componente da microbiota intestinal, beneficiando seus hospedeiros, já que

fisicamente excluem os patógenos em potencial de colonizar o intestino. Além

disso, tal espécie é considerada patógeno oportunista em humanos, com a

capacidade de causar infecções na cavidade peritoneal e levar à formação de

abscessos quando ocorre um trauma, por exemplo, no sítio de colonização. Em

um processo infeccioso, as bactérias precisam burlar o sistema imune a fim de

manter a infecção ativa, ou seja, necessitam escapar da atividade microbicida das

células que o compõem, tais como os macrófagos. Estes últimos atuam pela

produção de radicais livres como o óxido nítrico (NO), o qual é sintetizado pela

enzima NO sintase induzida (iNOS). Dados anteriores indicam que a espécie B.

fragilis é capaz de alterar a atividade microbicida de macrófagos, causando danos

não só à membrana plasmática bem como alterações aos filamentos de actina. O

objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos da interação de B. fragilis com

macrófagos peritoneais de camundongo (MØ) a fim de esclarecer de forma mais

detalhada os resultados obtidos anteriormente. Para tanto, foram realizados

ensaios de depleção parcial de colesterol bem como análises com utilização de

insertos de 0,4µm após eventos de interação, associados à microscopia eletrônica

de varredura. Os resultados apontam que a depleção de colesterol potencializa os

efeitos da interação e, ainda, que tais efeitos independem do contato

B.fragilis:MØ.

Palavras-chave: Bacteroides fragilis, macrófagos peritoneais de camundongo,

ensaios de interação, colesterol, β-ciclodextrina, microscopia eletrônica de

varredura.

ix

Abstract

Bacteroides is a bacterial genus composed of gram-negative, non-

sporulated and strict anaerobes rods. The B. fragilis species is an intestinal

microbiota component, wich brings benefits to the host since it physically excludes

the potential pathogens from colonizing the gut. Besides, such species is

considered an human opportunistic pathogen with the ability to cause infection on

peritoneal cavity inducing abscess formation when occurs a trauma, for example,

in the colonization site. During an infection process bacteria need to escape from

immune system in order to maintain the infection active, wish means, they need to

avoid microbicide activity of the immune system cells like macrophages. The latter

act by free radicals production such as nitric oxide (NO), which is synthesize by

NO synthase inducible (iNOS). Previous data showed that B. fragilis species is

capable of modify macrophages (MØ) microbicide action, causing not only

plasmatic membrane damages as also alteration on actin filaments. The aim of

this work was analyze B. fragilis effects on macrophages after interaction events to

clarify in detail the results obtained before. To do so, it was realized partial

cholesterol depletion essays as well analyses using transwell after interaction

events, associated to scanning electron microscopy. The results indicate that

cholesterol depletion potentize the interaction effects and, also such effects are

independent from B. fragilis:MØ contact.

Key-worlds: Bacteroides fragilis, mice peritoneal macrophages,

bacteria/macrophages interaction, cholesterol, β-ciclodextrin, analysis by electron

microscopy.

x

“Tenha em mente que tudo que você aprende na escola é trabalho de muitas

gerações. Receba essa herança, honre-a, acrescente a ela e, um dia, fielmente,

deposite-a nas mãos de seus filhos.” Albert Einstein

xi

Sumário

Lista de Figuras vi

Lista de Tabelas vi

Lista de Siglas vii

Resumo viii

Abstract ix

Epígrafe x

1- Introdução 01

1.1 – Aeróbios x Anaeróbios 01

1.2 – Gêneros Bacteroides 02

1.3 – Bacteroides Fragilis 03

1.4 – O colesterol de membrana 05

1.5 – Macrófagos 06

1.6 – Macrófago e o óxido nítrico 09

1.7 – Escapando da fagocitose 09

2 - Objetivos 11

2.1 – Objetivo Geral 11

2.2 – Objetivos Específicos 11

3 - Material e Métodos 12

3.1. Cepas bacterianas 12

3.2. Obtenção de Macrófagos Peritoneais de Camundongos (MØ) 13

3.3. Interação in vitro . 14

3.4. Ensaio com β-ciclodextrina 15

3.4.1. Analise da viabilidade celular 15

3.4.2. Depleção parcial do colesterol pré-interação 15

3.5. Ensaio com Insertos 0,4µM 15

3.6. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 16

xii

4- Resultados 17

5- Discussão 25

6- Conclusões 28

7- Referências Bibliográficas 29

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. AERÓBIOS X ANAERÓBIOS

Todo organismo realiza um tipo de respiração para manter-se vivo. Alguns

organismos realizam a respiração aeróbia; enquanto que outros realizam a

respiração anaeróbia (Tabela 1).

Tabela 1: Classificação dos diferentes tipos de respiração. Adaptado de http://users.med.up.pt/cc04-10/Microdesgravadas/12_Anaerobias.pdf

Aeróbios Necessitam de O2 para desenvolvimento e multiplicação.

Anaeróbios

Estritos Não necessitam de O2

para desenvolvimento e multiplicação.

Extremamente sensíveis a

concentração de O2.

Anaeróbios

Tolerantes

Moderadamente sensíveis: toleram

baixas concentrações de O2.

Anaeróbios

Facultativos

Podem ou não utilizar O2

para seu crescimento e

multiplicar.

Crescem em aerobiose e são capazes de obter energia pela fermentação de compostos orgânicos.

A respiração aeróbica se desenvolve principalmente nas mitocôndrias e

requer oxigênio. Ela é formada por três fases: glicólise, ciclo de Krebs e cadeia

respiratória.

Já a respiração anaeróbia, também chamada de respiração anaeróbica, ou

também de fermentação, ocorre apenas na ausência de oxigênio. Contudo, a

sensibilidade dos microrganismos ao oxigênio varia, sendo classificados como

anaeróbios estritos, anaeróbios facultativos e anaeróbios tolerantes (ENGELKIRK

et al., 1992). A bactéria responsável por causar o botulismo, Clostridium

botulinum, só sobrevive na ausência de oxigênio sendo assim classificada como

anaeróbia estrita. Essa bactéria produz algumas toxinas que podem levar à morte

do hospedeiro. Mas as bactérias anaeróbias não causam somente prejuízos. O

gênero Lactobacilos, anaeróbios facultativos, são utilizados na produção de

2

iogurtes e coalhadas, além disso, essas mesmas bactérias são encontradas em

nosso intestino e auxiliam na fabricação de algumas vitaminas.

1.2. GÊNERO Bacteroides

Dentre as bactérias anaeróbias, se encontra o gênero Bacteroides formado

por bastonetes Gram-negativos anaeróbios estritos, não esporulados, bile-

resistentes e que podem ou não apresentar motilidade. São componentes

predominantes da microbiota das membranas mucosas (BROOK, 1995;

FERREIRA et al., 2003), colonizam a orofaringe e os tratos gastrintestinal e

genital feminino de seres humanos. As doenças infecciosas causadas por tais

microrganismos originam-se, principalmente, de sua disseminação endógena, a

partir de superfícies mucosas colonizadas para locais do organismo normalmente

estéreis (FINEGOLD & GEORGE, 1989; GOLDSTEIN, 1995; FERREIRA et al.,

2003).

As espécies de Bacteroides têm se destacado pela sua alta incidência de

isolamento, como é o caso, principalmente, da espécie B.fragilis (Tabela 2). Além

disso, as espécies deste gênero normalmente apresentam resistência a

antimicrobianos (FERREIRA et al., 2003). Estudos realizados por SEARS, C.L.

(2012), utilizando dois antibióticos diferentes, gentamicina e clindamicina,

demostraram a resistência do B. fragilis aos mesmos (Tabela 3).

Tabela 2: Informações clínicas de algumas das espécies do genero Bacteroides, (PAUL G. ENGELKIRK).

Espécies

Informação clinica

B. fragilis

Espécies mais isoladas de processos infecciosos dos

tecidos moles (61%)

B. ovatus

Ocasionalmente isoladas de amostras clínicas (5%)

B. thetaiotaomicron

Freqüentemente encontradas em amostras clínicas (17%)

B. vulgatus

Ocasionalmente isoladas de processos infecciosos (6%)

3

Tabela 3: Impacto do uso de antibióticos e sepse intra-abdominal e formação de

abscessos em ratos (Adaptado de SEARS, C.L. 2012).

Condições Formação de abscessos Mortalidade

Controle 100% 37%

Gentamicina 98% 4%

Clindamicina 5% 35%

Gentamicina/Clindamicina 6% 7%

A mucosa intacta representa uma importante barreira que previne

microrganismos de se espalharem para outros sítios. Portanto, as infecções

anaeróbias ocorrem normalmente na presença de fatores que são predisponentes

como necrose tecidual, causada por trauma ou cirurgia, insuficiência vascular ou

a presença de tumores (BROOK, 1987).

1.3. Bacteroides fragilis

A espécie B. fragilis apesar de minoritária na microbiota intestinal, é a mais

frequentemente associada a processos infecciosos, tais como bacteremias

(GOLDSTEIN & CITRON, 1988), infecções intra-abdominais (CRABB et al, 1990),

abscessos (BROOK & FINEGOLD, 1981) e infecções em tecidos moles (BROOK,

1987). Além disso, apesar de centenas de espécies bacterianas colonizarem o

trato gastrintestinal, o predomínio da espécie B. fragilis e da espécie anaeróbia

facultativa Escherichia coli em peritonites secundárias é comum (ONDERDONK et

al., 1974), reiterando o conceito de que as infecções anaeróbias são geralmente

polimicrobianas.

Acredita-se que tal espécie se destaque como um dos principais patógenos

em infecções anaeróbias devido a sua versatilidade em causar processos

infecciosos distintos (ONDERDONK et al., 1977a; 1990; ONDERDONK, 2005).

4

Neste contexto, alguns fatores de virulência têm sido propostos a fim de explicar o

seu comportamento patogênico e o destaque de B. fragilis em relação aos demais

componentes da microbiota intestinal em função da expressão de fatores de

virulência que poderiam conferir a espécie vantagens ecológicas (KASPER et al.,

1979; MYERS & SHOOP, 1987). Dentre os fatores de virulência já descritos, a

cápsula tem sido um dos mais estudados pela sua atuação como evasina

bacteriana e como participante da formação de abscessos (LINDBERG et al.,

1990; HOSFTAD, 1992; DUERDEN, 1994; KALKA – MOLL et al., 2001). Uma

observação importante foi a de que a cápsula de B. fragilis sozinha foi suficiente

para induzir a formação de abcessos em murinos (SEARS, C.L. et al. 2012).

Estudos anteriores realizados por COMSTOCK et al. (1999) constataram que o B.

fragilis possui o sistema de polissacarídeo mais complexo já descrito. Verificou-se

que B. fragilis apresenta a capacidade de sintetizar oito polissacarídeos

capsulares distintos. No entanto, curiosamente, cada cepa de B. fragilis apresenta

apenas um único membro desta família de polissacarídeos sobre a sua superfície.

Algumas cepas de B. fragilis podem secretar uma potente toxina,

denominada Toxina de B. fragilis (TBF), que rapidamente induz alterações na

biologia e transdução de sinal nas células epiteliais do cólon, bem como estimula

a resposta inflamatória neste sítio, tanto em humanos quanto em modelos

experimentais (SEARS, C.L. et al., 2008). A espécie B. fragilis pode ser dividida

em dois grupos com base na expressão de TBF. As BFNT (B. fragilis não-

toxigênico) não possuem o gene para expressão da TBF que promove a saúde da

mucosa e aquelas consideradas BFET (B. fragilis enterotoxigênico) expressam o

TBF (Fig. 1). Embora todos os B. fragilis têm a capacidade de induzir a formação

de abcesso em seres humanos, apenas as cepas BFET têm sido associadas com

doença diarréica humana. Além disso, até o presente o gene TBF não foi

identificado em quaisquer outros Bacteroides ou espécies microbianas (SEARS,

C.L. 2012). A expressão do gene TBF ocasiona a doença diarreica em humanos,

porém cepas BFET podem colonizar de forma exacerbada indivíduos, os quais

permanecem assintomáticos. Um estudo realizado por WU et al. (2006) demostra

que o receptor de TBF é uma proteína de membrana sensível à depleção de

colesterol. Os mesmos estudos ainda sugerem que os receptores de TBF estejam

localizados em jangadas lipídicas, ricas em colesterol (WU et al., 2006).

5

Fig. 1 – Classificação de cepas, produtoras e não produtoras de TBF (Adaptado de SEARS, C.L.

2012).

1.4. O COLESTEROL DE MEMBRANA

O colesterol é um lipídio encontrado nas membranas de células de

mamíferos. Este lipídio é componente essencial das membranas celulares

estando envolvido na regulação da fluidez das mesmas, assim como em

processos de sinalização celular, quando este se encontra associado a jangadas

lipídicas. Vários estudos têm demonstrado que o colesterol pode ser utilizado para

auxiliar na entrada de inúmeros patógenos em seus hospedeiros (WU et al.,

2006). O colesterol de membrana presente em células eucarióticas poder ser

depletado pela ação da droga β-ciclodextrina (βCD) (Fig. 2), ou de seus

derivados, o que ocasiona a desestruturação das jangadas lipídicas e

consequentemente bloqueio de diversos processos biológicos. (VENTURINI et al.,

2008).

As ciclodextrinas são polímeros formados por monômeros de glicose que

são obtidos a partir da degradação de amido. As mais conhecidas são de origem

natural e classificadas como α (alfa), β (beta), ou γ (gama), de acordo com a

quantidade de monômeros de glicose que as formam (VENTURINI et al., 2008).

6

1.5. MACRÓFAGOS

Diferentes mecanismos de defesa atuam concomitantemente e de forma

complementar em vários sítios, inclusive na cavidade peritoneal. Nesta última,

numa primeira etapa ocorre a depuração pelos vasos linfáticos e a fagocitose, o

que parece ser o principal mecanismo antimicrobiano no sítio da infecção (DUNN

et al., 1985; 1987), por macrófagos residentes (MØ). Os MØ são formas

diferenciadas de monócitos originários da medula óssea, que logo após sua

produção migraram pela corrente sanguínea para os tecidos, onde se fixaram e

sofreram diferenciação. MØ são células componentes do sistema imune de

mamíferos, integrando o sistema mononuclear fagocítico (VAN FURTH et al.,

1972)(Fig. 3). Sabe-se que os MØ são células fagocíticas profissionais que

participam de forma relevante na imunidade inata e adquirida dos organismos,

sendo caracterizadas como células apresentadoras de antígenos (MACMICKING.

et al. 1997). Deste modo, nas primeiras horas do desafio microbiano, os MØ são

os responsáveis pela atividade fagocítica na cavidade peritoneal (DUNN et al.,

1985; 1987).

Fig. 2 – Molécula de β-ciclodextrina (VENTURINI et al.,

2008)

7

Fig. 3 – Micrografia eletrônica de varredura de macrófago sadio apresentando em sua superfície

ondulações na membrana.

O processo de fagocitose tem inicio quando as células microbianas são

reconhecidas pelos MØ, logo após são englobadas e degradadas em seu interior,

ocorrendo à formação de vesículas especializadas, denominadas fagossomos.

Estes por sua vez se fundem aos lisossomos, vesícula contendo enzimas

produtoras de radicais óxidos, formando o fagolisossomo. Simultaneamente,

receptores que participam da fagocitose mandam sinais que ativam diversas

enzimas no interior do fagolisossomo, as quais têm por fim degradar a bactéria

(Fig. 4).

8

Fig. 4 – Representação do mecanismo de fagocitose em macrófago ativado por interferon-Ɣ.

Adaptado de http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap16/lecture3.htm

MØ expressam receptores de citosinas, tal como o interferon-ɣ (INF-ɣ).

Esta citosina quando se liga aos receptores dos MØ torna-os ativados, o que

aumenta a atividade microbicida do mesmo, por exemplo, pela produção de óxido

nítrico. A ativação do MØ também pode correr através da injeção em

camundongos de tioglicolato ou LPS (lipolissacarídeo), agentes pró-inflamatórios,

é possível fazer com que os MØ entrem num estado funcional intermediário entre

residente e ativado, estado este designado como elicitado ou estimulado (COHN,

1978).

O IFN- ɣ quando se liga aos receptores dos MØ torna-os ativados, levando

a ativação da enzima a síntese do óxido nítrico induzida (iNOS) , por exemplo,

responsável pela produção de óxido nítrico (NO). Posteriormente, outros

mecanismos são mobilizados, incluindo o bloqueio mecânico do processo

infeccioso na tentativa de impedir sua disseminação, o que se traduz na formação

de abscessos (DUNN et al., 1985; 1987; MADDAUS et al., 1988).

9

1.6. MACRÓFAGO E O OXIDO NÍTRICO

A ativação dos MØ leva a sinalização intracelular que induz a translocação

de um fator de transcrição, o que resulta na expressão de várias enzimas, como a

iNOS que sintetiza NO (BUTCHER et al, 2001). O NO, juntamente com outros

radicais superóxido e hidroxila, está relacionado ao mecanismo antimicrobiano

dos macrófagos chamado “burst” oxidativo ou estresse oxidativo. Neste caso os

MØ utilizam os efeitos citotóxicos de vários tipos de oxidantes como mecanismo

de defesa a favor do hospedeiro (HURST & BARRETTE, 1989; MILLER &

BRITIGAN, 1997).

NO é um radical gasoso solúvel em água e lipídios, reage na água com

oxigênio e seu produto reativo gera outros radicais (ex. dióxido de nitrogênio,

NO2), anions moderadamente estáveis (ex. nitrito, NO2-), anions muito estáveis

(ex. nitrato, NO3-), óxidos altamente estáveis (ex. trióxido de dinitrogênio, N2O3) e

peróxidos instáveis (ex. peroxinitrito, ONOO-). Biologicamente, a maioria dessas

formas é passível de surgir em poucos segundos após a ativação da iNOS

(MACMICKING, XIE & NATHAN, 1997).

Dados da literatura demonstraram que alguns patógenos têm a capacidade

de inibir a produção de NO por MØ (SEABRA. et al., 2002), assim como o contato

inicial entre as células, determinando uma vantagem na sua sobrevivência

durante o processo infeccioso (MACMICKING. et al., 1997).

1.7. ESCAPANDO DA ATIVIDADE MICROBICIDA DOS MØ

Estudos que analisaram os efeitos da interação de MØ com cepas da

espécie B. fragilis, utilizando imunocitoquímica e microscopia eletrônica de

transmissão e varredura, mostraram que tais bactérias são capazes de gerar

alterações em tais fagócitos (VIEIRA et al, 2005, VIEIRA et al, 2009). Ensaios in

vitro de imunocitoquímica demostraram extravasamento dos filamentos de actina,

os quais foram coincidentes com a marcação para iNOS. Além disso, análises da

resposta dos MØ infectados demonstrou que houve uma queda na produção de

NO nos MØ infectados (VIEIRA et al, 2005), o que também já foi observado para

outros patógenos (DAMATTA et al, 2000; SEABRA. et al., 2002; LÜDER et al,

2003).

10

Analises realizadas com o objetivo de testar o tipo de morte, apoptose ou

necrose, sofrida pelos macrófagos após os ensaios de interação com B. fragilis,

indicaram que a morte dos mesmos estaria ocorrendo por um processo similar à

necrose, com a formação de poros na membrana dos fagócitos (VIEIRA et al,

2009). Ainda, análises in vivo apresentaram resultados similares às análises in

vitro (VIEIRA et al, 2009).

As infecções causadas por bactérias anaeróbias são eventos clínicos

comuns e algumas se manifestam de forma muito grave, resultando em altas

taxas de letalidade. Além disso, as infecções anaeróbias facilmente escapam ao

diagnóstico laboratorial devido às precauções especiais necessárias à coleta e

transporte dos espécimes clínicos. Essas condições são indispensáveis à

realização de estudos bacteriológicos adequados, e em particular para esses

microrganismos. Adicionalmente, muitos laboratórios estão despreparados para o

manejo de alguns ou da maioria dos anaeróbios.

A biologia da espécie B. fragilis tem sido objeto constante de investigações

nos últimos anos e, apesar, de já serem conhecidos alguns dos aspectos relativos

às interações com o hospedeiro, muito ainda falta para o completo entendimento

dos processos causados por este importante patógeno anaeróbio. Dessa forma,

mostra-se importante avaliar a interação de B. fragilis com células hospedeiras de

maneira a complementar o conhecimento já adquirido, assim como elucidar os

mecanismos envolvidos nos eventos de interação.

11

2. OBJETIVO

2.1. OBJETIVO GERAL

Tendo em vista os resultados previamente observados para a espécie

B.fragilis com relação às alterações ocasionadas aos MØ infectados, o objetivo

deste estudo foi aprofundar as análises realizadas a fim de compreender de forma

mais precisa as moléculas e mecanismos envolvidos no processo de interação

bactéria: MØ.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Analisar através do tratamento com β-ciclodextrina a importância do

colesterol de membrana na interação B. fragilis: MØ;

Avaliar a necessidade do contato B. fragilis:MØ para observação dos

efeitos citotóxicos, através da utilização de insertos de 0,4µm durante os

ensaios de interação B. fragilis:MØ;

Realizar ensaios de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) após os

ensaios com β-ciclodextrina com a finalidade de observar os efeitos

ocasionados à topologia dos MØ.

12

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. CEPAS BACTERIANAS

As cepas 078320, ES 31.1, ELI 1.1 foram obtidas a partir da Coleção de

Cultura do Laboratório de Biologia de Anaeróbios (IMPPG/UFRJ). Tais cepas

foram reativadas em caldo BHI–PRAS (Brain Heart Infusion Pre-Reduced

Anaerobically Sterilized) (HOLDEMAN, KELLY & MOORE, 1984) a partir de

estoque em meio de Chopped meat, sendo incubadas por 24h a 37ºC. As cepas

ATCC (Ameican Type Cell Culture) 43859 e ATCC 25285 foram obtidas da

Coleção de Cultura Bacteriana do Laboratório de Microrganismos de Referência

(INCQS/FIOCRUZ) e reativadas em caldo Tioglicolato a partir de estoque

liofilizado, sendo incubadas por 48h a 37ºC. Critérios de viabilidade e pureza

foram utilizados, após semeadura em placas de ágar sangue suplementado (ASS)

com vitamina K (10 μg/mL) e hemina (5 μg/mL). Após o período de incubação, em

ambiente de anaerobiose (80% de N2, 10% de H2 e 10% de CO2), as colônias

foram repicadas para novo caldo BHI-PRAS, para avaliação morfo-tintorial pelo

método de Gram, modificado por Kopeloff, e confirmação do tipo respiratório

(JOUSIMIES-SOMER et al., 2002; FERREIRA. et al., 2003).

As suspensões bacterianas usadas nos experimentos foram obtidas por

cultura em caldo BHI-PRAS a 37°C. Brevemente, as células foram centrifugadas

por 10 min a 3600rpm após crescimento por 24 horas, lavadas com PBS

(Phosphate Buffered Saline), e ressuspensas a uma concentração de 6x108

UFC/mL, usando a escala 2 de McFarland .

13

Tabela 4: Cepas de B. fragilis utilizadas neste estudo.

CEPA ESPÉCIE ORIGEM

ATCC 43859

B. fragilis

Processo diarréico

ATCC 25285

Abscesso de apêndice

ES 31.3

Processo diarréico

ELI 1.1

Microbiota intestinal normal

078320

Processo diarréico

3.2. OBTENÇÃO DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS

Os macrófagos (MØ) foram obtidos como descrito por SEABRA et al. (2002). Os

MØ foram estimulados pela inoculação intraperitoneal de 30mg/mL de tioglicolato

em camundongos suíços de 48 dias. Após 72h, foi realizado lavado peritoneal nos

camundongos com 5mL de DMEM gelado (Dulbelco’s modified Eagle’s médium /

Sigma® - St Louis, MO/USA). O protocolo de estudos com animais foi revisto e

aprovado pelo comitê de ética de experimentos animais da Universidade Estadual

do Norte Fluminense Darcy Ribeiro(número de permissão 98).

14

Fig. 5 – Ilustração do procedimento de obtenção dos MØ – lavado peritoneal de camundongo.

Adaptado de http://www.scielo.br/img/revistas/acb/v20s1/25565f1.gif

As células peritoneais, obtidas através do lavado peritoneal, foram

incubadas em gelo apenas até o momento da centrifugação, centrifugadas a

3600rpm por 10 min a 4°C, ressuspensas em meio DMEM gelado, contadas com

auxílio de microscópio óptico, e ajustadas para 2x106

células/mL em meio DMEM

gelado. Para a obtenção de células aderentes, 180 μl de suspensão foram

espalhados sobre lamínulas em cada orifício de placa de 24 poços. Após 1 hora

de incubação a 37°C numa atmosfera a 5% de CO2, os poços foram lavados com

DMEM sem soro por duas vezes, para remoção das células não aderentes em

seguida a placa foi incubada, por 24 horas, com 500 μl de DMEM suplementado

com 5% de soro fetal bovino inativado por calor (SFB / Laborclin® - Pinhais,

Paraná, Brasil) e 2 μl/ml de interferon- (IFN- / Sigma®) para ativação dos

macrófagos.

3.3. INTERAÇÃO IN VITRO

As interações bactérias-macrófagos foram realizadas por 2 horas em estufa

a 37C numa atmosfera a 5% de CO2, usando uma proporção de 1:200,

macrófago:bactérias. Após o período de incubação, os poços foram lavados duas

vezes com DMEM sem soro.

15

3.4. ENSAIO COM β-CICLODEXTRINA (βCD)

3.4.1. ANÁLISE DA VIABILIDADE CELULAR

A concentração adequada para o tratamento com βCD deve ser controlada

de acordo com a linhagem celular, para que o tratamento com a droga não afete a

morfologia e a viabilidade da célula. Por este motivo, foi necessário definir a

concentração adequada de βCD a ser utilizada no tratamento dos macrófagos de

forma a depletar uma quantidade significativa de colesterol sem comprometer a

viabilidade da célula. Para este fim, as células foram obtidas como descrito no

item 3.2. E logo após, as mesmas foram tratadas com concentrações de 5, 10, 20,

30 e 40mM (milimolar) de βCD. As alíquotas foram diluídas de um estoque de

100mM, preparado com 3ml de DMSO (Dimetilsulfóxido) filtrado e 7ml de DMEM

estéril. A viabilidade celular foi avaliada após 24 e 48h, através de ensaio com

azul de Trypan na concentração de 0,4% em PBS, foi possível avaliar que a

concentração de 10mM, depletou uma maior quantidade de colesterol sem afetar

a viabilidade das células.

3.4.2. DEPLEÇÃO PARCIAL DO COLESTEROL PRÉ-INTERAÇÃO

Os MØ foram obtidos como descrito no item 3.2. E, logo após o período de

incubação por 24 horas com DMEM suplementado, as células foram lavadas duas

vezes com DMEM sem soro e incubadas novamente com DMEM, contendo βCD

a uma concentração de 10mM, por 24h, a fim de obter o maior depleção possível

de colesterol. Após a incubação por 24 horas com a βCD, as células foram

lavadas duas vezes com DMEM.

As interações bactérias-macrófagos foram realizadas como descrito no

item 3.3. Após o período de incubação, os poços foram lavados duas vezes com

DMEM sem soro.

3.5. ENSAIO COM INSERTOS 0,4µM

Estes ensaios foram realizados a fim de avaliar a necessidade do contato

para ocorrência dos efeitos que porventura sejam observados após os eventos de

interação. Os ensaios de interação foram realizados conforme item 3.3 e 3.4.2 da

seção Material e Métodos, porém foram utilizados insertos 0,4µm (fig. 6).

16

Os insertos não permitem que haja o contato direto da B. fragilis com o

macrófago, a membrana permite apenas a passagem de possíveis substratos

produzidos pelas células. Após os ensaios, os MØ foram analisados por

microscopia eletrônica de varredura de acordo com o protocolo descrito na seção

3.6 do Material e Métodos.

Fig. 6 – Esquema representando os insertos de 0,4µm. Adaptado de:

http://wires.wiley.com/WileyCDA/WiresArticle/wisId-WNAN53.html

3.6. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV)

Após os eventos de interação de cepas de B. fragilis com macrófagos nos

tempos determinados para cada experimento, as células foram lavadas com

DMEM sem soro, fixadas em Karnovsky, (2,5% [v/v] de glutaraldeído e 4% [v/v] de

paraformaldeído em tampão CaCo (Cacodilato de Sódio) 0,1 M), por 40 min, e

lavadas com PBS. As células foram pós-fixadas em solução de tetróxido ósmio e

tampão CaCo na proporção 1:1, a temperatura ambiente, por 40 min, protegidas

da luz e posteriormente lavadas em PBS. As células foram desidratadas em série

gradual de acetona (40-100% / 15 min cada), secas através de ponto crítico

usando CO2, montadas em suportes de alumínio, e cobertas com ouro (20-30nm)

para observação em microscópio eletrônico de varredura JEOL (VIEIRA et al.,

2009).

17

4. RESULTADOS

No ensaio de viabilidade celular com βCD foi possível averiguar que a

concentração mais adequada de βCD foi 10mM por fornecer depleção eficiente do

colesterol celular sem comprometer a viabilidade celular (Fig. 7). Os MØ foram

tratados com 10 mM da droga e infectadas com as diferentes cepas de B. fragilis.

Juntamente foi realizado controle das infecções sem a βCD, ambas foram

observadas com auxílio de MEV.

Foi observado que após os ensaios, MØ não infectados estavam íntegros

(Fig. 8 - 12, A), apresentando ondulações de membrana plasmática, típicos

destas células. Contrariamente, os MØ não infectados, porém tratados com βCD

(Fig. 8 - 12, B) apresentaram diminuição do numero de ondulações de membrana

(Fig. 8 - 12, B cabeça de setas). MØ infectados com as cepas ATCC 25285, ELI

1.1, ES31.3, 078320 e ATCC 43859 de B. fragilis, mas não tratados com βCD

(Fig. 8 - 12, C) apresentaram poucas ondulações. Observou-se ainda a formação

de lesões na superfície dos macrófagos infectados com as cepas de B. fragilis e a

presença de bactérias aderidas aos fagócitos (Fig. 8 - 12, C).

MØ tratados com βCD e infectados com as cepas ATCC 25285, ELI 1.1,

ES31.3, 078320 e ATCC 43859 de B. fragilis (Fig. 8 - 12, D), apresentaram maior

adesão bacteriana (Fig. 8 - 12, D). Nas mesmas imagens nota-se que a

membrana dos macrófagos apresentava formação de estruturas parecidas com

poros.

Com a utilização dos insertos 0,4um, nos ensaios de interação não tratados

com βCD (Fig. 8 - 12, E), a menor formação das ondulações de membrana foi

aparente. Da mesma forma nos ensaios de interação nos quais os insertos foram

utilizados, juntamente com βCD, a membrana dos MØ infectados não apresentou

as ondulações características (Fig. 8 - 12, F). Houve também o aumento do

número de poros nas células tratadas e com insertos (Fig. 8 - 12, F) em

comparação com as células não tratadas (Fig. 8 – 10 e 12, A). Na cepa 078320,

os efeitos foram observados em menor escala (Fig. 11), se comparado com as

outras cepas.

18

Após a analise dos dados obtidos através das imagens, foi possível

expressa-las através da seguinte tabela (Tabela 5).

Tabela 5: Analise dos dados obtidos nos resultados.

Condições Membrana

MØ não infectado (Pranchas 1-5, A) Interação + Ondulações

MØ não infectado + βCD (Pranchas 1-5, B)

Sem ondulações

MØ infectados (Pranchas 1-5, C) Poucas ondulações (Lesões)

MØ infectados + βCD (Pranchas 1-5, D)

Poros + aumento da adesão bacteriana

MØ não infectados + Insertos de

0,4µm (Pranchas 1-5, E) Sem ondulações

MØ infectados + βCD + Insertos de

0,4µm (Pranchas 1-5, F) Ondulações não características + poros

19

Fig. 7 - Ensaio de viabilidade celular após tratamento com βCD. Painel A – MØ tratados com βCD

por 24h. Painel B - MØ tratados com βCD por 48h.

.

A

B

% de MØ

% de MØ

20

Figura 8 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa de B. fragilis ATCC

25285. A - MØ controle, não infectado, apresentando típicas ondulações de membrana (setas). B -

MØ controle tratados com βCD, aparente perda das ondulações é notada (cabeça das setas). C -

MØ infectados com a cepa ATCC 25285 sem tratamento com βCD. O rompimento da membrana é

aparente (seta). D – MØ tratados com βCD e infectados com a cepa ATCC 25285. Nota-se a

presença de bactérias aderidas (seta) e redução significativa de ondulações na membrana, o

rompimento da membrana é aparente (cabeça de seta). E – Ensaio de Insertos 0,4µm de MØ não

tratados com βCD, infectados com a cepa ATCC 25285. Nota-se a ausência de ondulações

características (seta) F – Ensaios de Insertos 0,4µm de MØ tratados com βCD, infectados com a

cepa ATCC 25285 formação de pseudopodes é notada (seta).

A B

C D

E F

21

Figura 9 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa ELI 1.1. A - MØ

controle, não infectados, apresentando típicas ondulações de membrana (setas). B – MØ controle

tratados com βCD, nota-se ausência de ondulações na membrana (seta). C - MØ infectados com a

cepa ELI 1.1, poros na membrana são aparentes. D – MØ tratados com βCD e infectados com a

cepa ELI 1.1. Apresentando extravasamento de citoplasma celular e redução significativa de

ondulações na membrana (setas). E - MØ infectados não tratados com βCD, utilizando-se do

insertos, ausência de ondulações características é notada. F – MØ infectados tratados com βCD,

utilizando insertos, observa-se ausência de ondulações.

A B

C D

E F

22

Figura 10 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa ES 31.3 de B.

fragilis. A - MØ controle, não infectados, apresentando típicos ondulações de membrana (setas). B

– MØ controle tratados com βCD nota-se a redução de ondulações na membrana. C - MØ

infectados com a cepa ES 31.3, apresentam poros na membrana (setas). D – MØ tratados com

βCD e infectados com a cepa ES 31.3 com redução de ondulações características na membrana

plasmática (seta). E - MØ infectados não tratados com βCD, utilizando insertos. Poros na

membrana são notáveis (seta). F – MØ infectados tratados com βCD, utilizando insertos. Poros de

membrana aparentes (setas) e redução de ondulações.

A B

C D

E F

23

Figura 11 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa 078320 de B.

fragilis. A - MØ controle, não infectados, apresentando típicos ondulações de membrana (setas). B

– MØ controle tratados com βCD. Nota-se a ausência de ondulações tipícas. C - MØ infectados

com a cepa 078320, apresentam poros na membrana (setas). D – MØ tratados com βCD e

infectados com a cepa 078320, nota-se grande numero de bactérias aderidas. E - MØ infectados

não tratados com βCD, utilizando-se do insertos. Nota-se a formação de pseudopodes (setas). F –

MØ infectados tratados com βCD, utilizando insertos, formação de pseudopodes é observado

(seta), mas em menor quantidade, do que as células não infectadas.

A B

C D

E F

24

Figura 12 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa ATCC 43859. A -

MØ controle, não infectados, apresentando típicos ondulações de membrana (setas). B – MØ

controle tratados com βCD. Ausência de ondulações tipicas é observado. C - MØ infectados com a

cepa ATCC 43859, apresentam poros na membrana(setas). D – MØ tratados com βCD e

infectados com a cepa ATCC 43859, nota-se a presença de bactéria aderida ao MØ. E - MØ

infectados não tratados com βCD, utilizando-se do insertos. Apresenta a formação significativa de

poros na membrana (seta). F – MØ infectados tratados com βCD, utilizando insertos,

apresentando poro na membrana (seta).

A B

C D

E F

25

5. DISCUSSÃO

Microrganismos que constituem parte da microbiota normal têm papel

importante na manutenção da saúde do organismo hospedeiro através da

produção de vitaminas essenciais, como a vitamina K, cofatores e ácidos graxos.

As bactérias anaeróbias são componentes das microbiota de humanos, animais e

outros, predominando no trato gastrintestinal, principalmente no cólon, além de

também colonizarem regiões como pele, cavidade oral, trato respiratório superior

e trato urogenital (FINEGOLD & GEORGE, 1989; SHAH et al., 2009).

Já se sabe que a espécie B. fragilis é causadora de algumas infecções

como formação de abcessos, sepse, infecções abdominais, entre outros (TALLY

& HO, 1987). Neste âmbito, vários mecanismos bacterianos vêm sendo

apontados como atuantes, inclusive aqueles relacionados com a resistência à

fagocitose. Além disso, alguns fatores de virulência têm sido propostos a fim de

explicar o comportamento patogênico da espécie. Foi observado que a

composição química da cápsula polissacarídica de B. fragilis é diferente de outros

polissacarídeos bacterianos (KASPER, 1976), além de ter sido mostrado que a

imunização de ratos com essa cápsula purificada conferia proteção aos animais

frente a novas infecções (KASPER et al., 1979; SHAPIRO et al., 1982; 1986).

Estudos em animais mostraram que somente cepas encapsuladas eram

virulentas (ONDERDONK et al., 1974; 1976; 1977a). Estudo mais recente

demonstrou que a cápsula de B. fragilis sozinha é capaz de induzir a formação de

abscessos em murinos (SEARS, C.L. 2012). Os autores deste estudo sugeriram

que o B. fragilis possui o sistema de polissacarídeo mais complexo conhecido até

o momento.

Algumas cepas de B. fragilis podem secretar TBF que, rapidamente, induz

uma resposta inflamatória no cólon, tanto em humanos quanto em modelos

experimentais (SEARS, C.L. et. al 2008). Também já foi demonstrado que o

receptor de TBF é sensível à depleção do colesterol de membrana, o que indicou

que receptores da TBF estão ligados a jangadas lipídicas, ricas em colesterol

(WU et al., 2006).

A capacidade dos microrganismos de aderir a tecidos do hospedeiro é

considerada um fator determinante para colonização e infecção (BEACHEY,

1981). Adicionalmente, foi visto que a produção de enzimas hidrolíticas capazes

26

de degradar diferentes componentes dos tecidos, também vêm sendo descritas

como potenciais fatores de virulência de espécies do gênero Bacteroides (BOTTA

et al., 1994). Para B. fragilis, diversas estruturas de superfície também já foram

descritas como possíveis adesinas (HOFSTAD, 1992; PATRICK, 1993).

MØ são células fagocíticas do sistema imune de mamíferos, caracterizadas

como células apresentadoras de antígenos (VAN FURTH et al.,1972;

MACMICKING, XIE & NATHAN, 1997). Tais células, quando ativadas, secretam

uma variedade de citocinas. A superfície dos MØ é repleta de receptores que

reconhecem moléculas expressas por patógenos e auxiliam no processo de

fagocitose (ESWARAPPA et al., 2008). Quando não infectados, esses fagócitos

apresentam em sua superfície estruturas (projeções) denominadas ondulações de

membrana, as quais estavam aparentes nos MØ controle de todos os

experimentos realizados (Pranchas 1-5 A). Tais projeções já foram observadas

em estudos anteriores (VIEIRA et al., 2005 e 2009).

Neste estudo, cinco cepas de B. fragilis foram utilizadas a fim de analisar o

papel do colesterol nos eventos de infecção dos MØ com B. fragilis. Ensaios

utilizando βCD, um polímero que auxilia na depleção parcial do colesterol, e

insertos 0,4µm, aparato que não permite o contato das bactérias com os MØ

foram utilizados para esse fim. Os efeitos foram observados por microscópio

eletrônico de varredura.

A fim de compreender a relevância do colesterol no processo de infecção do

B. fragilis, foi avaliado o efeito da depleção do colesterol celular no evento da

infecção. A concentração adequada para o tratamento com βCD é controlada de

acordo com o tipo celular, para que o tratamento com a droga não afete a

morfologia e a viabilidade celular. Assim foram realizados ensaios nos quais as

células foram tratadas com concentrações de 5, 10, 20, 30 e 40mM de βCD, com

posterior avaliação da viabilidade utilizando Azul de Trypan. Os resultados

mostram que a concentração de 10mM é a mais adequada, por proporcionar

maior depleção do colesterol sem afetar a viabilidade do MØ (Fig. 7).

Do ponto de vista dos aspectos morfológicos, os MØ não tratados com

βCD revelaram algumas alterações, quando infectados, sugestivas de liberação

de conteúdo citoplasmático por estas células (Fig 8, D). Análises dos MØ tratados

27

com βCD demonstraram que as alterações observadas anteriormente na

morfologia (perda das ondulações) dos MØ ocorriam mesmo sem a interação

(Fig. 8 - 12, B), sugerindo a participação do colesterol nos eventos de interação.

As observações das interações de MØ tratados com βCD e infectados com as

cepas ATCC 25285, ELI 1.1, ES 31.3, 078320 e ATCC 43859, todas da espécie

B. fragilis, resultaram em ruptura da membrana dos MØ bem como na perda

aparente das ondulações na superfície dos mesmos, além de apresentar

membrana porosa e aumentar a taxa de adesão bacteriana. A MEV dos ensaios

de tratamento com βCD após eventos de interação revelaram a alteração na

superfície dos macrófagos infectados com todas as cepas B. fragilis estudadas,

inclusive com a diminuição das ondulações na membrana (Fig. 8 - 12, D, setas).

Os ensaios de tratamento com βCD mostraram que a depleção de

colesterol da membrana dos MØ aumenta o dano causado ao fagócito após a

interação com as cepas de B. fragilis. Tais achados sugerem que o colesterol

participa do mecanismo de interação. Já foi observado anteriormente que a

depleção de colesterol altera a ação da toxina TBF secretada por B. fragilis, em

razão da possível presença de receptores da toxina em jangadas lipídicas ricas

em colesterol. No caso deste estudo, o efeito parece ser contrário, uma vez que a

depleção do colesterol potencializa a ação da molécula produzida por B. fragilis,

causando aumento no número de poros na membrana e mais perda das

ondulações características da mesma.

Os achados obtidos sugerem que algum agente tóxico produzido por B.

fragilis causa danos aos MØ com efeito potencializado pela depleção de

colesterol. O aumento dos danos causados nos MØ sugerem fortemente a

existência de uma molécula macrofágica capaz de protegê-los contra a ação do

TBF, ou, a toxina produzida pelo B. fragilis não depende de receptores ligados às

jangadas lipídicas, tendo ação independente do colesterol dos MØ. Desta forma,

análises complementares, utilizando técnicas de proteômica serão necessárias

para elucidar a molécula envolvida no mecanismo de interação, bem como

alterações moleculares ocasionadas na superfície dos macrófagos pós-infecção.

28

6. CONCLUSÕES

Nossos resultados demonstraram que a infecção de macrófagos

peritoneais de camundongos com cepas de B. fragilis alteram de fato a morfologia

desses fagócitos. Demostraram também que a depleção parcial do colesterol

pode intensificar os efeitos da interação, além de indicarem que não há

necessidade de contato célula:célula para que haja alteração na morfologia do

fagócitos profissionais. Portanto, a partir dos resultados conclui-se que:

1. B. fragilis não necessita do contato direto com MØ para induzir alterações

na morfologia dos mesmos, o que sugere a produção e liberação de um

agente tóxico, pela bactéria.

2. A depleção parcial do colesterol afeta de forma direta a interação de MØ

com B. fragilis, potencializando-a.

29

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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