Análise físico-química e ecotoxicológica do efluente gerado no cultivo de Pleurotus em palha de bananeira para produção de enzimas lignocelulolíticas.

PEREIRA, Camila Milanez1 (camilamilanez@yahoo.com.br); CORREA, Marcela1 (celacorrea@gmail.com); BELLO, Roger1 (roger_rhb@hotmail.com); PRADO, Sharline1 (shar_rrr@hotmail.com); Beatriz Maria de Oliveira Torrens (beatriz@expresso.com.br); BONATTI-CHAVES, Mariane1 (mbonatti@univille.br); GERN, Regina Maria Miranda1 (rgern@univille.br). 1 Universidade da Região de Joinville – UNIVILLE, campus universitário s/n, 89.219-905, Joinville, SC, Brasil. Abstract: Pleurotus genus can be grown in different agro-industrial wastes (banana

straw, banana leaves, banana peels, orange peels, etc.). These mushrooms present a high content of proteins and vitamins and low content of fat. However, a big quantity of effluent is produced during its cultivation (water released by banana straw humidification for subsequently solid cultivation of Pleurotus spp). This study aimed to study some physical-chemical parameters and toxicity of this effluent in order to agree with the legislation for discharge of effluents into water bodies. Moreover, was evaluated the use of this effluent as medium culture for P. ostreatus and P. sajor-caju to produce lignocellulolytic enzymes. The effluent was supplemented with 150 µM CuSO4 and 40 g.L-1 banana peel powder. Physical-chemical parameters were determined according methodology proposed by CETESB (1978) and the toxicological evaluation was carried out according NBR 12713. The enzyme activities were determined by methodology proposed by (Bailey et al., 1992). The temperature of the effluent was 20.5 °C, pH 6.48 and DBO5 165.2 mg.L-1. P. ostreatus presented the highest laccase and xylanase activities (3,658.3 U.L-1 and 544.3 U.L-1). Keywords: lignocellulolytic enzymes, banana straw, Pleurotus. Introdução Fungos do gênero Pleurotus são de fácil e barato cultivo, além de crescerem em uma ampla variedade de resíduos florestais e agroindustriais. São extremamente eficientes na conversão do substrato em biomassa, pois possuem um complexo enzimático lignocelulotítico único, que os habilita a decomporem diversos resíduos agroindustriais indisponíveis para a grande maioria dos organismos (Bonatti et al., 2004; Stajic, et al., 2006; Elisashvili et al., 2008). A primeira etapa do cultivo de Pleurotus em meio sólido envolve a umidificação do substrato (resíduo lignocelulósico) por imersão em água por 12 horas e posterior drenagem da água excedente (Madan et al., 1987). Nesta etapa é gerado um efluente líquido que para ser descartado em corpos de água deve atender as legislações vigentes como, por exemplo, a resolução CONAMA 357/2005 e o Decreto Estadual Nº 14.250/1981. Uma alternativa ao descarte destes efluentes em corpos de água é a sua utilização na formulação de meios de cultivo para a produção de enzimas lignocelulolíticas por basideomicetos. A otimização do processo de produção deste sistema enzimático em termos de aumento da produtividade e diminuição dos custos do processo tornou-se alvo de estudos, devido ao grande número de aplicações atribuídas a estas enzimas. Mais recentemente, é no tratamento de resíduos lignocelulósicos com enzimas lignocelulolíticas, para posterior fermentação visando a produção de bioetanol, que

estas enzimas encontram uma de suas aplicações mais promissoras, em face da constante busca por alternativas energéticas. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram: (a) avaliar parâmetros físico-químicos (temperatura, pH, DBO, sólidos totais e sedimentáveis) e ecotoxicológicos (toxicidade aguda com Daphnia similis) do efluente gerado a partir da umidificação de palha de folha de bananeira, etapa inicial do processo produtivo deste cogumelo e (b) avaliar a produção das enzimas lignocelulolíticas lacase e xilanase por fungos do gênero Pleurotus em cultivo submerso, utilizando o efluente gerado no processo produtivo suplementado com 150 µM de CuSO4 e 40 g.L-1 de pó de cascas de banana. Material e Métodos - Efluente: palha de folhas de bananeira, fornecida pela empresa Typicus localizada em Garuva - Santa Catarina, triturada e acondicionada em sacos de ráfia que foram imersos em água por 12 horas. Em seguida, os sacos de ráfia contendo o substrato úmido foram retirados do recipiente com a água de imersão (efluente) e o excesso de água (também efluente) foi drenado (Madan et al., 1987). - Parâmetros físico-químicos: temperatura, pH, demanda biológica de oxigênio (DBO5), sólidos totais e sedimentáveis foram determinados segundo metodologia proposta pela CETESB, 1978. - Análise ecotoxicológica: avaliou-se a toxicidade aguda com Daphinia similis de acordo com metodologia proposta pela NBR 12713, 2009. Para determinação da CL50 utilizou-se o programa estatístico TRIMMED SPEARMAN-KARBER (TSK). - Microrganismos e manutenção: as linhagens P. Ostreatus DSM 1833 e P. sajor-caju CCB 019, foram mantidas em meio sólido TDA (Trigo Dextrose Ágar) (Furlan et al., 1997), sob refrigeração (4ºC) e os repiques foram feitos a cada três meses. - Meio e condições de cultivo submerso para produção de enzimas: frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL do efluente suplementado com 150 µM de CuSO4 e 4 g de pó de cascas de banana, também fornecidas pela empresa Typicus, foram esterilizados. Após resfriados, foram inoculados com três discos de agar de aproximadamente 15 mm de diâmetro contendo o micélio fúngico. Os frascos foram incubados a 30ºC, sob agitação recíproca de 120 min-1, por 15 dias. - Análise enzimática: A atividade de xilanase foi avaliada através da mistura de 70 μL do extrato, devidamente diluído, com 630 μL de xilana de aveia (1% m/v) (pH 5,0) a 40ºC por 10 minutos (Bailey et al., 1992). O método utilizado para a quantificação de açúcares redutores totais foi o proposto por Miller (1959). A atividade de lacase foi avaliada através da variação no valor de absorbância (436 nm), produzida pela oxidação do composto 2,2´-azino-bis-[3-ethyltiazoline-6-sulfonate] (ABTS) (pH 4,2). - Análise estatística: utilizou-se o teste estatístico para rejeição de valores desviantes, denominado Teste ‘Q’ de Dixon, com nível de confiança de 95%, conforme Rorabacher (1991). Resultados e Discussão O efluente gerado no processo produtivo de Pleurotus apresentou temperatura de 20,5oC, pH 6,48 e DBO5 165,2 mg.L-1. As legislações estabelecem valores de temperatura abaixo de 40ºC, sendo que a variação desta no corpo receptor não deverá exceder a 3ºC na zona de mistura. O valor de pH é limitado pelo CONAMA 357/2005 entre 5,0 e 9,0 e pelo Decreto Estadual Nº 14.250/1981 entre 6,0 e 9,0. O decreto estadual Nº. 14250/1981 estabelece limite para DBO5 de no

máximo 60 mg.L-1. O valor observado neste trabalho está acima do limite máximo permitido em legislação e antes do descarte em corpos de água deve ser tratado. Em relação à concentração de material sedimentável, a legislação determina limite máximo de 1 mg.L-1, em teste de uma hora em cone Imhoff, para o lançamento em lagos e lagoas, cuja velocidade de circulação seja praticamente nula. A Tabela 1 mostra que todos os valores de sólidos totais e sedimentáveis estão abaixo do limite máximo permitido. Em relação ao teste de toxicidade aguda observou-se concentração letal média (LC50) de 5,62% para Daphnia similis. Organismos de outros níveis tróficos também devem ser avaliados antes do descarte deste efluente. Devido a este efluente apresentar concentração de matéria orgânica acima do limite máximo permitido (60 mg.L-1) optou-se avaliar a utilização deste resíduo, suplementado com CuSO4 e pó de cascas de banana, para o cultivo submerso de Pleurotus visando a produção de enzimas lignocelulolíticas. A Figura 1 mostra os valores de atividade enzimática para lacase e xilanase, as únicas enzimas expressas nestas condições. Observou-se concentrações elevadas principalmente de lacase (3.658,3 e 1.057,3 U.L-1 para P. ostreatus e P. sajor-caju, respectivamente) quando compara-se estes valores com os obtidos por Libardi (2010) utilizando água de torneira suplementada com 150 µM de CuSO4 e 4 g.L-1 de pó de cascas de banana (372,5 U.L-1 para P. ostreatus) e meio de cultivo Kirk modificado (sem glicose) suplementado da mesma forma (1.575 U.L-1 para P. ostreatus). Conclusões O efluente apresentou parâmetros físico-químicos como temperatura (20,5oC), pH (6,48), sólidos totais (1,36 µg.l-1) e sólidos sedimentáveis (0,1 mg.l-1) dentro dos limites máximos previstos em legislação para descarte de efluentes em corpos de água. Contudo, o parâmetro DBO5 (165,2 mg.L-1) mostrou-se acima do valor máximo permitido. Desta forma, avaliou-se neste trabalho a utilização deste meio, com concentração de matéria orgânica acima do permitido, para a produção de enzimas lignocelulolíticas de uso industrial. As atividades enzimáticas encontradas para lacase foram 3.658,3 e 1.057,3 U.L-1 para P. ostreatus e P. sajor-caju, respectivamente e para xilanase 544,3 e 540,1 U.L-1 para P. ostreatus e P. sajor-caju, respectivamente. Referências Associação Brasileira de Normas Técnicas (2009) NBR 12713: Ecotoxicologia aquática – Toxicidade Aguda – Método de ensaio com Daphnia ssp (Crustacea, Cladocera). Bailey, M. J., Biely, P., Poutanen, K. (1992) Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology, 23, 57-270. Bonatti, M., Karnopp, P., Soares, H. M., Furlan, S. A. (2004) Evaluation of Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-caju nutritional characteristics when cultivated in different lignocellulosic wastes. Food Chemistry, 88(3), 425-428. CETESB (1978) NT 07: Normalização Técnica Saneamento Ambiental – Análises Físico-Químicas de Água. Elisashvili V., Penninckx M., Kachlishvili E., Tsiklauri N., Metreveli E., Kharziani T., Kvesitadze G. (2008) Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Bioresource Technology, 99, 457–462.

Furlan, S. A., Virmond, L. J., Miers, D. A., Bonatti, M., Gern, R. M. M., Jonas, R. (1997) Mushroom strains able to grow at high temperatures and low pH values. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 13, 689-692. Gunde-Cimerman, N. (1999) Medicinal value of the genus Pleurotus (Fr.) P. Karst. (Agaricales s.I., Basidiomycetes). International Journal of Medicinal Mushrooms, 1, 69-80. Libardi, N. Estudo de lacases fúngicas para degradação de compostos interferentes endócrinos. 2010. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Processos) – Universidade da Região de Joinville / UNIVILLE, Joinville. Madan, M., Vasudevan, P., Sharma, S. (1987) Cultivation of Pleurotus sajor caju on Different Agro-wastes. Biological Wastes, 22, 241 – 250. Miller, G. L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Analutical Chemistry, 31, 426-428. Rorabacher, D. B. (1991) Statistical treatment for rejection of deviant values: critical values of dixon’s “Q” parameter and related subrange ratios at the 95% confidence level. Analytical Chemistry, 63(2), 139-143. Stajic M. L., Persky D., Friesem Y., Hadar S. P., Wasser S. P., Nevo E., Vukojevic J. (2006) Effect of different carbon and nitrogen sources on laccase and peroxidases production by selected Pleurotus species. Enzyme Microbiology and Technology, 38, 65–73.

Tabela 1 – Valores de sólidos totais e sedimentáveis (mg.L-1) para o efluente gerado no cultivo de Pleurotus.

Análise Concentração Análise Concentração

Sólidos totais 0,00136 Sólidos dissolvidos voláteis 0,000652

Sólidos fixos 0,000718 Sólidos suspensos totais 0,000257

Sólidos voláteis 0,000642 Sólidos suspensos fixos 0,000267

Sólidos dissolvidos 0,001103 Sólidos suspensos voláteis 0,00001

Sólidos dissolvidos fixos 0,000451 Sólidos sedimentáveis 0,1

Figura 1 – Atividade enzimática de lacase e xilanase produzidas por P. ostreatus e P. sajor-caju em cultivo submerso utilizando o efluente gerado no cultivo, suplementado com 150 µM de CuSO4 e 40 g.L-1 de pó de cascas de banana.