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UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA FACULDADE DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM FISIOTERAPIA
ANAacuteLISE DA INFLUEcircNCIA DA ADMINISTRACcedilAtildeO DA MELATONINA NO SISTEMA CARDIOVASCULAR E
MUSCULAR DE RATOS DESNERVADOS
EDUARDO DE LATORRE FUSATTO
2012
DISSERTACcedilAtildeO DE MESTRADO
2
EDUARDO DE LATORRE FUSATTO
ANAacuteLISE DA INFLUEcircNCIA DA
ADMINISTRACcedilAtildeO DA MELATONINA NO
SISTEMA CARDIOVASCULAR E MUSCULAR
DE RATOS DESNERVADOS
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade Metodista de Piracicaba para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Fisioterapia Aacuterea de concentraccedilatildeo Intervenccedilatildeo fisioterapecircutica Linha de pesquisa Plasticidade Neuromuscular e Desenvolvimento Neuromotor Avaliaccedilatildeo e Intervenccedilatildeo Fisioterapecircutica Orientador Prof Dr Carlos Alberto da Silva
PIRACICABA 2012
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F993a Fusatto Eduardo de Latorre
Anaacutelise da influecircncia da administraccedilatildeo da melatonina no sistema
cardiovascular e muscular de ratos desnervados Eduardo de Latorre
Fusatto ndash Piracicaba SP [sn] 2012
60 f il
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Fisioterapia) ndash Faculdade de Ciecircncia da Sauacutede
Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia - Universidade Metodista de
Piracicaba
Orientador Carlos Alberto da Silva
Inclui Bibliografia
1 Desnervaccedilatildeo 2 Melanina 3 Ratos 4 Interleucina 6 I Silva Carlos
Alberto da II Universidade Metodista de Piracicaba III Tiacutetulo
CDU 6158
Ficha Catalograacutefica elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da Unimep
Bibliotecaacuteria Luciene Cristina Correa Ferreira CRB-88235
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5
Dedico esse trabalho aos meus pais
Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo
Ricardo e a minha esposa Helena
pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio
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AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos
adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida
Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e
ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por
seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento
intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato
Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores
Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas
contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente
significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo
Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade
Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao
crescimento pessoal e profissional
A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste
trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento
7
ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma
em suas proacuteprias energias intelectuais
na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa
Satildeo elas que servem para tornar concretas
nossas aspiraccedilotildeesrdquo
(J W Goethe)
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ABSTRACT
Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy
Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6
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RESUMO
A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia
Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6
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SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
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mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
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onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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2
EDUARDO DE LATORRE FUSATTO
ANAacuteLISE DA INFLUEcircNCIA DA
ADMINISTRACcedilAtildeO DA MELATONINA NO
SISTEMA CARDIOVASCULAR E MUSCULAR
DE RATOS DESNERVADOS
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade Metodista de Piracicaba para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Fisioterapia Aacuterea de concentraccedilatildeo Intervenccedilatildeo fisioterapecircutica Linha de pesquisa Plasticidade Neuromuscular e Desenvolvimento Neuromotor Avaliaccedilatildeo e Intervenccedilatildeo Fisioterapecircutica Orientador Prof Dr Carlos Alberto da Silva
PIRACICABA 2012
3
F993a Fusatto Eduardo de Latorre
Anaacutelise da influecircncia da administraccedilatildeo da melatonina no sistema
cardiovascular e muscular de ratos desnervados Eduardo de Latorre
Fusatto ndash Piracicaba SP [sn] 2012
60 f il
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Fisioterapia) ndash Faculdade de Ciecircncia da Sauacutede
Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia - Universidade Metodista de
Piracicaba
Orientador Carlos Alberto da Silva
Inclui Bibliografia
1 Desnervaccedilatildeo 2 Melanina 3 Ratos 4 Interleucina 6 I Silva Carlos
Alberto da II Universidade Metodista de Piracicaba III Tiacutetulo
CDU 6158
Ficha Catalograacutefica elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da Unimep
Bibliotecaacuteria Luciene Cristina Correa Ferreira CRB-88235
4
5
Dedico esse trabalho aos meus pais
Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo
Ricardo e a minha esposa Helena
pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio
6
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos
adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida
Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e
ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por
seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento
intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato
Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores
Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas
contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente
significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo
Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade
Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao
crescimento pessoal e profissional
A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste
trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento
7
ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma
em suas proacuteprias energias intelectuais
na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa
Satildeo elas que servem para tornar concretas
nossas aspiraccedilotildeesrdquo
(J W Goethe)
8
ABSTRACT
Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy
Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6
9
RESUMO
A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia
Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6
10
SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Piracicaba
Orientador Carlos Alberto da Silva
Inclui Bibliografia
1 Desnervaccedilatildeo 2 Melanina 3 Ratos 4 Interleucina 6 I Silva Carlos
Alberto da II Universidade Metodista de Piracicaba III Tiacutetulo
CDU 6158
Ficha Catalograacutefica elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da Unimep
Bibliotecaacuteria Luciene Cristina Correa Ferreira CRB-88235
4
5
Dedico esse trabalho aos meus pais
Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo
Ricardo e a minha esposa Helena
pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio
6
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos
adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida
Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e
ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por
seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento
intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato
Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores
Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas
contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente
significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo
Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade
Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao
crescimento pessoal e profissional
A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste
trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento
7
ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma
em suas proacuteprias energias intelectuais
na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa
Satildeo elas que servem para tornar concretas
nossas aspiraccedilotildeesrdquo
(J W Goethe)
8
ABSTRACT
Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy
Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6
9
RESUMO
A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia
Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6
10
SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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4
5
Dedico esse trabalho aos meus pais
Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo
Ricardo e a minha esposa Helena
pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio
6
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos
adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida
Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e
ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por
seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento
intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato
Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores
Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas
contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente
significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo
Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade
Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao
crescimento pessoal e profissional
A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste
trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento
7
ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma
em suas proacuteprias energias intelectuais
na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa
Satildeo elas que servem para tornar concretas
nossas aspiraccedilotildeesrdquo
(J W Goethe)
8
ABSTRACT
Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy
Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6
9
RESUMO
A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia
Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6
10
SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Dedico esse trabalho aos meus pais
Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo
Ricardo e a minha esposa Helena
pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio
6
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos
adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida
Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e
ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por
seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento
intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato
Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores
Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas
contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente
significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo
Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade
Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao
crescimento pessoal e profissional
A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste
trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento
7
ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma
em suas proacuteprias energias intelectuais
na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa
Satildeo elas que servem para tornar concretas
nossas aspiraccedilotildeesrdquo
(J W Goethe)
8
ABSTRACT
Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy
Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6
9
RESUMO
A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia
Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6
10
SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos
adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida
Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e
ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por
seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento
intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato
Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores
Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas
contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente
significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo
Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade
Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao
crescimento pessoal e profissional
A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste
trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento
7
ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma
em suas proacuteprias energias intelectuais
na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa
Satildeo elas que servem para tornar concretas
nossas aspiraccedilotildeesrdquo
(J W Goethe)
8
ABSTRACT
Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy
Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6
9
RESUMO
A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia
Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6
10
SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma
em suas proacuteprias energias intelectuais
na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa
Satildeo elas que servem para tornar concretas
nossas aspiraccedilotildeesrdquo
(J W Goethe)
8
ABSTRACT
Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy
Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6
9
RESUMO
A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia
Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6
10
SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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8
ABSTRACT
Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy
Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6
9
RESUMO
A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia
Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6
10
SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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RESUMO
A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia
Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6
10
SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
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SUMAacuteRIO
1INTRODUCcedilAtildeO 12
11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15
12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17
2 HIPOacuteTESE 19
3 OBJETIVO 19
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19
4MATERIAL E MEacuteTODOS 20
41 DESNERVACcedilAtildeO 20
42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22
46 PROTEIacuteNA TOTAL 22
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22
48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23
49 INTERLEUCINA 6 23
410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24
412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO
11
CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25
5RESULTADOS 26
6 DISCUSSAtildeO 38
7 CONCLUSAtildeO 47
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48
12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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12
1 INTRODUCcedilAtildeO
As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva
inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)
As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento
sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia
na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os
movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo
neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores
quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN
e STANTON 2009)
De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico
observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e
escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente
polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA
e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a
ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada
de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo
mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda
eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)
O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras
musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de
metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de
tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas
longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo
mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa
velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato
(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem
grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada
capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)
Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas
ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias
escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute
13
mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade
glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com
atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas
e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves
vermelhas (SLUTZKY 1997)
Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem
denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra
de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas
poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas
superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)
Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza
preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a
captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que
a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)
de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a
qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio
energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al
1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de
captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica
tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET
1990)
Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente
70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de
glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura
esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade
de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico
das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia
muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento
marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)
KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada
pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo
ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie
14
onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina
(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)
Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos
proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor
de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das
proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem
Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS
cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia
a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-
quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da
produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2
(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa
IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute
hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)
A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase
(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc
que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na
transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute
codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena
que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras
(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a
participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da
cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina
aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da
mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a
translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal
S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da
fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via
anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo
de proteiacutenas (CROSS et al 1995)
15
11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO
O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para
os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras
musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior
e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN
1982)
Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido
utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso
DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da
melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)
utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07
mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular
RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo
encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)
podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente
levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma
incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores
(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o
catabolismo causado na musculatura pelo desuso
SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese
e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de
continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a
inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro
estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a
lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a
pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo
para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel
As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no
qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e
perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo
desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a
perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa
proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na
16
capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a
atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)
Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de
genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que
possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas
(GOLDSPINK 2002)
Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no
tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como
resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de
fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do
nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido
ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese
energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia
(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et
al 2004)
No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de
ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado
reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7
dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram
diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo
da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao
controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais
desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante
de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi
significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias
Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram
encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo
em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e
desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade
de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e
desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN
2007)
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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YOUSSEFT HIBAOUI Y REUTENAUER-PATTE J PATTHEY-VUADENS O
RUEGG UT DORCHIES OM Melatonin improves muscle function of the
dystrophic mdx5Cv mouse a model for Duchenne muscular dystrophy J Pineal
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YUSUF F BRAND-SABERI B Myogenesis and muscle regeneration Histochem
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60
WANG WZ FANG XH STEPHENSON LL Melatonin attenues IP ndash induced
mitocondrial dysfunction in skeletal muscle J Surg Res 2010
WILLIAMS PE GOLDSPINK G Connective tissue changes in immobilized
muscle J Anat 1984 138343-50
17
A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os
grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias
alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a
natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve
diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo
houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)
Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre
a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o
estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente
no processo de recuperaccedilatildeo muscular
12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA
A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa
cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema
cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a
principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL
estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do
sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO
e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo
exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)
Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo
o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em
espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite
tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute
pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a
MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente
(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)
A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina
denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona
redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2
estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central
(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de
aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-
18
hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente
conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo
este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)
Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina
tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em
clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute
receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina
exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)
A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto
lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das
biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor
especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou
nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)
Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais
caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente
no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo
da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL
inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al
2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-
dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)
Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a
atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia
gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e
da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003
JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a
musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no
tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo
esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na
regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al
2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)
Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas
antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa
essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e
19
promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)
2 HIPOacuteTESE
A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na
musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da
proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle
3 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos
submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina
analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica
paracircmetros indicadores do status nutricional
31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO
Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de
melatonina
Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de
melatonina
Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com
melatonina
Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose
(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade
das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina
Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de
ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito
do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de
proteiacutenas totais
Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal
desnervado e tratado com Melatonina
20
Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina
desnervados e desnervado tratado com melatonina
Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees
experimentais
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var
albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g
da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e
alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura
constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das
6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e
distribuiacutedos segundo a tabela
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6
Controle
Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg
Desnervado - 7 dias
Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg
Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos
algumas perdas amostrais reduzindo o n=4
41 DESNERVACcedilAtildeO
Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a
pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e
retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)
21
Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases
desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm
42 TRATAMENTO COM MELATONINA
A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas
em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10
mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da
manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia
(MALHOTRA et al 2004)
43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)
Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2
UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15
min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al
2007)
44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)
Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos
da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma
22
aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em
glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)
seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120
min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)
45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR
Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram
retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir
da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado
foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU
et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido
46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)
Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal
da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma
aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de
aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o
extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi
homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho
depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em
espectrofotocircmetro a 540 nm
47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA
Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do
periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado
melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure
Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e
diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo
Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de
experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de
grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um
23
compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram
por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute
conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao
aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica
meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada
compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que
os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas
anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por
semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006
48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA
Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos
foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo
supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram
conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs
derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL
e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi
medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de
retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi
corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e
posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo
QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises
foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da
dispersatildeo (COSTA 2008)
A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento
49 INTERLEUCINA 6
A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo
ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas
detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por
Ostrowski et al (1999)
24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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24
410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO
Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo
em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de
porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila
analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante
411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres
(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu
na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com
uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia
disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o
dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente
proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm
412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES
Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo
tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-
se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com
hematoxilina-Eosina (HE)
Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com
aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software
Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio
(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas
com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado
uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de
retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada
e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo
analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas
150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA
2010)
25
413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO
INTRAMUSCULAR
A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da
planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE
LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a
visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam
sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada
Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)
165
414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-
Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005
26
5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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5 RESULTADOS
Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a
concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a
sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo
haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de
cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg
sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina
(ITT)
Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a
curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com
melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se
comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de
10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi
realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a
porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado
que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina
5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao
controle (figura 2)
Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao
tratado com melatonina 10 mgKg
27
Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg
exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica
considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o
conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos
para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos
de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I
(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)
Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo
do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle
enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao
controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de
anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina
apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado
com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o
grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)
28
Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina
A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo
branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o
controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado
tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao
controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi
verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )
Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina
29
Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento
promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi
realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica
e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela
2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos
graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina
Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos
livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores
correspondem a meacutedia plusmn epm n=5
Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da
musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo
escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo
dos limites anatocircmicos
Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou
peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado
apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado
melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores
17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado
respectivamente como pode ser observado na figura 5
Hemoglobina
( gdL)
Hematoacutecrito
()
Leucometria
(x106)
AGL
(mmolL)
Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003
Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005
30
Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado
A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o
conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo
tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386
maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena
total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No
que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores
27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado
ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6
31
Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado
melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o
tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados
mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo
diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como
mostra a figura 7
$
32
Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem
A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo
da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o
tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a
concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi
observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi
observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees
foram similares ao controle como mostra a figura 8
33
Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado
Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do
efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco
iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi
observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser
verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma
com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo
PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide
figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica
tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica
Interleucina 6
34
0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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0
50
100
150
200
250
300
Controle Tratado
ba
tm
in
Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle
0
20
40
60
80
100
120
140
160
PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T
ms
Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a
pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou
reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na
pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11
Frequecircncia Cardiacuteaca
ECG
35
0
20
40
60
80
100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
eri
al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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100
120
140
160
SC ST DC DT MC MT
Pre
ssatildeo
Art
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al (m
mH
g)
Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle
Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a
anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo
tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao
grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado
aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento
com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido
Pressatildeo Arterial
36
Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle
Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea
489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado
melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi
observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e
478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do
desnervado
37
Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
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Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em
relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina
38
6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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6 Discussatildeo
O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho
metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina
Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando
selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees
metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos
Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de
toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na
concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a
responsividade dos tecidos perifeacutericos
Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se
fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de
carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da
sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas
(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a
busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico
A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na
demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por
atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se
eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al
2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de
10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta
pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro
lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade
proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA
et al 1999)
Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a
avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de
anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg
hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a
curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente
significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial
sensibilizador em tecido perifeacutericos
39
Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
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Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se
caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente
comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto
tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica
ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et
al 2010)
Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se
considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave
sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg
o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e
comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na
dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo
sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos
tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais
utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da
testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a
melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular
Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico
isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da
translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)
Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede
dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua
vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional
Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos
homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em
condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo
estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio
analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das
concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres
No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo
de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando
que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a
40
homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre
(AGL)
Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees
plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja
participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de
hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os
quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo
Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises
quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato
preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da
hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de
fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil
promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a
superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)
Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas
assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de
modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante
disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na
membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o
tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)
Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com
melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se
manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais
entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo
comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido
demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no
gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio
possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de
receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)
Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo
significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e
natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)
41
Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
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Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do
controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove
alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4
(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)
Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi
verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra
partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi
desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um
significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o
muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo
soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e
um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do
desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado
Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre
o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com
o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)
O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a
microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade
contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende
em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de
muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo
quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que
fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece
estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo
idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo
de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e
ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)
Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia
muscular (URUSHIYAMA et al 2004)
Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do
hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese
proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)
42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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42
Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30
dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a
expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela
glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia
muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I
Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo
metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)
sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-
se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a
atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-
se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)
Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de
proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo
reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas
musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a
qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do
sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito
sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na
ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)
PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida
localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em
grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo
da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode
operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta
metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo
desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status
metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo
da IL-6
Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas
diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob
ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a
disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste
sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na
43
produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
48
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produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o
efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo
devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade
No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em
pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade
da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios
citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de
aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que
a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)
Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a
atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados
a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um
meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma
vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se
propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas
prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do
hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus
amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)
Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo
fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e
temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula
principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores
secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)
A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo
arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o
eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho
em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na
frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso
central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus
simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta
resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com
melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS
2010)
44
Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
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Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees
na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou
QTc (HANCOCK 2009)
Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a
melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e
complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com
reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina
exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser
respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina
protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol
Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo
no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al
1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda
que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante
enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST
(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)
Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um
hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e
sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no
sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco
(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)
Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da
fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina
acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como
da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (
AHTIKOSKI et al 2003)
A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de
modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro
de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et
al 2003 GOMES et al 2004)
Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular
devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e
funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e
45
as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
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as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do
tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo
de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo
(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda
independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia
ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio
aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e
GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)
Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos
conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas
fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas
dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem
disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas
colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas
irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON
1987)
Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de
colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora
na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes
α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)
Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de
colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)
Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi
demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma
concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo
leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos
radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando
a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et
al 2012)
Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a
participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo
46
apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
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apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados
o qual foi objeto deste trabalho
Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como
consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que
ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica
Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso
trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para
que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia
Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se
comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa
de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo
(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para
uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos
metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo
maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza
dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica
47
7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
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7 CONCLUSOtildeES
A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com
intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees
hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora
das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa
redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos
A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais
segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de
conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou
indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos
hemoglobina e leucometria
A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees
quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a
produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina
diminuiu o processo inflamatoacuterio local
Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do
tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo
das aacutereas das fibras musculares
Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico
da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia
desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo
de tecido conjuntivo
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