anÁlise da influÊncia da administraÇÃo da … · (gb), por meio do método fenol sulfúrico. a...

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1 UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA MELATONINA NO SISTEMA CARDIOVASCULAR E MUSCULAR DE RATOS DESNERVADOS EDUARDO DE LATORRE FUSATTO 2012 DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

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Page 1: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

1

UNIVERSIDADE METODISTA DE PIRACICABA FACULDADE DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM FISIOTERAPIA

ANAacuteLISE DA INFLUEcircNCIA DA ADMINISTRACcedilAtildeO DA MELATONINA NO SISTEMA CARDIOVASCULAR E

MUSCULAR DE RATOS DESNERVADOS

EDUARDO DE LATORRE FUSATTO

2012

DISSERTACcedilAtildeO DE MESTRADO

2

EDUARDO DE LATORRE FUSATTO

ANAacuteLISE DA INFLUEcircNCIA DA

ADMINISTRACcedilAtildeO DA MELATONINA NO

SISTEMA CARDIOVASCULAR E MUSCULAR

DE RATOS DESNERVADOS

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade Metodista de Piracicaba para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Fisioterapia Aacuterea de concentraccedilatildeo Intervenccedilatildeo fisioterapecircutica Linha de pesquisa Plasticidade Neuromuscular e Desenvolvimento Neuromotor Avaliaccedilatildeo e Intervenccedilatildeo Fisioterapecircutica Orientador Prof Dr Carlos Alberto da Silva

PIRACICABA 2012

3

F993a Fusatto Eduardo de Latorre

Anaacutelise da influecircncia da administraccedilatildeo da melatonina no sistema

cardiovascular e muscular de ratos desnervados Eduardo de Latorre

Fusatto ndash Piracicaba SP [sn] 2012

60 f il

Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Fisioterapia) ndash Faculdade de Ciecircncia da Sauacutede

Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia - Universidade Metodista de

Piracicaba

Orientador Carlos Alberto da Silva

Inclui Bibliografia

1 Desnervaccedilatildeo 2 Melanina 3 Ratos 4 Interleucina 6 I Silva Carlos

Alberto da II Universidade Metodista de Piracicaba III Tiacutetulo

CDU 6158

Ficha Catalograacutefica elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da Unimep

Bibliotecaacuteria Luciene Cristina Correa Ferreira CRB-88235

4

5

Dedico esse trabalho aos meus pais

Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo

Ricardo e a minha esposa Helena

pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio

6

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos

adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida

Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e

ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por

seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento

intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato

Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores

Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas

contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente

significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo

Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade

Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao

crescimento pessoal e profissional

A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste

trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento

7

ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma

em suas proacuteprias energias intelectuais

na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa

Satildeo elas que servem para tornar concretas

nossas aspiraccedilotildeesrdquo

(J W Goethe)

8

ABSTRACT

Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy

Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6

9

RESUMO

A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia

Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6

10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 2: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

2

EDUARDO DE LATORRE FUSATTO

ANAacuteLISE DA INFLUEcircNCIA DA

ADMINISTRACcedilAtildeO DA MELATONINA NO

SISTEMA CARDIOVASCULAR E MUSCULAR

DE RATOS DESNERVADOS

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade Metodista de Piracicaba para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Fisioterapia Aacuterea de concentraccedilatildeo Intervenccedilatildeo fisioterapecircutica Linha de pesquisa Plasticidade Neuromuscular e Desenvolvimento Neuromotor Avaliaccedilatildeo e Intervenccedilatildeo Fisioterapecircutica Orientador Prof Dr Carlos Alberto da Silva

PIRACICABA 2012

3

F993a Fusatto Eduardo de Latorre

Anaacutelise da influecircncia da administraccedilatildeo da melatonina no sistema

cardiovascular e muscular de ratos desnervados Eduardo de Latorre

Fusatto ndash Piracicaba SP [sn] 2012

60 f il

Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Fisioterapia) ndash Faculdade de Ciecircncia da Sauacutede

Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia - Universidade Metodista de

Piracicaba

Orientador Carlos Alberto da Silva

Inclui Bibliografia

1 Desnervaccedilatildeo 2 Melanina 3 Ratos 4 Interleucina 6 I Silva Carlos

Alberto da II Universidade Metodista de Piracicaba III Tiacutetulo

CDU 6158

Ficha Catalograacutefica elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da Unimep

Bibliotecaacuteria Luciene Cristina Correa Ferreira CRB-88235

4

5

Dedico esse trabalho aos meus pais

Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo

Ricardo e a minha esposa Helena

pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio

6

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos

adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida

Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e

ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por

seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento

intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato

Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores

Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas

contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente

significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo

Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade

Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao

crescimento pessoal e profissional

A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste

trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento

7

ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma

em suas proacuteprias energias intelectuais

na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa

Satildeo elas que servem para tornar concretas

nossas aspiraccedilotildeesrdquo

(J W Goethe)

8

ABSTRACT

Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy

Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6

9

RESUMO

A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia

Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6

10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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WILLIAMS PE GOLDSPINK G Connective tissue changes in immobilized

muscle J Anat 1984 138343-50

Page 3: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

3

F993a Fusatto Eduardo de Latorre

Anaacutelise da influecircncia da administraccedilatildeo da melatonina no sistema

cardiovascular e muscular de ratos desnervados Eduardo de Latorre

Fusatto ndash Piracicaba SP [sn] 2012

60 f il

Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Fisioterapia) ndash Faculdade de Ciecircncia da Sauacutede

Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia - Universidade Metodista de

Piracicaba

Orientador Carlos Alberto da Silva

Inclui Bibliografia

1 Desnervaccedilatildeo 2 Melanina 3 Ratos 4 Interleucina 6 I Silva Carlos

Alberto da II Universidade Metodista de Piracicaba III Tiacutetulo

CDU 6158

Ficha Catalograacutefica elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da Unimep

Bibliotecaacuteria Luciene Cristina Correa Ferreira CRB-88235

4

5

Dedico esse trabalho aos meus pais

Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo

Ricardo e a minha esposa Helena

pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio

6

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos

adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida

Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e

ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por

seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento

intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato

Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores

Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas

contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente

significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo

Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade

Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao

crescimento pessoal e profissional

A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste

trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento

7

ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma

em suas proacuteprias energias intelectuais

na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa

Satildeo elas que servem para tornar concretas

nossas aspiraccedilotildeesrdquo

(J W Goethe)

8

ABSTRACT

Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy

Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6

9

RESUMO

A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia

Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6

10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 4: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

4

5

Dedico esse trabalho aos meus pais

Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo

Ricardo e a minha esposa Helena

pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio

6

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos

adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida

Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e

ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por

seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento

intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato

Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores

Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas

contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente

significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo

Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade

Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao

crescimento pessoal e profissional

A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste

trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento

7

ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma

em suas proacuteprias energias intelectuais

na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa

Satildeo elas que servem para tornar concretas

nossas aspiraccedilotildeesrdquo

(J W Goethe)

8

ABSTRACT

Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy

Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6

9

RESUMO

A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia

Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6

10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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5

Dedico esse trabalho aos meus pais

Joseacute Eduardo e Sueli ao meu irmatildeo

Ricardo e a minha esposa Helena

pela dedicaccedilatildeo paciecircncia e apoio

6

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos

adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida

Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e

ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por

seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento

intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato

Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores

Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas

contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente

significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo

Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade

Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao

crescimento pessoal e profissional

A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste

trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento

7

ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma

em suas proacuteprias energias intelectuais

na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa

Satildeo elas que servem para tornar concretas

nossas aspiraccedilotildeesrdquo

(J W Goethe)

8

ABSTRACT

Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy

Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6

9

RESUMO

A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia

Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6

10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 6: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

6

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo a Deus pela oportunidade dessa conquista pelos conhecimentos

adquiridos e pelas pessoas que conheci durante essa etapa da minha vida

Agradeccedilo ao Prof Dr Carlos Alberto da Silva pela participaccedilatildeo direta e

ativa nesse caminho percorrido por ser muitas vezes mais que um orientador por

seus conselhos palavras conhecimentos e experiecircncia permitindo o crescimento

intelectual cientiacutefico e profissional Serei eternamente grato

Ao prof Dr Gabriel Borges Delfino e a profordf Dra Maria Luiza Ozores

Polacow por terem me dado a honra de tecirc-los em minha banca pelas

contribuiccedilotildees conselhos e correccedilotildees que contribuiacuteram de forma extremamente

significativa para a formaccedilatildeo do texto final dessa dissertaccedilatildeo

Ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Fisioterapia da Universidade

Metodista de Piracicaba onde tive a oportunidade de dar um importante rumo ao

crescimento pessoal e profissional

A todas as pessoas que participaram e contribuiacuteram para realizaccedilatildeo deste

trabalho direta ou indiretamente meu agradecimento

7

ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma

em suas proacuteprias energias intelectuais

na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa

Satildeo elas que servem para tornar concretas

nossas aspiraccedilotildeesrdquo

(J W Goethe)

8

ABSTRACT

Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy

Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6

9

RESUMO

A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia

Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6

10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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7

ldquoToda pessoa deve confiar em si mesma

em suas proacuteprias energias intelectuais

na proacutepria experiecircncia na proacutepria iniciativa

Satildeo elas que servem para tornar concretas

nossas aspiraccedilotildeesrdquo

(J W Goethe)

8

ABSTRACT

Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy

Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6

9

RESUMO

A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia

Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6

10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 8: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

8

ABSTRACT

Skeletal muscle has a major role in glycemic control thereforethe metabolic homeostasis of muscle fibers can be compromised by various factors such as in the denervation Melatonin is the main substance secreted by the pineal gland the melatonin acts via two different subtypes of G-protein receptors MT1 and MT2 and also via a membrane receptor called quinone oxidoreductase 2 (MT3) The objective of this study was to investigate in the skeletal muscle of rats after denervation the histological and chemical metabolic events linked to the treatment with melatonin analyzing through biochemical methodology the indicators parameters of nutritional status Wistar rats were used and divided into four groups with n = 4 as control group (C) Melatonin Treaty (TM) denervated (D) and denervated treated with melatonin (DT) for 7 days at 7 am to maintaining circulating concentrations even during the day Glycogen (GLY) was analyzed in the soleus muscle (S) and white gastrocnemius (GB) by the phenol sulfuric method while the analysis of total protein concentration was performed in S by the colorimetric method (laboratorial lit) and Interleukin 6 (IL-6) plasmatic determined by ELISA Was also evaluated constant of glucose decay the electrocardiographic profile the hematological profile and behavior of fatty acids (health status) Histomorphometric analysis was performed on the soleus muscles subjected to histological processed to the coloring in hematoxylin-eosin (HE) Statistical analysis was performed using the normality test of Shapiro-Wilk ANOVA one way and Tukeys test p lt005 The GLI of S was higher in the TM and DM groups compared to its control muscle GB D and DM groups were lower than C and TM groups The weight of the soleus was greater in treated groups ( TM and DM) compared to untreated groups (C and D) as well as the concentration of total protein The plasmatic concentration of IL6 showed itself high in group D and regained control concentrations in DT In respect of cardiac alterations all treated groups showed reduction in all segments of the ECG heart rate and reflection in the reduction of blood pressure In the histological analysis was verified an increase in the content of connective tissue and a reduction in cross-sectional area of group D and DT Treatment with melatonin has promoted improvement in the metabolic pattern of the denervated muscles but didnt prevent atrophy

Key words Denervation Melatonin Rats Interleukin 6

9

RESUMO

A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia

Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6

10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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9

RESUMO

A musculatura esqueleacutetica exerce um papel importante no controle glicecircmico sendo assim a homeostasia metaboacutelica das fibras musculares pode ser comprometida por diferentes fatores tal como na desnervaccedilatildeo A melatonina eacute a principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal sua accedilatildeo decorre de dois subtipos diferentes de receptores de proteiacutena-G MT1 e MT2 e ainda via um receptor de membrana chamado quinona oxidoredutase 2 (MT3) O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos histoloacutegicos e quimiometaboacutelicos ligados ao tratamento com melatonina analisando por meio de metodologia bioquiacutemica paracircmetros indicadores do status nutricional Foram utilizados ratos Wistar divididos em quatro grupos com n=4 sendo grupo controle (C) Tratado Melatonina (TM) Desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) durante 7 dias as 7 horas da manhatilde para manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia O glicogecircnio (GLI) foi analisado no muacutesculo soacuteleo (S) e gastrocnecircmio branco (GB) por meio do meacutetodo fenol sulfuacuterico A anaacutelise da concentraccedilatildeo de proteiacutena total foi realizada no S pelo meacutetodo colorimeacutetrico (kit laboratorial) e a Interleucina 6 (IL-6) plasmaacutetica determinada pelo meacutetodo ELISA Avaliou-se ainda a constante de decaimento da glicemia o perfil eletrocardiograacutefico o perfil hematoloacutegico e os niacuteveis dos aacutecidos graxos (estado de sauacutede) A anaacutelise histomorfomeacutetrica foi feita no soacuteleo submetido a processado histoloacutegico para coloraccedilatildeo em Hematoxilina-Eosina (HE) Anaacutelise estatiacutestica foi realizada atraveacutes do teste de normalidade de Shapiro-Wilk ANOVA one way e teste de Tukey plt005 O GLI do S foi maior no grupo TM e DM comparado ao seu controle no muacutesculo GB os grupos D e DM foram menores que o C e TM O peso do soacuteleo foi maior nos grupos tratados (TM e DM) em relaccedilatildeo aos grupos natildeo tratados (C e D) bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais A concentraccedilatildeo pIasmaacutetica de IL6 mostrou-se elevada no grupo D e recuperou as concentraccedilotildees controle no DT No que se refere agraves alteraccedilotildees cardiacuteacas todos os grupos tratados apresentaram reduccedilatildeo em todos os segmentos do ECG frequecircncia cardiacuteaca e reflexo na reduccedilatildeo da pressatildeo arterial Na anaacutelise histoloacutegica foi verificado aumento no conteuacutedo de tecido conjuntivo e reduccedilatildeo na aacuterea de secccedilatildeo transversa do grupo D e DT O tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico da musculatura desnervada poreacutem natildeo impediu a atrofia

Palavras Chave Desnervaccedilatildeo Melatonina Ratos Interleucina 6

10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

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10

SUMAacuteRIO

1INTRODUCcedilAtildeO 12

11CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO 15

12 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA 17

2 HIPOacuteTESE 19

3 OBJETIVO 19

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO 19

4MATERIAL E MEacuteTODOS 20

41 DESNERVACcedilAtildeO 20

42 TRATAMENTO COM MELATONINA 21

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA A INSULINA (ITT) 21

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA A GLICOSE (GTT) 21

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR 22

46 PROTEIacuteNA TOTAL 22

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUENCIA CARDIacuteACA 22

48 ANALIacuteSE ELETROMIOGRAacuteFICA 23

49 INTERLEUCINA 6 23

410 AVALIACcedilAtildeO DO IacuteNDICE DE HIDRATACcedilAtildeO 24

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES 24

412 ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES 24

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Res 2008 45373-382

YOUSSEFT HIBAOUI Y REUTENAUER-PATTE J PATTHEY-VUADENS O

RUEGG UT DORCHIES OM Melatonin improves muscle function of the

dystrophic mdx5Cv mouse a model for Duchenne muscular dystrophy J Pineal

Res 2011 51(2)163-71

YUSUF F BRAND-SABERI B Myogenesis and muscle regeneration Histochem

Cell Biol 2012 138(2)187-99

60

WANG WZ FANG XH STEPHENSON LL Melatonin attenues IP ndash induced

mitocondrial dysfunction in skeletal muscle J Surg Res 2010

WILLIAMS PE GOLDSPINK G Connective tissue changes in immobilized

muscle J Anat 1984 138343-50

Page 11: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

11

CONJUNTIVO INTRAMUSCULAR 25

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 25

5RESULTADOS 26

6 DISCUSSAtildeO 38

7 CONCLUSAtildeO 47

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 48

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 12: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

As funccedilotildees do muacutesculo esqueleacutetico dependem da atividade proprioceptiva

inervaccedilatildeo motora carga mecacircnica e mobilidade muscular (SILVERIA et al 1994)

As ceacutelulas musculares tecidos conjuntivos inervaccedilatildeo e suprimento

sanguiacuteneo constituem a armaccedilatildeo necessaacuteria para suportar a massa e eficiecircncia

na contraccedilatildeo produzindo os movimentos articulares e a locomoccedilatildeo pois os

movimentos fiacutesicos natildeo envolvem somente uma intricada coordenaccedilatildeo

neuromuscular mas tambeacutem ajustes complexos envolvendo sinalizadores

quiacutemicos aporte de substratos metabolizaacuteveis e geraccedilatildeo de energia (KOEPPEN

e STANTON 2009)

De acordo com a composiccedilatildeo anatomo-fisioloacutegica do muacutesculo esqueleacutetico

observam-se ceacutelulas longas delgadas com alternacircncia de bandas claras e

escuras multinucleadas e envolvidas por uma membrana eletricamente

polarizada chamada de sarcolema formando um conjunto contraacutetil (JUNQUEIRA

e CARNEIRO 2008) Os canais transmissor-ativados possuem receptor para a

ACh (acetilcolina) do tipo nicotiacutenico e apoacutes o acoplamento permitem a entrada

de soacutedio e caacutelcio na ceacutelula e a saiacuteda de potaacutessio para o meio extracelular (pelo

mesmo canal) Essa entrada inicial de soacutedio provoca a geraccedilatildeo de uma onda

eleacutetrica propagaacutevel (SARGENT 1993)

O muacutesculo estriado esqueleacutetico eacute composto por diferentes fibras

musculares Fibras vermelhas (tipo I) satildeo chamadas de contraccedilatildeo lenta de

metabolismo aeroacutebio apresentando grande quantidade de mitococircndrias de

tamanho maior e agregadas logo abaixo do sarcolema e em forma de colunas

longitudinais entre as miofibrilas a linha Z nessa fibra eacute mais forte e larga sendo

mais resistente agrave lesatildeo Devido a sua alta capacidade oxidativa e baixa

velocidade de contraccedilatildeo as principais vias de geraccedilatildeo de Adenosina Trifosfato

(ATP) satildeo decorrentes dos processos oxidativos mitococircndriais Tambeacutem possuem

grande capacidade de utilizar os aacutecidos graxos livres devido agrave elevada

capilaridade do tecido e alta reserva de trigliceriacutedeos (SLUTZKY 1997)

Por outro lado as fibras do tipo IIb tambeacutem denominadas fibras brancas

ou de contraccedilatildeo raacutepida apresentam metabolismo anaeroacutebio com mitococircndrias

escassas de forma eliacuteptica que se acumulam ao redor da banda I a linha Z eacute

13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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13

mais estreita apresenta capilaridade reduzida possuem uma alta capacidade

glicoliacutetica e tambeacutem elevada velocidade de contraccedilatildeo estatildeo envolvidas com

atividades de alta intensidade e curta duraccedilatildeo e o nuacutemero de vesiacuteculas sinaacutepticas

e sua complexidade das fendas juncionais satildeo maiores do que comparadas agraves

vermelhas (SLUTZKY 1997)

Ainda existe um tipo de fibra chamada de fibras do tipo IIa tambeacutem

denominada mista apresentando contraccedilatildeo raacutepida e oxidativa Eacute um tipo de fibra

de comportamento intermediaacuterio entre as fibras musculares vermelhas e brancas

poreacutem a presenccedila de mioglobina em sua estrutura lhe confere caracteriacutesticas

superficiais semelhantes agraves fibras vermelhas (LIEBER 2000)

Dentro de um perfil metaboacutelico a musculatura esqueleacutetica utiliza

preferencialmente a glicose como substrato energeacutetico Cabe ressaltar que a

captaccedilatildeo muscular de hexose eacute modulada pelo sistema endoacutecrino uma vez que

a insulina promove a translocaccedilatildeo de transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4)

de reservatoacuterios citosoacutelicos para a membrana elevando a captaccedilatildeo de glicose a

qual pode ser oxidada ou direcionada para formaccedilatildeo deste reservatoacuterio

energeacutetico (HENRIKSEN et al 1990 BELL et al 1990 RICHARSON et al

1991) Por outro lado tem sido demonstrado que os sistemas musculares de

captaccedilatildeo de glicose satildeo regulados pela insulina pela atividade metaboacutelica

tecidual ou ainda pela atividade contraacutetil (De FRONZO 1988 KLIP e PAQUET

1990)

Estudos realizados na deacutecada de 90 demonstraram que aproximadamente

70 a 85 da glicose que eacute captada em repouso fica reservada na forma de

glicogecircnio (KELEY et al 1990) O conteuacutedo de glicogecircnio na musculatura

esqueleacutetica estaacute relacionado diretamente a capacidade aeroacutebia ou agrave capacidade

de ldquoendurancerdquo do organismo de forma que as alteraccedilotildees no perfil enzimaacutetico

das mitococircndrias e das reservas glicogecircnicas satildeo os responsaacuteveis pela eficiecircncia

muscular assim como a depleccedilatildeo das reservas de glicogecircnio eacute o evento

marcador do estado de exaustatildeo muscular (TAYLOR 1972 CURI et al 2003)

KLIP e PAQUET (1990) propuseram que a captaccedilatildeo de glicose estimulada

pela elevaccedilatildeo no padratildeo contraacutetil das fibras varia dependendo do tipo de muacutesculo

ou do status metaboacutelico vigente Provavelmente existe variaccedilatildeo interespeacutecie

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 14: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

14

onde os muacutesculos de humanos diferenciam-se por ser mais sensiacutevel agrave insulina

(ANDERSEN et al 1993 SARABIA et al 1992)

Uma vez ativado o receptor de insulina fosforila vaacuterios substratos

proteicos em tirosina Atualmente jaacute foram descrito alguns substratos do receptor

de insulina poreacutem merece destacar que quatro desses pertencem agrave famiacutelia das

proteiacutenas IRS (substratos do receptor de insulina) Outros substratos incluem

Shc Gab-1 p60dokCbl JAK2 e APS A fosforilaccedilatildeo em tirosina das proteiacutenas IRS

cria siacutetios de reconhecimento para moleacuteculas contendo domiacutenios com homologia

a Src 2 (SH2) Dentre estas se destaca a fosfatidilinositol 3 quinase (PI 3-

quinase) As funccedilotildees fisioloacutegicas do IRS-12 foram estabelecidas atraveacutes da

produccedilatildeo de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2

(camundongos knockout para IRS-1 e IRS-2) O camundongo que natildeo expressa

IRS-1 apresenta resistecircncia agrave insulina e retardo de crescimento mas natildeo eacute

hiperglicecircmico (CAVALHEIRA et al 2002b SAAD et al 1994)

A insulina tambeacutem estimula a mitogen-activated protein quinase

(MAP) que eacute uma via iniciada com a fosforilaccedilatildeo das proteiacutenas IRS eou Shc

que interagem com a proteiacutena Grb2 A Grb2 (proteiacutena adaptadora envolvida na

transduccedilatildeo de sinalsinalizaccedilatildeo celular Nos humanos a proteiacutena GRB2 eacute

codificada pelo gene GRB2 ) estaacute constitutivamente associada agrave SOS proteiacutena

que troca GDP (guanosina difosfato) por GTP (guanosina trifosfato) da Ras

(proteiacutena liga a um gene ativador) ativando-a A ativaccedilatildeo da Ras requer a

participaccedilatildeo da SHP2 Uma vez ativada Ras estimula a fosforilaccedilatildeo em serina da

cascata da MAPK que leva agrave proliferaccedilatildeo e diferenciaccedilatildeo celulares A insulina

aumenta a siacutentese e bloqueia a degradaccedilatildeo de proteiacutenas atraveacutes da ativaccedilatildeo da

mTOR (enzima alvo da rapamicina ligada ao anabolismo) A mTOR controla a

translaccedilatildeo de proteiacutenas diretamente atraveacutes da fosforilaccedilatildeo da p70- ribossomal

S6 quinase (p70rsk) que ativa a siacutentese ribossomal de proteiacutenas atraveacutes da

fosforilaccedilatildeo da proteiacutena A mTOR tambeacutem fosforila a PHAS1 (enzima da via

anaboacutelica intracelular) que aumenta a siacutentese proteica via aumento da translaccedilatildeo

de proteiacutenas (CROSS et al 1995)

15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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15

11 CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE DESNERVACcedilAtildeO

O conhecimento dos fatores acima citado eacute extremamente importante para

os fisioterapeutas pois os fenocircmenos adaptativos adquiridos pelas fibras

musculares frente a diferentes condiccedilotildees tal como o desuso permitem uma maior

e melhor efetividade na interface avaliaccedilatildeo e tratamento (ROSE e ROTHSTEIN

1982)

Alguns recursos fisioterapecircuticos bem como farmacoloacutegicos tem sido

utilizados na tentativa da melhoria das condiccedilotildees causadas pelo desuso

DURIGAN (2007) utilizou estimulaccedilatildeo eleacutetrica neuromuscular na tentativa da

melhora dos padrotildees metaboacutelicos e histoloacutegicos do muacutesculo PARDI (2010)

utilizou nandrolona na musculatura imobilizada e encontrou na dose cliacutenica (07

mgKgsemana) importantes resultados na manutenccedilatildeo da homeostasia muscular

RIBEIRO (2010) utilizou o aminoaacutecido leucina em muacutesculo desnervado e natildeo

encontrou resultados satisfatoacuterios em doses altas desse aminoaacutecido (5 mM)

podendo afetar o funcionamento bioquiacutemico do organismo e possivelmente

levando na praacutetica clinica aacute algumas possiacuteveis complicaccedilotildees pelo uso de forma

incorreta deste suplemento O que natildeo aconteceu com o uso de doses menores

(030 mM) Esse trabalho assim vem como mais uma tentativa de diminuir o

catabolismo causado na musculatura pelo desuso

SEDDON (1943) descreve as lesotildees nervosas em neuropraxia axonotmese

e neurotmese Neuropraxia eacute a lesatildeo mais leve natildeo havendo perda de

continuidade do nervo e sua perda funcional eacute transitoacuteria Axonotmese eacute a

inturrupccedilatildeo completa do axocircnio e a mielina poreacutem o perineuro e o epineuro

estatildeo preservados jaacute a neurotmese eacute a desconexatildeo de um nervo ocorrendo a

lesatildeo inclusive do perineuro e do epineuro Neurotmese eacute segundo SEDDON a

pior lesatildeo nervosa possiacutevel Nosso trabalho optou assim por utilizar essa lesatildeo

para expor o muacutesculo na pior condiccedilatildeo possiacutevel

As lesotildees de nervos perifeacutericos aparecem comumente na praacutetica clinica no

qual aleacutem das alteraccedilotildees no padratildeo funcional do sistema nervoso central e

perifeacuterico os tecidos por estes inervados acabam por ser comprometidos pelo

desuso No caso de interrupccedilatildeo completa de inervaccedilatildeo motora observa-se a

perda imediata da accedilatildeo voluntaacuteria deste tecido bem como sua accedilatildeo reflexa

proliferaccedilatildeo de tecido conjuntivo intramuscular diminuiccedilatildeo ou perda na

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 16: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

16

capacidade de gerar forccedila fatores esses que de forma associada podem levar a

atrofia muscular (HENRIKSEN et al 1997 DOW et al 2006)

Tal processo envolve mudanccedilas quantitativas e qualitativas na expressatildeo de

genes especiacuteficos do muacutesculo sendo o muacutesculo esqueleacutetico um tecido que

possui a maior capacidade de adaptaccedilatildeo diante as diferentes condiccedilotildees impostas

(GOLDSPINK 2002)

Desta forma a literatura aponta as mudanccedilas significativas que ocorrem no

tecido muscular apoacutes uma secccedilatildeo completa de um nervo perifeacuterico como

resistecircncia perifeacuterica insuliacutenica devida a diminuiccedilatildeo na concentraccedilatildeo de

fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K) ligada ao receptor insuliacutenico diminuiccedilatildeo do

nuacutemero de GLUT 4 seus transportadores e na expressatildeo gecircnica do aacutecido

ribonucleacuteico mensageiro (RNAm) do GLUT 4 o que aflui na diminuiccedilatildeo da siacutentese

energeacutetica de glicose e proteacutetica do tecido afetado predispondo a atrofia

(SOWELL et al1989 CODERRE et al 1992 HENRIKSEN et al 1997 FORTI et

al 2004)

No estudo realizado por NUNES e MELLO (2005) em muacutesculo soacuteleo de

ratos desnervados durante os periacuteodos de 3 7 e 28 dias foi demonstrado

reduccedilatildeo na captaccedilatildeo de glicose pelo muacutesculo soacuteleo da pata desnervado apoacutes 7

dias em relaccedilatildeo ao grupo controle os demais grupos 3 e 28 dias natildeo foram

diferentes em relaccedilatildeo ao o grupo controle Aleacutem disso na avaliaccedilatildeo da oxidaccedilatildeo

da glicose soacute obtiveram significancia estatistica no grupo 7 dias em relaccedilatildeo ao

controle Em relaccedilatildeo agrave siacutentese de glicogecircnio houve uma diminuiccedilatildeo nos animais

desnervados em todos os grupos analisados em relaccedilatildeo ao controle A constante

de remoccedilatildeo da glicose sanguiacutenea (KiTT) apoacutes 28 dias de desnervaccedilatildeo foi

significativamente superior aos animais de controle e apoacutes 3 e 7 dias

Na anaacutelise histofisioloacutegica realizadas com animais imobilizados foram

encontradas alteraccedilotildees na distrubiccedilatildeo da densidade de aacuterea do tecido conjuntivo

em muacutesculo soacuteleo mais evidenciada no perimisio onde os grupos desnervados e

desnervadoseletroestimulado em dias alternados apresentaram maior densidade

de aacuterea de tecido conjuntivo quando comparado ao grupo controle e

desnervadoeletroestimulado diariamente (CAIERAtildeO et al 2008 DURIGAN

2007)

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 17: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

17

A anaacutelise da aacuterea das fibras do muacutesculo soacuteleo depois de 20 dias os

grupos desnervados desnervadoseletroestimulados diariamente e em dias

alternados apresentaram diminuiccedilatildeo em relaccedilatildeo ao controle o que demonstra a

natildeo efetividade da eletroestimulaccedilatildeo na prevenccedilatildeo da atrofia pois natildeo obteve

diferenccedila em relaccedilatildeo ao grupo desnervado aNo periacuteodo de 30 dias tambeacutem natildeo

houve diferenccedila estatistica entre os grupos experimentais (CAIERAtildeO et al 2008)

Em 2006 um estudo de Lima avaliou a accedilatildeo da estimulaccedilatildeo eleacutetrica sobre

a expressatildeo gecircnica da MyoD atrogina-1 e miostatina onde foi observado que o

estiacutemulo eleacutetrico promoveu eventos ligados a miogecircnese mostrando-se eficiente

no processo de recuperaccedilatildeo muscular

12 ndash CONSIDERACcedilOtildeES SOBRE MELATONINA

A melatonina (MEL) tem sido foco de grande interesse da pesquisa

cientiacutefica devido aos seus efeitos cliacutenicos principalmente no sistema

cardiovascular (SIMKO e PAULIS 2007) A MEL (N-acetil-5-metoxitriptamina) eacute a

principal substacircncia secretada pela glacircndula pineal Em humanos a accedilatildeo da MEL

estaacute associada por exemplo com o ciclo claroescuro ou seja a consolidaccedilatildeo do

sono regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e da temperatura corporal (TOMAacuteS-ZAPICO

e COTO-MONTES 2005 BERRA e RIZZO 2009) Sabe-se que a melatonina natildeo

exerce accedilatildeo toacutexica (FUENTES-BRITO et al 2010)

Esse neurohormocircnio eacute secretado durante a fase de ausecircncia de luz sendo

o sinalizador bioloacutegico do escuro assim atribui-se a MEL relaccedilatildeo com o sono em

espeacutecies de atividade diurna Poreacutem o fato da secreccedilatildeo de MEL ocorrer agrave noite

tanto em animais de atividade diurna quanto em animais de atividade noturna eacute

pouco provaacutevel que haja relaccedilatildeo direta entre o sono e a melatonina Portanto a

MEL pode levar a uma propensatildeo a sonolecircncia mas natildeo o induz diretamente

(MARKUS JUNIOR e FERREIRA 2003)

A literatura aponta que existem trecircs siacutetios para ligaccedilatildeo da melatonina

denominados de receptores MT1 e MT2 ligados a proteiacutena G e a enzima quinona

redutase 2 (QR2Mt3) (TAMURA et al 2006) Ambos receptores MT1 e MT2

estatildeo envolvidos no controle de funccedilotildees sistecircmicas e no sistema nervoso central

(HARDELAND et al 2006) A melatonina possui uma meia vida de

aproximadamente 4-6 horas apoacutes administraccedilatildeo sendo convertida em 6-

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 18: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

18

hidroximelatonina pela citocromo P450 1A2 no fiacutegado e posteriormente

conjugada com acido glicuronico ou sulfato gerando 6-sulfatoximelatonina sendo

este ultimo um marcador eficaz para atividade da melatonina (ARENDT 2006)

Diversos cientistas tecircm mostrado a expressatildeo de receptores de melatonina

tipo MT1 e MT2 em ilhotas pancreaacuteticas de humanos e roedores bem como em

clones de INS-1 nas ceacutelulas β (PANDI-PERUMAL et al 2008) Tambeacutem haacute

receptores MT1 e MT2 no sistema nervoso central e medula onde a melatonina

exerce funccedilatildeo analgeacutesica na dose de 60 mgKg (LASTE et al 2012)

A MEL eacute um produto do metabolismo do triptofano tendo natureza tanto

lipofiacutelica quanto hidrofiacutelica o que facilita sua passagem atraveacutes das

biomembranas (sem que seja necessaacuteria a ligaccedilatildeo com algum receptor

especifico) podendo assim exercer sua accedilatildeo em estruturas citosoacutelicas ou

nucleares (DOBSAK et al 2003 BERRA e RIZZO 2009)

Tem sido demonstrado que a MEL pode modular a transmissatildeo de sinais

caacutelcio dependentes devido agrave sua fixaccedilatildeo agrave calmodulina e influenciar diretamente

no sistema da adenilil-ciclase e fosfodiesterase (DOBSAK et al 2003) A ligaccedilatildeo

da MEL com a calmodulina pode ser um mecanismo molecular pelo qual a MEL

inibe a formaccedilatildeo de isoformas da enzima oacutexido niacutetrico sintase (TAMURA et al

2006) A MEL pode ainda modular diretamente os canais de caacutelcio voltagem-

dependente no coraccedilatildeo influenciando a fisiologia cardiacuteaca (DOBSAK et al 2003)

Segundo estudos a MEL auxilia no tratamento do cacircncer pois estimula a

atividade anti-mitoacutetica do sistema imune participa da regulaccedilatildeo da fisiologia

gastrintestinal da funccedilatildeo cardiovascular da funccedilatildeo renal da funccedilatildeo reprodutora e

da fisiologia oacutessea possui funccedilotildees anti-inflamatoacuterias (REITER et al 2003

JARZYNKA et al 2006) No que tange aos benefiacutecios da melatonina para a

musculatura esqueleacutetica tem sido demonstrado o potencial terapecircutico no

tratamento da distrofia muscular Duchenne pois previne apoptose no muacutesculo

esuqeleacutetico promove aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite e auxilia na

regeneraccedilatildeo da ceacutelula muscular lesada (CHAHBOUNI et al 2010 WANG et al

2010 YOUSSEF HIBAOUI et al 2011 STRATOS et al 2012)

Assim a melatonina aumenta indiretamente a produccedilatildeo de enzimas

antioxidantes como a glutationeperoxidase superoacutexido dismutase e glutationa

essa accedilatildeo ocorre em curtos prazos poreacutem em altas concentraccedilotildees (100 mgKg) e

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 19: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

19

promove a reduccedilatildeo da IL-6 (TAHAN et al 2004 e 2010)

2 HIPOacuteTESE

A hipoacutetese desse estudo eacute que a melatonina tem efeito protetor na

musculatura perifeacuterica impedindo a queda dos niacuteveis de glicogecircnio muscular da

proteiacutena total diminua a IL-6 e mantenha a histologia a niacuteveis controle

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar no muacutesculo esqueleacutetico de ratos

submetidos agrave desnervaccedilatildeo os eventos ligados ao tratamento com melatonina

analisando o perfil eletrocardiograacutefico e atraveacutes de metodologia bioquiacutemica

paracircmetros indicadores do status nutricional

31 OBJETIVO ESPECIacuteFICO

Realizar um estudo direcionado a determinaccedilatildeo da dose efetiva de

melatonina

Avaliar o estado de sauacutede dos animais tratados apoacutes estabelecer a dose de

melatonina

Acompanhar o perfil eletrocardiograacutefico de ratos controle e tratados com

melatonina

Aplicar o teste de toleracircncia agrave insulina (ITT) e o teste de toleracircncia agrave glicose

(GTT) para avaliar o iacutendice de decaimento da glicemia e a responsividade

das ilhotas pancreaacuteticas em animais tratados com a melatonina

Avaliar as reservas glicogecircnicas dos muacutesculos do membro posterior de

ratos controles e submetidos agrave desnervaccedilatildeo durante 7 dias aleacutem do efeito

do tratamento com a melatonina bem como a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de

proteiacutenas totais

Avaliar o conteuacutedo de proteiacutenas totais dos muacutesculos soacuteleo normal

desnervado e tratado com Melatonina

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 20: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

20

Avaliar A IL-6 dos grupos controle tratados com a melatonina

desnervados e desnervado tratado com melatonina

Avaliar as condiccedilotildees histoloacutegicas dos muacutesculos nas diferentes condiccedilotildees

experimentais

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Animais Foram utilizados ratos da linhagem Wistar (Rathus novergicus var

albinus Rodentia Mamalia) com 3 a 4 meses de idade com peso de 200 a 300 g

da ANILABreg localizada na cidade de Pauliacutenia - SP os quais receberam aacutegua e

alimentaccedilatildeo a vontade (ad libitum) sendo mantidos em ambiente com temperatura

constante de 23 plusmn 2degC e ciclo claroescuro de 12 horas com luz acesa a partir das

6 horas sendo mantidos em gaiolas coletivas contendo no maacuteximo 5 animais e

distribuiacutedos segundo a tabela

Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos ratos em grupos experimentais n=6

Controle

Tratado com Melatonina ndash 7 dias com a dose de 5 mgKg

Desnervado - 7 dias

Desnervado Tratado com Melatonina - 7 dias com a dose de 5 mgKg

Devido agrave anestesia e a cirurgia para a desnervaccedilatildeo dos animais tivemos

algumas perdas amostrais reduzindo o n=4

41 DESNERVACcedilAtildeO

Os animais foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgKg) a

pata posterior esquerda tricotomizada e 1 cm do nervo isquiaacutetico foi seccionado e

retirado segundo proposta de Corderre et al (1992)

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 21: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

21

Figura 1 Procedimento utilizado para desnervaccedilatildeo A figura mostra as fases

desde a localizaccedilatildeo do nervo ateacute a retirada de 1 cm

42 TRATAMENTO COM MELATONINA

A Melatonina (Sigma-Aldrich) foi administrada na dose de 5 mgKg diluiacutedas

em aacutegua deionizada e injetada via intraperitoneal (IP) ou ainda na dose de 10

mgKg no estudo de doses A dose foi administrada durante 7 dias as 7 horas da

manhatilde no intuito de manter as concentraccedilotildees circulantes mesmo durante o dia

(MALHOTRA et al 2004)

43 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave INSULINA (ITT)

Para a realizaccedilatildeo do ITT os ratos foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado insulina (2

UKgip - Biohulin) seguido de coleta de sangue nos tempos 5 min 10 min 15

min 20 min 25 min e 30 min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al

2007)

44 TESTE DE TOLERAcircNCIA Agrave GLICOSE (GTT)

Para avaliaccedilatildeo do GTT os animais foram anestesiados e apoacutes 10 minutos

da induccedilatildeo anesteacutesica foi realizado um corte na cauda do animal por onde uma

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

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Page 22: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

22

aliacutequota de sangue foi coletada e a glicemia avaliada atraveacutes de fita usada em

glicoteste determinando o tempo zero A seguir foi administrado glicose (2 gKgip)

seguido de coleta de sangue nos tempos 15 min 30 min 60 min 90 min e 120

min e a glicemia novamente avaliada (RAFACHO et al 2007)

45 GLICOGEcircNIO MUSCULAR

Apoacutes anestesia amostras dos muacutesculos soacuteleo e gastrocnecircmio branco foram

retiradas e digeridas em KOH 30 a quente o glicogecircnio foi precipitado a partir

da passagem por etanol a quente Entre uma fase e outra da precipitaccedilatildeo a

amostra foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 minutos O glicogecircnio precipitado

foi submetido agrave hidroacutelise aacutecida na presenccedila de fenol segundo a proposta de SIU

et al (1970) Os valores foram expressos em mg100 mg de peso uacutemido

46 PROTEIacuteNA TOTAL (PT)

Para a determinaccedilatildeo da proteiacutena total foi utilizado o kit laboratorial Prototal

da Laborlab Neste procedimento no dia da coleta muscular retirou-se uma

aliacutequota do muacutesculo soacuteleo sendo prontamente embebida em uma soluccedilatildeo de

aacutecido percloacuterico e posteriormente digeridas em politron (homogeinizador) e o

extrato obtido foi centrifugado a 5000 rpm por 5 minutos apoacutes este periacuteodo foi

homogeneizado e incubado durante 15 minutos agrave 37degC Retirado do banho

depois de resfriados o conteuacutedo foi determinado atraveacutes de colorimetria em

espectrofotocircmetro a 540 nm

47 AVALIACcedilAtildeO DA PRESSAtildeO ARTERIAL E FREQUumlEcircNCIA CARDIacuteACA

Durante todo o periacuteodo experimental uma vez por semana e no final do

periacuteodo foi verificada a pressatildeo arterial dos animais do grupo controle e tratado

melatonina por meio da conexatildeo de um pletismoacutegrafo (BP-2000 Blood Pressure

Analysis SystemTM) agrave cauda dos animais em sala com isolamento acuacutestico e

diminuiccedilatildeo de quaisquer fontes de ruiacutedo que pudessem interferir nesta avaliaccedilatildeo

Os ratos foram retirados do bioteacuterio e mantidos por 30 minutos no laboratoacuterio de

experimentaccedilatildeo para que pudessem se adaptar ao ambiente Dois ratos de

grupos alternados foram colocados no aparelho cada um dentro de um

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 23: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

23

compartimento retangular adequado ao tamanho do animal onde permaneceram

por 5 minutos sobre uma plataforma aquecida a 36 ordmC e com a cauda jaacute

conectada ao ldquocuffrdquo do aparelho Apoacutes 5 minutos de adaptaccedilatildeo do animal ao

aparelho este foi acionado e as medidas de pressatildeo arterial sistoacutelica diastoacutelica

meacutedia e frequumlecircncia cardiacuteaca foram coletadas Em cada troca de animal cada

compartimento retangular foi lavado com sabatildeo neutro e secado para evitar que

os odores liberados pelos ratos anteriormente analisados pudessem interferir nas

anaacutelises dos ratos subsequumlentes As anaacutelises foram realizadas uma vez por

semana entre 800 e 1200 h segundo Kang et al 2006

48 ANAacuteLISE ELETROCARDIOGRAacuteFICA

Para a avaliaccedilatildeo das ondas e intervalos eletrocardiograacuteficos os ratos

foram anestesiados com pentobarbital soacutedico (40 mgkgip) mantidos em posiccedilatildeo

supina com respiraccedilatildeo espontacircnea para registro do ECG Os eletrodos foram

conectados aos canais do computador (Heart Ware System) e registradas trecircs

derivaccedilotildees bipolares (DI DII e DIII) e nas trecircs derivaccedilotildees amplificadas (aVR aVL

e aVF) com sensibilidade 2 N e velocidade de 50 mmsegundo O intervalo QT foi

medido em dez batimentos consecutivos do iniacutecio do complexo QRS ao ponto de

retorno da onda T isoeleacutetrica definido como segmento TP O intervalo QT foi

corrigido pela frequecircncia cardiacuteaca usando a foacutermula de Bazett (QTc = QT radicRR) e

posteriormente foi calculada a dispersatildeo do intervalo QTc subtraindo o intervalo

QTc mais curto do QTc mais longo (QTcd = QTc Max ndash QTc min) As anaacutelises

foram feitas por um uacutenico avaliador para minimizar as divergecircncias na medida da

dispersatildeo (COSTA 2008)

A avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica foi realizada no 7 dia de tratamento

49 INTERLEUCINA 6

A concentraccedilatildeo plasmaacutetica da interleucina 6 foi realizada pelo meacutetodo

ELISA (Kit ReD Systems Minneapolis MN) com concentraccedilotildees miacutenimas

detectaacuteveis de 09 20 20 e 02 pgml respectivamente conforme descrito por

Ostrowski et al (1999)

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 24: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

24

410 AVALIACcedilAtildeO DO INDICE DE HIDRATACcedilAtildeO

Na avaliaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua muscular foi utilizado a desidrataccedilatildeo

em estufa a 50ordm onde o muacutesculo soacuteleo foi pesado e colocado em um cadinho de

porcelana previamente desidratado e o peso do muacutesculo avaliado com balanccedila

analiacutetica a cada hora ateacute atingir o peso constante

411 DOSAGEM DE AacuteCIDOS GRAXOS LIVRES

Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos livres

(AGL) foi utilizado o meacutetodo proposto por REGOUW (1971) O meacutetodo consistiu

na extraccedilatildeo do AGL atraveacutes de um solvente seletivo onde o extrato eacute tratado com

uma mistura reagente que conteacutem nitrato de cobre havendo em consequumlecircncia

disto a formaccedilatildeo de um sabatildeo de cobre O metal assim ligado reage com o

dietilditilcarbamato produzindo uma coloraccedilatildeo cuja intensidade eacute diretamente

proporcional ao teor de AGL que eacute medida espectrofotometricamente em 435 nm

412 - ANAacuteLISE DA SECCcedilAtildeO TRANSVERSA DAS FIBRAS MUSCULARES

Segmentos do ventre do muacutesculo soacuteleo foram fixados em soluccedilatildeo

tamponada de formol a 10 e processados para inclusatildeo em paraplast Utilizou-

se cortes natildeo seriados de 7 microm de espessura que foram corados com

hematoxilina-Eosina (HE)

Foram selecionados 20 cortes nos quais foram escolhidas 15 imagens com

aacutereas iguais e para a captaccedilatildeo e anaacutelise das imagens utilizando-se um software

Image Proacute-plusreg 62 e uma cacircmera digital (JVC) acoplada a um microscoacutepio

(Zeiss) com integraccedilatildeo a um microcomputador Todas as imagens foram captadas

com uma objetiva 20x Para a anaacutelise da secccedilatildeo transversa das fibras foi utilizado

uma tela quadriculada composta por 80 quadrados com 63 intersecccedilotildees de

retas A intersecccedilatildeo de retas que coincidia na fibra muscular esta era delimitada

e o programa gerava um nuacutemero correspondente agrave aacuterea da fibra sendo

analisadas 10 fibras por aacuterea escolhidas de forma aleatoacuteria Foram analisadas

150 fibras musculares em cada grupo experimental (MANDARIM DE LACERDA

2010)

25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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25

413- ANAacuteLISE DA DENSIDADE DE AacuteREA DO TECIDO CONJUNTIVO

INTRAMUSCULAR

A densidade de aacuterea de tecido conjuntivo (em ) foi obtida por meio da

planimetria por contagem de pontos (MATHIEU et al 1981 MANDARIN DE

LACERDA 2010) que atraveacutes do software Image Proacute-Plusreg 62 proporcionou a

visualizaccedilatildeo em uma tela quadriculada A intersecccedilatildeo de retas que coincidiam

sobre o tecido conjuntivo foram contados e a porcentagem de aacuterea foi calculada

Resultado = Nuacutemero de pontos X100 (nuacutemero de pontos X 100165)

165

414 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

Na avaliaccedilatildeo estatiacutestica foi utilizado o teste de normalidade de Shapiro-

Wilk seguido de ANOVA e teste de Tukey plt005

26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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26

5 RESULTADOS

Inicialmente optou-se por realizar um estudo no intuito de determinar a

concentraccedilatildeo de melatonina que melhor produzisse resposta tendo como foco a

sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos Esta opccedilatildeo estaacute baseada no fato de natildeo

haver consenso quanto a concentraccedilatildeo ideal a ser empregada em estudos de

cunho metaboacutelico As doses selecionadas foram de 5 mgKg e de 10 mgKg

sendo escolhido os testes de toleracircncia a glicose (GTT) e de toleracircncia a insulina

(ITT)

Na anaacutelise do GTT utilizamos como paracircmetro de anaacutelise a aacuterea sob a

curva apoacutes 120 minutos de teste sendo observado que os animais tratados com

melatonina na dose de 5 mgKg apresentaram valores 94 menores se

comparado ao controle por outro lado o grupo tratado com a concentraccedilatildeo de

10mgKg natildeo diferenciou do controle (figura 1) O mesmo perfil de anaacutelise foi

realizado aplicando-se o ITT no qual utilizou-se como iacutendice de avaliaccedilatildeo a

porcentagem de decaimento da glicemia por minuto (KITTmin) sendo observado

que a velocidade de decaimento da glicemia dos ratos tratados com melatonina

5mgKg natildeo diferiu do controle enquanto no grupo tratado com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg foi observado valores 29 menores em relaccedilatildeo ao

controle (figura 2)

Figura 1 Representaccedilatildeo da aacuterea sob a curva no teste de toleracircncia a glicose (GTT) de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao

tratado com melatonina 10 mgKg

27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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27

Figura 2 Representaccedilatildeo da constante de decaimento da glicemia (KITT) no teste de toleracircncia a insulina de ratos controle tratado com melatonina 5 mgKg e tratado melatonina 10 mgKg Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Uma vez constatado que a melatonina na concentraccedilatildeo de 5 mgKg

exerceu accedilatildeo de secretagogo sem interferir na sensibilidade perifeacuterica

considerando-se o tempo do tratamento aqui descrito passou-se a avaliar o

conteuacutedo muscular de glicogecircnio reserva reflexo da accedilatildeo insuliacutenica e escolhidos

para o estudo os muacutesculos soacuteleo e o gastrocnecircmio branco por serem muacutesculos

de tipagem de fibras diferentes sendo o soacuteleo tipicamente fibras do tipo I

(vermelhas) e gastrocnecircmio branco tipicamente fibras do tipo II (branca)

Os resultados mostraram que o conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo

do grupo tratado com melatonina foi 21 maior se comparado ao controle

enquanto o desnervado teve suas reservas reduzidas em 37 se comparado ao

controle e 48 se comparado ao grupo tratado melatonina No mesmo perfil de

anaacutelise foi observado que o grupo desnervado tratado com melatonina

apresentou reservas 28 e 40 menores se comparado ao controle e ao tratado

com melatonina respectivamente natildeo havendo diferenccedila estatiacutestica entre o

grupo desnervado e desnervado tratado (figura 3)

28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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28

Figura 3 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo aos tratados com melatonina

A anaacutelise do conteuacutedo glicogecircnico do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo

branca mostrou que o glicogecircnio do grupo desnervado foi 43 menor do que o

controle e 50 menor que o grupo tratado melatonina jaacute o grupo desnervado

tratado com melatonina apresentou reservas 50 menores em relaccedilatildeo ao

controle e 56 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo foi

verificado diferenccedila entre desnervado e desnervado tratado (figura 4 )

Figura 4 Conteuacutedo de glicogecircnio do muacutesculo gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (GB) de ratos controle tratado com melatonina (10mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina

29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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29

Uma vez determinado a dose efetiva surgiu a preocupaccedilatildeo do tratamento

promover alteraccedilotildees em padrotildees hematimeacutetricos Para dirimir a duacutevida foi

realizado a avaliaccedilatildeo de 3 padrotildees indicativos de anemia ou reaccedilotildees imunoloacutegica

e natildeo foi verificado diferenccedila entre os grupos como pode ser verificado na tabela

2 Na mesma tabela pode ser verificado que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos

graxos livres foram reduzidas em 16 devido ao tratamento com melatonina

Tabela 2 Padratildeo hematoloacutegico e concentraccedilatildeo plasmaacutetica de aacutecidos graxos

livres (AGL) de ratos controle e tratados com melatonina 5 mgKg Os valores

correspondem a meacutedia plusmn epm n=5

Quando se avalia paracircmetros que envolvem a recuperaccedilatildeo metaboacutelica da

musculatura atenccedilatildeo especial deve ser direcionada ao peso do muacutesculo sendo

escolhido neste estudo o muacutesculo soacuteleo devido a maior facilidade de identificaccedilatildeo

dos limites anatocircmicos

Os dados mostram que o soacuteleo do grupo tratado melatonina apresentou

peso 14 maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado

apresentou peso 25 e 34 menores se comparado ao controle e ao tratado

melatonina Jaacute o grupo desnervado tratado com melatonina apresentou valores

17 e 25 menores do que o grupo tratado melatonina e desnervado

respectivamente como pode ser observado na figura 5

Hemoglobina

( gdL)

Hematoacutecrito

()

Leucometria

(x106)

AGL

(mmolL)

Controle 1273plusmn08 24plusmn50 612plusmn03 x106 050 plusmn 003

Tratado 1317plusmn05 306plusmn21 626plusmn03 x106 042 plusmn 005

30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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30

Figura 5 Peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10gkg) desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 com relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado melatonina $ comparado ao desnervado

A partir do reflexo do tratamento sobre o peso passou-se a avaliar o

conteuacutedo de proteiacutenas totais Nesta avaliaccedilatildeoos dados mostraram que no grupo

tratado melatonina o soacuteleo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutena total 2386

maior do que o controle Por outro lado o grupo desnervado apresentou proteiacutena

total 23 e 38 menor se comparado ao controle e ao tratado melatonina No

que se refere ao grupo desnervado tratado com melatonina foi verificado valores

27 menores do que o grupo tratado melatonina e 18 maiores se comparado

ao grupo desnervado natildeo tratado como pode ser observado na figura 6

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 31: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

31

Figura 6 Conteuacutedo de proteiacutena total do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina (10 mgKg) desnervado e desnervado tratado com melatonina (10 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle plt005 com relaccedilatildeo ao tratado

melatonina $plt005 com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma vez que foi verificado alteraccedilotildees no peso optou-se por verificar se o

tratamento estaria elevando o conteuacutedo de aacutegua no muacutesculo e os dados

mostraram que o iacutendice de desidrataccedilatildeo atingiu em meacutedia 74 natildeo

diferenciando entre os grupos controle e tratado com melatonina como

mostra a figura 7

$

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 32: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

32

Figura 7 Avaliaccedilatildeo do iacutendice de desidrataccedilatildeo definida a partir do peso (mg) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle e tratado com melatonina (5 mgKg) Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=4 plt005 em relaccedilatildeo ao controle representado pelo peso inicial Os nuacutemeros 2 3 e 4 representam as horas subsequentes da pesagem

A observaccedilatildeo de modificaccedilotildees metaboacutelicas e teciduais instigou a avaliaccedilatildeo

da concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6) sendo observado que o

tratamento de muacutesculos normais com melatonina (10 mgKg) natildeo alterou a

concentraccedilatildeo da citocina fato contraacuterio ocorreu no muacutesculo desnervado onde foi

observado elevaccedilatildeo na secreccedilatildeo atingindo valores 11 maiores Por sua vez foi

observado que no grupo desnervado tratado com a melatonina as concentraccedilotildees

foram similares ao controle como mostra a figura 8

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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therapy of patients with stable angina and arterial hypertension Klin Med (Mosk)

2008 86 (9) 64-67

ZANQUETTA MM SERAPHIM PM SUMIDA DH CIPOLLA-NETO J MACHADO

UF Calorie restriction reduces pinealectomy-induced insulin resistance by

improving GLUT4 gene expression and its translocation to the plasma membrane

2005 35(3)141-148

YEUNG HM HUNG MW FUNG ML Melatonin ameliorates calcium homeostasis

in myocardial and ischemia-reperfusion injury chronically hypoxic rats J Pineal

Res 2008 45373-382

YOUSSEFT HIBAOUI Y REUTENAUER-PATTE J PATTHEY-VUADENS O

RUEGG UT DORCHIES OM Melatonin improves muscle function of the

dystrophic mdx5Cv mouse a model for Duchenne muscular dystrophy J Pineal

Res 2011 51(2)163-71

YUSUF F BRAND-SABERI B Myogenesis and muscle regeneration Histochem

Cell Biol 2012 138(2)187-99

60

WANG WZ FANG XH STEPHENSON LL Melatonin attenues IP ndash induced

mitocondrial dysfunction in skeletal muscle J Surg Res 2010

WILLIAMS PE GOLDSPINK G Connective tissue changes in immobilized

muscle J Anat 1984 138343-50

Page 33: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

33

Figura 8 Concentraccedilatildeo plasmaacutetica de Interleucina 6 (pgmL) de ratos controle (C ) tratados com melatonina (T 5 mgKg) desnervado (D) e desnervado tratado com melatonina (DT) Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n= 4 plt005 comparado ao controle plt005 comparado ao desnervado

Dentro de uma anaacutelise mais ampla que dimensiona-se a amplitude do

efeito da melatonina atenccedilatildeo especial foi direcionada ao comportamento cardiacuteaco

iniciando pela avaliaccedilatildeo do comportamento da frequumlecircncia cardiacuteaca onde foi

observado reduccedilatildeo de 19 no grupo tratado com a melatonina como pode ser

verificado na figura 9 A seguir foram avaliados segmentos do eletrocardiograma

com ecircnfase nas ondas e nos segmentos sendo constatado reduccedilatildeo no intervalo

PR QTc e no complexo QRS atingindo 21 10 e 29 respectivamente (vide

figura 10) Com relaccedilatildeo agraves demais caracteriacutesticas das ondas eletrocardiograacutefica

tais como amplitude e tempo natildeo foi observado diferenccedila estatiacutestica

Interleucina 6

34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

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34

0

50

100

150

200

250

300

Controle Tratado

ba

tm

in

Figura 9 Frequumlecircncia cardiacuteaca (batmin) em ratos normais e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias Os valores correspondem a meacutedia plusmn epm n=8 plt005 comparado ao controle

0

20

40

60

80

100

120

140

160

PR - C PR - T QTc - C QTc - T QRS - C QRS - T

ms

Figura 10 Intervalos PR QTc e complexo QRS do eletrocardiograma representado em milissegundos (ms) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Baseado nos reflexos sobre a funccedilatildeo cardiacuteaca optou-se por analisar a

pressatildeo arterial e foi observado que o grupo tratado com melatonina apresentou

reduccedilatildeo de 10 na pressatildeo sistoacutelica 28 na pressatildeo diastoacutelica e 28 na

pressatildeo meacutedia como mostra a figura 11

Frequecircncia Cardiacuteaca

ECG

35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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35

0

20

40

60

80

100

120

140

160

SC ST DC DT MC MT

Pre

ssatildeo

Art

eri

al (m

mH

g)

Figura 11 Pressatildeo arterial (mmHg) sistoacutelica (S) diastoacutelica (D) e meacutedia (M) de ratos controle (C) e tratados com melatonina 5 mgKg durante 7 dias (T) Os valores correspondem agrave meacutedia plusmn epm n=8 plt 005 comparado ao controle

Na interface entre as vias de controle metaboacutelico muscular deu-se inicio a

anaacutelise histoloacutegica realizada no muacutesculo soacuteleo sendo observado que o grupo

tratado melatonina apresentou 150 mais tecido conjuntivo se comparado ao

grupo controle por sua vez no grupo desnervado tambeacutem foi observado

aumento no conjuntivo atingindo 140 em relaccedilatildeo ao controle O tratamento

com melatonina natildeo alterou a porcentagem () deste tecido

Pressatildeo Arterial

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 36: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

36

Figura 12 Porcentagem de aacuterea do tecido conjuntivo do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em relaccedilatildeo ao controle

Com relaccedilatildeo a aacuterea das fibras (microm) o grupo desnervado apresentou aacuterea

489 e 457 menor se comparado ao grupo controle e ao grupo tratado

melatonina respectivamente Jaacute no grupo desnervado tratado com melatonina foi

observado que apresentou aacuterea 51 menor com relaccedilatildeo ao grupo controle e

478 menor com relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina poreacutem natildeo diferiu do

desnervado

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 37: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

37

Figura 13 Aacuterea das fibras em microcircmetro (microm) do muacutesculo soacuteleo de ratos controle tratado com melatonina desnervado e desnervado tratado com melatonina Os valores representam a meacutedia plusmn epm n=5 plt005 em

relaccedilatildeo ao controle plt005 em relaccedilatildeo ao grupo tratado melatonina

38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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38

6 Discussatildeo

O presente estudo traacutes no eixo norteador realizar uma avaliaccedilatildeo de cunho

metaboacutelico focada nas accedilotildees proporcionadas pelo tratamento com melatonina

Neste contexto optou-se por iniciar o desenvolvimento experimental buscando

selecionar a dose adequada que proporcionasse melhora nas condiccedilotildees

metaboacutelicas dos tecidos perifeacutericos em especial os muacutesculos

Iniciou-se realizando o teste de toleracircncia agrave glicose (GTT) e teste de

toleracircncia a insulina (ITT) em animais controle e tratados com melatonina na

concentraccedilatildeo de 10 mgKg e 5 mgKg buscando informaccedilotildees sobre a

responsividade dos tecidos perifeacutericos

Uma explicaccedilatildeo para os resultados observados no GTT e no ITT se

fundamentam nas relaccedilotildees que a melatonina exerce sobre o metabolismo de

carboidratos onde tem sido descrito que sua accedilatildeo eacute expressa tanto no acircmbito da

sensibilizaccedilatildeo tecidual quanto na responsividade das ceacutelulas β pancreaacuteticas

(ROBEVA et al 2008) Assim a opccedilatildeo por avaliar diferentes doses reitera a

busca em compreender os eventos que participam do controle glicecircmico

A opccedilatildeo por avaliar a dose de 10 mgKg de melatonina se pauta na

demonstraccedilatildeo que a melatonina exerce accedilatildeo protetora nos cardiomioacutecitos por

atuar reduzindo a accedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio bem como mostra-se

eficiente em promover reduccedilatildeo na apoptose (YEUNG et al 2008 TAKE et al

2009 SANTOS 2010) No entanto nossos resultados mostraram que a dose de

10mgKg natildeo causou modificaccedilatildeo na dinacircmica secretoacuteria das ceacutelulas beta

pancreaacuteticas uma vez que a aacuterea sob a curva no GTT natildeo alterou-se por outro

lado o hormocircnio potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com intensidade

proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees hipoglicemicas (SUMIDA

et al 1999)

Diante dos resultados obtidos a partir da dose supra-citada passamos a

avaliar os eventos inerentes a uma dose 50 menor natildeo mudando o perfil de

anaacutelise jaacute em curso Neste contexto foi observado que a dose de 5 mgKg

hipersensibilizou o processo secretoacuterio representado por uma menor aacuterea sob a

curva descrita no GTT no entanto natildeo apresentou resultado estatisticamente

significativo em relaccedilatildeo ao ITT sendo sugestivo a existecircncia de potencial

sensibilizador em tecido perifeacutericos

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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Page 39: ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DA ADMINISTRAÇÃO DA … · (GB), por meio do método fenol sulfúrico. A análise da concentração de proteína total foi realizada no S, pelo método colorimétrico

39

Estudos tecircm demonstrado que o estado de resistecircncia agrave insulina se

caracteriza pela reduccedilatildeo na eficiecircncia do sinal insuliacutenico e consequente

comprometimento na captaccedilatildeo de glicose por tecidos perifeacutericos Neste aspecto

tem sido proposto que a melatonina promove melhora na sensibilidade insuliacutenica

ativando proteiacutenas chave na cascata insuliacutenica (CONTRERAS-ALCANTARA et

al 2010)

Dentre os processos de sensibilizaccedilatildeo tecidual haacute duas condiccedilotildees a se

considerar a primeira ligada agrave sensibilizaccedilatildeo perifeacuterica e a segunda ligada agrave

sensibilizaccedilatildeo das ilhotas pancreaacuteticas Assim eacute sugestivo que na dose 10 mgKg

o aumento na captaccedilatildeo perifeacuterica possa induzir um ajuste na populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos gerando down regulation diminuiccedilatildeo na sensibilidade e

comprometimento na sensibilidade dos tecidos perifeacutericos Por outro lado na

dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora das respostas pancreaacuteticas sendo

sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos

tecidos perifeacutericos Nosso estudo corrobora com Oumlner et al (2008) os quais

utilizando uma dose proacutexima (6 mgKg) por 30 dias comparou o efeito da

testosterona e da melatonina na atrofia muscular de ratos e demonstrou que a

melatonina foi tatildeo efetiva quanto a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia muscular

Estudos in vitro tambeacutem reiteraram em fibras de muacutesculos esqueleacutetico

isoladas que a melatonina exerce accedilatildeo na cascata da via insuliacutenica atraveacutes da

translocaccedilatildeo de GLUT 4 para membrana (STRATOS et al 2012)

Na experimentaccedilatildeo cientiacutefica faz-se necessaacuterio avalliar o estado de sauacutede

dos animais jaacute que compreende o bem estar comportamental e fiacutesico que por sua

vez refletem a interaccedilatildeo com o ambiente e o status nutricional

Haacute diversos indicadores da sauacutede dos animais tais como pecirclos

homogecircneos com brilho olhos brilhantes e umidificados e vivacidade em

condiccedilotildees de normalidade (ANDERSEN et al 2004) Quando o foco do estudo

estaacute pautado em avaliaccedilotildees de paracircmetros metaboacutelicos faz-se necessaacuterio

analisar o perfil hematoloacutegico bem como o comportamento glicecircmico e das

concentraccedilotildees de aacutecidos graxos livres

No acircmbito hematoloacutegico optou-se por analisar o hematoacutecrito e o conteuacutedo

de hemoglobina natildeo sendo verificado diferenccedila entre controle e tratado indicando

que a melatonina durante o periacuteodo avaliado natildeo modifico a formaccedilatildeo e a

40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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40

homeostase dos gloacutebulos vermelhos A analisou-se tambeacutem o aacutecido graxo livre

(AGL)

Cabe ressaltar que na presenccedila da melatonina as concentraccedilotildees

plasmaacuteticas de aacutecidos graxos livres foram reduzidas sugerindo que haja

participaccedilatildeo da melatonina enquanto hormocircnio que pode minimizar as accedilotildees de

hormocircnios cuja accedilatildeo estaacute centrada na mobilizaccedilatildeo das reservas lipiacutedicas os

quais possivelmente satildeo secretados frente agrave desnervaccedilatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da dose efetiva passamos para as anaacutelises

quimiometaboacutelicas dos muacutesculos Sabe-se que a glicose eacute um substrato

preferencialmente metabolizado em todos os tecidos assim a captaccedilatildeo da

hexose por tecidos perifeacutericos tal como o muacutesculo esqueleacutetico depende de

fatores como a estimulaccedilatildeo pela insulina ou a elevaccedilatildeo na atividade contraacutetil

promovendo a translocaccedilatildeo do transportador de glicose (GLUT4) para a

superfiacutecie da ceacutelula (PESCHKE et al 2008)

Tem sido descrito a presenccedila de receptores de melatonina no pacircncreas

assim a pineal de maneira indireta pode alterar a secreccedilatildeo de insulina atraveacutes de

modulaccedilatildeo autonocircmica e de responsividade dos neurotransmissores Diante

disso sob estiacutemulo insuliacutenico ocorre translocaccedilatildeo das vesiacuteculas de GLUT 4 na

membrana plasmaacutetica aumentando em 30 vezes o transporte de glicose para o

tecido muscular (de OLIVEIRA et al 2012 MUHLBAUER et al 2012)

Nosso estudo mostra que no muacutesculo soacuteleo (fibra tipo I) o tratamento com

melatonina 5 mgKg promoveu elevaccedilatildeo nas reservas glicogecircnicas efeito que se

manifestou em muacutesculos normais e desnervados indicando as relaccedilotildees funcionais

entre o hormocircnio e a efetividadeativaccedilatildeo das vias insuliacutenicas mesmo existindo

comprometimento gerado pela perda do controle motor No mesmo sentido

demonstramos que as accedilotildees nas vias glicogecircnicas natildeo foram observadas no

gastrocnecircmio porccedilatildeo branca (fibra tipo II) o que pode indicar que o hormocircnio

possa exercer accedilatildeo preferencial em fibras vermelhas nas quais a populaccedilatildeo de

receptores insuliacutenicos eacute maior (RAFACHO et al 2007)

Em ratos pinealectomizados o conteuacutedo do GLUT 4 e seu RNAm satildeo

significativamente menores (48 a 71) alteraccedilatildeo observada no muacutesculo soacuteleo e

natildeo nos muacutesculos gastrocnecircmios (LIMA 2004)

41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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41

Em suma a melatonina exerce um importante papel na regulaccedilatildeo do

controle glicecircmico pois eleva a sensibilidade tecidual a insulina e promove

alteraccedilotildees na expressatildeo gecircnica da proteiacutena transportadora GLUT 4

(ZANQUETTA et al 2005 LIMA 2006 GHOSH et al 2011)

Ao avaliarmos o conteuacutedo de proteiacutenas totais de muacutesculos desnervados foi

verificado diminuiccedilatildeo estatisticamente significante no soacuteleo no entanto em contra

partida o muacutesculo soacuteleo do animal tratado com a melatonina e aquele que foi

desnervado e posteriormente tratado com a mesma dose apresentaram um

significante aumento no conteuacutedo de proteiacutena muscular se comparado com o

muacutesculo desnervado Da mesma maneira nossa avaliaccedilatildeo do peso do muacutesculo

soacuteleo mostrou diminuiccedilatildeo significativa no desnervado com relaccedilatildeo ao controle e

um aumento significativo do tratado melatonina com relaccedilatildeo ao controle e do

desnervado melatonina com relaccedilatildeo ao desnervado

Uma possiacutevel resposta para discernir sobre as accedilotildees da melatonina sobre

o paracircmetro peso muscular pode estar relacionado agrave interaccedilatildeo da melatonina com

o IGF-I e consequentemente o hormocircnio de crescimento (GH)

O tecido muscular tem a capacidade de se regenerar em resposta a

microlesotildees que podem ser geradas frente agrave elevaccedilatildeo na exigecircncia da atividade

contraacutetil Sua habilidade de responder a estiacutemulos fiacutesicos ou quiacutemicos depende

em grande quantidade das ceacutelulas sateacutelite as quais satildeo ceacutelulas precursoras de

muacutesculo ou ceacutelulas ldquoproacute-muacutesculordquo Elas satildeo ceacutelulas que estatildeo tanto no muacutesculo

quanto ao redor deste Estas ceacutelulas ficam ldquodormentesrdquo ateacute o momento que

fatores de crescimento tal como IGF-1 as estimula Uma vez que isto acontece

estas ceacutelulas se dividem e mudam geneticamente em ceacutelulas que tecircm o nuacutecleo

idecircntico agravequeles de ceacutelulas musculares Estas novas ceacutelulas sateacutelites com nuacutecleo

de ceacutelulas musculares satildeo ldquomandatoacuteriasrdquo para o crescimento muscular (RELAIX e

ZAMMIT 2012 YUSUF et al 2012)

Sabe-se que a reduccedilatildeo dos niacuteveis de IGF-I esta associada agrave atrofia

muscular (URUSHIYAMA et al 2004)

Nesse sentido a literatura mostra que a melatonina altera a siacutentese do

hormonio de crescimento e IGF-I em diferentes tecidos promovendo a siacutentese

proteacuteica muscular (OSTROWSKA et al 2003)

42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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42

Oumlner (2008) observou que a suplementaccedilatildeo de melatonina durante 30

dias em ratos castrados aumentou o diacircmetro da fibra muscular o peso e a

expressatildeo do IGF-I no muacutesculo soacuteleo e conclui que a melatonina secretada pela

glacircndula pineal tem efeitos similares a testosterona na prevenccedilatildeo de atrofia

muscular induzida pela castraccedilatildeo por meio do eixo IGF-I

Na busca de aumentar informaccedilotildees sobre a integraccedilatildeo na sinalizaccedilatildeo

metaboacutelica optou-se por avaliar a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de interleucina 6 (IL-6)

sendo verificado aumento no grupo desnervado Para explicar esta alteraccedilatildeo tem-

se que relatar que as citocinas satildeo moduladas por vaacuterios estiacutemulos incluindo a

atividade fiacutesica trauma e infecccedilatildeo condiccedilotildees onde as reservas energeacuteticas torna-

se comprometidas (MOLDOVEANU et al 2000 OSTROWSKI et al 2011)

Dentre as interleucinas a IL-6 eacute um potente estimulador da secreccedilatildeo de

proteiacutenas de fase aguda da inflamaccedilatildeo pelo fiacutegado e tambeacutem exerce uma accedilatildeo

reguladora do metabolismo promovendo mobilizaccedilatildeo das reservas energeacuteticas

musculares (MOOREN e VOLKER 2012) Esta citocina eacute biologicamente ativa a

qual inicialmente havia referencia somente de sua secreccedilatildeo pelas ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico durante condiccedilotildees inflamatoacuterias poreacutem tem sido descrito

sua secreccedilatildeo pelo tecido adiposo e pela contraccedilatildeo muscular inclusive na

ausecircncia de inflamaccedilatildeo (STEENSBERG et al 2000)

PEDERSEN et al (2001) propuseram que a IL-6 eacute produzida

localizadamente pelo muacutesculo esqueleacutetico e liberada na corrente sanguiacutenea em

grandes quantidades e dessa forma exerce um papel importante na manutenccedilatildeo

da homeostasia da glicose durante o exerciacutecio Tambeacutem sugerem que a IL-6 pode

operar suas accedilotildees de uma maneira similar a um hormocircnio otimizando a resposta

metaboacutelica durante a atividade muscular Cabe ressaltar que no grupo

desnervado observou-se pequenas reservas glicogecircnicas indicando que o status

metaboacutelico da musculatura possa ter sido um dos fatos estimulador da secreccedilatildeo

da IL-6

Outro ponto a se destacar se refere a multiplicidade de accedilotildees ligadas

diretamente a atuaccedilatildeo da IL6 na fibra muscular destacando-se o estimulo sob

ceacutelulas sateacutelite e a mobilizaccedilatildeo de diferentes reservatoacuterios energeacuteticos elevando a

disponibilidade de acordo com a demanda (PEDERSEN et al 2000 ab) Neste

sentido no grupo desnervado tratado com melatonina foi observado reduccedilatildeo na

43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

48

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43

produccedilatildeo da interleucina 6 indicando que possivelmente a melatonina diminuiu o

efeito inflamatoacuterio local caracterizado pela diminuiccedilatildeo significativa da IL-6 e natildeo

devido as reservas energeacuteticas onde o efeito foi de pequena intensidade

No que se refere a elevaccedilatildeo das reservas glicogecircnicas mesmo em

pequena quantidade como observado no muacutesculo soacuteleo se deve a capacidade

da IL-6 interagir com as vias insuliacutenicas translocando GLUT 4 de reservatoacuterios

citosoacutelico ateacute a membrana ativando a enzima AMPK e estimulando a oxidaccedilatildeo de

aacutecidos graxos associado a captaccedilatildeo de glicose desta forma haacute de se sugerir que

a IL6 seja um ldquosensor de energiardquo (MOOREN e VOLKER 2012)

Tendo em vista que a melatonina eacute considerada um hormocircnio que reduz a

atividade dos oacutergatildeos o estudo foi direcionado a avaliaccedilotildees de paracircmetros ligados

a atividade cardiacuteaca iniciando pela avaliaccedilatildeo eletrocardiograacutefica que eacute um

meacutetodo efetivo no diagnoacutestico de alteraccedilotildees cardiacuteacas por natildeo ser invasivo uma

vez que capta sinais eleacutetricos que se originam no muacutesculo cardiacuteaco e se

propagam pela superfiacutecie corporal Dentre as novas opccedilotildees farmacoloacutegicas

prescritas no tratamento de complicaccedilotildees cardiovasculares a utilizaccedilatildeo do

hormocircnio melatonina enquanto coadjuvante tem se destacado devido aos seus

amplos efeitos moderadores das sintomatologias (HARDELAND et al 2011)

Com relaccedilatildeo as variaccedilotildees na secreccedilatildeo de melatonina sabe-se que estatildeo

fortemente associadas com o ciclo claroescuro regulaccedilatildeo do ritmo circadiano e

temperatura corporal (BERRA RIZZO 2009) Embora a pineal seja a glacircndula

principal na produccedilatildeo e secreccedilatildeo da melatonina jaacute foi descrito menores

secreccedilotildees pela retina e trato gastrointestinal (TEIXEIRA 2003)

A literatura mostra ainda relaccedilotildees diretas entre alteraccedilotildees na pressatildeo

arterial e modificaccedilatildeo nas propriedades eleacutetricas do coraccedilatildeo indicando que o

eletrocardiograma eacute um meacutetodo eficiente em detectar tais alteraccedilotildees O trabalho

em tela mostra que o grupo tratado com melatonina apresentou reduccedilatildeo na

frequumlecircncia cardiacuteaca sugerindo que o hormocircnio atuando no sistema nervoso

central melhora a dinacircmicaresposta dos pressoceptores reduzindo o tocircnus

simpaacutetico e com isto a frequecircncia cardiacuteaca (SIMKO 2009) Recentemente esta

resposta foi reiterada ao se demonstrar que ratos tratados durante 30 dias com

melatonina manifestaram uma expressiva reduccedilatildeo frequumlecircncia cardiacuteaca (RAMOS

2010)

44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

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44

Inuacutemeras alteraccedilotildees eletrocardiograacuteficas satildeo expressas por modificaccedilotildees

na duraccedilatildeo eou amplitude do intervalo QRS anormalidades do segmento PR ou

QTc (HANCOCK 2009)

Um ponto merecedor de destaque e demonstrado neste trabalho eacute que a

melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais segmentos e

complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de conduccedilatildeo com

reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca assim fica notoacuterio que a melatonina

exerce um importante mecanismo cardioprotetor Esta conclusatildeo pode ser

respaldada no trabalho de Santos (2010) onde foi demonstrado que a melatonina

protegeu o coraccedilatildeo das alteraccedilotildees geradas pelo agente anaboacutelico stanazolol

Recentes estudos observaram que o tratamento com melatonina foi efetivo

no tratamento de diferentes alteraccedilotildees cardiacuteacas tais como infarto (MOR et al

1999) angina e hipertensatildeo (ZASLAVSKAIA et al 2010 2008) Reitera-se ainda

que a concentraccedilatildeo plasmaacutetica de melatonina pode ser um iacutendice importante

enquanto marcador de infarto com supra desnivelamento no segmento ST

(DOMINGUEZ-RODRIGUES et al 2006)

Por fim nosso trabalho corrobora com a sugestatildeo que a melatonina eacute um

hormocircnio importante com accedilatildeo indireta no controle da variabilidade cardiacuteaca e

sugere que haja um efeito direto de cunho biofiacutesico atuando diretamente no

sistema de geraccedilatildeo e propagaccedilatildeo do sinal eleacutetrico no muacutesculo cardiacuteaco

(BAKSHEEV KOLOMETS 2011 RECHCINSKI et al 2010)

Dentro de um perfil de anaacutelise histoloacutegica foi observado reduccedilatildeo na aacuterea da

fibra nos grupos desnervados e desnervado tratado com melatonina

acompanhando autores que descreveram reduccedilatildeo da massa muscular bem como

da aacuterea de secccedilatildeo transversa em condiccedilotildees que promovem o desuso (

AHTIKOSKI et al 2003)

A reduccedilatildeo na aacuterea das fibras bem como da massa muscular decorre de

modificaccedilotildees no balanccedilo siacutentesedegradaccedilatildeo proteica apontando para o quadro

de hipotrofia muscular tal como preconizado (QIN et al 1997 TAILLANDIER et

al 2003 GOMES et al 2004)

Com relaccedilatildeo agrave densidade de aacuterea do tecido conjuntivo intramuscular

devemos nos atentar aos componentes relacionados a homeostasia e

funcionalidade das fibras tal como o colaacutegeno tipo IV laminina proteoglicanas e

45

as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

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as metaloproteinases que satildeo as enzimas responsaacuteveis pela degeneraccedilatildeo do

tecido conjuntivo (CARMELLI et al 2004)

Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees geradas pelo desuso tem sido descrito reduccedilatildeo

de componentes da matriz extracelular bem como o aumento da renovaccedilatildeo

(ldquoturnoverrdquo) do colaacutegeno com degradaccedilatildeo e siacutentese aceleradas e ainda

independente do modelo de desuso muscular estudado (imobilizaccedilatildeo tenotomia

ou denervaccedilatildeo) a quantidade de tecido conjuntivo no endomiacutesio e perimiacutesio

aumenta significativamente variando de 50 a 700 (WILLIAMS e

GOLDSPINK 1984 JOacuteZSA et al1988 e 1990)

Tem sido descrito alteraccedilotildees no metabolismo de colaacutegeno nos tecidos

conjuntivos quando submetidos ao desuso em decorrencia da falta de forccedilas

fisioloacutegicas atuando sobre eles o que impede a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas

dando origem a fibras imaturas as quais satildeo responsaacuteveis pela fibrose Aleacutem

disso com a falta de movimento perpetua uma orientaccedilatildeo aleatoacuteria das fibrilas

colaacutegenas receacutem-sintetizadas facilitando o surgimento de ligaccedilotildees cruzadas

irregulares em regiotildees estrateacutegicas do padratildeo tranccedilado do colaacutegeno (AKESON

1987)

Recentes estudos tem descrito que a melatonina promoveu acuacutemulo de

colaacutegeno no coraccedilatildeo enfartado sendo considerado um evento ligado a melhora

na resistecircncia agrave traccedilatildeo da cicatriz devido a accedilatildeo direta da substacircncia nos genes

α1 (I) e (III) de procolaacutegeno (DROBNIK et al 2008 2010)

Haacute relatos que a melatonina exerce accedilatildeo inibitoacuteria na produccedilatildeo de

colaacutegeno poreacutem isso ocorre no fiacutegado e na pele (TAHAN et al 2010)

Por fim nosso estudo acompanha um recente trabalho onde foi

demonstrado em muacutesculos lesados que a melatonina administrada na mesma

concentraccedilatildeo que utilizamos neste estudo promove reduccedilatildeo na infiltraccedilatildeo

leucocitaacuteria induz aumento no nuacutemero de ceacutelulas sateacutelite reduz a eficiecircncia dos

radicais livres e ainda estimula a geraccedilatildeo de citocinas pro-inflamatoacuterias facilitando

a regeneraccedilatildeo e modulando as vias controladoras do metabolismo (STRATOS et

al 2012)

Por outro lado possivelmente os benefiacutecios descritos pelo autor indica a

participaccedilatildeo impar da melatonina no reparo de muacutesculos lesados natildeo

46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

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46

apresentando a mesma intensidadeeficiecircncia de accedilatildeo em muacutesculos desnervados

o qual foi objeto deste trabalho

Como limitadores deste trabalho tivemos perda de animais como

consequecircncia da anestesia e da cirurgia de desnervaccedilatildeo o que fez com que

ficaacutessemos com um nuacutemero de animais menor que o previsto para a estatiacutestica

Outro importante limitador foi o tempo de administraccedilatildeo da melatonina no nosso

trabalho 7 dias poreacutem acreditamos que seja um tempo relativamente curto para

que observaacutessemos efeitos mais reais dessa substacircncia

Por fim este trabalho auxilia a fisioterapia pois na praacutetica cliacutenica encontra-se

comumente paciente com lesatildeo perifeacuterica e esse estudo foi mais um na tentativa

de inibir o catabolismo da musculatura esqueleacutetica em desuso extremo

(desnervaccedilatildeo) com o intuito de deixar esse muacutesculo em melhores condiccedilotildees para

uma possiacutevel reinervaccedilatildeo Observamos que apesar da melhora nos aspectos

metaboacutelicos e cardiovasculares satildeo necessaacuterios mais estudos com um tempo

maior de administraccedilatildeo e outros modelos de desuso para podermos ter certeza

dos efeitos da melatonina na musculatura esqueleacutetica

47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

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47

7 CONCLUSOtildeES

A dose de 10mgKg potencializou a captaccedilatildeo perifeacuterica de glicose com

intensidade proacutexima a manutenccedilatildeo de glicemias em concentraccedilotildees

hipoglicemicas Por outro lado na dose 5 mgkg a accedilatildeo se mostrou estimuladora

das respostas pancreaacuteticas sendo sugestivo que a constacircncia do estiacutemulo possa

redirecionar agrave sensibilizaccedilatildeo dos tecidos perifeacutericos

A melatonina promoveu reduccedilatildeo no tempo e intensidade dos principais

segmentos e complexos do eletrocardiograma indicando reduccedilatildeo no tempo de

conduccedilatildeo com reflexo na reduccedilatildeo da atividade cardiacuteaca e natildeo se modificou

indicando a eficaacutecia sem comprometimentos no hematoacutecrito eritroacutecitos

hemoglobina e leucometria

A melatonina segundo nosso estudo melhorou as condiccedilotildees

quimiometaboacutelicas como glicogecircnio muscular e proteiacutena total Reduziu a

produccedilatildeo das IL-6 no grupo desnervado tratado sendo indicativo que a melatonina

diminuiu o processo inflamatoacuterio local

Com relaccedilatildeo agrave histologia observamos que houve um aumento significativo do

tecido conjuntivo nos grupos tratados com melatonina e natildeo houve recuperaccedilatildeo

das aacutereas das fibras musculares

Assim o tratamento com melatonina promoveu melhora no padratildeo metaboacutelico

da musculatura desnervada poreacutem natildeo foi eficiente em impedir a atrofia

desencadeada pela desnervaccedilatildeo sendo observado ainda aumento no conteuacutedo

de tecido conjuntivo

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78 512-7

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resistence is associated with increased connexin 36 mRNA and protein expression

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56

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139(16)2845-56

RIBEIRO CB Anaacutelise quimiometaboacutelica e biomolecular da musculatura

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RICHARSON JM BALON TW TREADWAY JL e PESSIN JF Differential

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Chem 1991 266 12690 - 12694

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induced liver fibrosis in rats J Pineal Res 2004 37 78-84

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UZUN H TAHAN V ZENGIN K Melatonin a meliorates liver fibrosus induced by

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TAMURA EK SILVA CLM MARKUS RP Melatonin inhibits endothelial nitric oxide

production in vitro J Pinela Res 2006 41267-274

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2008 86 (9) 64-67

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UF Calorie restriction reduces pinealectomy-induced insulin resistance by

improving GLUT4 gene expression and its translocation to the plasma membrane

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in myocardial and ischemia-reperfusion injury chronically hypoxic rats J Pineal

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TEIXEIRA A Propriedades Antioxidantes da Melatonina Inibiccedilatildeo de Enzimas

Proacute-Oxidantes e Accedilatildeo Contra a Peroxidaccedilatildeo Lipiacutedica [Dissertaccedilatildeo] Universidade

Federal de Santa Catarina 2003

TOMAacuteS-ZAPICO C COTO-MONTES A A proposed mechanism to explain the

stimulatory effect of melatonin on antioxidative enzymes J Pineal Res 2005

3999-104

59

TAKE G ERDOGAN D HELVACIOGLU F et al Effect of melatonin and time of

administration on irradiation-induced damage to rat testes Brazilian Journal of

Medical and Biological Research 2009 42 621-628

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A Change from a hard to soft diet alters the expression of insulin-like growth

factors their receptors and binding proteins in association with atrophy in adult

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ZASLAVSKAIA RM SHCHERBAN EA LILITSA GV Melatonin in the combined

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ZASLAVSKAIA RM SHCHERBAN EA LOGVINENKO SI Melatonin in combined

therapy of patients with stable angina and arterial hypertension Klin Med (Mosk)

2008 86 (9) 64-67

ZANQUETTA MM SERAPHIM PM SUMIDA DH CIPOLLA-NETO J MACHADO

UF Calorie restriction reduces pinealectomy-induced insulin resistance by

improving GLUT4 gene expression and its translocation to the plasma membrane

2005 35(3)141-148

YEUNG HM HUNG MW FUNG ML Melatonin ameliorates calcium homeostasis

in myocardial and ischemia-reperfusion injury chronically hypoxic rats J Pineal

Res 2008 45373-382

YOUSSEFT HIBAOUI Y REUTENAUER-PATTE J PATTHEY-VUADENS O

RUEGG UT DORCHIES OM Melatonin improves muscle function of the

dystrophic mdx5Cv mouse a model for Duchenne muscular dystrophy J Pineal

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60

WANG WZ FANG XH STEPHENSON LL Melatonin attenues IP ndash induced

mitocondrial dysfunction in skeletal muscle J Surg Res 2010

WILLIAMS PE GOLDSPINK G Connective tissue changes in immobilized

muscle J Anat 1984 138343-50

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