análise da expressão gênica promíscua no timo de...

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Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada Grupo de Imunogenética Molecular Análise da Expressão Gênica Promíscua no Timo de Camundongos DBA-1/J e DBA-2/J Durante a Imunização com Colágeno: Modelo de Susceptibilidade/Resistência a Artrite Reumatóide Dissertação de Mestrado Paula Barbim Donate Ribeirão Preto 2008

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Universidade de São Paulo

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada

Grupo de Imunogenética Molecular

Análise da Expressão Gênica Promíscua no Timo de Camundongos DBA-1/J e DBA-2/J

Durante a Imunização com Colágeno: Modelo de Susceptibilidade/Resistência a Artrite

Reumatóide

Dissertação de Mestrado

Paula Barbim Donate

Ribeirão Preto

2008

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

Paula Barbim Donate

Análise da Expressão Gênica Promíscua no Timo de Camundongos DBA-1/J e DBA-2/J

Durante a Imunização com Colágeno: Modelo de Susceptibilidade/Resistência a Artrite

Reumatóide

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciência; área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada.

Orientador: Prof. Dr. Geraldo Aleixo da Silva Passos

C0-orientador: Prof.Dr. Fernando de Queiróz Cunha

Ribeirão Preto

2008

DONATE, Paula B.

Análise da Expressão Gênica Promíscua no Timo de Camundongos DBA-1/J e DBA-2/J

Durante a Imunização com Colágeno: Modelo de Susceptibilidade/Resistência a Artrite

Reumatóide

103p.30cm

Dissertação de mestrado apresentada a Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, Área de Concentração em Imunologia Básica e Aplicada.

Orientador: Passos, Geraldo Aleixo da Silva

Apoio e suporte financeiro

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Imunogenética Molecular, localizado no

Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) – USP

com o apoio financeiro das seguintes entidades e instituições:

- Fundação de Amparo à Pesquisa de Estado de São Paulo (FAPESP) por meio da Bolsa

de Mestrado Proc. 05/57474-8 e Auxílio à Pesquisa Proc. 06/54788-4.

- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP - USP

DEDICO ESTE TRABALHO...

Às pessoas que mais amo na minha vida:

Especialmente a minha mãe, que é minha força, sempre esteve ao meu lado em todos os

momentos, e sempre confiou, acreditou e me apoiou incondicionalmente em minhas

conquistas, em todas as fases da minha vida. Ela é a razão de eu estar onde estou. Você

sempre foi mais que uma mãe para mim. Obrigada por tudo!!! Te amo muito!!!

As minhas irmãs, pela compreensão e apoio;

Meu namorado Anderson, por todo carinho, amor, paciência e companheirismo durante

todo o trajeto de desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por ser esta pessoa

maravilhosa e ser parte da minha vida. Te amo fofitinho!!!!!!

Agradecimentos

Agradeço a todos que de alguma forma, seja ela direta ou indiretamente, me ajudaram

para que este trabalho pudesse ser concluído.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Geraldo Aleixo da Silva Passos, pela orientação e

dedicação durante o desenvolvimento deste trabalho, e por seu exemplo de

profissionalismo e seriedade que contribuíram e continuam a contribuir para meu

crescimento profissional. Muito Obrigada!!!

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Fernando de Queiróz Cunha, que me acompanha desde

a iniciação científica, pela confiança, pelos ensinamentos e apoio durante estes anos, e

por disponibilizar o laboratório para que este trabalho pudesse ser desenvolvido. Quero

agradecer também a todo laboratório de inflamação e dor, por toda ajuda,

disponibilidade e amizade.

Ao departamento de Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto (FMRP) pela dedicação, destacando o laboratório do Prof. Dr. João

Santana pelo auxílio na utilização do FACs, e especialmente a Ana por todo carinho e

paciência, sem ela o departamento não seria o mesmo!

Ao laboratório de Citogenética e Mutagênese pela ajuda, e por disponibilizar o

laboratório sempre que necessário.

Ao departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos,

especialmente ao Prof. Dr. Klauss Hartfelder, e ao departamento de Fisiologia da

Faculdade de Odontologia, especialmente a Profa. Maria José Alves da Rocha que

gentilmente me auxiliaram respectivamente na utilização do microscópio confocal e o

criostato.

Ao departamento de Genética, em particular, ao laboratório de Imunogenética

Molecular, onde foi realizado este trabalho.

Aos meus grandes amigos do grupo de Imunogenética Molecular, pela convivência

extremamente agradável, pelos ensinamentos, colaborações e pelas alegrias que

marcaram estes anos. Vocês são muito especiais!!!

“A ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de Deus. Quando considero quantas e quão maravilhosas coisas o homem compreende, pesquisa e consegue realizar, então reconheço claramente que o espírito humano é obra de Deus, e a mais notável”.

Galilei Galilei

Sumário

RESUMO ...................................................................................................................................... ii

ABSTRACT................................................................................................................................. iii

1 INTRODUÇÃO......................................................................................................................... 2

1.1 Auto-imunidade....................................................................................................... 2

1.2 Artrite reumatóide ................................................................................................... 7

1.3 Caracterização do timo............................................................................................ 9

1.4 Caracterização da expressão promíscua no timo................................................... 16

1.5 Papel regulador do gene Aire ................................................................................ 19

1.6 Análise do transcriptoma....................................................................................... 20

1.6.1 Conceito de transcriptoma .................................................................... 20

1.6.2 Métodos de análise do transcriptoma.................................................... 21

1.7 A utilização de RNA interferente (RNAi anti-Aire) na pesquisa em

imunologia ................................................................................................................ 24

2 HIPÓTESE DO TRABALHO ............................................................................................... 27

3 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 28

4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 30

4.1 Linhagem de camundongos DBA-1/J e DBA-2/J ................................................. 30

4.2 Indução de artrite reumatóide por imunização com colágeno............................... 30

4.3 Separação de células epiteliais tímicas (TECs) ..................................................... 30

4.4 Extração de RNA total .......................................................................................... 31

4.5 Quantificação e Eletroforese de Amostras de RNA Total..................................... 32

4.6 Cultura de timo adulto (ATOC) ............................................................................ 32

4.7 Tratamento de ATOC com RNAi anti-Aire .......................................................... 33

4.8 Avaliação de apoptose e necrose em ATOC por citometria de fluxo ................... 34

4.9 Reações de RT- PCRs (transcrição reversa seguida de PCR) ............................... 35

4.10 Preparação de cDNA microarrays em lâminas de vidro....................................... 37

4.10.1 Biblioteca de cDNAs murinos .............................................................. 37

4.10.2 Amplificação de cDNA para a confecção de microarrays ................... 37

4.10.3 Purificação dos produtos de PCR.......................................................... 38

4.10.4 Confecção das lâminas de microarrays ................................................ 39

4.10.5 Delineamento das hibridações em microarrays.................................... 39

4.10.6 Marcação das sondas complexas de cDNA com fluorocromos Cy3

e Cy5...... ............................................................................................................ 41

4.10.7 Hibridação das lâminas de microarrays................................................ 47

4.10.8 Aquisição de Imagens de microarrays.................................................. 47

4.10.9 Quantificação e normalização dos dados de microarrays..................... 47

4.10.10 Nomenclatura dos genes ....................................................................... 52

4.11 Análise da expressão gênica promíscua no timo................................................... 53

5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL................................................................................ 55

6 RESULTADOS ....................................................................................................................... 57

6.1 Avaliação da integridade das amostras de RNA ................................................... 57

6.2 Avaliação da expressão do gene Aire e de TRAs no estroma tímico.................... 58

6.3 Avaliação da viabilidade de ATOC....................................................................... 59

6.4 Determinação da seqüência de RNAi anti-Aire para ensaio em ATOC................ 61

6.5 Análise do silenciamento do gene Aire pela técnica de RNAi.............................. 65

6.6 Marcação com sonda fluorescente e obtenção de imagens ................................... 66

6.7 Análise dos genes diferencialmente expressos por agrupamento hierárquico,

e da significância estatística do padrão de expressão ............................................... 68

6.8 Determinação da expressão gênica promíscua (PGE) no Timo ............................ 71

7 DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 76

7.1 Expressão de TRAs no estroma tímico ................................................................. 76

7.2 Avaliação do silenciamento do gene Aire............................................................. 79

7.3 Expressão Gênica Promíscua do Timo.................................................................. 80

8 CONCLUSÕES....................................................................................................................... 85

9 REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 87

ANEXO

Lista de Figuras

Figura 1 Fatores envolvidos no desenvolvimento de doenças auto-imunes ..................................3

Figura 2 Mapas esquemáticos dos loci do MHC humano e de camundongos ...............................4

Figura 3 Resíduos polimórficos de uma molécula MHC...............................................................5

Figura 4 Morfologia do timo........................................................................................................10

Figura 5 Estrutura do timo ...........................................................................................................11

Figura 6 Estrutura e função do timo.............................................................................................13

Figura 7 Caracterização da PGE ..................................................................................................17

Figura 8 Marcação fluorescente de microarrays..........................................................................23

Figura 9 Delineamento dos experimentos com microarrays .......................................................41

Figura 10 Preparação da fita simples de cDNA incorporada com amino alil ..............................45

Figura 11 Preparação do cDNA marcado com CyDye.................................................................46

Figura 12 “Pipeline” utilizado na análise de dados de microarrays em lâminas de vidro...........49

Figura 13 Gráfico do SAM ..........................................................................................................52

Figura 14 Integridade das amostras de RNA ...............................................................................57

Figura 15 Avaliação da expressão dos genes: β-actina, CD3e, Aire, Ins-1, Ins-2, Gad67 e Pró-colágeno II estroma tímico....................................................................................................58

Figura 16 Avaliação da viabilidade em ATOC por citometria de fluxo ......................................60

Figura 17 Avaliação da expressão dos genes HPRT e Aire de RNAi anti-Aire ..........................62

Figura 18 Seqüência selecionado de RNAi anti-Aire ..................................................................62

Figura 19 Microscopia confocal...................................................................................................64

Figura 20 Avaliação da expressão do gene Aire em amostras de estroma tímico de ATOC.......65

Figura 21 Hibridações de microarray com sondas fluorescentes ................................................67

Figura 22 Comparação dos perfis de expressão gênica entre os animais das linhagens DBA-1/J e DBA-2/J...............................................................................................................................69

Figura 23 Comparação dos perfis de expressão gênica de ATOC tratada e não-tratada com RNAi anti-Aire em animais da linhagem DBA-2/J ....................................................................70

Figura 24 Gráfico ilustrativo do Symatlas ...................................................................................72

Figura 25 Representação da expressão gênica específica de tecidos e órgãos em timo de camundongo DBA........................................................................................................................73

Figura 26 Representação da expressão gênica específica de tecidos e órgãos em timo de camundongo DBA-2/J, durante o tratamento com RNAi anti-Aire.............................................74

Lista de tabelas

Tabela 1 Primers utilizados na amplicação por PCR, para avaliação da PGE.............................36

Tabela 2 Genes diferencialmente expressos (160) de acordo com o programa SAM em amostra

de estroma tímico comparando as linhagens DBA-1/J e DBA-2/J .....................................Anexo I

Tabela 3 Genes diferencialmente expressos (26) acordo com o programa SAM em ATOC de

animais da linhagen DBA-2/J, tratados com RNAi anti-Aire .............................................Anexo I

Lista de abreviaturas

AIRE: Autoimmune regulator

APS-1: Síndrome poliglandular auto-imune tipo I

ATOC : Adult Thymus Organ Culture

CD: Células dendríticas

cDNA: DNA complementar

cTEC: Células epiteliais corticais tímicas

DEPC: Dietil pirocarbonato

dNTP: Desoxirribonucleotídeo trifosfatado

FDR: False Discovery rate

MHC: Complexo principal de histocompatibilidade

MOPS: 3-(N-Morpholino) propanesulfonic acid

MMP: Metaloproteinases

RNAm: RNA mensageiro

mTEC: Células epiteliais medulares tímicas

pb: pares de base

PCR: Polymerase chain reaction

PGE: Promiscuous gene expression

RNAi: RNA interferente

SAM: Significance analysis of microarrays

SOURCE: Stanford online universal resource for clones and ESTs

TCR: Receptor de células T

TEC: Células epiteliais tímica

TRAs: Antígenos tecido-relacionados

UV: Ultra violeta

RESUMO E ABSTRACT

Resumo

ii

Resumo A artrite reumatóide é uma doença auto-imune sistêmica de etilogia

desconhecida, que acomete preferencialmente o sistema locomotor (articulações).

Caracterizada por um intenso processo inflamatório na sinóvia, diversas citocinas e

mediadores inflamatórios estão envolvidos, podendo causar destruição óssea e articular.

A artrite induzida por colágeno é um modelo animal amplamente utilizado por suas

características fisiopatológicas muito similares à doença em humanos. A linhagem de

camundongos DBA-1/J desenvolve a doença após imunização e booster com colágeno

do tipo II, enquanto que a linhagem DBA-2/J se mostra refratária. Isso confere um

sistema modelo de susceptibilidade/resistência à artrite, que pode ser estudado em

diferentes abordagens. O fenômeno de expressão gênica promíscua no timo (PGE), foi

caracterizado recentemente como a capacidade das células epiteliais tímicas,

especialmente as medulares (mTECs), de apresentar antígenos ectópicos tecido-

específicos aos timócitos durante seu processo de seleção intra-tímica. Assim a PGE

tem sido diretamente relacionada à tolerância central, ou seja, aos mecanismos de

discriminação do próprio-não-próprio, estabelecendo uma ligação com o complexo e

ainda não muito bem entendido processo de auto-imunidade. Estima-se que o pool de

genes promíscuos representa 5-10% de todos os genes funcionais conhecidos, e a

maioria, se não todos, os órgãos parenquimais. Grande parte destes genes parece estar

sob influência de um controlador transcricional chamado Aire (autoimmune regulator).

O gene Aire é expresso principalmente em células mTEC, e foi, no presente trabalho,

alvo de inibição utilizando-se a técnica de RNA interferente (RNAi anti-Aire) em

ATOC (Adult Thymus Organ Culture). Com o intuito de se avaliar o comportamento da

PGE no modelo de susceptibilidade/resistência à artrite, foi utilizado a tecnologia de

cDNA microarrays, que incluiu os programas de bioinformática, SAM (Significance

Analysis of Microarrays) e Cluster e TreeView, e o banco de dados Symatlas para

análise dos dados. Os resultados mostraram que a susceptibilidade a AR característica

da linhagem DBA-1/J, pode ocorrer devido às alterações da PGE, caracterizadas pela

redução da expressão de genes de antígenos relacionados a tecidos (TRAs) no timo,

incluindo aqueles do sistema locomotor. Isto poderia afetar o processo de seleção

negativa implicado num aumento de linfócitos auto-reativos na periferia. Além disto,

houve um descontrole da PGE após silenciamento parcial do transcrito do gene Aire em

ATOC utilizando-se a técnica de RNAi (RNA interferente).

Abstract

iii

Abstract Analysis of Promiscuous Gene Expression in the Thymus of DBA-1/J and DBA-2/J Mice During Imunization with Collagen: A model-system to study susceptibility/resistance to

Reumatoid Arthritis

Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease of unknown etiology,

whose clinical expression predominates in the locomotory system (joins). Characterized

by an intense inflammatory synovitis, many cytokines and inflammatory mediators are

involved causing articular and bone destruction. Collagen-induced arthritis is an animal

model widely studied due to its similarities to human disease. The DBA-1/J mouse

strain develops arthritis after immunization process and booster with Type II collagen,

and the DBA-2/J strain is refractory to the disease induction. This offers an useful

susceptibility/resistance model-system to study RA. The promiscuous gene expression

(PGE) phenomenon in the thymus was recently characterized by the capacity of thymic

epithelial cells (TECs), specially the medullary TECs, to present ectopic tissue-related

antigens (TRAs) to thymocytes during the selective process. PGE is associated to the

central tolerance process and self-non-self discrimination, establishing a link with the

complex and not yet well understood autoimmunity process. The pool of genes

promiscuously expressed is estimated to include up to 5-10% of all currently known

genes, and represent most, if not all, parenchymal tissues. A subset of promiscuously

expressed genes seems to be controlled by a transcriptional regulator called Aire

(autoimmune regulator). The Aire gene is expressed specially in mTECs, and in the

present study it was downregulated by RNA interference (RNAi) in ATOC (Adult

Thymus Organ Culture). To evaluate the possible association between PGE and

susceptibility/resistance model to RA, we used the cDNA microarrays technology,

which includes bioinformatics programs as SAM (Significance Analysis of

Microarrays), Cluster e TreeView, and the data bank Symatlas database for PGE

determinations. The results show that alterations in PGE can be associated to disease

susceptibility to the RA in DBA-1/J strain, characterized by a reduction in TRA gene

expression in the thymus including those genes coding for the locomotory system

antigens. This might affect the negative selection and consequently increase auto-

reactive T cells in the periphery. Also, the PGE representation was affected after the

partial silencing of Aire transcripts in ATOC using RNAi technique.

INTRODUÇÃO

Introdução

2

1) Introdução

1.1)Auto-imunidade

A auto-imunidade é um fenômeno caracterizado pelo estado de sensibilidade do

sistema imunológico a antígenos autólogos, podendo acarretar uma doença auto-imune

quando o mesmo responde causando lesão celular e tecidual. A possibilidade do sistema

imunológico de reagir contra esses antígenos e causar danos podem ser reconhecidos no

termo utilizado pelo Imunologista Paul Ehrlich, horror autotoxicus, do início da década

de 1900 (ABBAS & LITCHMAN, 2005).

O poder destrutivo e a complexidade do sistema imunológico necessitam da

presença de sofisticados mecanismos que regulem sua atividade. A defesa imunológica

é obtida a partir da integração de dois sistemas complementares: a resposta imune inata

e a adaptativa. Defeitos na resposta adaptativa tem sido o principal foco de pesquisas

para doenças auto-imunes (GREGERSEN et al, 2006). A discriminação próprio-não-

próprio e a regulação da auto-imunidade têm surgido como um problema central na

imunologia moderna. Atualmente há pelo menos quarenta doenças auto-imunes

conhecidas, ou que, presumivelmente estão incluídas nesta categoria, sendo que uma em

cada trinta pessoas é afetada por algum tipo de desordem auto-imune (JACOBSON et

al, 1997; HALLERT et al 2004; KOBELT et al 2006).

Doenças auto-imunes resultam da interação de três componentes: genético,

ambiental e regulação imunológica (ERMANN et al 2002) (Figura 1).

Um aspecto característico das doenças auto-imunes é a seleção de um tipo celular

simples, órgão ou tecido por uma determinada população de células T auto-reativas ou

células B. A classificação mais comum referente às doenças auto-imunes baseia-se nos

mecanismos imunológicos que levam à auto-imunidade e aos diferentes tipos de

antígenos envolvidos neste processo. As respostas imunes contra antígenos amplamente

disseminados e a formação de complexos auto-imunes resultam tipicamente em doenças

sistêmicas. Em contraste respostas auto-imunes contra antígenos com distribuições

tissulares restritas provocam lesões órgão-específicas ou tecido-específicas.

Introdução

3

Figura 1. Fatores envolvidos no desenvolvimento de doenças auto-imunes. O meio ambiente é capaz de induzir auto-imunidade em indivíduos geneticamente susceptíveis sob condições de desrregulação imunológica.

Fatores de risco genético

Desde os mais antigos estudos de pacientes com desordens auto-imunes, sabe-se

que algumas destas doenças aparecem em famílias, o que sugere uma susceptibilidade

genética (ORTONNE, 1999; KUKREJA & MACLAREN, 1999). Estudos

epidemiológicos têm demonstrado que fatores genéticos são determinantes na

predisposição a uma doença auto-imune. Genes de susceptibilidade para a auto-

imunidade podem atuar determinando o tecido e a especificidade da doença, através do

direcionamento da resposta para auto-antígenos particulares. Devido a sua

complexidade, essas doenças envolvem muitos genes, porém apenas uma parte deles,

envolvidos em mecanismos patogênicos, são atualmente conhecidos.

Um cluster gênico que se destaca em definir a susceptibilidade genética a

doenças auto-imunes e apresenta loci gênicos altamente polimórficos é aquele que

codifica para as moléculas do Complexo principal de histocompatibilidade (MHC -

Major histocompatibility gene complex). O MHC foi descoberto como um locus que

determinava o resultado de transplantes de órgãos entre indivíduos diferentes. Os loci

das classes I e II codificam grupos de proteínas estruturalmente distintas, porém

homólogas (Figura 2), sendo as moléculas MHC da classe I reconhecidas pelas células

T CD8+, enquanto as moléculas da classe II pelas células T CD4+.

Doença auto-imune

AmbienteRegulação imunológica

Genes

Introdução

4

Figura 2. Mapas esquemáticos dos loci do MHC humano e de camundongos. Os tamanhos dos genes e das seqüências intervenientes não estão em escala. O locus MHC III se refere aos genes que codificam moléculas diferentes das moléculas que apresentam peptídeos; esse termo não é usado normalmente.

As moléculas do MHC humano são chamadas de antígeno leucocitário

humano (HLA) e são equivalentes às moléculas chamadas de histocompatibilidade-2

(H2) no camundongo. Hoje se sabe que essas moléculas são essenciais para o

funcionamento normal da resposta adaptativa devido ao seu papel na apresentação de

antígenos para as células T. Sua diversidade excede o de qualquer outra família de

proteínas, o que confere as diferenças individuais de respostas imunológicas. Essas

moléculas possuem algumas características estruturais comuns, que são críticas para que

desempenhem seu papel, e são elas: uma fenda extracelular que liga os peptídeos,

seguida de um par de domínios semelhantes ao de imunoglobulinas, e está ancorada a

membrana celular por meio de domínios trans-membrana e citoplasmáticos (ABBAS &

LITCHMAN, 2005) (Figura 3). Uma associação entre os produtos MHC e doenças

auto-imunes tem sido descrita a mais de 20 anos.

Introdução

5

Figura 3. Resíduos polimórficos de uma molécula MHC. Os resíduos polimórficos das moléculas MHC das classes I e II (exibidos como círculos vermelhos) estão localizados nas fendas de ligação de peptídeos nas α-hélices em torno de cada fenda. Na molécula da classe II aqui exibida (HLA-DR) praticamente todo polimorfismo se encontra na cadeia β. Entretanto, outras moléculas mostram graus variáveis de polimorfismo na cadeia α e geralmente muito mais na cadeia β.

Fatores de risco ambiental

Agentes ambientais podem causar a auto-imunidade, mas apenas quando

associados a fatores genéticos. Desta forma, ambos afetam a susceptibilidade à auto-

imunidade em três níveis: a reatividade total do sistema imune, o antígeno específico e

sua apresentação, e o tecido alvo (MARRACK et al, 2001). Os fatores ambientais

ganharam importância após a análise de que gêmeos idênticos apresentavam diferenças

quanto à predisposição genética a doenças auto-imunes. Esses fatores referem-se

principalmente à exposição do organismo a agentes patogênicos, que podem resultar em

reação cruzada, sendo então responsáveis pela ativação de linfócitos T auto-reativos

encontrados normalmente na periferia. Na maior parte destas doenças, o microrganismo

infeccioso não está presente nas lesões auto-imunes, não sendo detectável à medida que

se desenvolve a auto-imunidade. Portanto, as lesões não se devem ao próprio agente

Introdução

6

infeccioso, mas resultam das respostas imunes do hospedeiro. Muitos estudos têm

sido realizados nesta área, pois em muitas doenças auto-imunes a etiologia permanece

desconhecida (ABBAS & LITCHMAN, 2005; ERMANN et al 2002).

Outros fatores que podem ser citados quanto ao envolvimento no processo de

auto-imunidade são: alterações anatômicas, como inflamação, lesão isquêmica ou

trauma, que podem levar a exposição de antígenos próprios que normalmente ficam

ocultos, e influências hormonais (ABBAS & LITCHMAN, 2005).

Tolerância e auto-imunidade

Uma das propriedades mais notáveis do sistema imunológico é a capacidade de

distinguir antígenos próprios de antígenos estranhos, não respondendo em condições

normais aos antígenos próprios, determinando uma tolerância imunológica que impede

este ataque. Durante uma resposta auto-imune esta distinção é perdida resultando em

inflamação e destruição tecidual.

Essa tolerância imunológica é estabelecida em dois níveis, sendo que

inicialmente ocorre o desenvolvimento da tolerância central, e posteriormente observa-

se o processo de tolerância periférica. Muitas das doenças auto-imunes parecem ser

resultados de falha na tolerância central, que envolve o processo de seleção tímica dos

linfócitos, onde diferenças quantitativas de expressão de antígenos e/ou a resposta dos

linfócitos a eles podem afetar esse mecanismo, culminando com reações descontroladas

na periferia.

A resposta imune específica e a resposta auto-imune envolvem uma série de

eventos imunológicos e foi verificado que os mesmos elementos participam destas

respostas: um antígeno (ou auto-antígeno), resposta por interação de famílias ou sub-

grupos de células, incluindo células apresentadoras de antígeno, linfócitos T e B,

moléculas mensageiras, citocinas, quimiocinas e seus receptores, além de moléculas de

sinalização e co-estimulatórias nas superfícies celulares. Um aspecto de grande

importância envolve falhas na expressão de moléculas co-estimulatórias por outras

células, no momento da interação com os linfócitos T, fundamentais para os processos

de sinalização e ativação (ABBAS & LITCHMAN, 2005; LISTON et al 2005).

Introdução

7

1.2) Artrite reumatóide

A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crônica sistêmica, de

etiologia ainda desconhecida, que apresenta uma ampla distribuição mundial e acomete

todos os grupos étnicos, estimando-se que atinja aproximadamente 1,5% da população

dos Estados Unidos. As mulheres são afetadas cerca de três vezes mais em relação aos

homens, e apesar da doença atingir qualquer idade, sua incidência aumenta em

indivíduos idosos (DANIEL J.MCCARTY,1989). Caracterizada por um intenso

processo inflamatório na sinóvia, deposição de fibrina, hiperplasia de células sinoviais,

infiltrados mononucleares, formação de pannus e eventual anquilose em uma ou mais

articulações, as pequenas articulações de mãos e pés são preferencialmente afetadas

(KOOPMAN et al 2001). A produção exacerbada de citocinas e mediadores

inflamatórios, entre eles interleucinas 1 e 6 (IL-1, IL-6), TNF-α, metaloproteinases

(MMP) relacionadas à manutenção da matriz extracelular, resultam em destruição de

cartilagem e ossos (AREND et al 2001; KOTZIN et al 1998; YAMAMURA et al 2001;

FELDMANN et al 1996). Tipicamente, pacientes com AR exibem manifestações

sistêmicas, como produção de auto-anticorpos denominados fatores reumatóides;

nódulos reumatóides, a lesão cutânea mais comum; vasculite, uma complicação que

pode afetar muitos órgãos vitais causada por uma endoartrite obliterativa; entre outros

(MUSTILA et al 2000; GORONZY et al 1995).

A contribuição genética da AR pode ser evidenciada pela associação da doença a

alguns dos produtos gênicos provenientes de certas classes de MHC de classe II, mais

precisamente, a molécula HLA-DR. O conjunto de alelos do MHC presentes em cada

cromossomo é chamado de haplótipo MHC, e pacientes que são homozigotos

apresentam um maior número de manifestações extra-articulares, incluindo uma maior

destruição articular quando comparados aqueles que apresentam apenas um alelo

(LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKING, 1999). A relação entre esses produtos e a

doença parece estar associada à epítopos específicos na região da fenda, fenômeno

chamado de “epítopo compartilhado” (GREGERSEN et al 1987) .

Entre os leucócitos recrutados para as articulações, as células T, particularmente

as TCD4+ auxiliares, apresentam um papel central no desenvolvimento da doença. Isso

pode ser evidenciado pelo alto número dessas células ativadas na circulação periférica

de pacientes, bem como sua abundância na sinóvia.

Introdução

8

Na AR essa resposta celular apresenta uma tendência ao padrão TH1,

caracterizado pela liberação das citocinas pró-inflamatórias descritas acima

(LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKING, 1999). Experimentos murinos demonstraram

que células TCD4+ auxiliares naive podem se diferenciar em quatro diferentes tipos de

células T, chamadas TH1, TH2, TH17 e Treg. Essas células são induzidas a se

comprometer a uma linhagem particular baseadas no tipo de estimulação, concentração

de antígeno, co-estimulação e citocinas encontrados no meio (CONSTANT et al 1997).

As células TH17 descobertas recentemente como um novo padrão de células T,

secretoras de interleucina 17 (IL-17), têm sido relacionadas a muitos processos

inflamatórios (FOSSIEZ et al 1996). Muitas pesquisas têm evidenciado o papel da IL-

17 na patogênese da AR, devido aos elevados níveis desta citocina encontrado na

sinóvia (MIOSSEC et al 2003; KOTAKE et al 1999; HWANG et al 2005), que devido

ao seu papel pró-inflamatório, patologicamente pode ativar e aumentar os mecanismos

de injúria tecidual descritas previamente. Em particular a IL-17 up-regula e/ou atua de

forma sinérgica com mediadores inflamatórios locais como IL-6, IL-1β e TNF-α, óxido

nítrico, bem como promove destruição da matriz extracelular através da estimulação e

produção de MMP, e inibição dos componentes de reparo (CHABAUD et al 1998,

2000; KATZ et al 2001; LEGRAND et al 2001; LUBBERTS et al 2000; JOVANOVIC

et al 2000, 2001; CHEVREL et al 2002).

Como grande parte das doenças auto-imunes, muitas das evidências encontradas

são referentes à utilização de modelos animais. A artrite induzida por colágeno (CIA –

Collagen-induced arthritis) foi relatada pela primeira vez por Trentham e colaboradores,

que observaram a doença em ratos após uma injeção intradérmica de colágeno do tipo II

somado a adjuvante completo de Freud. Estudos posteriores demonstraram que uma

patologia similar poderia ser induzida em primatas e linhagens de camundongo

susceptíveis. Esse modelo tem sido amplamente utilizado por apresentar características

similares a AR, como deposição de fibrina, hiperplasia de células sinoviais, infiltração

mononuclear, formação de pannus, destruição óssea e cartilaginosa, presença de fatores

reumatóides e manifestações sistêmicas (HOLMDAHL et al 1989; SVENSSON et al

1998; BURKHARDT et al 1991; TERATO et al 1992), além da susceptibilidade

claramente associada à expressão de genes específicos de MHC de classe II.

Camundongos, como o DBA-1/J, que apresentam o haplótipo H-2q são susceptíveis a

doença (WOOLEY et al 1981; BRUNSBERG et al 1994), o que já não ocorre com

Introdução

9

outras linhagens, entre elas a DBA-2/J, que se mostra resistente mesmo quando exposta

ao mesmo tratamento.

A CIA representa uma doença imunológica multifacetada que envolve células T,

B, além das células inflamatórias que infiltram as articulações. Muitos estudos

relacionam células TCD4+ auto-reativas para o colágeno II como principais mediadoras

da indução de artrite. A habilidade de indução de uma artrite crônica com a utilização de

colágeno indica que pelo menos alguns desses linfócitos auto-reativos são produtos de

uma falha de deleção tímica, ou do processo de tolerância periférica (HOLMDAHL et

al 1990; WOOLEY et al 1981; SEKI et al 1988). Isso pode ser comprovado através de

trabalhos que demonstram prevenção da doença através da depleção dessas células auto-

reativas (ZHANG et al 2002), a partir do qual podemos então concluir que falhas nos

processos de tolerância central são pontos importantes a serem estudados.

1.3) Caracterização do timo

A primeira descrição do timo foi feita pelo italiano Jacopo Berengario,

no século 15. É um órgão linfóide primário formado por dois lobos (direito e esquerdo),

sendo ambos divididos em múltiplos lóbulos por septos fibrosos. Anatomicamente, cada

lóbulo é composto de uma região cortical mais externa, e uma região medular mais

interna (Figura 4).

O timo deriva de invaginações do ectoderma no pescoço e tórax do embrião em

desenvolvimento que formam estruturas chamadas de arcos branquiais (ABBAS &

LITCHMAN, 2005). Situado na região do mediastino anterior, é o local onde os

precursores de células T, chamados de timócitos, sofrem maturação e adquirem sua

competência funcional podendo assim exercer sua função na periferia. Este órgão tem

um suprimento vascular abundante e vasos linfáticos eferentes que drenam para os

linfonodos do mediastino (VAN EWIJK et al 1991; GRAY et al 2002; ABBAS &

LITCHMAN, 2005).

No camundongo o timo inicialmente se desenvolve a partir da terceira bolsa

faringeal, por volta dos dias 10-11 do período embrionário, período que possibilita a

detecção morfológica de um epitélio rudimentar (MANLEY et al 2000).

Introdução

10

Figura 4. Morfologia do timo. Microscopia óptica de um lobo do timo mostrando o córtex e a medula. As células coradas de azul são células T em desenvolvimento chamadas timócitos.

Recentemente surgiram evidências da presença de um segundo timo, chamado

cervical, em algumas linhagens de camundongos, que se desenvolve após o

nascimento, tendo o mesmo tamanho de um linfonodo (GRZEGORZ et al 2006). Essa

descoberta pode mudar todo nosso conhecimento a cerca deste órgão, porém muitos

estudos ainda deverão ser realizados a fim de se chegar a conclusões definitivas.

É bem estabelecido que o fator transcricional FoxN1 tem um papel essencial no

desenvolvimento tímico, bem como na formação de um microambiente epitelial

funcional (NEHLS et al 1996; BLACKBURN et al 1996; BOEHM et al 2003). Com

relação à origem desse epitélio, estudos histológicos e diversas evidências sugerem que

todas as células epiteliais tímicas são originárias da endoderme (MANLEY et al 2003;

GORDON et al 2004). Células epiteliais maduras no timo adulto podem ser

caracterizadas por expressão diferencial de queratinas, e divididas em células epiteliais

tímicas medulares (mTECs – medullary thymic epithelial cells), que são

predominantemente K5+K8-, e células epiteliais tímicas corticais (cTECs - cortical

thymic epithelial cells), K5-K8+. No início do desenvolvimento tímico essas células são

duplo-positivas para os marcadores de queratinas citados acima, o que sugeriu além da

origem, também um precursor comum (GILL et al 2002; BENNETT et al 2002; KLUG

et al 2002). Apesar de evidências encontradas em estudos de timos embrionários, não há

evidências da existência destes precursores no timo adulto.

Introdução

11

Os progenitores linfóides entram no timo adulto pela junção córtico-

medular e então migram para a região subcapsular antes, porém, retornando pelo córtex

em direção a medula (ANDERSON & JENKINSON, 2001). Uma vez que os timócitos

entram no timo, seu contato com o estroma tímico; composto essencialmente de células

epiteliais (TECs), fibroblastos reticulares, células dendríticas e macrófagos derivados da

medula óssea, além de estruturas conhecidas como corpúsculos de Hassal, localizados

especificamente na medula tímica e composto de espirais compactas de células

epiteliais remanescentes de células em degeneração (VAN EWIJK et al 1991; GRAY et

al 2002) (Figura 5); guia sua maturação. Isso ocorre mesmo durante os estágios de

desenvolvimento tímico mostrando que o microambiente é capaz de promover a

maturação de timócitos e simultaneamente dar continuidade ao seu próprio programa de

desenvolvimento. Esse processo ocorre devido à presença de mediadores importantes

como a interleucina 7 (IL-7) e os ligantes Notch (ZAMISCH et al 2005; HARMAN et

al 2005).

Figura 5. Esquema representativo da estrutura do timo e de todos os seus componentes celulares. (Extraído e modificado de Human Embriology - http://www.embryology.ch/anglais/qblood/lymphat03.html).

Introdução

12

Além da maturação de timócitos, essa interação com o estroma é de fundamental

importância também na organização do microambiente tímico, modelo chamado de

”crosstalk tímico” (VAN EWIJK et al 1999; VAN EWIJK et al 1994; GERMERAARD

et al 2003; VAN EWIJK et al 2000).

O processo de maturação dos linfócitos consiste numa complexa seqüência de

eventos biológicos, compreendendo a proliferação das linhagens celulares precursoras, a

expressão diferencial de proteínas de membrana, rearranjos gênicos do receptor de

antígeno, a seleção do repertório de linfócitos maduros, e conseqüente morte celular

programada dos linfócitos não selecionados e finalmente a migração celular. Durante

cada um desses estágios, as células sofrem significativas mudanças celulares e genéticas

(ABBAS & LITCHMAN, 2005). Na região cortical é possível encontrar uma grande

densidade de timócitos imaturos e cTECs fornecendo o microambiente necessário para

o processo de seleção positiva, que promove a sobrevivência e expansão de timócitos

restritos ao MHC próprio; enquanto que a região medular é caracterizada por grande

quantidade de células T já maduras e mTECs, local de ocorrência do evento de seleção

negativa, responsável pela eliminação dos timócitos capazes de reconhecerem peptídeos

próprios com grande avidez (ABBAS & LITCHMAN, 2005).

Os timócitos imaturos corticais recém-chegados ao timo contêm os genes de

seus receptores (TCRs-T cell receptor) na configuração germinativa e, portanto, ainda

não expressam o TCR, CD3, as cadeias ζ e os co-receptores CD4 e CD8. Essas células

são chamadas de timócitos duplo-negativos (DN) e se submetem a múltiplos ciclos de

proliferação e de progresso, aproximadamente 5% do total de timócitos, com discretos

passos de maturação distinguidos pela expressão de marcadores de superfície celular

CD44highCD25- (DN1), CD44highCD25+ (DN2), CD44lowCD25+ (DN3), e

CD44lowCD25- (DN4). As proteínas do complexo recombinase (Rag-1 e Rag-2) são

expressas pela primeira vez nesse estágio, e os rearranjos V(D)J se iniciam. Durante a

transição da fase DN para duplo-positiva CD4+CD8+ (DP), aproximadamente 85% dos

timócitos se redistribuem à região cortical (RAMIALISON et al., 2002). O rearranjo

dos genes da cadeia α e a expressão do heterodímero TCR αβ ocorrem na população

CD4+CD8+, exatamente antes ou durante a migração dos timócitos do córtex para a

medula (Figura 6).

Introdução

13

Figura 6. Estrutura e função do timo. Dividido em duas regiões, córtex e medula, povoados por diferentes subtipos celulares epiteliais tímicos (TECs). Nos adultos, os precursores de células T entram no timo pela junção cortico-medular, e começam então um programa altamente complexo de diferenciação, o qual está ligado à migração através do estroma tímico. Os subtipos diferentes de timócitos são encontrados conseqüentemente em regiões espacialmente restritas do timo. O córtex tímico foi separado em quatro regiões: Região 1, junção cortico-medular, local de entrada dos precursores de células T; Região 2, células diferenciadas em DN2 as quais se submetem a expansão clonal proliferativa; Região 3, inicia-se os rearranjos V(D)J dos genes TRs em células no estágio DN3; Região 4, transição de DN para o estado de DP (CD4+CD8+). Células DP migram do córtex para a medula tímica, onde se diferenciam em simples positivas (SP CD4+ ou CD8+). A seleção positiva ocorre no córtex entre as TECs corticais (cTECs), e a seleção negativa ocorre principalmente na medula, entre as TECs medulares (mTECs) e células dendríticas (DCs). Células SP que completaram o programa de diferenciação saem da medula tímica em direção a periferia. [Extraído e modificado de Blackburn & Manley, 2004].

Introdução

14

A recombinação V(D)J dos receptores de células T é um evento molecular

essencial na maturação destas células. É um processo de recombinação sítio específica

da molécula de DNA que só ocorre nos estágios inicias de desenvolvimento dos

linfócitos T e B. A geração de grande diversidade nas regiões variáveis do receptor de

antígeno de linfócitos T é crucial para que os organismos possam reconhecer e

responder contra, virtualmente, todo e qualquer antígeno estranho. As primeiras células

que expressam os TCRs estão no córtex tímico, e essa expressão é baixa em comparação

com a célula T madura. Em virtude da expressão de seus complexos TCR completos, as

células duplo-positivas podem responder ao antígeno e ficam sujeitas à seleção positiva e

negativa. A maioria das células DP, as quais constituem cerca de 80% daquela população,

morre por negligência porque não reconhecem moléculas disponíveis de MHC expressas

por células estromais tímicas (ABBAS & LITCHMAN, 2005; SAVINO, 2006).

As células que passam com sucesso pelos processos de seleção amadurecem em

células T CD4+ ou CD8+ e são chamadas de timócitos simples positivos (SP), e

compreendem aproximadamente 10% dos timócitos no timo (Ramialison et al., 2002).

Assim, os estágios de maturação das células T podem ser rapidamente distinguidos pela

análise da expressão das moléculas CD4 e CD8. Essa maturação fenotípica é acompanhada

da maturação funcional (ABBAS & LITCHMAN, 2005).

Finalmente, os timócitos maduros com positividade única (células T CD4 e CD8

restritas ao MHC) entram na medula do timo e deixam esse órgão pelos vasos

sanguíneos para colonizar os tecidos linfóides periféricos (HAKS et al., 1998). Apenas

15% dos timócitos que vivem no timo nesta fase vão formar a maioria do repertório de

células T periféricas (SAVINO, 2006).

Um aspecto importante para se entender os mecanismos por trás do

processo de seleção está no reconhecimento das células envolvidas no processo. No

timo, as TECs, juntamente com as células dendríticas derivadas da medula óssea,

expressam moléculas de MHC das classes I e II. Estudos das moléculas de expressão

em TECs demonstraram um grupo bastante heterogêneo, principalmente no que se

refere à sub-população de mTECs. De maneira geral elas se caracterizam por serem

EpCAM+, MHC-II+, e CD45-, e são ótimas apresentadoras de antígeno (GRAY et al

2002, 2006). As células epiteliais tímicas são os componentes celulares principais do

microambiente tímico, e influenciam diferentes aspectos da diferenciação dos timócitos:

Introdução

15

vias de interações célula-célula e secreções de fatores solúveis, tais como os hormônios

tímicos timulina (thymulin), timopoetina (thymopoietin) e timosina- α1 (thymosin-α1)

(SAVINO, 2006).

Dados recentes mostram que o hormônio do crescimento (GH) modula

pleiotropicamente funções tímicas como, por exemplo, aumenta a proliferação de

timócitos e de células epiteliais tímicas (SAVINO, 2007).

Um complexo linfoepitelial localizado corticalmente no timo, as células “nurse”

tímicas (TNC), são estruturas multicelulares linfoepiteliais formadas por uma célula

epitelial tímica (TEC) que abriga 20-200 timócitos, carregando primeiramente o

fenótipo duplo-positivo CD4/CD8, embora timócitos imaturos duplo negativos, bem

como, células maduras simples positivas também possam ser encontradas. TNCs criam

provavelmente um microambiente especial para a diferenciação e/ou proliferação dos

timócitos, com timócitos sendo expostos aos antígenos do complexo principal de

histocompatibilidade (MHC) e aos hormônios tímicos. Tal diferenciação ocorre em

paralelo com a migração da célula dentro e fora do complexo (SAVINO, 2006).

O mesênquima tímico, derivado da crista neural, também pode ser capaz de

influenciar diretamente o desenvolvimento dos precursores de células T CD4-8- por

apresentação de fatores de crescimento solúveis sobre componentes da matriz

extracelular (ECM). Além de influenciar o desenvolvimento das células epiteliais

tímicas imaturas, e assim ter um papel direto no estabelecimento do microambiente

tímico (JENKINSON et al., 2003).

O processo de seleção e a maturação do repertório de células T são de grande

importância, pois induzem a tolerância dessas células ao que é próprio. A aquisição

dessa tolerância é dependente da interação entre receptor de célula T (TCR-T-cell

receptor) e ligantes peptídeos-MHC próprios. Logo a diversidade de antígenos próprios

acessível a esse repertório no timo é quem vai determinar a extensão e especificidade

dessas células (KLEIN et al 2000).

Introdução

16

1.4) Caracterização da expressão promíscua no timo

A área de tolerância central tem sido recentemente revisada, e um acúmulo de

evidências mostram a expressão de antígenos-tecido específicos (TRAs – Tissue-related

antigens) no timo, e sua participação na seleção do repertório de células T. A interação

entre células estromais e linfóides dentro do microambiente tímico é um fator crítico

para formar a correta especificidade antigênica do repertório de células T, assim como

para capacitá-lo a responder à apresentação de antígenos estranhos pelas moléculas de

MHC e não responder a antígenos próprios (BARTHLOTT et al., 2006).

À expressão de TRAs é uma propriedade fisiológica das TECs, particularmente

de uma subpopulação de mTECs que expressa altas concentrações de MHC-II na

membrana, sendo é um fenômeno conhecido como Expressão Gênica Promíscua (PGE)

(DERBINSKI et al 2001; GOTTER et al 2004).

Apesar de inicialmente se suspeitar que essa “promiscuidade” se referia apenas a

antígenos de reações imunológicas autodestrutivas, trabalhos demonstraram que esse

pool de genes é muito mais amplo (KYEWSKI et al 2002). Através de análise gênica

utilizando-se técnicas de arrays, os genes relacionados à PGE não são dependentes de

sexo ou período embrionário, assim antígenos fetais continuam a ser expresso;

antígenos específicos de um determinado sexo são expressos pelo outro; além de se

encontrar expressão de antígenos abundantes na circulação, como exemplo a proteína

do complemento C5 (MATZINGER et al 1994; VOLKMANN et al 1997). Esse pool de

genes representa a maioria, senão todos os órgãos parênquimais, e é estimado que inclua

cerca de 5-10% de todos os genes conhecidos, persistindo enquanto as células T

passarem pelo timo, inclusive após o processo de involução (KYEWSKI et al 2004;

DERBINSKI et al 2001) (Figura 7). A involução alométrica do timo inicia-se pouco

antes do nascimento e a involução absoluta ocorre na puberdade, entretanto o timo

adulto continua a receber células precursoras, vindas da medula óssea e a lançar células

colonizadoras das áreas T periféricas (BODEY et al., 1997). Esse fenômeno é

conhecido e freqüentemente associado à idade, sendo caracterizado pela substituição do

estroma tímico por tecido adiposo (ENCARNACION et al 2005). Portanto neste

processo há uma perda considerável de TECs, e conseqüente redução do processo de

seleção. Diversos esforços têm sido realizados para melhor se entender esse processo,

na tentativa de reverter esse quadro, e recuperar o repertório de células T perdido, por

Introdução

17

exemplo, por pacientes imunossuprimidos. Em camundongos o stress, processos de

imunização, além de imunodeficiência e o fator idade são responsáveis por um processo

de involução acentuado do órgão, que inclusive dificulta a sua localização (KUPER et

al 1995).

Figura 7. Diversos tecidos são representados pela expressão promíscua nas células medulares epiteliais tímicas (mTECs). Genes expressos em mTECs de camundongo, comparados as TECs corticais utilizando-se análise por chip, são relacionados aos tecidos de acordo com sua expressão predominante obtidas de bancos de dados públicos GNF Gene Expression Atlas e Swissprot somados a literatura.Cerca de um quarto dos genes expressos por todas as mTECs podem ser classificados como tecido-específicos e são apresentados no gráfico. A fração de genes tecido-específicos é provavelmente superestimada dado os baixos níveis de expressão nas mTECs, e a sensibilidade limitada da técnica de array. (Extraído de Kyewski & Derbinski, 2004).

Intestino

Placenta

Próstata

Músculo esquelético

Útero

Bexiga

Embrião

Olho

Tecido Gorduroso

Vesícula biliar

Oócito/zigoto

Paratireóide

Cérebro Fígado

Outros

EpidermeTireóide

Glândula mamáriaRim

Leucócitos

CoraçãoLíngua

Estômago

Testículos

Glândula salivar Pâncreas

Pulmão

Eritrócitos

Cordão umbilicalMedula ósseaEndotélio

Ameloblastos

Placenta

Próstata

Músculo esquelético

Útero

Bexiga

Embrião

Olho

Tecido Gorduroso

Vesícula biliar

Oócito / zigoto

Paratireóide

Intestino

Placenta

Próstata

Músculo esquelético

Útero

Bexiga

Embrião

Olho

Tecido Gorduroso

Vesícula biliar

Oócito/zigoto

Paratireóide

Cérebro Fígado

Outros

EpidermeTireóide

Glândula mamáriaRim

Leucócitos

CoraçãoLíngua

Estômago

Testículos

Glândula salivar Pâncreas

Pulmão

Eritrócitos

Cordão umbilicalMedula ósseaEndotélio

Ameloblastos

Placenta

Próstata

Músculo esquelético

Útero

Bexiga

Embrião

Olho

Tecido Gorduroso

Vesícula biliar

Oócito / zigoto

Paratireóide

Placenta

Próstata

Músculo esquelético

Útero

Bexiga

Embrião

Olho

Tecido Gorduroso

Vesícula biliar

Oócito / zigoto

Paratireóide

Introdução

18

Vários modelos foram desenvolvidos para explicar o comprometimento das

TECs em expressar antígenos de outros tecidos. O mais aceito é chamado modelo

alternativo terminal de diferenciação e propõem que a expressão de TRAs seria uma

propriedade autônoma dessas células, onde o processo terminal de maturação em cTECs

ou mTECs levaria a um “relaxamento” dos controles de expressão gênica, que

permitiriam então a expressão de antígenos de outros tecidos de forma arbitrária. Esse

modelo sugere então que a PGE é parte do programa de diferenciação, principalmente

das mTECs, sub-população responsável pela expressão da maior diversidade desses

antígenos (KYEWSKI et al 2004). Somado a isso, as TECs formam um epitélio

estratificado similar ao da pele (BOEHM et al 2003; ALONSO et al 2003; BOOTH et

al 2000), que está em continuo processo de renovação (turnover). Esse processo ocorre

continuamente em um período de três a quatro semanas, e juntamente com o processo

que envolve as células dendríticas, que leva cerca de duas semanas, demonstram um

compartimento altamente dinâmico, que não altera o espectro de antígenos expressos

(KAMATH et al 2002).

Entretanto o ponto mais importante é a relação entre PGE e o processo de

tolerância. Duas propostas tentam explicar a indução de tolerância na população de

células T. A primeira delas sugere que após a entrada no timo, os timócitos são capazes

de “varrer” as células estromais por muitos dias o que faria com que essas células

fossem capazes de encontrar cerca de 20% de todas as mTECs, e isso já seria suficiente

para que elas entrassem em contato com todo o pool de genes expressos

promiscuamente (KLEIN et al 2000; SCOLLAY et al 1995). Essa proposta seria

favorecida pela localização dessas células na região cortico-medular, e pela expressão

de citocinas (AVICHEZER et al 2003; KLEIN et al 2001; BLEUL et al 2000;

ANNUNZIATO et al 2001; KWAN et al 2004). A segunda proposta por sua vez,

propõe que os TRAs poderiam ser secretados e capturados por células apresentadoras de

antígeno vizinhas, principalmente células dendríticas, que apresentariam esses antígenos

de maneira cruzada aos timócitos. Esse mecanismo seria capaz aumentar a

disponibilidade de TRAs expressos no timo, bem como a eficácia do encontro com os

timócitos (ZHANG et al 2003). Apesar da possibilidade de ocorrência de ambas as

propostas, estudos deverão ser realizados para obtenção de informações conclusivas,

porém fica evidenciada a alta probabilidade do encontro dos timócitos com os TRAs.

Introdução

19

1.5) Papel regulador do gene Aire

A descoberta do gene AIRE (autoimmune regulator) foi possibilitada com o

estudo de pacientes que possuíam uma doença autossômica recessiva rara conhecida

como Síndrome poliglandular auto-imune tipo I (APS-1). Pacientes com o gene mutado

desenvolvem uma doença auto-imune espontânea que afeta primariamente órgãos

endócrinos como tireóide, adrenais, ovários, entre outros (PERHEENTUPA et al 2002).

Caracterizada por uma herança monogenética recessiva, essa síndrome estimulou

buscas que culminaram com o mapeamento e posição clonal de um gene denominado

AIRE (No authors listed 1997; NAGAMINE et al 1997). O gene, localizado no

cromossomo 21q22.3, codifica uma proteína de 545 aminoácidos expressa

principalmente no timo, e em menor extensão nos linfonodos, além de ter sido

encontrado em alguns outros tecidos (BLECHSCHMIDT et al 2000; ZUKLYS et al

1983; ANDERSON et al 2002; HALONEN et al 2001; ADAMSON et al 2004). No

timo, estudos demonstraram que sua presença é restrita as mTECs e células dendríticas

(ANDERSON et al 2002; GOTTER et al 2004), e revelam que sua função está

relacionada ao controle da transcrição de um grande número de TRAs (ANDERSON et

al 2002, 2005). Uma parte dos transcritos de TRAs, porém parecem ser independentes

da expressão de Aire (DERBINSKI et al 2005), e este gene também regula positiva e

negativamente a transcrição de uma gama de genes nas TECs, que não codificam para

TRAs. O significado deste controle no timo foi observado em estudos com animais

Aire-knockout, onde a ausência desse gene promove o aparecimento de auto-anticorpos,

especialmente para o olho e o estômago (DEVOSS et al 2006; GAVANESCU et al

2007), sendo suficiente para causar auto-imunidade. A partir destes resultados

estabeleceu-se uma relação deste controle e o fenômeno de tolerância, que poderia estar

interferindo no processo de deleção clonal, levando a um escape de linfócitos T auto-

reativos (ANDERSON et al 2005; LISTON et al 2003, 2004).

A proteína codificada pelo gene Aire mostra muitas das características

encontradas nos fatores de transcrição, compartilhando muitos domínios com os

conhecidos controladores transcricionais, além de sua localização nuclear observada em

TECs (HEINO et al 2000; AKIYOSHI et al 2004). Um exemplo é o domínio SAND,

homólogo a domínios de ligação de DNA da família SP100 (BOTTOMLEY et al 200;

ISAAC et al 2006), e motivos PHD (BIENZ et al 2006). Apesar de o Aire ser retratado

Introdução

20

de forma similar, alguns pontos o distingue dos fatores transcricionais convencionais,

pois seu efeito é parcial e parte dos TRAs não é afetado por ele. Além disso, há

dificuldades em prever um local de ligação que ocorra em milhares de promotores, além

de sua especificidade, na qual já foi demonstrada a ausência de alguns aminoácidos

importantes para ligação ao DNA (GIBSON et al 1998; PUROHIT et al 2005; KUMAR

et al 2001). Recentemente dados ainda não publicados mostraram diferenças nos sítios

promotores dos TRAs, quando comparados aos genes expressos do próprio tecido.

Pesquisas demonstraram que os genes afetados pelo Aire se encontram clusterizados

(JOHNNIDIS et al 2005), e o efeito sobre esses genes tendem a ser heterogêneo, o que

descarta uma explicação simplista do modo de ação desta proteína. Alguns estudos

propõem o Aire como um modificador transcricional epigenético, que seria capaz de

modificar outros fatores nucleares, aumentando sua ação, ou mesmo promovendo sua

degradação (UCHIDA et al 2004). Apesar da grande quantidade de estudos, os dados se

mostram ainda muito controversos, o que deixa claro a importância de pesquisas acerca

desta importante proteína.

1.6) Análise do transcriptoma

1.6.1 Conceito de transcriptoma

Em analogia ao termo genoma o qual se refere ao conjunto de genes de uma

determinada espécie, criou-se o termo transcriptoma para se referir ao conjunto de

RNAs, ou seja, os transcritos de uma célula num dado momento de seu ciclo. Como são

os RNAm os responsáveis pela codificação da síntese de proteínas e, portanto, os mais

importantes no estudo da expressão do genoma, geralmente entende-se que o

transcriptoma é o conjunto dos RNAm. Mas é oportuno lembrar que tanto os RNAs

transportadores (RNAt) e os RNAs ribossômicos (RNAr) devem ser incluídos no

conceito do transcriptoma apesar de não serem codificadores de proteínas.

Recentemente foram incluídos os microRNAs no conceito de transcriptoma por

representarem uma classe distinta de RNAs que controlam a expressão gênica ao nível da

síntese e/ou degradação dos RNAm (SEVIGNANI et al., 2006).

Introdução

21

Durante todo o processo de diferenciação celular e tecidual, um conjunto

diversificado de proteínas é mobilizado como resultado da expressão diferencial dos

respectivos genes. Portanto, pode-se dizer que durante o desenvolvimento o primeiro

ponto de controle molecular é a expressão gênica ao nível do conjunto de RNAm,

definido como transcriptoma. Sabe-se hoje que o transcriptoma das células e tecidos é

reflexo da razão entre a biossíntese de RNAm (transcrição) e sua degradação, muitas

vezes causada pelos microRNAs (SEVIGNANI et al., 2006).

Além disso, o transcriptoma é variável entre os diferentes tipos de células,

tecidos e órgãos de um dado indivíduo, sendo que as próprias condições fisiológicas

normais, como as diferentes fases do ciclo celular, ou patológica, como por exemplo,

infecções ou neoplasias, influenciam no chamado perfil do transcriptoma (PASSOS et

al., 2000).

A comparação da expressão gênica por mensuração dos níveis de RNAm de células

em condições normais e patológicas está resultando em diagnósticos por “fingerprints” o

que poderá ajudar a identificar disfunções moleculares com maior precisão, para uma

posterior intervenção terapêutica (XIANG & CHEN, 2000).

1.6.2 Métodos de análise do transcriptoma

Cópias de RNAm na forma de DNA (DNA complementar ou simplesmente cDNA)

clonadas em vetores plasmidiais de E.coli e o sequenciamento a partir da extremidade 3´-

OH, perfazendo 0,3 a1,5 kb, confere ao que chamamos de “Expressed Sequence Tags”

(ESTs) ou em português, Etiqueta de Seqüência Expressa. As ESTs proporcionaram um

avanço significativo na decifração do genoma funcional humano, de camundongos e outros

organismos.

Mais recentemente o Brasil deu uma contribuição importante no sequenciamento

de cDNAs pela tecnologia das seqüências ORESTES (Open-Reading Frame ETSs)

(DIAS NETO et al., 2000). Tais seqüências correspondem a porções mais internas em

direção à extremidade 5´dos RNAm, o que fez os pesquisadores conhecerem mais sobre

a estrutura do transcriptoma humano.

Um grande progresso tem ocorrido nos últimos anos na caracterização de clones

Introdução

22

de cDNA de humanos, camundongos e outros organismos-modelo. Os clones de cDNA

e suas seqüências formam a base para a técnica de arranjos em membranas de alta

densidade (microarrays) para a análise de expressão gênica em grande escala

(DUGGAN et al., 1999; LIPSHUTZ et al., 1999).

Várias técnicas para a análise do transcriptoma analisando expressão de mRNA

estão disponíveis atualmente como SAGE (análise em série da expressão gênica, do

inglês Serial Analysis of Gene Expression) (YE et al., 2002). Muitos métodos

tradicionais de clonagem diferencial têm sido empregados de maneira bem sucedida, a

fim de se isolar genes únicos associados a doenças. Entretanto essas técnicas

apresentam limitações para estudos em doenças multigênicas como aquelas relacionadas

à auto-imunidade.

A utilização de cDNA microarrays, com a sua habilidade em determinar o padrão

de expressão de milhares de genes simultaneamente, obtendo assinaturas moleculares do

estado de ativação celular, é uma das ferramentas mais apropriada para o estudo em

questão. É amplamente reconhecido que a expressão de vários genes é coordenada espacial

e temporalmente, e que essa coordenação é alterada durante o desenvolvimento e a

progressão de uma doença. Análises por microarrays fornecem informações valiosas acerca

da patologia de doenças, progressão e resposta a tratamentos abrangendo qualquer

compartimento celular, sendo ainda capaz de permitir o aumento de diagnósticos e

abordagens terapêuticas para doenças auto-imunes. Aliando-se a disponibilidade das

bibliotecas de cDNA com a robótica de alta precisão na deposição de pequenas amostras

em superfícies sólidas, tornou-se possível a preparação dos arrays (arranjos) de clones de

cDNA, produtos de PCR (reação de polimerização em cadeia) e oligonucleotídeos em

membranas de nylon ou em lâminas de vidro (PASSOS et al., 2000).

As sondas utilizadas nas hibridações com os microarrays (sondas de cDNA

derivadas das amostras de RNA em estudo) podem ser marcadas com radioatividade

(33P) quando utiliza-se como plataforma membranas de nylon ou com fluorocromos

(Cy3 e Cy5) quando utiliza-se lâminas de vidro (Figura 8).

Como definiu Jordan (1998), as seqüências de cDNA fixadas no microarray são

chamadas de alvo e o RNA extraído das células (cDNAs marcados) chamado de sonda. E

neste trabalho, seguiremos esta definição, mas sabemos que vários laboratórios definem as

seqüências depositadas no array como sondas.

Introdução

23

Figura 8. Ilustração dos métodos de marcação de sondas complexas de cDNA para microarrays. A) Método fluorescente usando Cy3 e Cy5 e lâmina de vidro e B) Método radioativo usando 33P e membranas de náilon. (Extraído e modificado do livro Mutagênese Ambiental: Sakamoto-Hojo et al., 2003).

Introdução

24

Tudo isso vêm sendo aprimorado a partir do advento do seqüenciamento

associado ao desenvolvimento de técnicas de bioinformática, que disponibiliza

seqüências completas de genomas inteiros, permitindo assim um maior número de

investigações, aprimorando nossos conhecimentos a respeito dessas patologias

(MOSER et al 2004). Essa tecnologia vem sendo amplamente utilizada para estudos

clínicos como em estudos de leucemia, que mostra a possibilidade das células serem

divididas em subtipos agudos mielóides ou linfoblásticos a partir do perfil de transcritos

de RNA mensageiro (GOLUB et al 1999); estabelecimento de diferentes padrões de

assinatura relacionados ao perfil da doença, além de fornecer importantes informações

na expressão de clusters de genes particulares, como genes anti-apoptóticos em

linfomas de células B (ALIZADEH et al 2000); utilização da tecnologia para análise de

transcritos de tecidos complexos como porções do cérebro humano para estudo de

esclerose múltipla (LOCK et al 2002); receptor CXCR4 em artrite (RUS et al 2002), e

expressão de genes relacionados ao IFN e membros da família TNF em modelos de

esclerose (CROWE et al 2003), entre muitos outros.

Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado a estudos de

genômica funcional aplicada a imunologia, campo referido como imunogenômica. A

base tecnológica é o emprego de cDNA microarrays no estudo de doenças auto-imunes

como a artrite reumatóide (OLIVEIRA et al 2007; JUNTA, submetido),

desenvolvimento ontogenético do timo de camundongos isogênicos (MAGALHAES et

al 2006), e timo fetal em cultura (SOUSA et al 2006), além de estudos com câncer,

modelos de artrite e diabetes, e mais recentemente estudos envolvendo células tronco

hematopoiéticas, e bioinformática (SILVA et al 2007).

1.7) A utilização de RNA interferente (RNAi anti-AIRE) na pesquisa em

imunologia

O fenômeno de RNA interferente (RNAi ) foi primeiramente observado no final

da década de 1980, representando atualmente uma técnica potente no silenciamento da

expressão de genes por meio da degradação de seu RNA mensageiro (RNAm)

(CAPLEN et al, 2004; LEUNG et al, 2005; SHANKAR et al, 2005). O processo

envolve diversas etapas, do qual fazem parte a clivagem de um RNA dupla-fita em

Introdução

25

porções menores de 21-28 nucleotídeos por uma enzima RNase-III denominada Dicer.

As fitas simples de RNAi geradas pela degradação, são incorporadas a um

complexo multiprotéico chamado RISC (RNA-inducing silencing complex), que serve

como base para o reconhecimento do RNAm complementar alvo, que por sua vez é

degradado por uma enzima Slicer do complexo, uma proteína posteriormente

reconhecida e denominada Argonauta-2. O RNAi exibe uma eficácia de longo alcance,

pelo fato de estar protegido pelo complexo RISC, sendo então preservado facilitando

assim a degradação de RNAs mensageiros em subseqüentes reações endonucleolíticas.

Diversos pequenos tipos de RNAs dupla-fita artificiais têm sido inseridos em

uma grande variedade de células e organismos diferentes, sendo, portanto a técnica de

RNAi anti-Aire amplamente utilizada como um método para o silenciamento de genes

específicos. Assim, essa tecnologia apresenta um vasto potencial como ferramenta para

determinar funções de genes, e como forma de terapia para patologias caracterizadas

por expressão aberrante de proteínas celulares, como doenças infecciosas, desordens

genéticas, neoplasias e disfunções imunológicas.

A imunologia é um campo de pesquisa muito vasto, e muitas descobertas têm

sido realizadas com o advento e amplo uso da tecnologia de RNAi. Essa técnica tem

sido aplicada tanto para estudos na imunidade inata, quanto adaptativa, e tem se focado

na função de genes críticos, importantes sinais de vias de transdução, desenvolvimento

e diferenciação celular, e mecanismos iniciadores e efetores das respostas imunes. Essa

tecnologia, além da compreensão de desordens do sistema imunológico, tem também

contribuído para o entendimento dos mecanismos pelo qual patógenos são capazes de

invadir o hospedeiro, e a informação adquirida destes estudos sugerem que a técnica

poderá ser utilizada para regulação do sistema imune no cenário clínico.

Especificamente, o potencial das aplicações médicas com essa tecnologia inclui o

aprimoramento das respostas contra patógenos, tumores, tratamentos de doenças auto-

imunes e alérgicas, além de uma possível minimização das rejeições contra enxertos

(CHIH-PING et al, 2007).

No presente trabalho estudou-se o efeito da inativação do transcrito do gene Aire

diretamente no timo de camundongos DBA-2/J para se observar quais genes

codificadores de antígenos TRAs estão sob seu controle.

HIPÓTESES E OBJETIVOS

Hipótese e objetivos

27

2) Hipótese do trabalho

Considerando que: a) a auto-imunidade envolve o reconhecimento de auto-

antígenos, b) a apresentação destes auto-antígenos é dependente da expressão

promíscua (PGE) pelas células epiteliais corticais tímicas (mTECs) e c) que parte da

PGE é controlada pelo gene Aire, formulamos as seguintes hipóteses:

1) No sistema-modelo de indução de artrite reumatóide (AR), a PGE no timo de

camundongos da linhagem DBA-1/J (susceptível a AR) é diferente de

camundongos da linhagem DBA-2/J (resistente a AR);

2) O gene Aire controla parte da PGE na linhagem DBA-2.

Hipótese e objetivos

28

3) Objetivos

Objetivo amplo: Comparar a expressão gênica promíscua de genes de TRAs no timo das

linhagens DBA-1/J e DBA-2/J e avaliar o efeito da inativação do transcrito do gene

Aire na PGE exibida pela linhagem DBA-2/J.

Objetivos específicos:

1. Avaliar a expressão gênica diferencial de TRAs (expressão gênica promíscua)

no estroma do timo das linhagens DBA-1/J e DBA-2/J durante a imunização

com colágeno e transição do estado pré auto imune auto imune (DBA-1/J)

usando a tecnologia dos cDNA microarrays. 2. Avaliar e comparar os níveis de expressão do gene Aire no estroma do timo das

linhagens DBA-1/J e DBA-2/J usando a técnica de RT-PCR. 3. Avaliar quais genes tem seu padrão de expressão alterado após a inativação do

transcrito do gene Aire usando o sistema de RNA interferente in vitro em ATOC

(linhagem DBA-2/J).

MATERIAL E MÉTODOS

Material e métodos

30

4) Material e métodos

4.1) Linhagem de camundongos DBA-1/J e DBA-2/J

A linhagem DBA-1/J, que representa a linhagem susceptível a indução de artrite

reumatóide, foi adquirida junto ao biotério de camundongos isogênicos da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto, enquanto a DBA-2/J, linhagem que por sua vez se mostra

resistente a indução da doença, é proveniente do biotério da Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP). Os animais foram transferidos para o Laboratório no

Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, e

mantidos e câmara isoladora “Alesco”, com entrada de ar filtrado (filtro de 0,45 µ),

temperatura constante de 25oC, ciclo de iluminação de 12 horas, água e ração ad

libitum.

4.2) Indução de artrite reumatóide por imunização com colágeno

Animais de ambas as linhagens (DBA-1/J e DBA-2/J) receberam uma injeção

intradérmica na base da cauda de 200µg de colágeno do tipo II bovino (CII Sigma)

emulsificados em 0,1ml de PBS/adjuvante completo de Freund (1:1 CFA) (Difco). Os

camundongos controle falso-imunizados receberam o mesmo tratamento, porém sem

administração de colágeno.

4.3) Separação de células epiteliais tímicas (TECs)

Os animais de ambas as linhagens (DBA-1/J e DBA-2/J) foram sacrificados por

deslocamento cervical, conforme normas do Comitê de Ética, e os timos retirados

cirurgicamente. Foram coletados de dois a três timos para cada amostra, e, portanto foi

utilizado um pool de timos, os quais foram cortados, visando romper a cápsula que

envolve o órgão, com o auxílio de uma tesoura, no interior de um béquer contendo 40

ml de meio de cultura Dulbecco`s Modified Eagle`s (DMEM) e HAM F-10

(Invitrogen). Com auxílio de uma pulga magnética os timos sofreram uma agitação por

Material e métodos

31

cerca de 30 minutos (GRAY et al, 2002). Após esse tempo os fragmentos foram

retirados e lavados em EDTA 0,5M e posteriormente passaram pelo processo de

extração de RNA total.

4.4) Extração de RNA total

As amostras de RNA total foram extraídas de cada amostra de timo depletada de

timócitos, recém removidos e ATOC, tanto de animais imunizados quanto dos controles

utilizando-se Trizol ® Reagent (Invitrogen).

Após a obtenção das células, estas foram suspensas em 200 µL de solução salina

0,9% estéril e em seguida foi adicionado 1mL de Trizol ® Reagent (Invitrogen). Com o

auxílio de pipetador procurou-se dissociar os fragmentos do tecido ainda restantes. As

amostras assim homogeneizadas foram incubadas durante 5 minutos a temperatura

ambiente para dissociação nucleoprotéica. Em seguida, foram adicionados 200 µL de

clorofórmio, seguindo-se por agitação em Vórtex durante 15 segundos e posterior

incubação por mais 3 minutos a temperatura ambiente. Após esse período, as amostras

foram centrifugadas por 15 minutos a 12000xg a 4°C, recolhendo-se a fase aquosa

sobrenadante e transferindo-a para um novo tubo. Para a precipitação do RNA foi

adicionado ao sobrenadante 3X o volume do sobrenadante com isopropanol gelado, cuja

mistura permaneceu a -20°C durante 18 horas. O RNA total foi coletado por

centrifugação a 12000xg a 4°C durante 15 minutos, e o precipitado foi lavado com 1000

µL de etanol 70 %. O precipitado de RNA foi coletado após centrifugação a 7500xg a

4ºC durante 5 minutos, e após secagem em tubo aberto, foi dissolvido em 10 a 15 µL de

H2O milliQ estéril.

A fim de prevenir a contaminação por ribonucleases no isolamento e manuseio

do RNA, a vidraria, espátulas, pinças e “pulgas magnéticas” utilizadas foram

autoclavadas; e todo material plástico, além de serem novos, foram autoclavados para o

manuseio que foi realizado com luvas de látex sem talco.

Material e métodos

32

4.5) Quantificação e Eletroforese de Amostras de RNA Total

Da solução de RNA total, 3µl foram retirados, e então diluídos 100X a fim de

serem submetidos a dosagens em espectrofotômetro usando luz ultravioleta

(GENEQUANT – AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH). As dosagens tiveram

como base a seguinte estimativa: 1U de A 260 = 40 µg RNA/ml. O grau de pureza do

RNA foi calculado pela razão entre as absorbâncias; A260/A280 ~ 2,0 indicando que a

preparação estava livre de proteínas e A220/A260 ~ 0,7, indicando estar livre de fenol.

A qualidade das preparações de RNA foi avaliada por meio de eletroforese em

gel de agarose sob condições denaturantes. Um volume total de 70 mL de agarose

fundida foi misturado a 20 mL de formaldeído 37% e 22 mL de tampão de migração

MOPS 5X (20,6g de MOPS dissolvidos em 800 mL de acetato de sódio 50mM, pH 7,0

ajustado com NaOH 2N e adicionado 10 mL de EDTA 0,5M pH 8,0; volume final

ajustado para 1000 mL). Durante o tempo de solidificação do gel, as amostras de RNA

foram denaturadas na seguinte mistura: 4,5 µL de solução de RNA (cerca de 3 µg

RNA); 2,0 µL de tampão MOPS 5X; 3,5 µL de formaldeído 37% (Merck, Alemanha),

10,0 µL de formamida, e 1,0 µL de brometo de etídeo diluído 3:1 (solução estoque

10mg/mL). A mistura foi então incubada por 15 minutos em banho a 65°C. Após esse

tempo, o tubo foi colocado imediatamente no gelo, e adicionou-se e 2,0 µL de dye

loading solution (1/10 do volume). Após eletroforese a 80V durante 90 minutos as

bandas de RNAr 28S, 18S e 5S foram visualizadas em transluminador UV e

fotografadas.

4.6) Cultura de timo adulto (ATOC)

Os timos dos animais da linhagem DBA-2/J foram removidos, cortados e

transferidos para filtros de policarbonato Millipore 0,45µm colocados sobre um bloco

de grids de plástico, mantidos em placas de cultura (24 poços) contendo 3,0 mL de meio

Dulbecco`s Modified Eagle`s (DMEM) e HAM F-10 (Invitrogen), adicionados 20% de

soro bovino fetal, estreptomicina (100µg/mL), penicilina (250U/Ml), gentamicina

(10µg/Ml) e bicarbonato de sódio (1,2g/L). Os órgãos foram cultivados a 37ºC em

atmosfera de 5% de CO2 (WHALEN et al, 1999).

Material e métodos

33

4.7)Tratamento de ATOC com RNAi anti-Aire

Para realização dos ensaios de RNAi anti-Aire utilizou-se o TriFECTaTM Dicer-

Substrate RNAi anti-Aire anti-Aire Kit, que contém:

Três seqüências específicas de RNA duplo fita para o RNA mensageiro

alvo – Aire (2nmoles cada).

Um controle de transfecção marcado com Cy3TM DS (1nmole).

Um controle negativo universal (DS Scrambled Neg), que corresponde a

uma seqüência de RNA dupla fita que é ausente no genoma de humanos,

camundongos e ratos (1nmole).

Um controle positivo (HPRT-S1 DS Positive Control), cujo alvo é o gene

da hipoxantina guanina fosforibosiltransferase 1 - HPRT, e é comum

entre humanos, camundongos e ratos.

Um tampão (Rnase-free Duplex Buffer – 100mM KAc/30Mm HEPES Ph

7.5, 2mL).

Lipofectamina, responsável pela formação de complexos com o RNAi

anti-AIRE anti-AIRE, o que permite sua entrada na células.

Em cada seqüência específica de 2nmoles foram adicionados 100µl de tampão, e

em cada seqüência de 1nmole foram adicionados 50µl, todas com uma concentração

final de 20µM. Posteriormente as seqüências foram aquecidas a 94ºC por 2 minutos

para formação das duplas fitas, e finalmente estocados a -20ºC.

Para escolha da seqüência de RNAi anti-Aire mais eficaz para o silenciamento,

foram utilizadas culturas de linhagens celulares de mTECs de camundongos C57BL/6, e

a eficiência foi verificada por reações de RT-PCR, citada abaixo. Entretanto para o

controle da transfecção, e determinação da melhor concentração, foi utilizado o próprio

timo.

O órgão foi inicialmente tratado com RNAi marcado com Cy3 e colocado em

um tampão de congelamento (TBS – Tissue Freezing MediumTM, Triangle Biomedical

Sciences, Durham, N.C) no interior de uma forma e estocado a -80ºC. Após o

congelamento foram feitos cortes, no escuro, em criostato (Microtome Cryostat HM

Material e métodos

34

505E) de 20µm, para se evitar ruptura do tecido e consequentemente das camadas

celulares, e colocados em uma lâmina, para posterior avaliação por microscópio

confocal (Leica TCS – SP2), localizado no Departamento de Biologia Celular e

Molecular e Bioagentes Patogênicos.

Para os ensaios com RNAi anti-Aire, a seqüência 5’

GGAUUCUCUUUAAGG 3’ e 5’ UUGUAGUCCUUAAAG 3’ foi utilizada, pois

demonstrou maior eficiência quanto ao processo de silenciamento do gene Aire. A

concentração de 50µM foi determinada, e assim um total de 27µl de solução; sendo

20µl de meio MEM filtrado, 6µl de RNAi anti-Aire anti-Aire, e 1µl de

lipofectamina; permanecia 10 minutos em repouso a temperatura ambiente para

formação dos complexos, e posteriormente colocada em contato com o órgão com o

auxílio de uma micropipeta.

4.8) Avaliação de apoptose e necrose em ATOC por citometria de fluxo

Os timos removidos dos animais da linhagem DBA-2/J foram transferidos em

placas de cultura (12 poços), contendo 1ml de colagenase II, 100U/ml de meio de

cultura Dulbecco`s Modified Eagle`s (DMEM) por 30 minutos. Após esse tempo, os

timos foram então macerados em uma rede de nylon com o auxílio de um embolo de

seringa, e a suspensão de células foi então quantificada por meio do aparelho Coulter. A

quantidade de 1x106 /tubo células foi utilizada para o ensaio. Posteriormente as células

foram lavadas em 3ml de PBS 1X, e o botão de células obtido após centrifugação a

400g, por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado, e a seguir foram

adicionados 100µl/tubo de tampão de Annexin Binding Buffer diluído 1:10 em PBS, e

1µl de cada marcador, anexina V e iodeto de propídeo (PI) provenientes do

ApoScreenTM Annexin V-FITC KIT (Birmengham, AL35260 USA). As amostras foram

incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente, e posteriormente adicionado 50µl de

PBS para leitura no citômetro.

Material e métodos

35

4.9) Reações de RT- PCRs (transcrição reversa seguida de PCR)

As reações de transcrição reversa foram realizadas com 2 µg de RNA total, 1µL

de oligo(dT) e 1 µL de DNTP mix 10nM em um volume final de 20 µL, segundo

instruções do fabricante. As amostras permaneceram a 65°C durante 5 minutos e depois

foram colocadas imediatamente no gelo e foi dado um spin para que se evitasse a

evaporação da amostra após a abertura do tubo. Em seguida, acrescentou-se 4µL de

buffer 5x first-strand, 2µL de dTT e 1µL de RNAsin e deixou-se por 2 minutos a 42°C.

Adicionou-se 1µL de enzima Superscript II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen

Corporation, Carlsbad, CA, USA) e a reação permaneceu por 50 minutos a 42°C,

completando a reação após 15 minutos a 72°C.

Para a posterior PCR semiquantitativa foram feitas diluições (1:1 a 1:256) de

cada amostra de cDNA (molde) e primers específicos localizados em éxons diferentes

para evitar uma possível amplificação de DNA genômico contaminante. As reações de

PCR foram preparadas em um volume final de 25 µL, contendo 0,10 µM de cada

primer, solução de dNTPs (10 mM), KCl 50 mM; Tris pH 8.0, 10 mM; MgCl2 1,5 M, e

Taq DNA polimerase (5U/µL). O protocolo de amplificação difere de acordo com a

temperatura para cada um dos primers utilizando-se um aparelho Master Cycler

Gradiente (Eppendorf).

Para a análise dos produtos gênicos amplificados, uma alíquota de 10 µL desta

solução foram misturados com 2µl de loading buffer e separados por eletroforese em gel

de agarose 1,5% contendo brometo de etídio. A corrida eletroforética procedeu-se a 80

V durante 2 horas. Foi usado como marcador de pesos moleculares o ∅X174 RF

DNA/Hae III . As bandas foram visualizadas por iluminação UV de um transiluminador

e o gel fotografado usando uma câmera digital. Os pares de oligonucleotídeos utilizados

estão descritos nas tabelas 1, e foram obtidos através do Software Primer 3

(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi).

Material e métodos

36

Tabela 1. Primers utilizados na amplicação por PCR, para avaliação da PGE.

Primer Seqüência (sense e anti-sense

respectivamente)

Temperatura de

anelamento

Aire 5´ CATCCTGGATTTCTGGAGGA 3’ e

5’ GCTCTTTGAGGCCAGAGTTG 3’.

57ºC

CD3e 5´ GATGCGGTGGAACACTTTCT 3´ e

5´ ACTGTCCTCGACTTCCGAGA 3´

57ºC

Pró-colágeno II 5´ GCCAAGACCTGAAACTCTGC 3´ e

5´ GCCATAGCTGAAGTGGAAGC 3´

57ºC

Gad67 5´ TGCAACCTCCTCGAACGCGG 3´ e

5´ CCAGGATCTGCTCCAGAGAC 3´

60ºC

Ins-1 5´ CAGCCCTTAGTGACCAGC 3´ e

5´ TCTCCAGCTGGTAGAGGG 3´

60ºC

Ins-2 5´ CAGCCCTAAGTGATCCGC 3´ e

5´ TCTCCAGCTGGTAGAGGG 3´

61ºC

Β-actina 5´ ATGGATGACGATATCGCT 3´ e

5´ ATGAGGTAGTCTGTCAGG 3´

60ºC

Material e métodos

37

4.10) Preparação de cDNA microarrays em lâminas de vidro

4.10.1) Biblioteca de cDNAs murinos

Nosso laboratório mantém uma biblioteca de cDNA murino (Biblioteca

MTB IMAGE), com cerca de 9.000 clones de timo provenientes do “IMAGE

Consortium” (http://image.llnv.gov). São clones com seqüências “expressed

sequence tags” (EST), cujos tamanhos moleculares variam de 500 a 1.500 pb, e

está totalmente caracterizada, cujos clones estão seqüenciados e catalogados.

Os clones estão identificados com seus respectivos “accession numbers” (Acc)

no GenBank, Clone ID, o nome do gene e a posição de cada clone nas placas de

384 poços em planilhas do programa Excel® Microsoft. Conservamos esta

biblioteca em E. coli e placas de microtitulação (384 poços) a -80°C (material

gentilmente cedido pela Dra. Catherine Nguyen, do INSERM-TAGC ERM 206,

Marseille, França).

4.10.2) Amplificação de cDNA para a confecção de microarrays

Os clones de E. coli da biblioteca de cDNA IMAGE murina, repicados

em placas de 384 poços contendo meio de cultura 2X LB + ampicilina foram

incubados durante 16 horas, na proporção de 5 µl da cultura original diluídos

em 45 µl de meio de cultura 2X LB (volume final em cada poço: 50 µl). A

seguir uma alíquota de 8µl da cultura foi transferida para outra placa de 384

poços, contendo 72 µl de água deionizada estéril, e esta placa incubada a 95o C

por 10 minutos para lise das células. Após centrifugação a 4000xg por 5

minutos foi retirado 10µl do sobrenadante e adicionado a 40µl de um mix para

PCR contendo tampão da reação de PCR (10X), solução de dNTP (2mM),

primers com seqüências consenso aos três vetores presentes na biblioteca

(10µM), primer LBP 1S (5´tgtggattgtgagcggataa3´) e primer 1AS

(5´gggttgaattagcggaacg3´), Taq Polimerase (5U/µl) e água deionizada estéril

q.s.p 50 µl. O programa para amplificação dos insertos teve como base aquele

descrito por Menossi et al., 2000: 5 minutos a 94°C, seguidos de 30 ciclos

Material e métodos

38

(94°C, por 30 segundos; 55°C por 30 segundos, 72°C por 2 minutos), seguida

por uma extensão final de 7 minutos a 72°C e 5 minutos a 4 °C. Foi realizada

em um aparelho termociclador “Mastercycler Gradient” (Eppendorf), em placas

de PCR seladas com adesivo laminado para evitar evaporação. Cerca de 2

amplificações PCR de cada clone foram realizadas, sempre totalizando 50µl de

volume.

A avaliação da qualidade dos produtos amplificados pela PCR foi feita

em gel de agarose 1%, em tampão TAE 1X (Tris-acetato 0,04 M, EDTA 0,001

M) contendo brometo de etídio (10mg/ml) a 80V, durante 15 min. A

visualização das bandas foi realizada utilizando transluminador U.V. e

fotografados em Polaroid.

4.10.3) Purificação dos produtos de PCR

Para obtenção de uma eficiente fixação dos insertos de cDNA

amplificados nas lâminas de vidro é necessária a remoção de nucleotídeos não

incorporados e primers da reação de PCR (HEDGE et al. 2000). Utilizamos a

purificação dos produtos de PCR por precipitação com etanol.

Os produtos de PCR (50 µl) foram transferidos para placas de cultivo

com fundo em “U” e foram adicionados 10 µl de acetato de sódio 3M pH 4,8

em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, os produtos das duas PCR

foram agrupados, totalizando 100 µl, que foram transferidos para esta mesma

placa. Após a adição de 100 µl de etanol absoluto, as placas foram incubadas

por 16 horas (overnight) a –20oC. Após este tempo, as placas foram

centrifugadas a 4000xg por 60 min. a 2-8°C. O sobrenadante foi desprezado e o

pellet foi ressuspenso em 100 µl de etanol 70%. As placas foram novamente

centrifugadas a 4000xg por 30 min a 2-8°C. O sobrenadante foi novamente

desprezado e a placa secou à temperatura ambiente overnight. Após a placa

seca, o pellet foi ressuspenso em 50 µl de água deionizada autoclavada.

Uma alíquota de 5 µl destes produtos foi aplicada em gel de agarose 1%

contendo brometo de etídeo, visualizado em transluminador U.V. e fotografado

em Polaroid para avaliar a qualidade dos produtos amplificados.

Material e métodos

39

As placas foram secas em forno a 42°C e adicionou-se 27 µl de solução

de espotagem (DMSO 50% - dimetil sulfóxido) por poço da placa. Em seguida,

estas placas foram levadas ao freezer – 20°C e os produtos foram congelados e

descongelados por 3 vezes para uma melhor dissolução do DNA concentrado.

Posteriormente, os clones foram passados para as placas do robô, e estocadas a

4°C até a deposição dos produtos de PCR em membranas de náilon Hybond N+

(GE Healthcare) ou em lâminas de vidro.

4.10.4) Confecção das lâminas de microarrays

Amostras de produtos de PCR purificados foram preparadas para deposição em

lâminas de vidro adicionando-se mesmo volume (1:1) de Reagente D (GE Healthcare) e

transferidas para microplacas de 384 poços (Genetix). Por meio de um robô Array

Spotter III (Amersham Molecular Dynamics) as amostras foram depositadas por um

conjunto de 12 canetas que deposita um volume de 0,9 nl da amostra baseada na ação de

capilaridade em superfície de lâminas de vidro (Corning ® - UltraGaps 40015). Após a

deposição de cada conjunto de amostras as canetas foram lavadas automaticamente em

uma estação de lavagem que utiliza sucessivamente água purificada (18 megohm/cm),

etanol absoluto (Merck), solução 0,2 M de KOH e água novamente. As canetas foram

secas com nitrogênio 5.0 analítico antes das próximas amostras serem carregadas. A

câmara de deposição das amostras em lâminas do robô Array Spotter III possui

temperatura e umidade controladas. A umidade relativa de deposição das amostras foi

de~55% e a temperatura foi de ~25°C. Além disso, este robô está instalado numa sala

especial com ar limpo (sala limpa classe 10.000). Após a deposição e secagem de todas

as amostras nas lâminas, o DNA foi fixado por “cross-linking” por meio de irradiação

ultravioleta a 500 mJ de energia (Hoefer UV Crosslinker).

4.10.5) Delineamento das hibridações em microarrays

Uma escolha chave em um projeto que envolve a tecnologia de microarray é

utilizar comparações que podem ser diretas ou indiretas isto é, estabelecer comparações

dentro ou entre as lâminas. Não existe um delineamento experimental ideal para todas

as situações, ou seja, diferentes desenhos experimentais são necessários para contextos

experimentais diferentes. Qualquer que seja o tipo de desenho utilizado será requerido o

Material e métodos

40

mesmo número de hibridações, e a decisão sobre o tipo de delineamento deve

considerar a pergunta do trabalho.

O pool de RNA derivado de linhagens celulares é a amostra de referência mais

utilizada atualmente. Para fornecer a cobertura ótima dos genes depositados na lâmina,

as amostras de referência são freqüentemente constituídas de diferentes linhagens

celulares oriundas de vários tecidos. Como neste trabalho escolheu-se o uso de RNA de

referência, segue algumas considerações:

Ensaios de co-hibridação diferencial usando microarrays medem a expressão

gênica relativa de amostras emparelhadas e de uma amostra referência, sendo que o

poder da análise de microarray vem da identificação de padrões informativos de

expressão de um gene através das experiências múltiplas. O cumprimento destes

objetivos é facilitado usando uma amostra de referência comum para todos os

experimentos que forneça uma medida da expressão base para cada gene, permitindo a

normalização e a comparação de experimentos independentes.

Um vasto número de linhagens celulares pode não melhorar necessariamente a

representatividade total dos genes depositados no array, pois algumas linhagens

celulares expressam significativamente mais genes do que outras e, nem todas as

linhagens expressam todos os genes em níveis semelhantes. Misturar RNA de muitas

linhagens celulares pode diluir os transcritos raros de modo que a sua representação no

“pool” final do RNA corre o risco de ficar abaixo do limite detectável (YANG et al.

2002).

O delineamento das hibridações de microarrays consistiu em marcar o pool de

referência, constituído de timos de camundongo C57BL/6, com fluorocromo Cy5 e

combiná-los numa mesma lâmina com amostras de RNA (cDNA) marcados com Cy3

(Figura 9).

Material e métodos

41

4.10.6) Marcação das sondas complexas de cDNA com fluorocromos Cy3 e Cy5

Amostras de RNA foram convertidas a cDNA e marcadas utilizando o

Kit CyScribe Post-Labelling (GE Healthcare) que envolve a preparação e

adequação do cDNA em dois passos. No primeiro passo ocorre a síntese da

primeira fita de cDNA com a incorporação de nucleotídeos amino- alil dUTP

modificados, com posterior degradação da cadeia de RNAm e purificação do

cDNA para remoção de nucleotídeos livres e oligômeros (Figura 10).

a) Preparação da primeira fita de cDNA por incorporação de AAdUTP

Em um tubo Eppendorf de 1,5 µl imerso em gelo picado foram

adicionados 10 µg de RNA total, 1 µl de primers randômicos, 3 µl de oligo (dT)

e 0,5 µl de controle denominado “spike mix” para o Universal ScoreCard em

um volume total de 11 µl (Proporção de 2 µl de spike mix para cada 1 µg de

RNA marcado). A reação foi cuidadosamente montada e incubada a 70°C por 5

minutos, sendo posteriormente resfriada a 4°C durante 5 minutos. A extensão

Figura 9. Delineamento dos experimentos com microarrays. Foi utilizado RNA total (cDNA total) de timo de camundongo adulto C57BL/6 como RNA de referência (marcado com Cy3). As amostras de timo experimental foram marcados com Cy5.

RNA de Timos de camundongos adultos C57BL/6

RNA de Estroma depletado de Timócitos de camundongos adultos DBA-1/J e DBA-2/J

Pool de referência marcado com Cy5.

Sonda de cDNA marcado com Cy3.

Material e métodos

42

da cadeia de cDNA foi realizada utilizando 4 µl de tampão 5X CyScript , 2 µl

de DDT 0,1 M, 1µl de nucleotídeo “mix”, 1µl de AA-dUTP (a quantidade de um

tubo contendo AA-dUTP liofilizado foi ressuspensa em 30 µl de água livre de

nucleases e mantido a -20°C por no máximo 30 dias), 1 µl de transcriptase

reversa CyScript, em um volume final de reação de 20 µl. A reação foi incubada

a 42°C por 1,5 hora. Procedemos à degradação do RNAm adicionando 2 µl de

NaOH 25M com incubação a 37°C durante 15 minutos, posteriormente foi

adicionado 20 µl de HEPES 2M.

b) Purificação do cDNA com colunas de purificação CyScribe GFX

Para cada amostra de cDNA com volume entre 20 a 100 µl foram

adicionados 500µl de solução “capture buffer” em uma coluna de purificação

GFX colocada dentro de um tubo coletor. O produto de cDNA marcado com

aminoalil não purificado foi adicionado à coluna e misturado 5 vezes. A

centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o

líquido contido no tubo coletor foi descartado. A coluna foi novamente

colocada no tubo coletor e foram adicionados 600µl de etanol 80%. A

centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o

líquido contido no tubo coletor foi descartado. Esta lavagem foi repetida mais

duas vezes. Uma nova centrifugação foi feita a 13800 xg por 10 segundos. para

retirada do excesso de etanol 80% da amostra. O tubo coletor foi descartado e a

coluna contendo o cDNA foi colocada em um tubo de 1,5 µl. Foi adicionada a

coluna 60 µl de bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0 e incubado durante 5

minutos. O material foi centrifugado a 13800 xg por 1 minuto.

No segundo passo, o cDNA é marcado com formas reativas de ésteres

NHS Cy3 e Cy5 que se ligam aos nucleotídeos modificados e após um processo

de purificação para eliminação dos CyDye não incorporados a sonda está pronta

para hibridação (Figura 11).

Material e métodos

43

c)Incorporação de Cy3 e Cy5

A amostra de cDNA marcada com aminoalil purificado foi adicionada a

um tubo com a alíquota de CyDye NHS éster e ressuspendida várias vezes. O

material foi centrifugado a 13800 xg por 1 minuto e incubado, no escuro,

durante 1 hora. Posteriormente, foi adicionado 15 µl de hidroxilamina 4M

seguida de incubação no escuro, durante 15 min a temperatura ambiente.

d)Purificação do cDNA marcado com CyDye com colunas de purificação CyScribe

GFX

Para cada amostra de cDNA com volume entre 20 a 100 µl foram

adicionados 500 µl de solução “capture buffer” em uma coluna de purificação

GFX colocada dentro de um tubo coletor. O produto de cDNA marcado com

CyDye não purificado foi adicionado à coluna e misturado 5 vezes. A

centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o

líquido contido no tubo coletor foi descartado. A coluna foi novamente

colocada no tubo coletor e foram adicionados 600 µl da solução “wash buffer”.

A centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o

líquido contido no tubo coletor foi descartado. Esta lavagem foi repetida mais

duas vezes. Uma nova centrifugação foi feita a 13800 xg por 10 segundos para

retirada do excesso da solução “wash buffer” da amostra. O tubo coletor foi

descartado e a coluna contendo o cDNA foi colocada em um tubo de 1,5 µl. Foi

adicionado a coluna 60 µl da solução “elution buffer” pré-aquecido à 65°C e

incubado durante 5 minutos. O material foi centrifugado a 13800 xg por 1

minuto.

e)Quantificação do CyDye incorporado no cDNA

Após a purificação foi feita a monitoração de incorporação dos fluorocromos por

meio de leitura em espectrômetro (Ultrospec 2100, GE Healthcare) em comprimento de

onda a 550 nm para Cy3 e 650 nm para o Cy5 usando amostras diluídas 100X. A

quantidade de Cy3 ou Cy5 incorporados no cDNA pode ser calculada através do seu

Material e métodos

44

coeficiente de extinção molar 150 000 l mol –1 cm-1 para Cy3 e 250 000 l mol –1 cm-1

para Cy5. As proporções de Cy3 e Cy5 incorporados no cDNA foram calculados pela

fórmula: (A)/E x Z x fator de diluição x 10 12 , onde:

A= absorbância de Cy3 a 550 nm ou Cy5 a 650 nm

E= coeficiente de extinção para Cy3 ou Cy5 x 10-6

Z= volume (µl) da sonda após purificação

Para hibridações com os dois fluorocromos foram adicionados os cDNA

marcado com Cy3 e Cy5 em um tubo de microcentrífuga protegido da luz. A solução de

cDNA foi concentrada no aparelho “Speed Vacum”. A seguir o cDNA foi dissolvido

em 6 µl de água livre de nuclease e desnaturado a 95°C por 2 min. A solução foi

imediatamente resfriada no gelo por 30 seg. A essa reação adicionamos 1,5 µl de A80

(1mg/ml) e incubamos a 75 °C por 45 min, estando assim pronta para o processo de

hibridação.

Material e métodos

45

Figura 10. Preparação da fita simples de cDNA incorporada com amino alil com o kit “CyScribe Post Labelling”(GE Healthcare).

RNA Total

Anelamento do RNA

Oligo (dT) primer

random nonamers

Anelamento da fita simples de cDNA incorporada com amino alil (AA-dUTP) com o RNA

Nucleotídeos, AA-dUTP,

Tampão da Reação, Enzima

Anelamento

Síntese de cDNA

Degradação do RNAm Tratamento alcalino (2,5 M NaOH)

Neutralização (2 M HEPES)

Fita simples de cDNA incorporada com amino alil livre de nucleotídeos e oligômeros

Purificação do cDNA Purificação com colunas

CyScribe GFX

Fita Simples de cDNA marcada e incorporada com Amino Alil Purificada

Material e métodos

46

Acoplamento do cDNA com CyDye-NHS ester

Purificação do cDNA marcado com CyDye

Fita simples de cDNA incorporada com amino-alil purificada

CyDye-NHS ester

Hidroxilamina

cDNA incorporado com CyDye e CyDye não incorporado

Colunas de purificação CyScribe GFX

cDNA marcado com CyDye purificado

Hibridação com os microarrays

Figura 11. Preparação do cDNA marcado com CyDye com o kit “CyScribe Post Labelling” (GE Healthcare).

Material e métodos

47

4.10.7) Hibridação das lâminas de microarrays

As lâminas de microarrays foram hibridadas utilizando um processador

automático, “Lucidea Automated Slide Processor”–ASP (GE Healthcare) que permite a

hibridação e lavagens em câmaras independentes (12 lâminas por vez). Este aparelho

inclui um software que automatiza a injeção de amostras líquidas e soluções de lavagens

ou ar dentro das câmaras e possui parâmetros de controle de temperatura e velocidade

de injeção e circulação destas soluções no interior das mesmas.

As lâminas foram hibridadas por 15 horas a 42°C. As condições de lavagens

foram: 1XSSC/0,2%SDS (2 x 20 seg. à temperatura ambiente); 0,1X SSC/0,2% SDS (2

x 20 seg. à temperatura ambiente); 0,1X SSC (2 x 20 seg. à temperatura ambiente). A

última lavagem das lâminas foi feita com isopropanol, sendo em seguida aquecidas a

42°C, e novamente lavada com isopropanol. Após as lavagens as lâminas foram

aquecidas a 60°C para secagem. As lâminas estavam prontas para serem “lidas” em

aparelho “scanner” a laser.

4.10.8) Aquisição de Imagens de microarrays

As lâminas foram lidas num aparelho Generation III “Array Scanner” (GE

Healthcare) com lasers de 532nm para o Cy3 (verde) e 633 nm para o Cy5 (vermelho).

A leitura da lâmina gera dois arquivos com imagens separadas com os pontos em preto

para os dois canais (Cy3 e Cy5) e uma terceira imagem, agora colorida, sobrepondo

Cy3 e Cy5 visualizadas usando o software ImageQuant (GE Healthcare).

4.10.9) Quantificação e normalização dos dados de microarrays

Após obtenção das imagens seguiu-se à análise realizada em duas etapas.

Inicialmente, os dados contidos nas imagens foram transformados em dados

numéricos, utilizando o programa Spotfinder (http://www.tigr.org/software). Esse

programa, além de transformar as informações das imagens em valores numéricos,

também analisa a qualidade dos pontos e calcula o "background". Dois parâmetros

foram considerados para o controle de qualidade neste programa: os pontos de boa

Material e métodos

48

qualidade apresentam valores superiores e/ou igual a 1 valor "backgrounds" mais 1

valor desvio padrão.

Em seguida, estes dados foram normalizados. A normalização retira os erros

experimentais sistemáticos por balancear a intensidade dos dois fluorocromos. Esses

erros podem ocorrer devido à diferença de incorporação dos corantes, efeitos espaciais

na lâmina e diferenças durante a aquisição das imagens nos dois canais. Para esses

ajustes, utilizou-se a plataforma R (www.r-project.org), com o pacote AROMA

(http://www.maths.lth.se/help/R/aroma/), que retém as funções necessárias para a

normalização dos dados de microarrays. Portanto, após a retirada do background pelo

programa Spotfinder, os dados foram importados para o ambiente R e transformados

para o formato de dados “M versus A”, onde M é igual a log2(R/G) e A é igual a

1/2·log2(R·G). Em seguida, os métodos de normalização “print-tip Lowess” e “absolute

median deviation (MAD) re-scaling” foram aplicados respectivamente. O primeiro

método aplica uma regressão linear nos dados, para corrigir erros espaciais que possam

ter sido gerados durante os experimentos. O segundo re-escalona as razões de log para

cada microarray, de maneira que cada slide adquire a mesma distribuição dos dados, de

acordo com a MAD, capaz de estimar com robustez a variância de uma amostra. Na

Figura 12, observamos o fluxograma do “pipeline” desenvolvida para análise dos dados.

Material e métodos

49

Quantificação das imagens

Armazenamento dos dados em tabelas de texto tabuladas

Filtragem do background + 2X o desvio padrão

Filtragem dos valores negativos e zeros

Transformação dos dados para o formato MA

Normalização intra-lâminas (print-tip lowess) e entre-lâminas (escalonamento pela MAD)

Criação dos gráficos diagnósticos para cada passo de filtragem, normalização e análise

Filtragem pela razão do valormediano do ponto (spot)

Filtragem dos spots utilizados como controles(Scorecard)

Filtragem pelo tamanho dos spots

Criação de modelo linear de análise

Análise da expressão gênica diferencial pela estatística bayesiana empírica (estatística B)

KTH + BIOCONDUCTOR

Ambiente R

SPOTFINDER

AROMA

LIMMA

Figura 12. “Pipeline” utilizado na análise de dados de microarrays em lâminas de vidro.

Material e métodos

50

Utilizando o pacote LIMMA (Linear Models for Microarray Data)

(SMYTH et al, 2004)foi aplicado o método Bayesiano empírico para análise

estatística da expressão diferencial.

Posteriormente, o programa SAM (“Significance Analysis of Microarrays”) (TUSHER

et al. 2001) foi utilizado para a detecção dos genes diferencialmente expressos

(SMYTH et al, 2004). O programa SAM representa uma evolução dos softwares de

análise estatística para a tecnologia de microarrays e encontra-se disponível no endereço

(http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/). A análise baseia-se em uma série de testes-t

específicos para cada gene, que são adaptados para a detecção da expressão gênica

diferencial em larga escala. A partir da observação de que as flutuações casuais são

específicas para cada gene, o teste SAM é baseado na razão entre a diferença das médias

das situações, como por exemplo, pool de órgãos (Xc) e o timo (Xp), e o desvio padrão

de cada gene, calculados a partir de repetição experimental. A diferença relativa d(i) na

expressão gênica é então definida pela equação 1:

0)()()(

)(SiS

iXiXid cp

+−

=

Onde Xp(i) e Xc(i) são definidos como níveis médios da expressão do gene nos estados

p (timo) e c (pool de órgãos), respectivamente. A dispersão gene-específica S(i) é o

desvio padrão de medidas repetidas de expressão, e a constante positiva So no

denominador da equação acima, servem para certificação de que a variância de d(i) é

independente da expressão gênica. Para a determinação de genes com mudanças

d(i) = diferença relativa

Xp(i) = níveis médios da expressão dos genes no timo

Xc(i) = níveis médios da expressão dos genes no pool de órgãos

S(i) = desvio padrão de medidas repetidas de expressão

[EQUAÇÃO 1]

Material e métodos

51

significativas na expressão, utilizou-se um gráfico de dispersão d(i), em relação à

diferença relativa esperada dE.(i). Para uma grande maioria de genes d(i) ≅ dE.(i), mas

alguns genes são representados por pontos distantes da linha d(i) ≅ dE.(i). As alterações

das expressões dos genes que se encontram a uma distância maior do que o limiar (∆) é

então considerado significante (Figura 13).

O limiar (∆) determina dois cortes horizontais, ou seja, o menor valor de d(i)

indica que o gene seja considerado significantemente induzido (hiperexpresso), e o

valor menos negativo de d(i) indica que o gene está significantemente reprimido

(hipoexpresso).

A porcentagem de genes identificados por mudanças aleatórias é chamada de

Freqüência de Descobertas Falsas (FDR), um método inicialmente idealizado por

(BENJAMINI & HOCHBERG, 1995) e definido como a proporção esperada de

rejeições falsas. O cálculo de FDR e o número de genes com mudanças significativas

estão intimamente relacionados com o limiar ∆. À medida que o valor de ∆ diminui, o

número de genes significantemente alterados aumenta à custa de um aumento de um

FDR. Essa determinação do nível de significância pelo limiar providencia cortes

assimétricos para genes induzidos e genes reprimidos. Essa assimetria é desejável, posto

que os genes induzidos e genes reprimidos podem se comportar de maneira diferente em

alguns experimentos. Ao utilizar o SAM, o usuário pode escolher o limiar ∆ mais

conveniente com base no nível de significância estimado pelo FDR e no número de

genes com os quais se pretende trabalhar.

O programa SAM estabelece automaticamente uma ligação entre o número de

acesso das seqüências utilizadas com as páginas de informações sobre o clone em

questão, situados no banco de dados S.O.U.R.C.E. (“Stanford Online Universal

Resource for Clones and ESTs”) (http://source.stanford.edu/cgi-

bin/source/sourceSearch). O S.O.U.R.C.E. compila informações de vários bancos de

dados públicos (UniGene, dbEST, Swiss-Prot, GeneMap99, RHdb, GeneCards e

LocusLink) e as disponibilizam de maneira a facilitar a identificação dos genes

diferencialmente expressos.

Material e métodos

52

SAM Plot

-15

-10

-5

0

5

10

15

-15 -10 -5 0 5 10

Expected

Obs

erve

dSignif icant: 104Median # false signif icant: 50,24446

Delta 0,47270Fold Change

Todas as informações citadas acima foram retiradas do trabalho de (TUSHER et

al. 2001), do manual do software SAM e de relatórios técnicos publicados na página de

Robert Tibshirani (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM).

4.10.10) Nomenclatura dos genes

Em função da dificuldade de se traduzir corretamente para o português o

nome de todos os genes citados neste trabalho, optou-se por utilizar o nome dos genes

em inglês, com a mesma grafia utilizada no arquivo do banco de dados da biblioteca

IMAGE.

Figura 13. Comparação entre a distância relativa observada d(i) e esperada dE(i).

GENES REPRIMIDOS

GENES INDUZIDOS

Material e métodos

53

4.11) Análise da expressão gênica promíscua no timo

Os agrupamentos gênicos gerados durante o processamento dos dados no

programa TIGR MEV foram analisados em termos de Expressão Gênica Promíscua

(PGE) para avaliar a representatividade dos órgãos e sistemas. A análise foi feita

utilizando o banco de dados GNF SymAtlas (http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/) que

permite a visualização da expressividade de cada gene em um gráfico de barras

paralelas que apresenta 60 tecidos, que representam por sua vez 17 sistemas do

organismo. Visando a homogeneização dos dados optou-se por considerar como

tecidos representados por um determinado gene, apenas aqueles tecidos que obtiveram

expressividade superior à linha da mediana que se encontra presente em cada gráfico.

Após a organização dos dados em sistemas, gerou-se uma planilha contendo o número

de genes que caracterizavam cada sistema em particular e, posteriormente, gerou-se um

gráfico que passou a demonstrar a representatividade de cada sistema nos agrupamentos

definidos. Procurou-se ainda destacar a representatividade dos genes no sistema

locomotor em relação aos demais sistemas e ressaltar os genes que codificadores de

proteínas encontradas na matriz extracelular, condição de maior importância frente a

doença estudada.

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Delineamento experimental

55

5) Delineamento Experimental

5.1) Cultura, extração de RNA e utilização de RNAi anti-Aire

RT PCR Aire

DBA-1/J e DBA-2/J

Timo

Células TEC

RNA Total

Sondas de cDNA

Hibridações com Microarrays

Análise dos dados

ATOC + RNAi anti-Aire

DBA-2/J

RESULTADOS

Resultados

57

6) Resultados

6.1) Avaliação da integridade das amostras de RNA

As amostras de RNA total obtidas do estroma tímico, recém removidos e ATOC,

depletado de timócitos dos animais DBA-1/J e DBA-2/J, foram analisadas em relação à

sua integridade por eletroforese em gel de agarose desnaturante 1,5% (Figura 14). É

possível observar os rRNA 28S e 18S na proporção próxima de 2:1, comprovando,

assim, a integridade e a qualidade da preparação. Este é controle de qualidade

obrigatório e adotado para avaliar todas as preparações utilizadas neste trabalho.

Figura 14. Integridade das amostras de RNA. Eletroforese em gel de agarose sob condições denaturantes 1,5% das preparações de RNA total (2µg) provenientes de estroma tímico depletado de timócitos.

28S

18S

Resultados

58

6.2) Avaliação da expressão do gene Aire e de TRAs no estroma

tímico

Após a obtenção de cDNA provenientes das amostras de estroma tímico

dos animais de ambas as linhagens, foram realizados experimentos de PCR para

avaliação do gene Aire, cujo RNAm foi alvo do tratamento utilizando-se a

técnica de RNA interfente; o gene CD3e para verificação da contaminação de

timócitos nas amostras; o gene do pró-colágeno II, que codifica proteína

colágeno do tipo II apresentada como principal alvo da ação de linfócitos T na

periferia; e presença de alguns genes já descritos na literatura como TRAs,

entre eles: Ins-1, Ins-2 e Gad67, além do controle, que neste trabalho

corresponde ao gene da β-actina (Figura 15).

Β-actinaCD3e Aire Ins-1 Ins-2 Gad67

A

BCD

E

Pró-colágeno II

Figura 15. Avaliação da expressão dos genes: CD3e, β-actina, Aire, Ins-1, Ins-2, Gad67 e Pró-colágeno II no estroma tímico. a) Estroma de DBA-1/J falso-imunizados; b) Estroma de DBA-1/J imunizados; c) Estroma de DBA-2/J falso-imunizados; d) Estroma de DBA-2/J imunizados; e) Timócitos (Resultado típico)

Resultados

59

6.3) Avaliação da viabilidade de ATOC

Para o ensaio de apoptose e necrose, com o objetivo de analisar a viabilidade da

técnica de ATOC nos animais da linhagem DBA-2/J foram realizados ensaios de

anexina V e PI. Os resultados foram obtidos por citometria de fluxo, nos tempos: 0, 6,

12, e 24 horas (Figura 16).

O tempo ideal para incorporação dos complexos pelas células e ação do RNAi

anti-Aire é de 24 a 48 horas. Entretanto, como pode ser observado na figura 16, já com

6 horas de cultura apenas 25% das células eram viáveis, e esses valores reduziram-se

drasticamente, atingindo 13% de viabilidade no tempo mínimo de ação do RNAi anti-

Aire, ou seja, 24 horas. As células epiteliais tímicas (TECs) são caracterizadas por uma

forte aderência entre elas, e delas com os timócitos. Assim fomos verificar a

possibilidade desta aderência estar prejudicando a entrada de nutrientes, levando grande

parte das células a morte. Para isto, o timo foi fragmentado, método já descrito por

Whalen et al (1999). Observando novamente a figura 16, é nítida a diferença de

viabilidade das células quando se compara os dados, pois as culturas de 6 e 12 horas dos

timos fragmentados, ainda mantêm valores muito próximos a 0 hora, caindo entretanto,

novamente de forma drástica após 24 horas de cultura. Apesar do tempo ideal para a

ação do RNAi anti-Aire de 24-48 horas, o tratamento foi realizado com 12 horas de

cultura, já que assim, o timo ainda apresentava cerca de 50% de viabilidade. Os

resultados foram avaliados por PCR.

Resultados

60

Figura 16. Autofluorescência das células de timo total, intacto e fragmentado, da linhagem DBA-2/J, e marcação de Anexina V para ensaio de apoptose, e PI para necrose, nos tempos de: 0, 6, 12, e 24 horas.

Resultados

61

6.4) Determinação da seqüência e concentração de RNAi anti-Aire para

ensaio em ATOC

Para realização dos ensaios de RNAi anti-Aire e determinação da seqüência que

melhor promoveu o silenciamento deste gene, utilizou-se uma linhagem de células

mTECs, de camundongo C57BL/6, o que possibilitou a escolha da seqüência de forma

rápida e eficiente. Como observado nas figura 17, utilizou-se as concentrações de 2.5, 5

e 10nM, recomendada pelo kit para ensaio em cultura, sendo possível determinar a

seqüência 1 como aquela que obteve o maior grau de silenciamento do gene Aire, e,

portanto escolhida para os passos posteriores.

Resultados

62

Figura 17. Eletroforese em gel de agarose de produtos de RT-PCR semiquantitativa para a detecção do transcrito do gene Aire. PCRs realizadas com as seguintes amostras: mTEC na ausência de RNA interferente e mTEC em presença das três diferentes seqüências de RNAi anti-Aire, cada uma em três concentrações (2.5, 5.0 e 10.0 nM). * RNAi e concentração escolhidos para a continuação dos experimentos. B = Controle negativo

Figura 18. Seqüência 1 do RNAi anti-Aire, utilizada nos experimentos de inibição do transcrito do gene Aire em timos de camundongos DBA-2/J em cultura ATOC.

Resultados

63

Uma vez definida a melhor seqüência (Figura 18), determinou-se a concentração

ideal de RNAi anti-Aire para o silenciamento no timo.

Com a utilização de uma seqüência marcada com o fluorescente Cy3, os timos

de animais da linhagem DBA-2/J, foram congelados e posteriormente cortados com o

auxílio de um criostato, com espessura de 20µM, medida mínima na qual era possível se

evitar a ruptura tecidual e conseqüentemente das camadas celulares. Os cortes, feitos no

escuro para não prejudicar a marcação, foram depositados em lâminas de vidro para

posterior análise em microscopia confocal. A utilização desta técnica permitiu a

realização de cortes virtuais, facilitando a visualização da entrada do corante em

camadas únicas de células. Após observação dos resultados (Figura 19) determinou-se a

concentração de 50mM como ótima para os ensaios de RNAi anti-Aire em timo.

Resultados

64

Figura 19. Microscopia confocal. Microdissecção virtual de timo total de animais da linhagem DBA-2/J, incorporados com RNAi anti-Aire marcado com Cy3, nas concentrações de 10, 50, e 100nM.

Resultados

65

6.5) Análise do silenciamento do gene Aire pela técnica de RNAi

Para os ensaios de tratamento de timo de camundongos da linhagem DBA-2/J

com RNA interferente (RNAi) anti-Aire, os seguintes grupos de ATOC foram

utilizados: Meio de cultura MEM filtrado, MEM + Lipofectamina, MEM + controle

positivo, MEM + controle negativo, e MEM + RNAi anti-Aire. Os ATOCs foram

mantidos por 12 horas em estufa com CO2 e umidade adequados. Posteriormente

realizou-se a extração de RNA total do estroma tímico de cada um dos grupos para

análise do silenciamento do gene AIRE por PCR (Figura 20).

Para visualização do silenciamento foram realizadas diluições seriadas de

cDNA, de 1:1 a 1:256. A partir da diluição de 1:256, é possível observar que os

respectivos controles ainda mantém a expressão do RNA mensageiro referente ao gene

AIRE, porém, na amostra tratada com RNAi sua expressão do gene Aire não foi mais

detectada (Figura 20). Partindo deste dado, foi considerado um silenciamento parcial, e

deu-se seqüência a análise do fenômeno de PGE utilizando-se a tecnologia dos

microarrays.

Figura 20. Avaliação da expressão do gene Aire em amostras de estroma tímico de ATOC 12 horas, de animais de DBA-2/J, na concentração de 50nM. O controle negativo corresponde a um RNAi anti-Aire irrelevante, e o controle positivo é referente ao gene HPRT.

Resultados

66

6.6) Marcação com sonda fluorescente e obtenção de imagens

Os microarrays foram preparados através da deposição na lâmina de vidro dos

produtos de PCR purificados, através do sistema robotizado Array Spotter Generation

III – Amersham Molecular Dynamics. O “design” do microarray foi baseado em spots

com diâmetro de 250µm e distância entre eles de 30µm. O Spotter Generation III pode

depositar até 4608 clones (em duplicata) em uma lâmina, que correspondem a 12 placas

de 384 clones. As condições de marcação estão todas completamente padronizadas em

nosso laboratório, e assim foram realizados todos os experimentos com as amostras

biológicas de estroma tímico de ambas as linhagens (DBA-1/J e DBA-2/J), e ATOC de

timos tratados com RNAi anti-Aire dos animais DBA-2/J. É importante ressaltar que foi

utilizado o pool de RNA de referência nas marcações, As imagens obtidas (Figura 21)

foram posteriormente analisadas.

Resultados

67

Figura 21. Imagem típica de cDNA microarray deste projeto, contendo 9000 pontos (4500 seqüências em duplicata) preparado em uma lâmina de vidro espelhada (Amersham tipo 7). Hibridações com sondas fluorescentes (verde Cy3 = amostra e vermelha Cy5 = pool de referência).

Resultados

68

6.7) Análise dos genes diferencialmente expressos por agrupamento

hierárquico, e da significância estatística do padrão de expressão

Os 4500 valores numéricos quantitativos já normalizados, representando o

conjunto de genes analisados, de cada uma das variáveis foram analisados pelo

programa de agrupamento hierárquico Cluster & TreeView. Como este programa só

analisa os valores que aparecem em, pelo menos, 80% dos experimentos, ocorre uma

redução no número de seqüências analisadas. Assim, para comparação entre os animais

das linhagens DBA-1/J e DBA-2/J foram obtidos dados de expressão de 160 seqüências

(Figura 22), e 27 seqüências entre o controle e o tratamento com RNAi anti-Aire em

timo de animais da linhagem DBA-2/J (Figura 23).

Os mesmos 4500 valores numéricos foram analisados pelo programa SAM

multiclass. Este tipo de análise nos permitiu apontar seqüências diferencialmente

expressas segundo um valor de exclusão, a partir do qual os genes são considerados

induzidos. Além disso, o programa SAM fornece o FDR, bem como o q value para cada

seqüência, o que nos orienta na escolha se seqüências com valores de expressão com

alta significância estatística (tabela 2 e 3 - Anexo I).

Resultados

69

Figura 22. Comparação dos perfis de expressão gênica entre os animais das linhagens DBA-1/J e DBA-2/J. Matriz de expressão de 160 seqüências gênicas de estroma tímico, de animais controles e testes de ambas as linhagens. A correlação de Pearson foi utilizada como medida de similaridade. O vermelho indica indução da expressão, o verde repressão, e o preto ausência de modulação. Cores mais claras representam maior intensidade na alteração da expressão. O cinza indica ausência de valores.

Resultados

70

Figura 23. Comparação dos perfis de expressão gênica de ATOC tratada e não-tratada com RNAi anti-Aire em animais da linhagem DBA-2/J. Matriz de expressão de 27 seqüências gênicas de estroma tímico, de timos tratados e não-tratados com RNAi anti-Aire. A correlação de Pearson foi utilizada como medida de similaridade. O vermelho indica indução da expressão, o verde repressão, e o preto ausência de modulação. Cores mais claras representam maior intensidade na alteração da expressão. O cinza indica ausência de valores.

Resultados

71

6.8) Determinação da expressão gênica promíscua (PGE) no Timo

A PGE foi analisada a partir dos genes diferencialmente expressos obtidos pelo

programa SAM e por agrupamento hierárquico dos animais de ambas as linhagens

(DBA-1/J e DBA-2/J), e de ATOC de animais DBA-2/J após tratamento com o RNAi

anti-Aire, por um programa denominado Symatlas. Esse programa tem como função

fornecer a expressão de um determinado gene em cerca de 60 tecidos diferentes, como

pode ser observado na Figura 24. Após a realização da análise de cada gene, foram

gerados gráficos que mostram as porcentagens referentes a representação de 18 sistemas

diferentes no timo de acordo com os clusters que caracteriza cada uma das linhagens, e

aquele que caracteriza a ação do tratamento com RNAi anti-Aire (Figuras 25 e 26).

Resultados

72

Figura 24. Gráfico ilustrativo gerado pelo banco de dados do Symatlas (http://symatlas.gnf.org/SymAtlas) mostrando a representação tecidual do gene Casp8, com os nomes de cada tecido e/ou órgão.

Resultados

73

Figura 25. Representação da expressão gênica específica de tecidos e órgãos em timo de camundongo DBA. Os genes significativamente induzidos dos 4500 analisados foram anotados caracterizando a expressão promíscua, representando os antígenos tecido-relacionados ao timo. A: Genes induzidos no estroma tímico de animais da linhagem DBA-1/J. B: Genes induzidos no estroma tímico de animais da linhagem DBA-2/J.

A

B

Resultados

74

Figura 26. Representação da expressão gênica específica de tecidos e órgãos em timo de camundongo DBA-2/J, durante o tratamento com RNAi anti-Aire. Os genes significativamente induzidos dos 4500 analisados foram anotados caracterizando a expressão promíscua, representando os antígenos tecido-relacionados ao timo.

DISCUSSÃO

Discussão

76

7) Discussão

7.1) Expressão de TRAs no estroma timo

O timo é um órgão complexo formado pelo estroma, o qual é dividido em

medula e córtex formados respectivamente pelas células epiteliais medulares (mTEC) e

epiteliais corticais (cTEC). Além destas, outros tipos celulares são ali encontrados

formando o microambiente tímico, que são as células dendríticas, os macrófagos, os

fibroblastos e as células endoteliais (VAN EWIJK et al, 1991 e GRAY et al, 2002).

Durante a fase em que o timo se encontra em plena atividade, ou seja, do nascimento a

puberdade, contribuindo com o repertório de células T, a proporção entre os timócitos e

estroma é alta (GRAY et al, 2006). Com o avanço da idade, este órgão passa por um

processo natural de involução, e esta proporção se altera.

Portanto, para o estudo da expressão gênica promíscua, propriedade do estroma

tímico (células TEC) que compõe o estroma, nos atentamos para este fenômeno e

estudou-se somente animais adultos jovens.

Entretanto, foi necessário aplicar um método de separação do estroma tímico. O

procedimento escolhido foi baseado no trabalho de GRAY, et al (2002), no qual o timo

é fragmentado e passa por um processo de agitação em meio de cultura celular

possibilitando a remoção dos timócitos da “malha” do estroma para o meio.

Como, infelizmente, este processo não é de todo eficiente, devido à alta

aderência do estroma com os timócitos, realizamos um monitoramento da presença

destas últimas em nossas preparações de estroma. Utilizamos para isto a detecção do

RNAm do receptor CD3e que é específico de linfócitos T por PCR.

Reconhece-se que a técnica utilizada para o estudo do estroma tímico não foi de

todo eficiente, devido a detecção de RNAm do gene CD3e nas amostras utilizadas,

comprovando assim a presença de linfócitos T (Figura 15); e que a obtenção de uma

amostra pura utilizando-se marcadores celulares específicos seria ideal. Entretanto, as

amostras apresentaram uma depleção de timócitos, já que muitos deles foram

encontrados no meio de cultura. Além disso, os genes são analisados utilizando-se uma

Discussão

77

ferramenta que possibilita a identificação da expressão de cada gene em diferentes

órgãos e tecidos, entre eles os linfócitos T e B. Assim, essa técnica permitiu a detecção

daqueles genes que estariam sendo expressos pelos linfócitos T no timo, e foi dada

continuidade ao estudo de expressão gênica promíscua (PGE).

O fenômeno da PGE, descrito como a capacidade das TECs de expressar

antígenos ectópicos vem sendo amplamente estudada, e grande parte desses antígenos

parecem estar sob a influência de um fator transcricional denominado Aire (do inglês

autoimmune regulator). A expressão deste gene foi observada em órgãos linfóides,

especialmente o timo, e em grande parte nas células epiteliais tímicas (TECs), fato este

que relacionou sua função ao fenômeno de PGE (ANDERSON et al, 2002 e 2005).

Portanto, a descrição da expressão do gene Aire em nossas amostras de estroma

tímico, tanto de animais controle como dos imunizados, representou uma base para

considerarmos que o fenômeno da PGE nas linhagens de camundongos estudadas

poderia estar sob o controle deste gene (Figura 15).

Entretanto, nem todos os antígenos expressos pelo timo estão sob controle do

gene Aire como por exemplo a proteína C-reativa e ácido glutâmico descarboxilase de

67kDa (Gad67) (DERBINSKI et al, 2005).

Alguns dos antígenos sabidamente considerados TRAs, estão bem descritos na

literatura em linhagens como C57BL/6, Balb-c, e na auto-imune NOD, que desenvolve

diabetes espontaneamente, ou seja, um modelo de auto-imunidade (DERBINSKI et al,

2001). Baseado nos trabalhos de Derbinski verificou-se a presença de alguns desses

antígenos, utilizando-se a técnica de PCR. Os genes de insulina 1 e 2 (Ins-1 e Ins-2) são

descritos como expressos pelas mTECs e controlados pelo gene Aire.

Observando a Figura 15, é possível notar a expressão do gene Ins-2 em todos os

diferentes grupos em estudo, ou seja, tanto nos controles quanto nos imunizados de

animais das linhagens DBA-1/J e DBA-2/J. Isso mostra que a expressão deste gene

parece não ser alterada pelo processo de auto-imunidade em um modelo de AR, nem

pela susceptibilidade a doença. Porém, com relação ao gene Ins-1 foi observado uma

expressão diferenciada, expressando mais nos grupos controle de ambas as linhagens,

quando comparados aos respectivos grupos imunizados. Isto sugere que seu padrão de

expressão está sendo alterado durante o processo de imunização.

Discussão

78

O gene Gad67 codifica um TRA, e é expresso também em mTECs, e apesar de

não estar sob o controle do gene Aire, também mostra uma expressão diferenciada,

expressando mais nos grupos controles de ambas as linhagens, e assim como o gene

Ins-1, sua expressão também está sendo alterada durante o processo de imunização que

leva a indução da AR (Figura 15).

Finalmente, no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), utilizado neste

trabalho, o desenvolvimento de artrite é atribuído grande parte a ação de linfócitos T

auto-reativos contra o colágeno de tipo II, uma proteína abundante nas articulações

(HOLMDAHL et al 1990; WOOLEY et al 1981; SEKI et al 1988).

Da mesma maneira como procedido para os auto antígenos acima mencionados,

investigamos a expressão do pró-colágeno II no estroma tímico, já que o colágeno II é

reconhecido como principal alvo das reações auto-imunes na AR. Como neste trabalho

tenta-se discutir o modelo de CIA no contexto da expressão promíscua de auto-

antígenos no timo, o resultado apresentado na Figura 15 passou a ser de especial

interesse. Na linhagem DBA-1/J que é susceptível a indução de AR, detectou-se

redução na expressão de RNAm de pró-colágeno II quando estes animais foram

imunizados. Já na linhagem DBA-2/J, refratária a AR, a expressão deste RNAm

continuou mesmo nos animais imunizados. Este resultado pode ser visualizado a partir a

diluição 1:4 da reação de PCR.

Consegue-se explicar este resultado no contexto da PGE: a redução da expressão

de RNAm de colágeno II no timo dos animais DBA-1/J imunizados poderá implicar na

redução da seleção negativa de linfócitos auto-reativos contra o colágeno II

possibilitando assim a reação auto-imune na periferia. Como na linhagem DBA-2/J a

expressão deste RNAm foi mantida tanto nos controles como nos imunizados, presume-

se que tenha havido seleção negativa dos ditos linfócitos auto-reativos, explicando

assim a refração desta linhagem a indução de AR.

Salienta-se que o fenômeno da PGE é avaliado a nível de transcrição de RNAm.

Reconhecemos que a comprovação da expressão do respectivo polipeptídeo na

superfície das células TEC muito enriqueceria este achado.

Discussão

79

7.2) Avaliação do silenciamento do gene Aire

A utilização de RNA interferente (RNAi) na pesquisa tem sido amplamente

difundida, pois a possibilidade de “silenciar” a expressão de genes pode levar a

aplicações na pesquisa básica como no seu uso (CHEN et al, 2003; STRILLACCI et al,

2006).

Neste trabalho, esta tecnologia foi útil para o estudo de um gene de grande

importância para o fenômeno de PGE, o gene Aire. Este gene, quando mutado é

responsável por uma rara síndrome humana, de caráter monogênico, a APS-1, em cuja

manifestação há doença auto- imune (FINNIISH-GERMAN 1997; NAGAMINE et al,

1997). Com a descoberta de que o gene AIRE é o responsável por esta síndrome, houve

muito interesse em saber seu papel no controle da PGE e conseqüentemente na

tolerância imunológica. A associação deste gene com o fenômeno da PGE surgiu após a

detecção de sua expressão nas mTECs, as quais expressam TRAs no timo.

Evidências obtidas com camundongo Aire knockout demonstraram que o gene

Aire é um fator transcricional, responsável pela regulação da expressão de grande parte

destes antígenos ectópicos, sendo, portanto de grande importância para os processos de

seleção de linfócitos T no timo (ZUKLYS et al, 2000; ANDERSON et al, 2002).

Inicialmente ensaiamos o silenciamento do gene Aire utilizando células mTEC

de C57Bl/6 em cultura (figuras 17) para depois passarmos para os testes com os timos

intactos de DBA-2/J em ATOC.

A seqüência de RNAi anti Aire utilizada neste trabalho (Figura 19) silenciou

parcialmente o gene em questão (figura 20). Entretanto, este silenciamento parcial foi

suficiente para desregular alguns genes que codificam possíveis TRAs no timo. O grupo

de genes discutidos mostra claramente um padrão de repressão no estroma tímico de

DBA-2/J tratado com RNAi anti-AIRE quando comparados ao controle (Figura 23).

Como abordado anteriormente, o significado do controle do gene Aire no timo

foi observado em estudos com animais Aire-knockout. A ausência deste gene promove o

aparecimento de auto-anticorpos, especialmente contra antígenos de olho e de estômago

(DEVOSS et al 2006; GAVANESCU et al 2007), sendo suficiente para causar auto-

imunidade.

Discussão

80

Os dados encontrados no presente trabalho corroboram com os autores supra

citados, pois o estroma tímico de DBA-2/J tratado com RNAi anti-Aire passou a

expressar menor número de genes associados a olho e sistema digestório, incluindo

estômago e, conseqüentemente, diminuindo a representação antigênica destes

órgãos.Quanto a representação de antígenos associados ao sistema locomotor, também

houve redução a níveis comparados com a linhagem DBA-1/J (Figura 26).

7.3) Expressão Gênica Promíscua do Timo

Os experimentos realizados em escala genômica objetivam avaliar os processos

biológicos como um todo, mas com precisão molecular. Usando a tecnologia dos cDNA

microarrays, a expressão dos mRNAs de milhares de genes pode ser mensurada

simultaneamente. O uso da bioinformática na análise da expressão gênica revela uma

profunda lógica molecular e biológica no entendimento da ativação e diferenciação

celulares. Genes que codificam componentes de um mesmo complexo multi-protéico

estão sob regulação coordenada. Esta regulação coordenada é também observada entre

genes que apresentam seus produtos funcionais participando de um mesmo processo

biológico (STAUDT & BROWN, 2000).

A tolerância ao próprio do repertório de células T é adquirido pela interação de

seus receptores aos peptídeos ligados ao MHC, por isso a diversidade de antígenos

expressos no timo é de grande importância.

A expressão de antígenos ectópicos no timo é chamada de expressão gênica

promíscua, sendo uma propriedade fisiológica característica principalmente das

chamadas mTECs, e parece ser a base da indução do processo de tolerância (KYEWSKI

et al, 2002). Assim abriram-se perspectivas para se determinar a modulação e a extensão

da PGE em duas diferentes linhagens de camundongo, a DBA-1/J que se mostra

susceptível à indução de AR, e a DBA-2/J, que ao contrário se mostra resistente a

doença, avaliando se essa susceptibilidade/resistência tem como base o fenômeno da

PGE.

A expressão gênica promíscua é identificada atualmente pela análise de dados de

microarray dos diferentes genes órgão-específicos representados no timo de

camundongo, usando informação combinada do banco de dados público GNF Gene

Discussão

81

Expression Atlas (http://symatlas.gnf.org/SymAtlas) (SU et al, 2004). Este banco de

dados mostra a expressão gênica de mais 60 tecidos/órgão do camundongo avaliada

com microarrays da Affymetrix (http://www.affymetrix.com) (Figura 24). A

informação dos dados inclui o acesso ao GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/), a localização cromossômica e a função

molecular/biológica de cada gene analisado.

No presente trabalho, consideraram-se somente os genes promíscuos cuja

expressão foi significativamente induzida no timo (como indicado pelo algoritmo do

programa SAM) e detectada em órgãos ou tecidos diferentes, além do timo, e cujos

níveis de expressão forma maiores que a expressão média com relação a todos os órgãos

restantes que aparecem no Atlas GNF. A extensão da representação do próprio inclui a

maioria, senão todos os tecidos e órgãos parenquimais, representando um fenômeno

complexo e envolve 5-10% de todos os genes conhecidos de camundongos e humanos.

Os diferentes pools de genes não são complementares, mas sim aditivos, isto é, não

existe associação aparente entre a função molecular/biológica respectiva dos genes nos

órgãos parenquimatosos, o que pôde ser observado em nossos resultados.

Assim, o projeto de microarrays e a estringência estatística usada no programa

SAM, permitiram a observação da manifestação da PGE na indução de auto-imunidade,

aqui representada pela artrite reumatóide, demonstrando diferentes perfis de indução

entre os animais da linhagem susceptível (DBA-1/J), comparados a linhagem resistente

(DBA-2/J). Além disso, as duas linhagens foram agrupadas separadamente no programa

Cluster & TreeView, e em conjunto esses dados já inferem claramente que a

susceptibilidade/resistência a doença tem como base eventos moleculares ocorridos no

timo ( Figura 22).

A artrite reumatóide é uma doença severa, cujas manifestações clínicas ocorrem

predominantemente nas articulações. É caracterizada por hiperplasia, angiogênese,

infiltrados mono e polinucleares, além de anquilose e intensa resposta inflamatória na

sinóvia, responsável por uma destruição da cartilagem e óssea irreversíveis, causando

muita dor, e levando a disfunção (LIPPINCOTT & WILKING, 1999). Partindo destas

informações realizou-se um estudo mais refinado da PGE no modelo de AR.

Como a doença atinge primaria e preferencialmente as articulações, foi-se

averiguar os genes cuja expressão foi detectada no sistema locomotor. A representação

Discussão

82

destes genes encontrados no estroma tímico de camundongos DBA-1/J, é menor quando

comparada a linhagem DBA-2/J. Além disso, dentro deste sistema, foram selecionados

os genes que codificam para proteínas localizadas na matriz extracelular, local de

ocorrência de muitos dos eventos característicos da doença.

Genes identificados como codificadores de TRAs do sistema locomotor no timo de

DBA-1/J.

Dentre os genes induzidos no estroma tímico da linhagem DBA-1/J (cluster

indicado pela barra em roxo, figura 22), os quais codificam proteínas encontradas na

matriz extracelular, foi possível destacar dois genes; o TNF-alpha (Tumor necrosis

factor), que codifica uma citocina pró-inflamatória, e o Tgfb-1 (Transforming growth

factor, beta 1), que codifica uma citocina anti-inflamatória. Em termos de

representação antigênica de órgãos e tecidos no timo, ambos foram associados ao

sistema locomotor.

Genes identificados como codificadores de TRAs do sistema locomotor no timo de

DBA-2/J.

Na linhagem DBA-2/J, resistente a indução de AR, encontrou-se maior número

de genes que codificam proteínas encontradas na matrix extracelular (cluster indicado

pela barra azul, figura 22). Os genes observados incluem o C3 (Complement

component 3), que codifica uma proteína central do sistema do complemento; o gene

Hcst (Hematopoietic cell signal transducer), que por sua vez, codifica uma proteína

chamada DAP10, classificada como uma molécula transmembrana adaptadora; o gene

Tnfrsf13b (Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 13b) que codifica

uma proteína estimuladora de linfócitos B, membro da superfamília do TNF, chamada

BLyS; o gene Sdf2 (Stromal cell derived factor 2) codifica uma proteína secretora de

linhagens de células estromais de camundongo; e o gene Lamp1 (Lysosomal-

associated membrane protein 1), que codifica uma proteína lisossomal associada a

membrana.

Embora tenha sido mencionado as proteínas codificadas por cada um desses

genes de TRAs, é importante ressaltar que no presente trabalho não é focado suas

Discussão

83

respectivas funções biológicas e/ou moleculares, mas sim sua representação antigênica

no timo.

No contexto deste trabalho, os antígenos do sistema locomotor receberam maior

atenção por razões óbvias. Observou-se que no estroma tímico da linhagem DBA-1/J

houve expressão de menor número desses antígenos comparado com a linhagem DBA-

2/J. Levando em conta que a primeira linhagem é sensível a indução de AR, este achado

sugere que a menor diversidade de TRAs de sistema locomotor no timo poderá atenuar

a seleção negativa de linfócitos T auto-reativos, contribuindo assim com o processo de

auto-imunidade (Figura 25).

Além disso, a observação de que o RNAm de pró-colágeno II tem sua

transcrição diminuída no estroma tímico de animais DBA-1/J submetidos ao esquema

de imunização, reforçou ainda mais a sugestão apresentada (Figura 15).

Os resultados deste trabalho são importantes para um melhor entendimento dos

processos genético-moleculares que ocorrem no estroma tímico importantes para a

indução de tolerância imunológica central e em particular para o sistema-modelo de

indução de artrite reumatóide.

CONCLUSÕES

Conclusões

85

8) Conclusões

Camundongos DBA-1/J e DBA-2/J apresentam diferenças no repertório de

genes de TRAs expressos no estroma tímico e, portanto, diferindo em seus

respectivos padrões de PGE.

As diferenças encontradas envolvem expressão de genes de antígenos do sistema

locomotor.

A expressão de RNAm de pró-colágeno II, principal antígeno alvo na AR, no

estroma tímico foi reduzida nos animais DBA-1/J imunizados.

O gene Aire controla um conjunto de genes de TRAs incluindo aqueles

associados ao sistema locomotor, olho e sistema digestório, incluindo estômago.

REFERÊNCIAS

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ANEXO I

Tabela 2. Genes diferencialmente expressos (160) e com significância estatística de acordo com o programa SAM (FDR = 0,05 e delta = 0,162) em amostra de estroma tímico comparando as linhagens DBA-1/J e DBA-2/J.

CloneID Símbolo dos genes Nomes dos genes

IMAGE:582859 Smarcd2 SWI/SNF related, matrix

associated, actin dependent

regulator of chromatin,

subfamily d, member 2

IMAGE:640659 Srpk2 Serine/arginine-rich protein

specific kinase 2

IMAGE:640027 Data not found

IMAGE:2645608 Il6 Interleukin 6

IMAGE:639922 Birc6 Baculoviral IAP repeat-

containing 6

IMAGE:582879 Data not found

IMAGE:583528 Ccdc98 Coiled-coil domain

containing 98

IMAGE:583529 Data not found

IMAGE:576828 Ccl6 Chemokine (C-C motif)

ligand 6

IMAGE:638872 Wdr26 WD repeat domain 26

IMAGE:641098 Data not found

IMAGE:640110 In multiple clusters

IMAGE:583825 Data not found

IMAGE:640282 Bcap31 B-cell receptor-associated

protein 31

IMAGE:574533 Cutl1 Cut-like 1 (Drosophila)

IMAGE:573667 H2-K1 Histocompatibility 2, K1, K

region

IMAGE:640898 Sfrs1 Splicing factor,

arginine/serine-rich 1

(ASF/SF2)

IMAGE:5181343 CD80 CD80 molecule

IMAGE:582991 Sh3gl1 SH3-domain GRB2-like 1

IMAGE:583202 Zcchc6 Zinc finger, CCHC domain

containing 6

IMAGE:583131 Sfrs5 Splicing factor,

arginine/serine-rich 5

(SRp40, HRS)

IMAGE:573651 Def6 Differentially expressed in

FDCP 6

IMAGE:582824 Rgs10 Regulator of G-protein

signalling 10

IMAGE:583178 Mpp1 Membrane protein,

palmitoylated

IMAGE:574707 Lamp1 Lysosomal membrane

glycoprotein 1

IMAGE:583716 Mis12 MIS12 homolog (yeast)

IMAGE:582250 Data not found

IMAGE:575047 Sugt1 SGT1, suppressor of G2

allele of SKP1 (S. cerevisiae)

IMAGE:1328063 Il18 Interleukin 18

IMAGE:574088 Ifit2 Interferon-induced protein

with tetratricopeptide repeats

2

IMAGE:1327907 Zwint ZW10 interactor

IMAGE:5766881 IL18 Interleukin 18 (interferon-

gamma-inducing factor)

IMAGE:260035 IRF5 Interferon regulatory factor 5

IMAGE:574153 Data not found

IMAGE:639852 Bsg Basigin

IMAGE:576409 Nkx6-2 NK6 transcription factor

related, locus 2 (Drosophila)

IMAGE:575123 Rps20 Ribosomal protein S20

IMAGE:576731 Dedd Death effector domain-

containing

IMAGE:640580 Arl1 ADP-ribosylation factor-like

1

IMAGE:640263 In multiple clusters

IMAGE:1282235 Hivep2 Human immunodeficiency

virus type I enhancer binding

protein 2

IMAGE:576539 Mapk8ip3 Mitogen-activated protein

kinase 8 interacting protein 3

IMAGE:575266 Data not found

IMAGE:574422 Ly6a Lymphocyte antigen 6

complex, locus A

IMAGE:582931 Arntl Aryl hydrocarbon receptor

nuclear translocator-like

IMAGE:582917 C3 Complement component 3

IMAGE:576164 Slc12a6 Solute carrier family 12,

member 6

IMAGE:582778 Tnpo2 Transportin 2 (importin 3,

karyopherin beta 2b)

IMAGE:640698 Prkd2 Protein kinase D2

IMAGE:574837 Hcst Hematopoietic cell signal

transducer

IMAGE:573632 Btg2 B-cell translocation gene 2,

anti-proliferative

IMAGE:576262 Fmnl3 Formin-like 3

IMAGE:573640 Data not found

IMAGE:573637 Sdf2 Stromal cell derived factor 2

IMAGE:583592 Rgs1 Regulator of G-protein

signaling 1

IMAGE:574381 Unc84b Unc-84 homolog B (C.

elegans)

IMAGE:641072 Hspa14 Heat shock protein 14

IMAGE:575392 Ebag9 Estrogen receptor-binding

fragment-associated gene 9

IMAGE:582268 A630038E17Rik RIKEN cDNA A630038E17

gene

IMAGE:576085 Data not found

IMAGE:576679 Itk IL2-inducible T-cell kinase

IMAGE:573863 Ifngr2 Interferon gamma receptor 2

IMAGE:583468 Transcribed locus

IMAGE:574058 Data not found

IMAGE:576040 Cope Coatomer protein complex,

subunit epsilon

IMAGE:576252 Bat2d BAT2 domain containing 1

IMAGE:575468 Tnfrsf13b Tumor necrosis factor

receptor superfamily, member

13b

IMAGE:576236 4930427A07Rik RIKEN cDNA 4930427A07

gene

IMAGE:574316 Data not found

IMAGE:575230 Mark2 MAP/microtubule affinity-

regulating kinase 2

IMAGE:575300 Ccnd3 Cyclin D3

IMAGE:575732 Tpr Translocated promoter region

IMAGE:583471 Tspan3 Tetraspanin 3

IMAGE:640882 Trmt5 TRM5 tRNA

methyltransferase 5 homolog

(S. cerevisiae)

IMAGE:575796 Anapc2 Anaphase promoting complex

subunit 2

IMAGE:575958 Data not found

IMAGE:574375 Map2k1ip1 Mitogen-activated protein

kinase kinase 1 interacting

protein 1

IMAGE:30850 Rasa2 RAS p21 protein activator 2

IMAGE:575276 MMP17 Matrix metallopeptidase 17

(membrane-inserted)

IMAGE:577716 AI316807 Expressed sequence

AI316807

IMAGE:583712 Neil1 Nei endonuclease VIII-like 1

(E. coli)

IMAGE:582369 Jmjd3 Jumonji domain containing 3

IMAGE:582449 Irgm Immunity-related GTPase

family, M

IMAGE:582517 Cd69 CD69 antigen

IMAGE:581748 Mecp2 Methyl CpG binding protein

2

IMAGE:1263539 2610318N02Rik

RIKEN cDNA 2610318N02

gene

IMAGE:5213134 TNF

Tumor necrosis factor (TNF

superfamily, member 2)

IMAGE:639913 Data not found

IMAGE:5228776 CASP8

Caspase 8, apoptosis-related

cysteine peptidase

IMAGE:639854 D930015E06Rik

RIKEN cDNA D930015E06

gene

IMAGE:640959 Gramd1a

GRAM domain containing

1A

IMAGE:576194 Data not found

IMAGE:640924 Data not found

IMAGE:582815 Wasl

Wiskott-Aldrich syndrome-

like (human)

IMAGE:640743 Zfp496 Zinc finger protein 496

IMAGE:640501 Prss16 Protease, serine, 16 (thymus)

IMAGE:640309 Data not found

IMAGE:640212 In multiple clusters

IMAGE:640817 Data not found

IMAGE:640588 Data not found

IMAGE:641099 Data not found

IMAGE:640264 Data not found

IMAGE:640540 Data not found

IMAGE:583544 Data not found

IMAGE:640429 Data not found

IMAGE:639710 Data not found

IMAGE:583054 Data not found

IMAGE:573414 Hrbl

HIV-1 Rev binding protein-

like

IMAGE:640958 Rab14

RAB14, member RAS

oncogene family

IMAGE:640936 Hnrpdl

Heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein D-like

IMAGE:576815 Xcl1 Chemokine (C motif) ligand 1

IMAGE:640957 Data not found

IMAGE:640633 Data not found

IMAGE:640354 2310057D15Rik RIKEN cDNA 2310057D15

gene

IMAGE:640178 Gprk6

G protein-coupled receptor

kinase 6

IMAGE:583464 Data not found

IMAGE:641019 In multiple clusters

IMAGE:640405 Data not found

IMAGE:583462 Data not found

IMAGE:640837 Data not found

IMAGE:640861 Data not found

IMAGE:582950 Fbxl20

F-box and leucine-rich repeat

protein 20

IMAGE:640886 Prkrir

Protein-kinase, interferon-

inducible double stranded

RNA dependent inhibitor,

repressor of (P58 repressor)

IMAGE:640766 Data not found

IMAGE:640611 Stambpl1 Stam binding protein like 1

IMAGE:573147 Tcea3

Transcription elongation

factor A (SII), 3

IMAGE:583743 Rsnl2 Restin-like 2

IMAGE:583838 Glrx5

Glutaredoxin 5 homolog (S.

cerevisiae)

IMAGE:639880 Sri Sorcin

IMAGE:640384 Data not found

IMAGE:641101 Cotl1

Coactosin-like 1

(Dictyostelium)

IMAGE:640964 Brwd1

Bromodomain and WD repeat

domain containing 1

IMAGE:640265 Cflar

CASP8 and FADD-like

apoptosis regulator

IMAGE:640527 Data not found

IMAGE:640119 Transcribed locus

IMAGE:583048 Data not found

IMAGE:640582 Cecr5

Cat eye syndrome

chromosome region,

candidate 5 homolog (human)

IMAGE:583486 Zfr

Zinc finger RNA binding

protein

IMAGE:640660 Data not found

IMAGE:1527793 1700010I14Rik

RIKEN cDNA 1700010I14

gene

IMAGE:1226515 In multiple clusters

IMAGE:640578 Bap1 Brca1 associated protein 1

IMAGE:136821 TGFB1

Transforming growth factor,

beta 1 (Camurati-Engelmann

disease)

IMAGE:0 Data not found

IMAGE:641035 Data not found

IMAGE:641123 Data not found

IMAGE:583901 Mcm10

Minichromosome

maintenance deficient 10 (S.

cerevisiae)

IMAGE:641153 Data not found

IMAGE:573037 2310035C23Rik

RIKEN cDNA 2310035C23

gene

IMAGE:640194 Mll1

Myeloid/lymphoid or mixed-

lineage leukemia 1

IMAGE:640770 Data not found

IMAGE:583218 Data not found

IMAGE:640674 Data not found

IMAGE:1330038 Fbxo46 F-box protein 46

IMAGE:640290 Suhw2

Suppressor of hairy wing

homolog 2 (Drosophila)

IMAGE:640722 Cast Calpastatin

IMAGE:640338 Cdk4 Cyclin-dependent kinase 4

Tabela 3. Genes diferencialmente expressos (26) e com significância estatística de acordo com o programa SAM (FDR = 0,05 e delta = 0,322) em ATOC de animais da linhagen DBA-2/J, tratados com RNAi anti-Aire.

CloneID Símbolo dos genes Nomes dos genes

IMAGE:576305 Trim24 Tripartite motif protein 24

IMAGE:641132 Lypla1 Lysophospholipase 1

IMAGE:574250 Mapk1

Mitogen activated protein

kinase 1

IMAGE:575924 Gch1 GTP cyclohydrolase 1

IMAGE:573572 Hnrpa1

Heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein A1

IMAGE:583488 Taf12

TAF12 RNA polymerase II,

TATA box binding protein

(TBP)-associated factor

IMAGE:583330 Data not found

IMAGE:576200 Tcf7

Transcription factor 7, T-cell

specific

IMAGE:583295 Data not found

IMAGE:574060 Bcap31

B-cell receptor-associated

protein 31

IMAGE:640025 Ndufa11

NADH dehydrogenase

(ubiquinone) 1 alpha

subcomplex 11

IMAGE:573637 Rgs1

Regulator of G-protein

signaling 1

IMAGE:583741 Data not found

IMAGE:577721 Foxo3a Forkhead box O3a

IMAGE:575254 Data not found

IMAGE:574058 Cope

Coatomer protein complex,

subunit epsilon

IMAGE:639878 Map3k7ip1

Mitogen-activated protein

kinase kinase kinase 7

interacting protein 1

IMAGE:639711 Data not found

IMAGE:640358 Rtn4 Reticulon 4

IMAGE:640278 Zhx1 Zinc fingers and homeoboxes

protein 1

IMAGE:639735 Data not found

IMAGE:640860 Data not found

IMAGE:640305 Data not found

IMAGE:640966 Data not found

IMAGE:639758 Tagap1

T-cell activation GTPase

activating protein 1

IMAGE:640886 Prkrir

Protein-kinase, interferon-

inducible double stranded

RNA dependent inhibitor,

repressor of (P58 repressor)

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