análise da biogênese de micrornas na cardiomiopatia .6.4 limitações e garantia da qualidade

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  • Darlan da Silva Cndido

    Anlise da biognese de microRNAs na

    cardiomiopatia chagsica crnica

    Dissertao apresentada a Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias

    Programa de Alergia e Imunopatologia

    Orientadora: Profa. Dra. Ludmila Rodrigues Pinto Ferreira

    So Paulo

    2017

  • Darlan da Silva Cndido

    Anlise da biognese de microRNAs na

    cardiomiopatia chagsica crnica

    Dissertao apresentada a Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias

    Programa de Alergia e Imunopatologia

    Orientadora: Profa. Dra. Ludmila Rodrigues Pinto Ferreira

    So Paulo

    2017

  • Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

    Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

    reproduo autorizada pelo autor

    Cndido, Darlan da Silva Anlise da biognese de microRNAs na cardiomiopatia chagsica crnica / Darlan da Silva Cndido. -- So Paulo, 2017.

    Dissertao(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo.

    Programa de Alergia e Imunopatologia.

    Orientadora: Ludmila Rodrigues Pinto Ferreira. Descritores: 1.Cardiomiopatia chagsica 2.Doena de Chagas 3.MicroRNAs

    4.Biognese de microRNAs 5.Dicer1 protena, humana 6.Fibrose 7.Estresse oxidativo 8.Aldedo desidrogenase

    USP/FM/DBD-345/17

  • DEDICATRIA

    A Deus, ao universo, minha famlia, aos

    meus amigos. A tudo aquilo que faz bem e te

    centra. vida.

  • AGRADECIMENTOS

    minha orientadora, Dra. Ludmila Ferreira, por te me recebido de

    braos abertos, por me proporcionar uma das experincias mais

    enriquecedoras da minha vida, por todo o crescimento cientfico e pessoal, por

    cuidar de mim diversas vezes e pela amizade verdadeira. No poderia te

    agradecer o suficiente, Lud.

    Ao meu co-orientador, Dr. Edecio Cunha-Neto, por acreditar em mim e

    abrir as portas de seu laboratrio a fim de que eu pudesse desenvolver esse

    projeto encantador. Professor, obrigado de corao por apostar na minha

    capacidade e por me ensinar tanto.

    minha me, Vilma Alves, por ser minha me, amiga, minha f nmero

    um e por sempre acreditar em mim e me apoiar. Mesmo que isso signifique

    estar longe.

    Ligia Akemi e o Dr. Julio Ferreira, por todo o companheirismo e ajuda

    em contar essa histria to bonita. Em especial a Lgia, por todos os milhares

    de westerns, testes de atividade, risadas constantes, lanches do fisgado,

    cookies da fsica e pela amizade sincera.

    Andria Kuramoto (Dia), Victor Debbas e Patrcia Nolasco por toda

    ajuda com os interminveis westerns para protenas da biognese. Em especial

    a Dia por ser o principal apoio em nosso laboratrio e responder

    pacientemente as minhas centenas de perguntas dirias. Muito obrigado, Dia!

    minha amiga Amanda Cabral, no s pelo apoio na realizao deste

    trabalho, mas por me manter no centro, por dividir as tristezas e as alegrias,

    por me ensinar a conviver, respeitar e amar ao prximo do jeito que ele . Essa

    jornada nem de longe teria sido a mesma sem voc, Mands. Sou grato a Deus

    por ter colocado voc no meu caminho. OBS.: Chama minha me!

    Ao Vagner Carvalho, por ser muito mais que um colega de trabalho, mas

    um amigo que eu levarei para vida. Obrigado pelas discusses cientficas,

    pelos chs da tarde, pelos almoos no japa, pelas lies sobre trabalhos

    manuais e por ser esse poo sem fundo de assuntos interessantes. Valeu,

    Manolo!

  • Aos membros da minha banca de qualificao, Dra. Brbara Ianni, Dr.

    Emannuel Dias Neto e a Dra. Juliana Monte Real, por trazerem discusses to

    enriquecedoras e ajudarem a conceber este trabalho. Em especial a Dra

    Juliana pela ajuda tcnica e pela convivncia sempre to agradvel.

    Aos Dr. Frederico Ferreira e Helder Nakaya pelas diversas anlises

    estatsticas, bioinformtica e pelas sugestes presentes neste trabalho.

    equipe de transplante do InCor, a Monique Baron e Priscila Camillo

    Teixeira pelo trabalho rduo de coletar as amostras utilizadas neste trabalho.

    Aos companheiros de grupo Ramendra Patty, Marilda Savia, Almir e

    Ricardo Zaniratto pelo companheirismo, discusses cientficas, apoio e pelos

    happy hours!

    A todos os amigos e colaboradores do Laboratrio de Imunologia do

    InCor (LIM 19) pela convivncia diria, sorrisos, por todo o crescimento e

    ajuda. Em especial, a Fernanda Magalhes por sempre trazer felicidade aos

    meus dias e por ser um exemplo to bonito de acolhimento. Tambm, aos

    amigos do Laboratrio de Biologia Vascular, principalmente Tiffany, Perclia e

    Carol por me acolherem em seu convvio fora do laboratrio. OBS: Tiff tem os

    melhores abraos!

    s equipes dos Laboratrios de Integrao de Sistemas Biolgicos

    (LISB), Laboratrio de Biologia Vascular, Laboratrio de Patologia Pulmonar e

    do Hospital Srio Libans por todo o apoio tcnico prestado na realizao de

    experimentos.

    professora Dra. Maria de Ftima Oliveira, minha orientadora da

    graduao em farmcia, por me ensinar muito do que sei e por sempre me

    apoiar em tudo. Muito obrigado por sempre cuidar de mim.

    Ao Dr. Jorge Kalil por todo o apoio a minha jornada, por me receber em

    seu laboratrio e por enriquecer meu trabalho durante a sua disciplina.

    equipe do programa de ps-graduao, Eleni Arruda e Dr. sper

    Georges Kalls, pela prestatividade e resolutividade.

    A todos os meus amigos por me darem total apoio na minha jornada, por

    serem minha famlia longe de casa, por me darem tanto amor e por serem

    meus terapeutas voluntrios.

  • A So Paulo, por ser essa dualidade, por me ensinar tanto das formas

    mais difceis, por ser o lugar onde eu me perdi para me encontrar. Pelo

    autoconhecimento e por ver o mundo pela primeira vez. Gratido eterna

    Selva de Pedra.

    A Deus, por ser, por existir, por aprender, por mudar, por crescer. Pela

    vida, pois no h nada mais bonito que viver!

  • It takes courage...to endure the sharp pains

    of self-discovery rather than choose to take

    the dull pain of unconsciousness that would

    last the rest of our lives.

    Marianne Williamson

  • SUMRIO

    Lista de Abreviaturas

    Lista de Figuras e Tabelas

    Resumo

    Abstract

    1 INTRODUO .............................................................................................. 18

    1.1 Doena de Chagas .................................................................................. 19

    1.2 Fisiopatologia, tratamento e biomarcadores para a CCC ........................ 21

    1.3 MicroRNAs na CCC................................................................................. 25

    1.4 Biognese de miRNAs ............................................................................ 29

    1.5 Pontos regulatrios da biognese de miRNAs ........................................ 33

    1.6 Por que estudar a biognese de miRNAs no miocrdio de pacientes com

    CCC?............................................................................................................. 35

    2 HIPTESE ...................................................................................................... 0

    3 OBJETIVOS .................................................................................................. 40

    4 METODOLOGIA ............................................................................................ 42

    4.1 Delineamento experimental ..................................................................... 43

    4.2 Amostras de miocrdio humano .............................................................. 44

    4.3 Anlise da expresso gnica por PCR em tempo real (qPCR) ............. 46

    4.3.1 Extrao de RNA ........................................................................................................... 46

    4.3.2 Quantificao e integridade do RNA .................................................................... 47

    4.3.2 Transcrio Reversa .................................................................................................... 49

    4.3.4 Eficincia de amplificao ......................................................................................... 50

    4.3.5 Quantificao relativa por PCR em tempo real (qPCR).............................. 51

    4.3.6 Anlise da expresso de pr-miRNAs ................................................................ 53

    4.4 qPCR array para perfil de miRNAs .......................................................... 54

    4.5 Anlise da expresso proteica ................................................................ 56

    4.5.1 Extrao Proteica .......................................................................................................... 56

    4.5.2 Quantificao Proteica ................................................................................................ 57

  • 4.5.3 Anlise da expresso de protenaprotenas da maquinaria da

    biognese de miRNAs por Western Blot ........................................................................ 58

    4.6 Anlises de Bioinformtica ...................................................................... 59

    4.7Anlises estatsticas ................................................................................. 60

    5 RESULTADOS .........................................................................

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