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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ANA CARLA BALTHAR BANDEIRA

AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR DO LICOPENO EM UM MODELO DE

HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR PARACETAMOL EM CAMUNDONGOS

C57BL/6

OURO PRETO

MINAS GERAIS – BRASIL

2017

ANA CARLA BALTHAR BANDEIRA

AVALIAÇÃO DO EFEITO PROTETOR DO LICOPENO EM UM MODELO DE

HEPATOTOXICIDADE INDUZIDA POR PARACETAMOL EM CAMUNDONGOS

C57BL/6

Tese apresentada à Universidade Federal de Ouro

Preto, como parte das exigências do Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas, para obtenção do

título de Doutor em Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Bioquímica Metabólica e

Fisiológica

Orientadora: Profª Drª Daniela Caldeira Costa

Co-orientador: Prof. Dr. Frank Silva Bezerra

OURO PRETO

MINAS GERAIS – BRASIL

2017

iii

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,

mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou

o que deveria ser, mas graças a Deus, não sou o

que era antes.”

Marthin Luther King

Dedicatória

Bandeira, A.C.B.

iv

À minha mãe, Ana Cristina, e ao meu marido, Frank.

A paciência, força e compreensão de vocês foram

imprescindíveis para que eu seguisse em frente.

Agradecimento Especial

Bandeira, A.C.B.

v

AGRADECIMENTO ESPECIAL

À minha orientadora, Profª Drª Daniela Caldeira Costa, muito obrigada por esses

quatro anos que só fizeram me engrandecer como profissional e pessoa. Obrigada por me

receber de braços abertos em seu laboratório, quando nem mesmo me conhecia. Obrigada pela

confiança depositada em mim e por sempre acreditar que no final tudo daria certo. A sua

orientação foi essencial para que eu seguisse em frente. Sou grata por seus ensinamentos e

pelas discussões enriquecedoras. Sua dedicação, paciência, carinho e compreensão vão além

da orientação.

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Frank Silva Bezerra, obrigada por, efetivamente, me

co-orientar. Nossas discussões foram essenciais para o meu crescimento intelectual e

profissional. Sem dúvidas, você contribuiu muito para o desenvolvimento dessa tese.

Obrigada pelas palavras de apoio que sempre se fizeram presentes nos momentos certos.

Durante essa árdua jornada eu não estive apenas com orientadores ao meu lado, estive

ao lado de amigos.

Agradecimentos

Bandeira, A.C.B.

vi

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a Deus, a força divina que me guiou e me fez chegar até

aqui.

À minha mãe, mulher guerreira e sábia, que é tudo na minha vida. Obrigada pelo

incentivo que sempre me deu, pelas broncas, pelo amor e carinho, pelos conselhos e pelo colo

que nunca me negou. Se hoje sou o que sou eu devo a você. Amo-te incondicionalmente.

Agradeço ao meu marido, Frank, por tudo que nós sempre passamos juntos.

Obrigada por estar sempre ao meu lado, por torcer por mim e principalmente por acreditar em

mim. Você faz parte da minha vida e fez parte dessa etapa tão importante da minha história.

Tenho que agradecer o carinho, a paciência, a confiança, a amizade e as palavras de incentivo

tão importantes que você dispensou a mim nos momentos mais difíceis dessa jornada. Essa

conquista também é sua. Amo você!

Agradeço a minha família, em especial à minha avó, meu pai e meu tio, que são

pessoas que sempre torceram por mim e que rezam por mim todos os dias de suas vidas.

A toda equipe do Laboratório de Bioquímica Metabólica (LBM), Ana Carolina,

Karine, Pedro, Rafaella, Geisla, Karine Marinho, Sttefany. Aos novos e antigos integrantes,

obrigada pela ajuda, sugestões e amizade. Em especial agradeço ao Joamyr, Bruno, Carol,

Glaucy, Aline, Lorenza e Talita que apesar de não fazerem mais parte da equipe, foram

essenciais para o desenvolvimento desse projeto.

A equipe do Laboratório de Anatomia Humana da UFOP, obrigada pela

compreensão e apoio nos momentos nos quais tive que estar ausente.

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, obrigada

pelos importantes ensinamentos dispensados aos seus alunos.

Aos membros dos laboratórios LAFEX, LABNEX, LBBM, LABIIN e LIP, obrigada

por ceder espaço e equipamentos para a realização dos experimentos. Em especial, agradeço a

Keila e a Vivian.

Ao Prof. Wanderson Geraldo de Lima e a Profª Silvia Dantas Cangussú, pela

essencial ajuda com as análises histológicas.

Agradecimentos

Bandeira, A.C.B.

vii

Ao Sr. Jair e ao Aldo pela essencial ajuda com os animais e pela companhia no

biotério.

A todos os funcionários e colegas do Departamento de Ciências Biológicas e Escola

de Medicina.

Aos colegas e professores do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB)

e a Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

Aos meus velhos e eternos amigos, muito obrigada! O que seria da vida sem

amigos?! Especialmente Dani, Geísa, Carla, Akinori, Marco, Dudu, Jackson, Claudinha.

Apesar da distância sempre estiveram ao meu lado. Saudades...

Agradeço a empresa BASF por, gentilmente, nos ceder amostras do Lycovit

Dispersion 10 %, que foram essenciais para o desenvolvimento dos experimentos.

Enfim, a todos que fazem ou fizeram parte de alguma forma desse trabalho!!!

Agradecimentos aos Colaboradores

Bandeira, A.C.B.

viii

AGRADECIMENTO AOS COLABORADORES

Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX)

Laboratório de Fisiopatologia Experimental (LAFEX)

Laboratório de Imunobiologia da Inflamação (LABIIN)

Laboratório de Morfopatologia

Laboratório de Multiusuários/NUPEB

Muito obrigada pelo suporte necessário.

Apoio Financeiro

Bandeira, A.C.B.

ix

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Bioquímica Metabólica (LBM),

Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX) e no Laboratório de Fisiopatologia

Experimental (LAFEX) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Ouro Preto com o auxílio financeiro da FAPEMIG (nº APQ-01440-13), CAPES,

CNPq e UFOP

http://everest.fapemig.br/solicitacao/termo/APQ-01440-13

Sumário

Bandeira, A.C.B.

x

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS............................................................................................... 13

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... 14

LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................. 16

RESUMO................................................................................................................... 20

ABSTRACT.............................................................................................................. 21

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................... 22

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................. 24

2.1 O fígado e o metabolismo de xenobióticos......................................................... 24

2.2 Lesões hepáticas induzidas por drogas e o paracetamol...................................... 25

2.3 Estresse Oxidativo............................................................................................... 29

2.3.1 Sistema antioxidante......................................................................................... 32

2.4 Licopeno.............................................................................................................. 36

3. OBJETIVOS.......................................................................................................... 41

3.1 Objetivo geral...................................................................................................... 41

3.2 Objetivos específicos........................................................................................... 41

4. METODOLOGIA.................................................................................................. 43

4.1 Reagentes............................................................................................................. 43

4.2 Experimento 1: Análise temporal dos efeitos de uma dose tóxica do

paracetamol em camundongos...................................................................................

43

4.2.1 Animais............................................................................................................. 43

4.2.2 Indução da hepatotoxicidade............................................................................ 43

4.2.3 Análises e processamento do material biológico............................................. 45

4.2.4 Análises sorológicas......................................................................................... 45

I. Alanina aminotransferase (ALT)............................................................................ 45

II. Aspartato transaminase (AST).............................................................................. 46

4.2.5 Análise das defesas antioxidantes.................................................................... 46

I. Sistema glutationa (GSHt, GSSG, GSH, e relação GSH/GSSG).......................... 46

4.3 Experimento 2: Análise dos efeitos protetores de uma dose única de licopeno

em camundongos eutanasiados 12 e 24 horas após a intoxicação por paracetamol..

47

4.3.1 Animais............................................................................................................. 47

4.3.2 Pré-tratamento com licopeno e indução da hepatotoxicidade......................... 47

4.3.3 Análises sorológicas......................................................................................... 48

Sumário

Bandeira, A.C.B.

xi

I. Colesterol total....................................................................................................... 49

II. Colesterol HDL..................................................................................................... 49

4.3.4 Análise das defesas antioxidantes.................................................................... 50

I. Atividade da glutationa peroxidase (GPx)............................................................. 50

II. Atividade da glutationa redutase (GR)................................................................. 51

III. Atividade da catalase (CAT)................................................................................ 51

IV. Atividade da superóxido dismutase (SOD)......................................................... 52

4.3.5 Proteínas totais................................................................................................. 52

4.3.6 Marcadores de dano oxidativo......................................................................... 53

I. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)......................................... 53

II. Proteína carbonilada............................................................................................ 54

4.3.7 Zimografia........................................................................................................ 55

4.3.8 Análise histológica e morfométrica.................................................................. 56

4.4 Experimento 3: Análise dos efeitos protetores do pré-tratamento prolongado

com licopeno em camundongos eutanasiados 12 horas após intoxicação por

paracetamol................................................................................................................

56

4.4.1 Animais............................................................................................................. 56

4.4.2 Pré-tratamento com licopeno e indução da hepatotoxicidade......................... 57

4.4.3 Atividade da superóxido dismutase (SOD)....................................................... 58

4.4.4 Dosagem de citocinas....................................................................................... 59

4.4.5 Ensaio de RT-PCR quantitativa em tempo real................................................ 60

I. Extração de RNA total............................................................................................ 60

II. Síntese do DNA complementar (cDNA)................................................................ 60

III. Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores........................................................ 61

IV. Curva de eficiência dos oligonucleotídeos iniciadores....................................... 61

V. RT-PCR quantitativa em tempo real..................................................................... 61

4.5 Análise estatística................................................................................................ 62

5. RESULTADOS.................................................................................................... 63

5.1 Análise temporal dos efeitos do paracetamol sobre a função hepática............... 63

5.2 Análise temporal dos efeitos do paracetamol sobre o sistema glutationa........... 64

5.3 Efeitos da dose única de licopeno sobre os parâmetros bioquímicos de função

hepática e indicadores séricos do perfil lipídico após intoxicação com

paracetamol................................................................................................................

65

Sumário

Bandeira, A.C.B.

xii

5.4 Efeitos da dose única de licopeno sobre o sistema glutationa no fígado de

camundongos intoxicados com paracetamol.............................................................

68

5.5 Efeitos da dose única de licopeno sobre as enzimas de defesa antioxidante no

fígado de camundongos intoxicados com paracetamol.............................................

69

5.6 Efeitos da dose única de licopeno sobre os marcadores de dano oxidativo no


71

5.7 Efeitos da dose única de licopeno sobre a atividade da gelatinase MMP-2 no


73

5.8 Efeitos da dose única de licopeno sobre a necrose tecidual hepática de

camundongos intoxicados com paracetamol.............................................................

75

5.9 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre os parâmetros

bioquímicos de função hepática e indicadores séricos do perfil lipídico após

intoxicação com paracetamol....................................................................................

77

5.10 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o sistema

glutationa no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol.......................

79

5.11 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre enzimas de

defesa antioxidante no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol........

81

5.12 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre os marcadores

de dano oxidativo no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol..........

82

5.13 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o perfil

inflamatório em camundongos intoxicados com paracetamol..................................

83

5.14 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a atividade da

gelatinase MMP-2 no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol.........

86

5.15 Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a necrose

tecidual hepática de camundongos intoxicados com paracetamol............................

88

6. DISCUSSÃO......................................................................................................... 91

7. CONCLUSÕES E SUMÁRIO.............................................................................. 103

8. LIMITAÇÕES DO ESTUDO............................................................................... 105

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 106

ANEXOS................................................................................................................... 120

Lista de Tabelas

Bandeira, A.C.B.

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Espécies reativas de oxigênio radicais e não radicais.............................. 32

Tabela 2. Principais antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos......................... 33

Tabela 3. Quantidade de licopeno em frutas e vegetais.......................................... 37

Tabela 4. Quantidade de licopeno em produtos derivados do tomate..................... 37

Tabela 5. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a análise qRT-PCR......... 61

Tabela 6. Parâmetros bioquímicos séricos.............................................................. 67

Tabela 7. Parâmetros bioquímicos séricos.............................................................. 78

Tabela 8. Razão da expressão de mRNA................................................................ 85

Tabela 9. Tabela comparativa dos efeitos do licopeno nos experimentos 2 e 3...... 104

Lista de Figuras

Bandeira, A.C.B.

14

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Metabolismo de xenobióticos.................................................................. 25

Figura 2. Ativação metabólica do paracetamol....................................................... 28

Figura 3. Estresse oxidativo mitocondrial e formação de peroxinitrito durante a

hepatotoxicidade induzida por APAP......................................................................

29

Figura 4. Sítios de produção fisiológica de EROs.................................................. 31

Figura 5. Mecanismos celulares de geração de oxidantes e sistema antioxidante.. 35

Figura 6. Fórmula estrutural representando as configurações all-trans e 5-cis-

licopeno....................................................................................................................

36

Figura 7. Desenho experimental representando o Experimento 1 e 2..................... 44

Figura 8. Cronologia experimental do Experimento 1............................................ 45

Figura 9. Cronologia experimental do Experimento 2............................................ 48

Figura 10. Desenho experimental representando o Experimento 3........................ 58

Figura 11. Cronologia experimental do Experimento 3.......................................... 58

Figura 12. Efeitos do paracetamol sobre a função hepática.................................... 63

Figura 13. Efeitos do paracetamol sobre o sistema glutationa................................ 65

Figura 14. Influência da dose única de licopeno sobre o sistema glutationa no

modelo de overdose por paracetamol.......................................................................

69

Figura 15. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade de glutationa

peroxidase e glutationa redutase no modelo de overdose por paracetamol.............

70

Figura 16. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade da catalase e

do superóxido dismutase no modelo de overdose por paracetamol.........................

71

Figura 17. Influência da dose única de licopeno sobre os marcadores de dano

oxidativo no modelo de overdose por paracetamol..................................................

72

Figura 18. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade de MMP-2 no

modelo de overdose por paracetamol.......................................................................

74

Figura 19. Fotomicrografia representativa e porcentagem de área de necrose

hepática......................................................................................................................

76

Figura 20. Influência da dose única de licopeno sobre a necrose tecidual hepática

no modelo de overdose por paracetamol...................................................................

77

Figura 21. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o

sistema glutationa no modelo de overdose por paracetamol....................................

80

Figura 22. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a

Lista de Figuras

Bandeira, A.C.B.

15

atividade de enzimas antioxidantes no modelo de overdose por paracetamol......... 81

Figura 23. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre

marcadores de dano oxidativo no modelo de overdose por paracetamol................

83


atividade de CCL2 e IL-22 no modelo de overdose por paracetamol.....................

84


atividade de MMP-2 no modelo de overdose por paracetamol................................

86

Figura 26. Fotomicrografia representativa da área de necrose hepática................. 89


porcentagem de área de necrose no modelo de overdose por paracetamol..............

90

Lista de Abreviaturas

Bandeira, A.C.B.

16

LISTA DE ABREVIATURAS

1O2 – Oxigênio singleto

A12 – Grupo paracetamol 12 horas

A24 – Grupo paracetamol 24 horas

ABTS – Ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)

AINES – Anti-inflamatórios não-esteroidais

ALT – Alanina aminotransferase

APAP – N-acetil-p-aminofenol (Paracetamol)

APO10LA – Ácido apo-10’-licopenóico

ARE – Elemento de resposta antioxidante

AST – Aspartato transaminase

Bcl-2 – Proteína célula-B de linfoma 2

BCO1 – β-caroteno 15,15 oxigenase

BCO2 – β-caroteno 9,10 oxigenase

BHT – Hidroxitolueno butilado

BSA – Albumina sérica bovina

C – Grupo controle

CaCl2 – Cloreto de Cálcio

CAT – Catalase

CCL-2 – Quimiocina ligante 2 (motivo C-C)

cDNA – DNA complementar

CEUA - Comitê de ética em pesquisa no uso de animais

CT – Colesterol total

CYP – Citocromo

DAMP – Padrões moleculares associados ao dano

DEPEC – Dietil pirocarbonato

DILI – Lesão hepática induzida por droga

DMSO – Dimetilsulfóxido

DNA – Ácido desoxirribonucléico

DNPH – 2,4-Dinitrofenilhidrazina

DNTB – Ácido 5,5´-Ditio-bis-(2-nitrobenzóico)

dNTPs – Desoxirribonucleotídeos fosfato

dT – Oligo


Bandeira, A.C.B.

17

EGTA – Ácido Bis(2- aminoetil) etilenoglicol-N,N,N',N'-tetraacético

ERNs – Espécies reativas de nitrogênio

EROs – Espécies reativas de oxigênio

FA – Frações aterogênicas

FDA – Food and Drug Administration

Fe2+ – Ferro

GCL – Glutamato cisteína ligase

GM-CSF – Fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos

GPx – Glutationa peroxidase

GR – Glutationa redutase

GSH – Glutationa reduzida

GSHt – Glutationa total

GSSG – Glutationa oxidada

GST – Glutationa-s-transferase

H2O – Água

H2O2 – Peróxido de hidrogênio

HCl – Ácido clorídrico

HDL – Lipoproteína de alta densidade

HE – Hematoxilina e eosina

HMGB1 – Proteína de alta mobilidade Box 1

HO-1 – Heme oxigenase-1

HOCl – Ácido hipocloroso

IGF-1 – Fator de crescimento insulina símile 1

IL-10 – Interleucina 10

IL-1β – Interleucina 1-beta





INFγ – Interferon gamma

IκB – Inibidor do kappa B

JNK – c-Jun N-terminal kinase

KCl – Cloreto de potássio


Bandeira, A.C.B.

18

L10+A12 – Grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h




LDL – Lipoproteína de baixa densidade

LPS – Lipopolissacarídeo

MAPK – Proteína quinase ativada por mitógenos

M-CSF – Fator estimulador de colônia de macrófagos

MgCl2 – Cloreto de magnésio

MMP-2 – Metaloproteinase de matriz 2

MTT – Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio]

NAD – Nicotinamida adenina dinucleotídeo

NADP – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NAN3 – Ázida de sódio

NaOH – Hidróxido de sódio

NAPQI – N-acetil-p-benzoquinona imina

NFR2 – Fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2

NFκB – Fator nuclear kappa B

NK – Natural killer

NKT – Célula T natural killer

NO – Óxido nítrico

O – Grupo óleo

O2 – Oxigênio molecular

O2˙ˉ – Radical superóxido

O3 – Ozônio

OH˙– Radical hidroxila

ONOOˉ – Peroxinitrito

ONOOH˙ – Ácido peroxinitroso

PBS – Tampão fosfato salino

PTP – Proteínas tirosina fosfatase

qPCR – Reação de cadeia de polimerase em tempo real

RNA – Ácido ribonucléico


Bandeira, A.C.B.

19

RNAm – Ácido ribonucléico mensageiro

RO˙– Radical alcoxila

ROO˙ – Radical peroxila

RT-PCR – Transcriptase reversa-reação em cadeia de polimerase

SDS – Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio

SOD – Superóxido dismutase

SR-B1 – Receptor scavenger classe B tipo 1

SSA – Ácido sulfossalicílico

STAT3 – Transdutor de sinal e ativador da transcrição 3

TBA – Ácido tiobarbitúrico

TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

Tc – Célula T citotóxica

TC – Threshold cycle

TCA – Ácido tricloroacético

TEA – Trietanolamida

TGFβ – Fator de crescimento e transformação beta

Th1 – Célula T helper 1



TNB – 5-tio-2-nitrobenzóico

TNF-α – Fator de necrose tumoral - alfa

Tx1 – Tioredoxina

UI – Unidades internacionais

VLDL – Lipoproteína de muito baixa densidade

Resumo

Bandeira, A.C.B.

20

RESUMO

O uso do paracetamol (APAP), um fármaco com efeitos antipiréticos e analgésicos, é a

principal causa de lesão hepática induzida por drogas. O modelo de lesão hepática induzida

por APAP é um dos modelos mais populares para testar potenciais agentes hepatoprotetores.

O licopeno é um carotenóide com alto poder antioxidante e, atualmente, vem sendo

amplamente estudado na prevenção de doenças. Estudos já demonstraram que o licopeno é

capaz de atuar modulando a expressão de enzimas do sistema citocromo P450 (CYP450) e

também a atividade de enzimas antioxidantes, ambas as vias relacionadas à inflamação

induzida pelo APAP. O presente estudo teve como objetivo estabelecer o modelo de

hepatotoxicidade induzida por APAP em camundongos e após o estabelecimento do modelo,

analisar os efeitos do pré-tratamento com o licopeno sobre a função e estrutura hepática de

camundongos intoxicados com APAP. Foram utilizados camundongos C57BL/6 machos e, no

Experimento 1, a eutanásia ocorreu 3, 6, 12 e 24 horas após a overdose de APAP (500 mg/kg,

dose única). No Experimento 2, os camundongos receberam as doses únicas (10 e 100 mg/kg)

de licopeno e foram eutanasiados 12 e 24 após a overdose de APAP. Finalmente, no

Experimento 3, os camundongos foram pré-tratados por 14 dias consecutivos com as doses de

licopeno (10 e 100 mg/kg) e posteriormente eutanasiados 12 horas após a overdose de APAP.

O Experimento 1 estabeleceu o modelo de intoxicação, onde observou-se a elevação das

enzimas ALT e AST, sendo que o pico do desequilíbrio redox ocorreu 12 horas após a

overdose, com a depleção do conteúdo de glutationa em sua forma reduzida (GSH). O

Experimento 2 mostrou que o licopeno regulou a GSH e a GSSG (glutationa oxidada),

reduziu o dano oxidativo sugerido pela diminuição principalmente da carbonilação de

proteínas, promoveu a redução da atividade de MMP-2 e reduziu as áreas de necrose hepática.

O Experimento 3 mostrou que o licopeno foi capaz de melhorar o desequilíbrio redox,

diminuindo a peroxidação lipídica e a carbonilação de proteínas e aumentando a atividade da

CAT e o conteúdo de GSH. Ainda, diminuiu a expressão do RNAm de IL-1β e a atividade de

MMP-2. Sendo assim, observamos em nosso estudo que o licopeno foi capaz de melhorar os

biomarcadores de estresse oxidativo causados pela intoxicação por APAP em camundongos

C57BL/6.

Palavras-chave: Paracetamol; APAP; Estresse oxidativo; Hepatotoxicidade; Licopeno;

Antioxidante

Abstract

Bandeira, A.C.B.

21

ABSTRACT

The use of acetaminophen (APAP), a drug with antipyretic and analgesic effects, is the main

cause of drug-induced liver injury. The APAP-induced liver injury model is one of the most

popular models to test potential hepatoprotective drugs. Lycopene is a carotenoid with high

antioxidant properties and currently has been widely studied in the prevention of diseases.

Studies have shown that lycopene can act by modulating the expression of cytochrome P450

system (CYP450) and also the activity of antioxidant enzymes, both pathways related to

inflammation induced APAP. This study aimed to establish the model of APAP-induced liver

injury in mice and, after that, to analyze the effects of the lycopene pretreatment in mice after

APAP overdose. Male C57BL/6 mice were used. In Experiment 1, euthanasia occurred 3, 6,

12 and 24 hours after APAP overdose (500 mg/kg, single dose). In Experiment 2, mice

received single doses (10 and 100 mg/kg) of lycopene and were euthanized 12 and 24 hours

after APAP overdose. Finally, in Experiment 3, mice were pre-treated for 14 consecutive days

with the doses of lycopene (10 and 100 mg/kg) and then euthanized 12 hours after APAP

overdose. The Experiment 1 established the hepatotoxicity model and it was observed the

elevation of ALT and AST enzymes. It was observed that the peak of the redox imbalance

occurred 12 hours after the overdose, showing GSH depletion. Experiment 2 showed that

lycopene regulated GSH, GSSG and CAT activity, reduced oxidative damage by decreasing

mainly protein carbonylation, caused a decrease in MMP-2 activity and reduced areas of liver

necrosis in C57BL/6 mice. Experiment 3 showed that lycopene has been able to improve the

redox imbalance, reducing lipid peroxidation and protein carbonylation and increasing the

activity of CAT and the content GSH. Also, decreased mRNA expression of IL-1β and MMP-

2 activity. Lycopene is a natural compound able to ameliorates the damage caused by APAP

overdose in C57BL/6 mice.

Keywords: Antioxidant; APAP; Oxidative stress; Hepatotoxicity; Lycopene; Acetaminophen

Introdução

Bandeira, A.C.B.

22

1. INTRODUÇÃO

O fígado é um órgão essencial para a manutenção do metabolismo corporal. Ele tem

estreita relação com o sistema imune inato auxiliando na remoção de estímulos nocivos. A

inflamação do fígado surge a partir de quaisquer agentes exógenos, tais como toxinas

ambientais ou a exposição a espécies reativas de oxigênio (EROs) endógenas (Lam et al.,

2016). Portanto, ele é particularmente suscetível a agressões e, a gravidade da lesão hepática

induzida por substâncias químicas varia entre pequenas modificações na estrutura e função

desse órgão à lesões agudas, cirrose e tumores malignos, no casos mais graves (Gu e

Manautou, 2012).

O organismo é constantemente exposto a uma variedade de xenobióticos (substâncias

químicas que não são produzidas normalmente pelo organismo) e, muitos deles são

conhecidos por serem potencialmente hepatotóxicos (Iovdijová e Bencko, 2010).

A utilização do paracetamol (APAP), um fármaco de efeito antipirético e analgésico

(Hinson et al., 2010), é a principal causa da falência hepática aguda nos EUA e em outras

nações ocidentais (Sarges et al., 2016). O APAP, especificamente, é responsável por 80.000

atendimentos de emergência, 2.500 hospitalizações e 500 intoxicações fatais nos EUA,

anualmente (Mühl, 2016). Um estudo analisou, entre os anos de 2005 e 2007, países europeus

selecionados e, foram encontrados documentados 114 casos de falência hepática aguda

relacionados à overdose de drogas que demandaram transplante (de um total de 600 casos).

Noventa e sete por cento (97 %) desses foram causados pelo APAP (111 casos) (Gulmez et

al., 2015). Na Alemanha, 850 internações por ingestão de APAP foram registradas em 2012

em pacientes com seguro de saúde (Mühl, 2016). A ingestão de APAP com concomitante

lesão hepática pode ser de caráter intencional (por tentativa de suicídio) ou acidental (por

exemplo, por ingestão do medicamento inadvertidamente durante dias seguidos (Licata,

2016).

O APAP é metabolizado pelo sistema citocromo P450 (CYP450) formando um

metabólito reativo, o N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI). O NAPQI é detoxificado pela

glutationa (GSH), causando sua depleção. Consequentemente, o NAPQI se liga

covalentemente a proteínas celulares, principalmente as proteínas mitocondriais, levando a

lesão hepática (Saito et al., 2010; Jaeschke et al., 2011). Portanto, a overdose por APAP

Introdução

Bandeira, A.C.B.

23

desencadeia a ativação de cascatas de sinalização celular e o estabelecimento do estresse

oxidativo.

Diversas pesquisas vêm utilizando o modelo experimental de intoxicação por APAP a

fim de estudar novos compostos. Logo, esse modelo de toxicidade tornou-se um dos métodos

mais populares para o estudo de potenciais agentes hepatoprotetores, especialmente de alguns

produtos naturais (Jaeschke et al., 2011).

O efeito protetor de alguns alimentos naturais é atribuído à presença de compostos

fitoquímicos como carotenóides, tocoferóis e polifenóis, os quais possuem propriedades

antioxidantes (D'angelo et al., 2009). Um importante carotenóide que não possui atividade

pró-vitamina A, é o licopeno.

Atualmente, o licopeno vem sendo amplamente estudado, principalmente em relação

às suas características preventivas. Hoje, sabe-se que ele tem ótimas respostas frente às

doenças crônicas. Sua ação foi descrita e bem estabelecida em estudos de câncer de próstata

(Giovannucci, 1999; Ono et al., 2015; Wang et al., 2015) e doenças cardiovasculares (Rao,

2002; Jacques et al., 2013; Vilahur et al., 2015). Apesar de seus efeitos benéficos, ainda há

controvérsias quanto ao seu mecanismo de ação. Acredita-se que ele possa atuar modulando

as junções comunicantes (gap juctions), os hormônios, o sistema imune e diferentes vias

metabólicas, porém o que mais se destaca na literatura são as suas ações antioxidantes (Di

Mascio et al., 1989; Giovannucci, 1999; Rao, 2002).

Escolhemos trabalhar com o licopeno por esse ser um composto comum na dieta e

também o carotenóide com maior atividade antioxidante, capaz de neutralizar espécies

reativas. Estudos já demonstraram que o licopeno é capaz de atuar inibindo a expressão de

enzimas do sistema CYP450 e também aumentando a atividade de enzimas antioxidantes,

ambas as vias relacionadas à inflamação induzida pelo APAP (Palozza et al., 2012).

Revisão Bibliográfica

Bandeira, A.C.B.

24

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. O fígado e o metabolismo de xenobióticos

O fígado não é apenas um órgão que participa dos processos digestórios, ele é um

órgão essencial para a manutenção do metabolismo corporal, sendo responsável por funções

vitais como: o metabolismo e a detoxificação de xenobióticos (substâncias químicas que não

são produzidas normalmente pelo organismo), o metabolismo da glicose, a síntese de

hormônios, a síntese e a degradação de proteínas plasmáticas e também participa da regulação

do sistema imune (Nemeth et al., 2009).

Ele é particularmente susceptível a agressões, pois é um dos primeiros órgãos a

manter contato com substâncias ingeridas oralmente como, por exemplo, bebidas alcoólicas,

fármacos, entre outros (Gu e Manautou, 2012), por isso, também é conhecido como sendo a

primeira linha de defesa contra micro-organismos e toxinas que atravessam a barreira

intestinal (Ramaiah e Jaeschke, 2007).

Neste sentido, sabe-se que o organismo é constantemente exposto a uma variedade

de xenobióticos e muitos deles são conhecidos por serem potencialmente hepatotóxicos

(Iovdijová e Bencko, 2010).

A metabolização de produtos exógenos no fígado ocorre através de dois mecanismos

(Figura 1). Durante a fase 1 do metabolismo, grupos polares são adicionados às moléculas por

oxidação, redução ou hidrólise. Essas reações são catalisadas pelo sistema do CYP450, uma

família de hemoproteínas ligadas à membrana, localizadas no retículo endoplasmático liso de

hepatócitos centrolobulares. Essa enzima utiliza a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD)

ou nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+) como cofatores para adicionar um

grupo reativo, como hidroxila por exemplo. Esse processo permite que esses compostos sejam

excretados, mas também pode produzir compostos reativos nocivos. Se essas moléculas não

forem metabolizadas pelas enzimas de fase 2, elas podem causar danos a proteínas, ao ácido

desoxirribonucléico (DNA) e ao ácido ribonucléico (RNA) (Walgren et al., 2005; Larson,

2007). Durante a fase 2 do metabolismo, moléculas são conjugadas com o ácido glicurônico,

sulfatos, ou GSH através das UDP-glicuronil transferases, sulfotransferases e glutationa S-

transferase (GST) (Walgren et al., 2005; Larson, 2007). Sendo assim, as enzimas de fase 2 do


Bandeira, A.C.B.

25

metabolismo além de defenderem as células contra compostos gerados na fase 1 também

agem sobre as espécies reativas produzidas endogenamente.

Figura 1. Metabolismo de xenobióticos. Reações da fase 1 são catalizadas pelo citocromo

P450 (CYP450). Reações da fase 2 são catalisadas por várias enzimas, como UDP-

Glicuronil-transferase, sulfotransferases e glutationa-s-transferase (GST). Os metabólitos

tóxicos que são formados podem levar a lesão hepática (Adaptado de Walgren et al., 2005;

Larson, 2007).

2.2. Lesões hepáticas induzidas por drogas e o paracetamol

A lesão hepática induzida por droga (DILI – drug-induced liver injury) engloba

reações adversas a medicamentos envolvendo o fígado após a administração de xenobióticos

como um fármaco ou um fitoterápico e/ou suplemento dietético (Björnsson, 2015). As DILIs

podem ser classificadas como: intrínsecas/dose dependente ou idiossincráticas/dose

independentes. As formas idiossincráticas são consideradas, atualmente, como formas que

raramente ocorrem, porém devem sempre ser consideradas no momento do diagnóstico,

independente da presença ou não de doenças hepáticas subjacentes (Licata, 2016).

Muitos fármacos são associados às DILIs. Os antibióticos são responsáveis por mais

de 46% dos casos nos EUA (Chalasani et al., 2014). Anti-inflamatórios não esteroidais

(AINES), estatinas e fitoterápicos e/ou suplementos dietéticos também podem levar ao

desenvolvimento da DILI (Navarro et al., 2014). Mecanismos multifatoriais estão associados

ao aparecimento das DILIs, como características químicas das drogas, dose, via de

administração e duração do tratamento. Da mesma forma, existem os fatores relacionados ao

indivíduo como, por exemplo, idade, sexo, genética, episódio prévio de DILI e doença


Bandeira, A.C.B.

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hepática crônica subjacente. E ainda, os fatores ambientais, como o tipo de dieta, etilismo,

tabagismo, poliquimioterapia, estado imunológico e estado nutricional (Chen et al., 2015).

Quase todas as classes de drogas podem estar envolvidas no desenvolvimento da

DILI. O paracetamol (N-acetil-p-aminofenol, acetaminofeno, APAP) representa um dos

melhores exemplos de DILI preditiva (Licata, 2016).

O APAP é um fármaco analgésico e antipirético amplamente utilizado para o alívio

de dores e redução da febre. Foi primeiramente prescrito em 1955 e, subsequentemente,

aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) em 1960. Normalmente, o APAP é

seguro quando consumido nas doses prescritas (1-4 g por dia). Em adultos, doses únicas de

mais de 10 a 15 g levam a lesão hepática severa ou fatal, secundária à necrose hepática

massiva. Intoxicações desencadeadas por doses terapêuticas também podem ocorrer em

determinadas condições fisiológicas e ambientais, como alcoolismo, idade, condições

nutricionais, doença hepática pré-existente, genética do indivíduo, entre outros (Larson,

2007).

Em 1966, Davidson e Eastham foram os primeiros a descrever o APAP como sendo

hepatotóxico em overdose. Muitos outros casos de overdose foram relatados desde então

(Davidson e Eastham, 1966).

Em janeiro de 2014, a FDA emitiu um comunicado recomendando a interrupção do

uso de APAP acima de 325 mg quando em combinação com outro fármaco (Toska et al.,

2014).

Em humanos, a overdose de APAP inicia-se com sintomas de náuseas e vômitos

dentro de 2 a 3 horas após a ingestão do medicamento, seguidos por dor abdominal. A injúria

hepática ocorre dentro das primeiras 24 horas, alcançando seu pico máximo em 3 a 4 dias.

Ocorre aumento nos níveis sorológicos de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato

transaminase (AST), hiperbilirrubinemia e alguns pacientes podem desenvolver

nefrotoxicidade além da hepatotoxicidade (Hinson et al., 2010).

A hepatotoxicidade também pode ser observada em roedores. Os ratos demonstram

certa resistência, ao contrário de camundongos e hamsters que são modelos experimentais

extremamente sensíveis. Histologicamente, pode ser observada a perda de glicogênio e a

vacuolização de hepatócitos centrolobulares nas primeiras 2 horas, modificações nucleares e


Bandeira, A.C.B.

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células picnóticas na região centrolobular em 3 horas e vasta necrose na mesma região em 6

horas. Sabe-se que, nesse modelo, as células morrem majoritariamente por necrose. O número

de células com características morfológicas que determinam a apoptose é inferior a 1% em

todo o parênquima e os níveis de caspase 3 não se encontram aumentados em fígado de

camundongos intoxicados com APAP (Malhi et al., 2006; Kon et al., 2007).

No organismo, cerca de 80% a 90% do APAP administrado é metabolizado por meio

da via de conjugação. Dois terços são metabolizados através da glicoronidação (UDP-

glicoruniltransferases) e um terço é metabolizado através da sulfatação (sulfotransferases). Os

conjugados inativos não-tóxicos são amplamente excretados pela urina e pela bile. Uma

pequena fração é metabolizada pelo sistema CYP450, principalmente pelas isoformas

CYP2E1 e CYP1A2, formando um metabólito reativo, o NAPQI. O NAPQI é conjugado e

detoxificado pela GSH e, posteriormente, excretado pela urina como ácido mercaptúrico e

conjugados de cisteína (Figura 2).

Doses terapêuticas de APAP resultam em pequenas quantidades de NAPQI que são

facilmente detoxificadas pela GSH. Doses excessivas de APAP levam à saturação das vias do

ácido glicurônico e do sulfato, sobrecarregando o sistema CYP.


Bandeira, A.C.B.

28

Figura 2. Ativação metabólica do paracetamol (APAP) (Adaptado de Jaeschke et al., 2011).

Após uma overdose de APAP, o excesso de NAPQI formado leva à depleção da

GSH. Consequentemente, o NAPQI se liga covalentemente a proteínas celulares,

principalmente as proteínas mitocondriais, levando a uma disfunção mitocondrial,

caracterizada pela formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e peroxinitrito, dano ao

ácido desoxirribonucléico (DNA) mitocondrial, liberação de proteínas mitocondriais

intermembrana, que translocam-se para o núcleo, causando a fragmentação do DNA nuclear e

culminando na abertura dos poros de transição mitocondriais e no colapso do potencial de

membrana (Figura 3) (Larson, 2007; Saito et al., 2010; Jaeschke et al., 2011). A morte celular

por necrose é desencadeada em meio à ativação das cascatas de sinalização celular e o

estabelecimento do estresse oxidativo.

Sabe-se que a overdose por APAP causa estresse oxidativo com concomitante

inflamação. As células necróticas liberam padrões moleculares associados ao dano (DAMPs)

que induzem a liberação de citocinas e quimiocinas pelas células de Kupffer e outras células


Bandeira, A.C.B.

29

imunes inatas que, consequentemente, levam a ativação e ao recrutamento de células

inflamatórias (Adams et al., 2010; Jaeschke e Ramachandran, 2011; Krenkel et al., 2014).

Está envolvida nessa sinalização uma grande quantidade de citocinas e quimiocinas como, por

exemplo, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, CCL2, CCL5, CXCL1, CXCL8, IL-10 entre outras

(Krenkel et al., 2014)

Figura 3. Estresse oxidativo mitocondrial e formação de peroxinitrito durante a

hepatotoxicidade induzida por paracetamol (APAP)(Adaptado de Jaeschke et al., 2011).

2.3. Estresse oxidativo

O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a quantidade de

oxidantes e antioxidantes (Sies e Cadenas, 1985). Essa definição criada por Helmut Sies, em

1985, foi muito importante durante duas décadas para o desenvolvimento de pesquisas nessa

área, porém Jones, em 2006, propôs uma definição mais atual, classificando-o como uma

perturbação do controle e da sinalização redox. Este desequilíbrio vem sendo relacionado com

diferentes quadros patológicos (Jones, 2006). Atualmente, sabe-se que a atividade de muitas


Bandeira, A.C.B.

30

proteínas envolvidas na sinalização celular são reguladas pelo estado redox de seus resíduos

tióis oxidáveis que atuam como alvos moleculares redox-sensíveis (Ray et al., 2012). O

estresse oxidativo, portanto, também pode ocorrer na ausência de danos estruturais diretos. A

interrupção dos circuitos redox, que regulam muitas vias de sinalização, também caracterizam

o estresse oxidativo (Jones e Go, 2010).

O estresse oxidativo é um evento intimamente relacionado à presença de radicais

livres. Um radical livre é qualquer espécie que contém um ou mais elétrons desemparelhados

em sua última camada. Devido a esta característica, os radicais livres são altamente reativos e

instáveis, podendo atacar alvos celulares diversos (proteínas, fosfolipídeos de membrana e

ácidos nucléicos) com o objetivo de estabilizarem sua estrutura molecular. Há uma ampla

variedade dessas moléculas nos seres vivos, porém nem todas são radicais. Dessa forma, tem

sido utilizada a denominação EROs como um termo coletivo que inclui não apenas radicais de

oxigênio, mas também algumas espécies não-radicalares derivadas do oxigênio, como o

peróxido de hidrogênio, ácido hipocloroso e ozônio (Tabela 1) (Halliwell e Gutteridge, 2007).

O oxigênio molecular (O2) é uma molécula fundamental para a sobrevivência de

organismos aeróbios, sendo necessária durante diversos processos vitais como: respiração

celular, produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização

intracelular e síntese de substâncias biológicas. Ao mesmo tempo, é uma molécula capaz de

gerar substâncias tóxicas a nível intracelular e extracelular (Circu e Aw, 2010; Jaeschke et al.,

2012).

A redução molecular do O2 resulta na formação de EROs, incluindo o ânion

superóxido, o peróxido de hidrogênio e os radicais hidroxila (Figura 5). Portanto, a

mitocôndria é uma importante fonte intracelular de EROs (Figura 4). Do total mitocondrial de

O2 consumido, 1 a 2% é desviado para a formação destas espécies, principalmente a nível do

complexo I e III da cadeia respiratória (Circu e Aw, 2010; Jaeschke et al., 2012; Mello et al.,

2016). Porém, as EROs não são formadas apenas durante o processo de respiração celular.

Espécies reativas também podem ser geradas pela mieloperoxidase a partir do peróxido de

hidrogênio, originando o ácido hipocloroso e pela peroxidação lipídica, que produz

hidroperóxidos lipídicos e os radicais alcoxila. A combinação de dois radicais, superóxido e

óxido nítrico, resulta na formação de peroxinitrito, uma espécie reativa de nitrogênio (ERN)

(Jaeschke et al., 2012; Mello et al., 2016).


Bandeira, A.C.B.

31

As EROs também são formadas pelo CYP450 e suas redutases, bem como a partir de

oxidases no interior das células, como por exemplo, as oxidases lipídicas nos peroxissomos

(Figura 4). Em condições patológicas, oxidases adicionais podem ser ativadas e tornar-se uma

origem de EROs, como a xantina oxidase e a NADPH oxidase. Essa última está presente em

fagócitos e é responsável por liberar ânion superóxido no interior do fagossoma ou fora da

célula quando os fagócitos estão ativados. Certas drogas podem ser reduzidas pelas enzimas

do CYP450 e formar radicais instáveis, que ao transferirem seus elétrons para o O2 formam o

radical superóxido. Portanto, existe um grande número de origens de EROs e ERNs em

diferentes locais, intracelulares e extracelulares (Jaeschke et al., 2012; Mello et al., 2016).

Várias fontes endógenas de EROs e ERNs contribuem para a carga oxidante total. Fontes

exógenas incluem, por exemplo, a exposição à radiação ionizante e não ionizante, poluição

atmosférica e gases tóxicos (Lykkesfeldt, 2007).

Figura 4. Sítios de produção fisiológica de espécies reativas de oxigênio (EROs). EROs

formadas nas membranas plasmáticas desativam PTPs (Proteínas tirosina fosfatase) e

permitem a transdução de sinais (por exemplo, pela insulina ou fator de crescimento

insulina-símile 1[IGF-1]) após a ativação do receptor de tirosina-quinase. A mitocôndria

produz EROs durante a respiração celular e a atividade metabólica. EROs são produzidas no

retículo endoplasmático durante o dobramento da proteína e detoxificação pelo sistema do

citocromo P450 (CYP450). Os lisossomos são necessários para o metabolismo do ferro e a

remoção de componentes celulares danificados por autofagia. Peroxissomos produzem EROs

durante atividades metabólicas ou de detoxificação (Adaptado de Mello et al., 2016).


Bandeira, A.C.B.

32

Sabe-se que o excesso de espécies reativas é prejudicial às estruturas celulares,

podendo promover alterações nos componentes lipídicos, protéicos e no DNA. Logo, os seres

aeróbios desenvolveram um complexo sistema antioxidante para controlar essas reações e

reparar os danos causados à maquinaria biológica.

2.3.1 Sistema antioxidante

A exposição a uma ampla variedade de origens de EROs e ERNs levou o organismo a

desenvolver uma série de mecanismos de defesa (Cadenas, 1997). Portanto, esses mecanismos

de defesa contra o estresse oxidativo envolvem diversas etapas: mecanismos preventivos,

mecanismos de reparo, mecanismos de defesa física e defesas antioxidantes (Valko et al.,

2007).

O organismo aeróbio conta com um complexo sistema de substâncias especializadas

em neutralizar as espécies reativas formadas, os antioxidantes.

Antioxidante é qualquer substância que presente em baixas concentrações quando

comparada a do substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação deste substrato de maneira

eficaz (Halliwell e Gutteridge, 1991). Logo, os antioxidantes são importantes na manutenção

do status redox fisiológico.


Bandeira, A.C.B.

33

Os antioxidantes podem ser enzimáticos ou não enzimáticos. Alguns exemplos são

apresentados na tabela a seguir (Valko et al., 2006; Valko et al., 2007):

Tabela 2. Principais antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos.

ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS E NÃO-ENZIMÁTICOS.

Antioxidantes Enzimáticos Antioxidantes não-enzimáticos

Superóxido Dismutase (SOD) Ácido ascórbico (Vitamina C)

Glutationa Peroxidase (GPx) α-tocoferol (Vitamina E)

Catalase (CAT)

Antioxidantes Tiols (Glutationa,

Tioredoxina, Ácido lipóico)

Carotenóides

Flavonóides e outros Fonte: (Valko et al., 2006; Valko et al., 2007)

Alguns antioxidantes são de origem endógena e outros são de origem exógena,

provenientes da alimentação ou de suplementos. O melhor exemplo de antioxidantes

endógenos é o sistema de defesa antioxidante primário, composto por três importantes

enzimas que previnem a formação e promovem a neutralização de espécies reativas: a

glutationa peroxidase (GPx), que promove a redução de peróxidos, a catalase (CAT), que

converte peróxido de hidrogênio em água e O2 e a superóxido dismutase (SOD), que converte

o ânion superóxido em peróxido de hidrogênio. O organismo ainda conta com outras

substâncias antioxidantes endógenas como, por exemplo, o sistema glutationa. A glutationa

possui um papel fundamental na prevenção contra o estresse oxidativo e na eliminação e

biotransformação de xenobióticos. É um tripeptídeo altamente abundante no meio

intracelular, formado pelos aminoácidos glutamato, cisteína e glicina. Sua atividade se

expressa pela redução das EROs e conseqüente oxidação da GSH a glutationa oxidada

(GSSG). Para que esse ciclo catalítico da GSH seja mantido, a atividade de três enzimas é

fundamental: a glutationa oxidase (GO), a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa redutase

(GR). GO e GPx catalisam a oxidação de GSH a GSSG e, a GR promove a regeneração da

GSH, a partir da GSSG, na presença de NADPH. A regulação do desequilíbrio redox baseia-

se na atividade de sistemas contra as EROs, o que envolve a GSH e as enzimas relacionadas

(Huber e Almeida, 2008).


Bandeira, A.C.B.

34

Por outro lado, defesas antioxidantes exógenas, como vitaminas e alguns minerais

também auxiliam nesse sistema. Exemplo de antioxidantes exógenos são os carotenóides.

Esses são um grupo de pigmentos naturais sintetizados por plantas e micro-organismos

(Rahman, 2007; Carocho e Ferreira, 2013).

Algumas defesas antioxidantes são extremamente importantes, pois representam uma

remoção direta de substâncias pró-oxidantes, promovendo o máximo de proteção para os

sistemas biológicos. Um bom antioxidante deve ter as seguintes características:

I- Eliminar os pró-oxidantes de maneira específica;

II- Quelar metais redox;

III- Interagir com outros antioxidantes (regenerar) dentro de uma “rede de

antioxidantes”;

IV- Ter efeito positivo na expressão gênica;

V- Ser facilmente absorvido;

VI- Ter uma concentração fisiológica relevante em tecidos e biofluidos;

VII- Ser eficaz em ambientes aquosos e/ou domínios de membrana (Valko et al., 2006).

Os antioxidantes atuam através de três diferentes mecanismos moleculares. No

primeiro mecanismo (Equação 1), o antioxidante (AH) doa um único elétron ao radical livre

(R˙). Durante esse processo de transferência de elétron, o caráter radical é transferido para o

antioxidante, formando um radical derivado de antioxidante, um radical menos reativo (A˙)

(Cadenas, 1997). O α-tocoferol, por exemplo, atua através desse mecanismo, formando o

radical α-tocoferoxil, que é recuperado à α-tocoferol pelo ácido ascórbico (Willson et al.,

1985)

AH + R˙ → A˙ +RH (Equação 1)

No segundo mecanismo, ocorre também transferência do caráter radical, porém com a

formação de um radical derivado de antioxidante estável ou inerte. Um exemplo desse

mecanismo ocorre com os radicais nitrona traps, que formam um aduto estável (Equação 2)

(Cadenas, 1997)


Bandeira, A.C.B.

35

(Equação 2)

Por fim, no terceiro mecanismo, pequenas moléculas antioxidantes atuam

mimetizando a ação de enzimas. Nitróxidos e aminoxils são miméticos da SOD que atuam

catalizando a dismutação do ânion superóxido (Equação 3 e 4) (Krishna et al., 1992; Krishna

et al., 1996)

(Equação 3)

(Equação 4)

Figura 5. Mecanismos celulares de geração de oxidantes e sistema antioxidante

(Adaptado de Jaeschke et al., 2012).


Bandeira, A.C.B.

36

Atualmente existem diversos estudos na literatura que avaliam as características dos

carotenoides como antioxidantes exógenos. Um importante carotenóide muito presente na

nossa dieta e que vêm sendo amplamente estudado é o licopeno.

2.4. Licopeno

Atualmente, mais de 700 carotenóides foram descritos na natureza e desses, 50

variedades tornaram-se presentes na dieta humana. Os mais importantes incluem: β-caroteno,

α-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina, β-criptoxantina, α-criptoxantina, γ-caroteno,

neurosporeno, ζ-caroteno, fitoflueno e fitoeno (Fiedor e Burda, 2014).

O licopeno é um composto pertencente à família dos carotenóides, responsável pela

cor vermelha de muitas frutas e vegetais. Seu grande representante é o tomate (Lycopersicum

esculentum) (Tabela 3 e 4). O licopeno é um hidrocarboneto altamente insaturado de cadeia

linear contendo 13 ligações duplas, sendo onze ligações duplas conjugadas linearmente e duas

ligações duplas não conjugadas. Apresenta um peso molecular de 536,9 g/mol e uma absorção

máxima de 470 nm. As duplas ligações podem existir na configuração trans e cis (Figura 6).

All-trans, 5-cis, 9-cis, 13-cis e 15-cis são as formas isoméricas mais comumente identificadas

(Rao et al., 2006). A configuração all-trans é encontrada no tomate in natura, porém a

molécula é susceptível a isomerização durante processamentos alimentícios (exposição ao

calor, luz, ácidos e oxigênio). Ainda, quando ingerido, o licopeno tende a se transformar na

forma mais bioativa cis (Rao e Rao, 2007; Friedman, 2013; Fiedor e Burda, 2014). A

conversão da forma isomérica do licopeno all-trans, presente nos tomates crus, para a forma

isomérica cis é relevante, visto que a forma cis apresenta maior biodisponibilidade. Em

relação à estabilidade dos isômeros do licopeno, sabe-se que a forma 5-cis é a mais estável

seguida, imediatamente, das formas all-trans, 9-cis, 13-cis, 15-cis, 7-cis e 11-cis (Nguyen e

Schwartz, 1998).

Figura 6. Fórmula estrutural representando as configurações all-trans e 5-cis-licopeno

(Adaptado de Friedman, 2013).


Bandeira, A.C.B.

37

Tabela 3. Quantidade de Licopeno em frutas e vegetais

Quantidade de Licopeno

(mg/100g de peso úmido) Origem

0,7 – 20 Tomates frescos

3,7 Tomates cozidos

2,3 – 7,2 Melancia fresca

2,0 – 5,3 Mamão fresco

5,2 – 5,5 Goiaba vermelha fresca

0,4 – 3,4 Uva rosa

0,01 – 0,05 Damasco Fonte: (Rao e Rao, 2007)

Tabela 4. Quantidade de licopeno em produtos derivados do tomate

Quantidade de Licopeno

(mg/100g) ± Desvio Padrão Origem

9,27 ±1,02 Tomates crus

17,23±2,18 Ketchup

15,99±0,90 Molho de espaguete

55,45±4,33 Extrato de tomate

16,67 Purê de tomate

17,98±1,47 Molho de tomate Fonte: (Rao e Rao, 2007)

A absorção do licopeno pela mucosa intestinal é auxiliada pela formação de micelas

lipídicas e de ácidos biliares. Acreditava-se que o licopeno fosse absorvido nas células da

mucosa intestinal por difusão passiva (Boileau et al., 2002), porém, estudos recentes indicam

a participação de um processo ativo via receptor scavenger classe B tipo 1 (SR-B1). Esse

receptor é encontrado no intestino delgado de humanos, bem como no fígado, glândulas

supra-renais, ovários, placenta, rins, próstata e cérebro. Portanto, SR-B1 pode ser

parcialmente responsável pelo transporte de carotenóides a partir de lipoproteínas para os

tecidos e dos tecidos para lipoproteínas (Wang, 2012). Após a sua absorção, o licopeno é

clivado principalmente pela enzima β-caroteno 9,10 oxigenase (BCO2) e em menor ou quase

nenhuma atividade pela enzima β-caroteno 15,15 oxigenase (BCO1), formando metabólitos

ou sendo incorporado em quilomícrons, que são secretados no sistema linfático e

transportados para o fígado. O licopeno é então transportado por lipoproteínas no plasma para

ser distribuído a outros órgãos (Boileau et al., 2002; Wang, 2012). As concentrações mais

elevadas de licopeno são encontradas nos testículos, glândulas supra-renais, fígado e próstata

(Rao e Agarwal, 2000).


Bandeira, A.C.B.

38

Em humanos, a absorção do licopeno é em torno de 10 a 30% do que foi ingerido,

sendo o restante excretado pelas fezes e urina. Muitos fatores biológicos e do estilo de vida do

indivíduo afetam a absorção do licopeno incluindo idade, sexo, status hormonal, massa

corporal, níveis lipídicos sanguíneos, tabagismo, etilismo e a presença de outros carotenóides

no alimento consumido (Stahl e Sies, 1992; Rao e Agarwal, 2000).

O licopeno é o carotenóide mais predominantemente encontrado no plasma humano,

com um tempo de meia vida de 2 a 3 dias segundo estudos de Stahl e Sies (Stahl e Sies,

1996). Porém sabe-se que o tempo de meia vida varia de acordo com a forma isomérica

presente. No plasma humano, o licopeno encontra-se como uma mistura de formas

isoméricas, sendo encontrados 50% na forma cis (Rao e Agarwal, 2000). Análises da

quantidade de licopeno sérico e tecidual mostraram a presença do isômero cis em modelos

experimentais alimentados predominantemente com a forma all-trans do licopeno, mostrando

que a conversão também ocorre após a ingestão do alimento (Jain et al., 1999).

O licopeno é um composto altamente lipossolúvel que se organiza na parte interna da

bicamada lipídica das membranas celulares. Acredita-se que essa característica do licopeno de

incorporar-se a membrana celular seja um fator importante na proteção contra as EROs (Rao e

Rao, 2007; Friedman, 2013; Fiedor e Burda, 2014).

Quanto à segurança do composto para os seres humanos, diversos estudos já foram

realizados. Em estudo de Mellert et al., duas origens de licopeno sintético da BASF, lycopene

10 CWD e lycovit 10%, cada um contendo aproximadamente 10 % de licopeno, foram

testados em ratos. Após ingestão do produto por 13 semanas com uma ingesta diária superior

a 3000 mg/kg, nenhum efeito adverso foi observado (Mellert et al., 2002). McClain e Bausch

publicaram um estudo utilizando o licopeno sintético e nenhum efeito teratogênico foi

observado em duas gerações de ratos estudadas. A deposição do licopeno nos tecidos

corporais também não apresentou efeitos adversos (Michael Mcclain e Bausch, 2003). Em

consideração as inúmeras pesquisas realizadas avaliando a segurança da ingestão do licopeno

para o consumo humano, a FDA dos EUA concedeu ao licopeno o status de seguro como um

suplemento nutricional, classificando-o como uma substância bem tolerada (Rao et al., 2006;

Holzapfel et al., 2013).

Estudos recentes sugerem que uma dieta rica em licopeno é capaz de reduzir os riscos

de doenças graves como o câncer (Giovannucci, 1999; Ono et al., 2015; Wang et al., 2015) e


Bandeira, A.C.B.

39

doenças cardiovasculares (Rao, 2002; Jacques et al., 2013; Vilahur et al., 2015). Muitos

mecanismos são atribuídos aos seus benefícios, como a modulação das junções comunicantes

(gap juctions), dos hormônios, do sistema imune e das vias metabólicas, porém acredita-se

que suas potentes propriedades antioxidantes estão primariamente envolvidas na prevenção de

algumas doenças. É o carotenóide de maior eficiência na supressão do oxigênio singleto (1O2),

sendo duas vezes mais potente que o β-caroteno e 10 vezes mais potente que o α-tocoferol

(Di Mascio et al., 1989). Além disso, ele parece intervir em reações iniciadas por radicais

livres, como o radical hidroxila e os radicais peróxidos. O licopeno atua sobre o 1O2 como na

equação 5 (Holzapfel et al., 2013).

1O2 + LYC → 3O2 + 3LYC

3LYC → LYC + calor (Equação 5)

A molécula de licopeno ganha o excedente de energia atingindo o estado tripleto, que

é perdido através de interações vibracionais e rotatórias com o solvente, resultando na

liberação de energia através de calor. Uma única molécula de licopeno pode extinguir cerca

1000 moléculas de 1O2 (Holzapfel et al., 2013).

Alguns estudos relatam que os carotenóides, em geral, são capazes de induzir

atividades enzimáticas associadas ao sistema do CYP450 (Palozza et al., 2012). Astorg et al.,

propuseram que o licopeno apresentou mecanismo protetor ao modular CYP2E1 em modelo

de lesão pré-neoplásica induzida por carcinógeno em fígado de ratos (Astorg et al., 1997).

Além disso, já foi visto que a administração de licopeno em ratos induziu a atividade de

isoformas de CYP (1A1/2, 2B1/2 3A) de forma dose-dependente, mostrando que esse

carotenóide, mesmo que em pequenas quantidades, pode ser relevante no metabolismo que

envolve o CYP450 (Breinholt et al., 2000).

Ainda, estudos têm demonstrado que o licopeno apresenta características anti-

inflamatórias, atuando em importantes vias de sinalização, inibindo a sinalização de JNK (c-

Jun N-terminal kinase) e NF-κB (fator nuclear kappa B) (Ip e Wang, 2014). Os

apolicopenóides, metabólitos do licopeno, mostraram-se eficientes na supressão da expressão

de citocinas pró-inflamatórias, como interleucina (IL) -6 e IL-1β em adipócitos estimulados

com fator de necrose tumoral – alfa (TNF-α) (Gouranton, Aydemir, et al., 2011). Ip et al.,

demonstraram que o metabólito ácido apo-10’-licopenóico (APO10LA) na concentração de


Bandeira, A.C.B.

40

10 mg/kg na dieta foi capaz de reduzir a inflamação hepática (diminuiu focos inflamatórios,

TNF-α, IL-6, NF-κB, expressão protéica de p65 e ativação do transdutor de sinal e ativador da

transcrição 3 [STAT3]) e a tumorigênese em modelo de camundongos obesos por dieta

hiperlipídica (Ip et al., 2013).

Tendo em vista que o APAP é metabolizado pelo CYP450 e que um dos mecanismos

de hepatotoxicidade induzida por esse fármaco é a depleção de GSH com concomitante

aumento do estresse oxidativo e, sabendo das características do licopeno como um eficiente

antioxidante e possível modulador da atividade de isoformas do CYP450, nossa meta foi

verificar os possíveis efeitos protetores do licopeno em um modelo de intoxicação por APAP.

Objetivos

Bandeira, A.C.B.

41

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Avaliar o efeito protetor do licopeno no modelo de hepatotoxicidade induzida por

APAP em camundongos C57BL/6.

3.2. Objetivos específicos

Experimento 1: Análise temporal dos efeitos de uma dose tóxica do paracetamol

em camundongos.

• Em amostras de soro:

- Avaliar as enzimas hepáticas (ALT e AST) dos animais em diferentes tempos

após a intoxicação por APAP.

• Em amostras de fígado:

- Avaliar a resposta do sistema glutationa em diferentes tempos após a

intoxicação por APAP.

Experimento 2: Análise dos efeitos protetores de uma dose única de licopeno em

camundongos eutanasiados 12 e 24 horas após a intoxicação por paracetamol.


- Avaliar o efeito do licopeno sobre as enzimas hepáticas (ALT e AST);

- Avaliar o efeito do licopeno sobre o perfil lipídico (Colesterol Total [CT],

lipoproteínas de alta densidade [HDL] e frações aterogênicas [FA]).


- Quantificar o conteúdo de glutationa total (GSHt), fração oxidada (GSSG),

fração reduzida (GSH) e relação GSH/GSSG;

- Quantificar a atividade de enzimas antioxidantes (GPx, GR, CAT e SOD);

Objetivos

Bandeira, A.C.B.

42

- Quantificar os marcadores de dano oxidativo (substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico [TBARS] e proteínas carboniladas);

- Quantificar a atividade da metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2);

- Avaliar a estrutura do parênquima hepático.

Experimento 3: Análise dos efeitos protetores do pré-tratamento prolongado com

licopeno em camundongos eutanasiados 12 horas após intoxicação por paracetamol.


- Avaliar o efeito do licopeno sobre as enzimas hepáticas (ALT e AST);

- Avaliar o efeito do licopeno sobre o perfil lipídico (CT, HDL e FA).


- Quantificar o conteúdo de GSHt, GSSG, GSH e relação GSH/GSSG;

- Quantificar a atividade de enzimas antioxidantes (CAT e SOD);

- Quantificar os marcadores de dano oxidativo (TBARS e proteínas

carboniladas);

- Avaliar a expressão gênica de IL-1β, IL-6 e IL-10;

- Quantificar a [CCL-2] e IL-22;

- Quantificar a atividade da MMP-2;

- Avaliar a estrutura do parênquima hepático.

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

43

4. METODOLOGIA

4.1. Reagentes

Foram utilizadas amostras de LycoVit® Dispersion 10%, ©BASF S.A., Alemanha

(ANEXO 1), óleo de girassol Mazola, ©Cargill do Brasil, óleo de girassol, ACQ & GBM

Comércio e Desenvolvimento Ltda, paracetamol suspensão oral de 100 mg/ml, Medley

Industria Farmacêutica Ltda, kits Labtest Diagnóstica S.A.® (Lagoa Santa, MG, Brasil) para

dosagens bioquímicas, kit #CS0260, Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO) para dosagem de

glutationa, “Superoxide Dismutase assay Kit” (Chemical Cayman, MI, EUA), “Glutathione

peroxidase assay kit” (kit ab102530, Abcam®) e “Glutathione reductase assay kit” (kit

ab83461, Abcam®) para dosagens de enzimas antioxidantes, Kit ELISA Murine JE/MCP-1

(900-K126, Peprotech®) e Kit ELISA Murine IL-22 (900-K257, Peprotech®) para dosagens

de marcadores inflamatórios, Trizol (Invitrogen Life Technologies, CA, USA), kit “Hight-

Capacity cDNA Reverse Transcription” (Applied Biosystems, Foster City, CA) e Power

SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) para dosagem

de transcriptase reversa-reação em cadeia de polimerase (RT-PCR) quantitativa em tempo

real.

4.2. Experimento 1: Análise temporal dos efeitos de uma dose tóxica do

paracetamol em camundongos.

4.2.1. Animais

Sabendo que o objetivo principal do Experimento 1 foi realizar uma análise temporal

dos efeitos de uma dose tóxica do APAP, foram utilizados camundongos machos (n = 30) da

linhagem C57BL/6, de 8-12 semanas, com média de peso 20-30g. Os animais foram alocados

no Biotério da Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), com

temperatura e umidade controladas (21 ± 2 ºC, 50 ± 10%, respectivamente) e foram

submetidos aos ciclos claro/escuro de 12 h (luzes artificiais, 19 - 7 h) e exaustão 15 min/h. O

presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFOP,

protocolo 2012/41 (ANEXO 2).

4.2.2. Indução da hepatotoxicidade

Para a indução da hepatotoxicidade nos camundongos C57BL/6 foi utilizado o modelo

de overdose por APAP já estabelecido na literatura (Jaeschke et al., 2011; Singh et al., 2011;

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

44

Chen, P. et al., 2012; Marques et al., 2012). Os animais foram distribuídos nos seguintes

grupos experimentais (Figura 7):

Grupo Controle (C) – recebeu o veículo (água filtrada);

Grupo APAP – recebeu o APAP na concentração de 500 mg/kg em dose única.

Todos os tratamentos foram administrados nos animais em jejum de 12 horas por

gavagem orogástrica.

Os animais do grupo paracetamol foram eutanasiados, aleatoriamente, através de

inalação de isofluorano seguida de exsanguinação, nos tempos 3h, 6h, 12h e 24h após a

administração do fármaco (Figura 8).

Figura 7. Desenho experimental representando o Experimento 1 e 2.

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

45

Figura 8. Cronologia experimental do Experimento 1.

4.2.3. Análises e processamento do material biológico

Foram coletadas amostras de sangue e de fígado dos animais. O sangue foi coletado

através da punção cardíaca e logo em seguida centrifugado a 10.000g por 15 minutos a 4ºC

para a obtenção do soro. O fígado foi extraído e imediatamente pesado. Todas as amostras

foram armazenadas em freezer -80˚C para posterior realização das análises.

4.2.4. Análises sorológicas

As análises bioquímicas para obtenção da concentração das enzimas hepáticas ALT e

AST foram realizadas no soro utilizando kits comerciais Labtest Diagnóstica S.A.® (Lagoa

Santa, MG, Brasil).

I. Alanina aminotransferase (ALT) (Kit ref. 53)

A ALT promove a transferência de grupamentos amina de α-aminoácidos para α-

cetoácidos. O piruvato formado é medido através da formação de hidrazona, a qual tem

intensidade de cor em meio alcalino.

L-Alanina + α-cetoglutarato𝐴𝐿𝑇→ Glutamato + Piruvato

Resumidamente, foi adicionado 0,1 mL do Reagente nº 1 (TGP substrato) e transferido

para o banho-maria a 37ºC. Esperou-se 2 minutos e adicionou-se 0,02 mL da amostra ao

microtubo com reagente nº 1. As amostras permaneceram mais 30 minutos no banho-maria a

37ºC. Posteriormente, o microtubo foi retirado do banho-maria e adicionou-se 0,1 mL do

Reagente nº 2 (reagente de cor), que foi homogeneizado e incubado em temperatura ambiente

por 20 minutos. Após o tempo determinado, foi adicionado 1 mL de hidróxido de sódio

(NaOH) de uso às amostras, que foram homogeneizadas e incubadas por mais 5 minutos para

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

46

a realização da leitura a 505 nm. Os valores são expressos em Unidades/mL. Conversão para

Unidades Internacionais (UI): Unidades/mL x 0,482.

II. Aspartato transaminase (AST) (Kit ref. 52)

A AST promove a transferência de grupamentos amina de α-aminoácidos para α-

cetoácidos.

L-aspartato + α-cetoglutaratoAST→ Glutamato + Oxalacetato

Resumidamente, foi adicionado 0,1 mL do Reagente nº 1 (TGO substrato) e

transferido para o banho-maria a 37ºC. Esperou-se 2 minutos e adicionou-se 0,02 mL da

amostra ao microtubo com reagente nº 1. As amostras permaneceram mais 60 minutos no

banho-maria a 37ºC. Posteriormente, o microtubo foi retirado do banho-maria e adicionou-se

0,1 mL do Reagente nº 2 (reagente de cor), que foi homogeneizado e incubado em

temperatura ambiente por 20 minutos. Após o tempo determinado, foi adicionado 1 mL de

NaOH de uso às amostras, que foram homogeneizadas e incubadas por mais 5 minutos para a

realização da leitura a 505 nm. Os valores são expressos em Unidades/mL. Conversão para

UI: Unidades/mL x 0,482.

4.2.5. Análise das defesas antioxidantes

I. Sistema Glutationa (GSHt, GSSG, GSH e relação GSH/GSSG)

A GSH está presente nas células principalmente na sua forma reduzida representando

em torno de 90%, o restante aparece na forma de GSSG. Esta dosagem foi adaptada do kit

comercial Sigma #CS0260, e utiliza um método cinético para mensurar os níveis de GSHt

(GSH+GSSG) em amostras biológicas, através da redução do Ácido 5,5´-Ditio-bis-(2-

nitrobenzóico) (DTNB) à 5-tio-2-nitrobenzóico (TNB).

Para realizar a dosagem, amostras de 100 mg de tecido hepático foram

homogeneizadas com 1 mL de ácido de sulfosalicílico 5% (SSA), e em seguida centrifugadas

a 10.000 g por 10 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e utilizado como amostra

biológica.

A dosagem é realizada em microplaca de 96 poços. Inicialmente são adicionados aos

poços 150 μl da mistura de trabalho que contém glutationa redutase (GR), DTNB, e 100 mM

tampão fosfato de potássio. Em seguida, adiciona-se 10 μl de amostra para os testes e 10 μl de

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

47

100 mM tampão fosfato de potássio para o branco. As amostras são incubadas por 5 minutos

e, em seguida, a reação é iniciada com a adição de 50 μl de solução de NADPH. Com o início

da reação, a absorbância foi imediatamente medida a 405 nm utilizando um leitor de placa de

ELISA (Biotek ELx808). Foram realizadas 6 leituras com intervalo de 1 minuto entre cada

leitura.

Para mensurar os níveis de GSSG, o procedimento foi o mesmo, porém a amostra

biológica passou por um processo de derivatização antes do início da dosagem. Para isso foi

feita uma alíquota de 100 μl de amostra e acrescentou-se à esta 2 μl de vinilpiridina e 5 μl de

trietanolamida (TEA). Esta nova amostra apresentou o pH entre 6 e 7 e ficou incubada por

uma hora. Após esse período, utilizou-se 10 μl desta nova amostra para reagir com a mistura

de trabalho, como anteriormente descrito.

As concentrações de GSHt e GSSG foram obtidas através de uma curva padrão

realizada para cada uma das dosagens. A subtração da concentração de GSSG do valor da

concentração da GSHt forneceu o valor da concentração da GSH e, a relação GSH/GSSG

obteve-se através da divisão dos resultados de concentração de GSH pelos resultados de

GSSG.

4.3. Experimento 2: Análise dos efeitos protetores de uma dose única de licopeno

em camundongos eutanasiados 12 e 24 horas após a intoxicação por paracetamol.

4.3.1. Animais

Sabendo que o objetivo principal do Experimento 2 foi analisar os efeitos preventivos

de uma dose única do licopeno no fígado de camundongos, 12 e 24 horas após a intoxicação

com APAP, foram utilizados camundongos machos (n = 56) da linhagem C57BL/6, de 8-

12 semanas, com média de peso 20-30g. Os animais foram alocados no Biotério da Escola de

Nutrição da UFOP, com temperatura e umidade controladas (21 ± 2 ºC, 50 ± 10%,

respectivamente) e foram submetidos aos ciclos claro/escuro de 12 h (luzes artificiais, 19 - 7

h) e exaustão 15 min/h. O presente estudo foi aprovado pelo CEUA da UFOP, protocolo

2012/41 (ANEXO 2).

4.3.2 Pré-tratamento com licopeno e indução da hepatotoxicidade

Os camundongos foram distribuídos de acordo com o tratamento recebido nos

seguintes grupos (Figura 7):

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

48

Grupo controle (C) – recebeu água filtrada (veiculo do APAP);

Grupo Óleo (O) – recebeu óleo de girassol (veículo do licopeno);

Grupo APAP (A12 e A24) – recebeu o APAP na dose de 500 mg/kg em dose única;

Grupo APAP + Licopeno 10 mg (L10+A12 e L10+A24) – recebeu o licopeno (10 mg/kg)

1 (uma) hora antes da administração do APAP na dose de 500 mg/kg;

Grupo APAP + Licopeno 100 mg (L100+A12 e L100+A24) – recebeu o licopeno (100

mg/kg) 1 (uma) hora antes da administração do APAP na dose de 500 mg/kg.

Todos os tratamentos foram administrados nos animais em jejum de 12 horas por

gavagem orogástrica.

Os animais foram eutanasiados, aleatoriamente, através de inalação de isofluorano

seguida de exsanguinação, nos tempos 12h e 24h após a administração do APAP (Figura 9).


A coleta e o processamento do material biológico, assim como as análises sorológicas

de ALT e AST e as análises do sistema glutationa seguiram o mesmo padrão do Experimento

1 e estão descritos nas páginas anteriores. A seguir, estão descritas as metodologias das

demais análises utilizadas no Experimento 2.

4.3.3 Análises sorológicas

As análises bioquímicas para obtenção do conteúdo de CT e HDL foram realizadas no

soro utilizando-se kits comerciais Labtest Diagnóstica S.A.® (Lagoa Santa, MG, Brasil). A

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

49

fração aterogênica (lipoproteínas de baixa densidade [LDL] + lipoproteínas de muito baixa

densidade [VLDL]) obteve-se através da subtração dos resultados de concentração de CT

pelos resultados de HDL. Os protocolos serão descritos abaixo.

I. Colesterol Total (Kit ref. 76)

O CT é determinado de acordo com as seguintes reações:

Ésteres de colesterol 𝐶𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝐸𝑠𝑡𝑒𝑟𝑎𝑠𝑒→ Colesterol + Ácidos graxos

Colesterol + O2

𝐶𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑂𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒→ Colest-4-en-ona + H2O2

2H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina 𝑃𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒→ Antipirilquinonimina + 4H2O

A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à concentração de

CT na amostra.

Resumidamente, foram adicionados em três tubos de ensaio os seguintes reagentes:

As amostras foram misturadas e os tubos colocados em banho-maria a 37ºC por 10

minutos. Foram determinadas as absorbâncias do teste e do padrão em 500 nm ou filtro verde

(490 a 510 nm), acertando o zero com o branco. A cor é estável por 60 minutos.

Cálculos: CT mg/dL= 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑇𝑒𝑠𝑡𝑒

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜×200

II. Colesterol HDL (Kit ref. 13)

As VLDL e as LDL são quantitativamente precipitadas e, após centrifugação, o

colesterol ligado ao HDL é determinado no sobrenadante.

Branco Teste Padrão

Amostra ----- 0,01 mL -----

Padrão (nº 2) ----- ----- 0,01 mL

Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

50

Inicialmente foi realizada a separação das frações de colesterol, misturando-se o soro

com o reagente precipitante em um microtubo. Após a agitação vigorosa no vórtex, essa

amostra foi centrifugada a 3.500 rpm por 15 minutos e para a dosagem utilizou-se o

sobrenadante resultante.

Em três tubos de ensaios foram adicionados os seguintes reagentes, como a seguir:

Branco Teste Padrão

Sobrenadante ---- 0,1 mL ----

Padrão (nº2) ---- ---- 0,1 mL

Reagente (nº1) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Cálculos: HDL mg/dL=𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑇𝑒𝑠𝑡𝑒

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜×40

4.3.4. Análise das defesas antioxidantes

I. Atividade da glutationa peroxidase (GPx)

A atividade da GPx foi determinada utilizando o “Glutathione peroxidase assay kit”

(kit ab102530, Abcam®). Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foram homogeneizados

em 0,2 mL de tampão de ensaio gelado e centrifugados a 10.000 rpm durante 15 min a 4ºC. O

sobrenadante foi coletado e utilizado para a análise como na descrição a seguir. Cinco (5) µL

de homogenato foram adicionados aos poços da microplaca e o volume final completado para

50 µL de tampão de ensaio. No branco, adicionou-se 50 µL de tampão de ensaio, 40 µL de

mix de reação (tampão de ensaio, 40 mM de NADPH, GR e GSH) e, após mistura, a placa foi

incubada por 15 min em temperatura ambiente. Posteriormente, adicionou-se 10 µL de

hidróxido de cumeno nos poços e, as absorbâncias foram imediatamente lidas em intervalos

de 1 minuto durante 5 minutos à temperatura de 25ºC à 340 nm em um leitor de placa de

ELISA (Biotek ELx808).

Para a curva padrão, o NADPH 40 mM foi diluído em água destilada para gerar um

padrão de NADPH a 1 mM. Adicionou-se 0, 20, 40, 60, 80 e 100 µL do padrão de NADPH a

1 mM na placa de 96 poços, em duplicata, e completou-se o volume final até 100 µL com

tampão de ensaio. A leitura foi realizada a 340 nm nas mesmas condições anteriores e, traçou-

se a curva padrão que foi utilizada como base no cálculo.

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

51

Aplicou-se o ∆A340 à curva padrão para obtenção de B e a atividade de GPx foi

obtida através da divisão de B pelo tempo da primeira leitura diminuído do tempo da segunda

leitura multiplicado pelo volume da amostra e pela diluição.

II. Atividade da glutationa redutase (GR)

A atividade da GR foi determinada utilizando o “Glutathione reductase assay kit” (kit

ab83461, Abcam®). Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foram homogeneizados em 1

mL de tampão de ensaio gelado e centrifugados a 10.000 rpm durante 15 min a 4ºC. O

sobrenadante foi coletado e as amostras tratadas para a destruição da GSH antes do inicio do

ensaio. 5 µL de H2O2 a 3 % foram adicionados a 100 µL de amostra que foi incubada a 25ºC

durante 5 minutos. Após esse tempo, 5 µL de CAT foram adicionados ao microtubo e

novamente a amostra foi incubada a 25ºC durante 5 minutos. Para o ensaio, 5 µL das amostras

tratadas foram pipetados nos poços de uma microplaca e 50 µL do mix de reação (tampão de

ensaio, DNTB, NADPH-GNERAT e GSSG) e em seguida foi realizada a leitura a 405 nm em

um leitor de placa de ELISA (Biotek ELx808). As absorbâncias foram lidas em intervalos de

1 minuto durante 10 minutos a 25ºC.

Para a curva padrão, adicionou-se 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µL de TNB nos poços da

microplaca e completou-se o volume final para 100 µL com tampão de ensaio. A leitura foi

realizada a 405 nm nas mesmas condições anteriores e traçou-se a curva padrão que foi

utilizada como base no cálculo.

Aplicou-se o ∆A405 à curva padrão para obtenção de ∆B e a atividade de GR foi

obtida através da divisão do ∆B pelo tempo da segunda leitura subtraído do tempo da primeira

leitura multiplicado por 0,9, pelo volume da amostra pré-tratada e pelo fator de diluição.

III. Atividade da catalase (CAT)

A determinação da atividade da enzima CAT é baseada na sua capacidade de clivar o

peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e O2, conforme descrito por Aebi (Aebi, 1984).

Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foi homogeneizado em 1 mL de tampão

fosfato a 100 mM (pH 7,2) e em seguida centrifugado a 10.000 g por 10 minutos à 4ºC. O

sobrenadante foi coletado e utilizado como amostra biológica. Em um microtubo foram

adicionados 50 μL de tampão fosfato a 100 mM (pH 7,2) e 40 μL de água destilada e 10 μL

da amostra. A reação foi iniciada pela adição de 900 μL de H2O2 a 5 mM. As absorbâncias

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

52

foram determinadas a cada minuto, durante três minutos, a 240 nm. Água destilada foi

utilizada como branco.

Uma unidade (U) de CAT é equivalente a hidrólise de 1mol de H2O2 (ε = 39,4 L.mol-

1. cm-1) por minuto (Aebi, 1984). A atividade da CAT foi calculada segundo a lei de Lambert

Beer. A absorbância utilizada para o cálculo é o delta obtido das três absorbâncias lidas

(absorbância final – absorbância inicial).

IV. Atividade da superóxido dismutase (SOD)

A atividade da SOD total foi determinada utilizando o “Superoxide Dismutase assay

Kit” (Chemical Cayman, MI, EUA). Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foram

homogeneizados em 1 mL de tampão HEPES 20 mM, gelado, pH 7,2, contendo 1 mM de

Ácido Bis(2- aminoetil) etilenoglicol-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), 210 mM de sacarose e

70 mM de manitol. O homogenato foi centrifugado a 12.000 g por 10 minutos em centrífuga

refrigerada a 4˚C e o sobrenadante foi retirado para ser utilizado como amostra biológica.

Para a realização do ensaio foi utilizado 10 µL de sobrenadante. A reação iniciou-se

pela adição da xantina oxidase. A placa foi incubada em um agitador a temperatura ambiente

por 20 minutos e a absorbância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de placa de ELISA

(Biotek ELx808).

4.3.5. Proteínas Totais

A concentração de proteínas totais foi determinada de acordo com o método de Lowry

(Lowry et al., 1951). O princípio do método baseia-se na redução do reagente Folin Ciocalteu,

ao reagir com aminoácidos aromáticos, catalisada por íons cobre, em meio alcalino, formando

uma coloração azul.

Inicialmente são preparadas as soluções de trabalho conforme descrito abaixo:

- Reagente A: dissolve-se 0,25 g de sulfato de cobre e 0,5 g de citrato de sódio em 100

mL de água destilada. A solução deve ser armazenada, no escuro, em temperatura ambiente.

- Reagente B: dissolve-se 5 g de carbonato de sódio e 1 g de hidróxido de sódio em

250 mL de água destilada. Deve ser armazenada a temperatura ambiente.

- Reagente C: adiciona-se 1 mL do reagente A em 50 mL do reagente B. Deve ser

preparado na hora do teste.

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

53

- Reagente D: dissolve-se 1 mL de Folin-Ciocateau em 1 mL de água destilada. Deve

ser preparado na hora do teste.

Foram realizados quatro pontos para a construção da curva padrão para proteínas

totais, pelo seguinte procedimento:

P1- 25 μL de uma solução estoque de proteínas a 0,2 mg/dL e o volume completado

com água destilada para 100 mL. A concentração final obtida deste ponto é de 0,05 mg/mL.

P2- 7,5 μL de uma solução estoque de proteínas a 2 mg/dL e o volume completado


P3- 15 μL de uma solução estoque de proteínas a 2 mg/dL e o volume completado


P4- 25 μL de uma solução estoque de proteínas a 2 mg/dL e o volume completado


Para a realização da dosagem, foram adicionados 10 μL de amostra ou padrão em

tubos de polipropileno, e completados para 100 μL com água destilada. O branco, usado para

zerar o espectrofotômetro, foi feito apenas com 100 μL de água destilada. Posteriormente

adicionou-se 1 mL do reagente C em todos os tubos (incluindo branco e padrões). A mistura

foi agitada no vórtex e mantida a temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, foi

adicionado em cada tubo 100 μL do reagente D. O volume foi misturado e incubado a

temperatura ambiente, no escuro, por 30 minutos. Em seguida, realizou-se a leitura em

espectrofotômetro a 660 nm.

Após as leituras, foi feito um gráfico expressando a concentração do padrão (Eixo Y)

versus absorbância do padrão (Eixo X). A equação da reta gerada foi utilizada para determinar

a concentração de proteínas totais no homogenato. Todas as concentrações foram obtidas em

mg/mL.

4.3.6. Marcadores de dano oxidativo

I. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

A técnica do TBARS avalia os produtos da peroxidação lipídica ocasionada por EROs,

dentre eles o malondialdeído. Quando esses produtos reagem com o ácido tiobarbitúrico

(TBA) em meio aquecido, dão origem a uma reação colorimétrica que pode ser lida por

espectrofotometria, como descrita por Draper et al. (Draper et al., 1993). Resumidamente,

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

54

100 mg de tecido foram homogeneizados em 1 mL de tampão Tris ácido clorídrico (HCL) a

20 mM, pH 7,4, e centrifugados a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi

coletado e, para o ensaio foram pipetados nos microtubos 500 µL de amostra. Em seguida,

adicionou-se às amostras 250 µL de ácido tricloroacético (TCA), 250 µL de TBA, 125 µL de

hidroxitolueno butilado (BHT) a 5 mM e, após mistura, as amostras foram incubadas por 15

minutos a 95ºC. Após o tempo de incubação, as amostras foram colocadas em banho de gelo

para a interrupção da reação química. Em seguida, foram centrifugadas por 10 minutos a

13.000 rpm e o sobrenadante foi coletado e pipetado nos poços da microplaca para leitura a

535 nm em um leitor de placa de ELISA (Biotek ELx808).

O valor de TBARS se dá pela multiplicação da absorbância da amostra pelo valor do

coeficiente de extinção molar e dividindo-se este resultado pelo valor de proteínas totais na

amostra.

II. Proteína carbonilada

Proteína carbonilada é um marcador da oxidação de proteína por EROs. Derivados

carbonílicos podem ser mensurados por métodos sensitivos, particularmente aqueles que

utilizam o 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). Neste método o DNPH reage com grupos

carbonílicos gerando a hidrazona correspondente, a qual pode ser analisada

espectrofotometricamente (Levine et al., 1994).

Para a realização da dosagem, uma amostra de 400 mg de tecido hepático foi

homogeneizada em 2 mL de tampão fosfato 50 mM, pH 6,7, e em seguida o homogenato foi

centrifugado a 10.000g por 15 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e utilizado no

procedimento experimental. 500 μL do sobrenadante do homogenato foram transferidos para

dois microtubos denominados Amostra (A) e Controle (C). A cada tubo foi adicionado igual

volume de TCA 10% e após centrifugação a 5.000g por 10 minutos a 4°C, o sobrenadante foi

descartado. Em seguida foram adicionados ao tubo A 500 μL de DNPH a 10 mM em 2 M de

HCl, e ao tubo C 500 μL de HCL 2 M. Ambos foram mantidos no escuro à temperatura

ambiente por um período de 30 minutos sofrendo agitação a cada 15 minutos. No passo

seguinte foram adicionados 500 μL de TCA 10% em cada tubo. Em seguida, os tubos foram

centrifugados a 5.000 g por 10 minutos a 4°C e os sobrenadantes foram novamente

descartados. Os precipitados em ambos os tubos foram lavados com 1 mL da mistura

etanol/acetato de etila, na proporção de 1:1, misturados no vórtex e novamente centrifugados

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

55

conforme descrito na etapa anterior, o sobrenadante foi descartado. Este último passo foi

repetido duas vezes. Ao final do processo de lavagem, foram adicionados em ambos os tubos

1 mL de SDS 6%, misturados no vórtex e centrifugados à 10.000 g por 10 minutos à 4°C.

Finalmente as absorbâncias dos sobrenadantes foram determinadas a 370 nm. Os resultados

são expressos em nmol de proteína carbonilada por mg de proteína.

O conteúdo de DNPH incorporado foi calculado utilizando o coeficiente de extinção

molar do DNPH (22000 M-1cm-1) segundo a lei de Lambert Beer.

4.3.7. Zimografia

As amostras de fígado foram pesadas e homogeneizadas (na proporção de 100 mg/400

µL) em tampão RIPA, acrescido de coquetel inibidor de protease (1:1000) a 4ºC. Após a

centrifugação (10 min, 10.000g), o sobrenadante foi coletado e usado imediatamente para

dosagem de proteínas. A concentração protéica foi determinada utilizando-se uma curva

padrão de albumina pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951), utilizando-se o programa

Microsoft Excel.

As zimografias foram executadas segundo protocolo previamente descrito por Sung

(Sung et al., 2007) em gel de poliacrilamida SDS-PAGE (eletroforese em gel de

poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio) a 8% contendo gelatina do tipo A de pele

suína (Sigma Chem. Co, St. Louis, Mo. EUA) na concentração de 2 mg/mL e os géis de

entrada poliacrilamida 5% (w/v) em placas de 0,75mm. A eletroforese foi realizada com a

concentração de 30 µg de proteína para cada amostra, acrescido (de acordo com cálculos

realizados para cada amostra) de tampão RIPA e tampão de amostra para SDS-PAGE. Antes

da aplicação no gel as mesmas foram aquecidas por dois minutos a 37ºC no banho úmido. Um

volume de 10 μL do marcador padrão de massa molecular (BLUeye Prestained Protein

Ladder – Genedirex) foi utilizado em todas as corridas.

A corrida da eletroforese foi realizada durante 120 minutos a 100 V. Após a

eletroforese os géis foram cuidadosamente lavados 3 vezes em 2.5% Triton X-100 para total

remoção do dodecil sulfato de sódio (SDS) seguido de incubação a 37◦C por 18h em tampão

contendo o substrato (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM cloreto de cálcio (CaCl2), 0.05%

ázida de sódio (NaN3), pH 7.5). SDS é o agente responsável pela ativação das

metaloproteinases (MMPs) mesmo na forma inativa sem clivagem proteolítica (Talhouk et al.,

1991). Os géis foram corados com 0,05% de Coomassie Brilliant blue G-250 por 3 horas e

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

56

descorados com solução descorante (4% metanol, 8% ácido acetico e água). A atividade da

gelatinase foi visualizada por bandas não marcadas em um fundo azul representando áreas de

proteólise no substrato de proteína. As MMPs são secretadas na forma latente e necessitam da

clivagem do terminal peptídico NH2 para ativação.

Após descorar o gel da zimografia, os mesmos foram escaneados e as bandas

marcadas foram quantificadas com auxílio do software Quantity One (BioRad) e do software

ImageJ versão 1.32j de domínio público http://rsb.info.nih.gov.ij/ onde a densidade óptica de

cada banda foi detectada. Utiliza-se como parâmetro para análise o volume ajustado das

bandas, que significa o volume total, diminuído do background. Inicialmente o sistema de

análise calcula a média dos valores de densidade óptica para a região delimitada pelo

operador. Esta região deve ter uma área suficiente para abrigar todas as bandas (uma de cada

vez) visíveis no filme, não devendo ser alterada, quando se passa a analisar outra banda.

4.3.8. Análise histológica e morfométrica

O fígado dos camundongos foi removido ao final de cada experimento e fixado em

formol tamponado a 4%. O tecido hepático foi fixado e processado em série decrescente de

álcoois e posteriormente embebido em parafina. Secções parafinadas de aproximadamente 4

μm foram obtidas em micrótomo semi-automático, a as lâminas foram coradas pela técnica de

Hematoxilina & Eosina (HE), para visualização da histoarquitetura do parênquima hepático.

Fotomicrografias foram obtidas em microscópio óptico Leica acoplado a câmera digital

DM5000, com o software de análises Leica Aplication Suite. A análise morfométrica para

quantificação das áreas de necrose foi realizada com o auxílio do software ImageJ, versão

1.32j.

4.4. Experimento 3: Análise dos efeitos protetores do pré-tratamento prolongado

com licopeno em camundongos eutanasiados 12 horas após intoxicação por paracetamol.

4.4.1. Animais

Sabendo que o objetivo principal do Experimento 3 foi analisar os efeitos do pré-

tratamento do licopeno por 14 dias consecutivos no fígado de camundongos eutanasiados 12

horas após a intoxicação com APAP, foram utilizados camundongos machos (n = 35) da

linhagem C57BL/6, de 8-12 semanas, com média de peso 20-30g. Os animais foram alocados

no Biotério da Escola de Nutrição da UFOP, com temperatura e umidade controladas (21 ± 2

ºC, 50 ± 10%, respectivamente) e foram submetidos aos ciclos claro/escuro de 12 h (luzes

http://rsb.info.nih.gov.ij/

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

57

artificiais, 19 - 7 h) e exaustão 15 min/h. O presente estudo foi aprovado pelo CEUA da

UFOP, protocolo 2012/41 (ANEXO 3).

4.4.2. Pré-tratamento com licopeno e indução da hepatotoxicidade

Os camundongos foram distribuídos de acordo com o tratamento recebido nos

seguintes grupos (Figura 10):

Grupo controle (C) – recebeu água filtrada (veículo);

Grupo Óleo (O) – recebeu óleo de girassol (veículo do licopeno);

Grupo APAP (A12) – recebeu o APAP na dose de 500 mg/kg em dose única;

Grupo APAP + Licopeno 10 mg (L10+A12) – recebeu o licopeno (10 mg/kg) por 14 dias

consecutivos e, 1 hora após a última dose de licopeno, foi intoxicado com APAP na dose de

500 mg/kg;

Grupo APAP + Licopeno 100 mg (L100+A12) – recebeu o licopeno (100 mg/kg) por 14 dias

consecutivos e, 1 hora após a última dose de licopeno, foi intoxicado com APAP na dose de

500 mg/kg.

Todos os tratamentos foram administrados por gavagem orogástrica e os animais

permaneceram por um período de 15 horas de jejum antes da eutanásia.

Os animais foram eutanasiados, aleatoriamente, através de inalação de isofluorano

seguida de exsanguinação, 12 horas após a administração do APAP (Figura 11).

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

58

Figura 10. Desenho experimental representando o Experimento 3


A coleta e o processamento do material biológico, assim como as análises seguiram o

mesmo padrão do Experimento 2 e estão descritos nas páginas anteriores. A seguir, serão

descritas as metodologias das demais análises utilizadas no Experimento 3.

4.4.3. Atividade da superóxido dismutase (SOD)

A detecção da atividade da SOD utilizada nesse experimento baseia-se na capacidade

da enzima dismutar o ânion superóxido resultando na diminuição da taxa de auto-oxidação do

pirogalol como descrito por Marklund e Marklund (Marklund e Marklund, 1974).

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

59

Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foram homogeneizados em 1 mL de tampão

fosfato a 50 mM e centrifugados por 10 minutos a 12.000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi

coletado e utilizado para o ensaio. Em microplaca de 96 poços foram pipetados os

sobrenadantes das amostras e os reagentes conforme a tabela abaixo:

Amostra - µL Tampão - µL MTT (1,25 mM) - µL Pirogalol (100 mM) - µL

Branco - 144 6 -

Padrão - 129 6 15

Amostra 30 99 6 15

Após essa etapa a placa foi incubada por 5 min na estufa a 37 ºC. Em seguida, a reação

foi parada através da adição de 150 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) e imediatamente foi

realizada a leitura a 570 nm em um leitor de placa de ELISA (Biotek ELx808).

A atividade enzimática da SOD foi calculada através multiplicação da absorbância da

amostra por 1 U de SOD e dividido pela absorbância do padrão. O resultado final foi dividido

pela quantidade de proteínas totais no tecido.

4.4.4. Dosagem de citocinas

Foi realizada a dosagem de IL-22 e CCL2 no soro dos camundongos pelo método

imunoenzimático de ELISA através de kits da Peprotech ®.

Em microplacas de alta sensibilidade foram adicionados 100 µl de anticorpo

monoclonal contra a proteína (ou peptídeo) a ser dosada, diluídos em tampão fosfato salino

(PBS) contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO),

sendo estas placas incubadas por 12 horas à temperatura ambiente. Anticorpos não adsorvidos

pelas placas foram descartados, por inversão e sucessivas lavagens em PBS-Tween e as placas

bloqueadas com 300 µl/poço de uma solução contendo PBS-BSA 1%, durante 1 hora a

temperatura ambiente. A seguir as placas foram novamente lavadas. As amostras de plasma

foram aplicadas em um volume de 25 µl para cada poço. Paralelamente, a proteína

investigada foi diluída em várias concentrações para o estabelecimento da curva padrão.

Os anticorpos secundários, após os poços serem devidamente lavados, foram diluídos

em PBS-BSA 0.1% e incubados por duas horas à temperatura ambiente. Finalmente, 100 µl

de estreptavidina ligada à peroxidase na diluição de 1:2000 em PBS-BSA 0.1% foram

adicionados à placa e a mesma foi incubada por 30 minutos, em abrigo da luz.

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

60

Após a lavagem das placas foram adicionados 100 µl/poço do substrato ABTS - 2,2′-

Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, Sigma®). Após 20 minutos de incubação

em ausência de luz, a leitura da intensidade de coloração foi realizada em leitor de ELISA

(Microplate Reader, model 680 BioRad) utilizando-se o comprimento de onda de 405 nm.

4.4.5. Ensaio de RT-PCR quantitativa em tempo real

I. Extração do RNA total

O RNA total foi extraído do fígado fresco de camundongos (50 mg) usando Trizol

(Invitrogen Life Technologies, CA, USA) de acordo com as recomendações do fabricante.

Resumidamente, as amostras foram transferidas para tubos de polipropileno e foram

adicionados 500 μL de trizol às amostras lentamente. Estas foram deixadas no gelo por 10

minutos para completa dissociação de complexos nucleoprotéicos. Foram adicionados 100 μL

de clorofórmio em cada tubo, misturou-se por 10 minutos e incubou-se no gelo por mais 10

minutos. Na sequência, os tubos foram centrifugados por 15 minutos a 12.000g a 4 ºC. Após a

centrifugação, foi removida a fase aquosa (contendo o RNA). Esta fase foi transferida para

outro tubo, sendo adicionados 250 μL de isopropanol. A solução foi homogeneizada e

incubada por 45 minutos a -20 ºC. Em seguida, foi centrifugada por 15 minutos a 12.000g a 4

ºC e o sobrenadante descartado. Foi adicionado 1 mL de etanol a 75%, misturado por inversão

e centrifugado por 10 minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o

pellet seco em temperatura ambiente. O RNA foi ressuspendido em 30 μL de água DEPEC

(dietil pirocarbonato). Por último, foi determinada a concentração e pureza do RNA, em

espectrofotômetro NanoVue (GE Healthcare, UK).

II. Síntese do DNA complementar (cDNA)

O cDNA foi sintetizado a partir de 1μg de RNA total, utilizando oligo (dT) (Applied

Biosystems, Foster City, CA) e o kit “Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription” (Applied

Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O meio de reação

continha 2 μL de tampão 10x (500 mM de cloreto de potássio (KCl), 100 mM deTris-HCl, 25

mM de cloreto de magnésio (MgCl2), pH 8,3), 0,8 μL da mistura de desoxiribonucleotídeos

trifosfato (dNTPs) 100 mM, 1 μL de oligo (dT), 1 μL da enzima transcriptase reversa

MultiScribe (50 U/μL). A reação foi realizada nas seguintes condições: 10 minutos a 25°C,

seguido de 120 minutos a 37°C e 5 minutos a 85°C em termociclador Biocycler modelo

MJ96+.

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

61

III. Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores

Os iniciadores utilizados para amplificar o gene de referência endógena, β-actina, e os

genes IL-1β, IL-6 e IL-10 foram desenhados com base nas sequências de Mus musculus,

disponíveis no banco de dados do GenBank (National Center for Biotechnology Information).

As construções foram feitas com o auxílio do programa Primer-BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) (Tabela 5).

Tabela 5. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a análise qRT-PCR

Gene Oligonucleotídeos iniciadores (sequência 5’

para 3’)

β-actina (forward) CTGAGCTGCGTTTTACACC

β-actina (reverse) CGCCTTCACCGTTCCCAGTT

IL-1β (forward) AGAGCCCATCCTCTGTGACT

IL-1β (reverse) GGAGCCTGTAGTGCAGTTGT

IL-6 (forward) ACTTCCATCCAGTTGCCTTCT

IL-6 (reverse) AGTCTCCTCTCCGGACTTGT

IL-10 (forward) TGGGTTGCCAAGCCTTATCG

IL-10 (reverse) CAGCTTCTCACCCAGGGAAT

IV. Curva de eficiência dos oligonucleotídeos iniciadores

Para determinar a eficiência da amplificação dos genes alvo e do gene de referência

endógena foram construídas curvas padrões para cada amplificado, a partir de diluições

seriadas do cDNA de uma mesma amostra. A análise de regressão linear dos valores de

Threshold Cycle (TC) em função do logaritmo da respectiva diluição forneceu o coeficiente

angular da reta (a, em y = ax+b) que foi utilizado para o cálculo da eficiência de amplificação

do produto pelos iniciadores.

V. RT-PCR quantitativa em tempo real

Para a análise da expressão dos genes em estudo foi utilizada a técnica de PCR em

tempo real (qPCR). A quantificação dos produtos formados durante os ciclos de amplificação

foi realizada com o reagente Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Metodologia

Bandeira, A.C.B.

62

Foster City, CA, USA). As reações foram realizadas em placas de 96 poços, sendo

adicionados em cada poço 2 μL de cDNA (100 ng), 0,48 μL de cada primer (forward e

reverse, 10 μM), 6 μL Power de SYBR® Green Master Mix e volume final de água livre de

DNAse para 12 μL. As reações foram realizadas nas seguintes condições, 50°C por 2min, 95°

C por 10 min e então 40 ciclos de 95°C por 15s (desnaturação) e 60°C por 1min (anelamento

dos iniciadores e extensão dos produtos) no termociclador ABI 7300 (Applied Biosystems,

CA, USA). O gerenciamento do termociclador e a coleta dos dados gerados durante a

amplificação foram realizados pelo programa 7000 System SDS Software (Applied

Biosystems). Todas as análises foram realizadas em triplicata. A especificidade dos produtos

obtidos foi confirmada pela análise das curvas de dissociação do produto amplificado ao final

de cada reação.

Os dados obtidos foram analisados utilizando o método de quantificação relativa da

expressão gênica (TC comparativo ou ΔΔTC), que permite quantificar diferenças no nível de

expressão de um gene específico entre as diferentes amostras. A expressão dos genes alvo foi

determinada em função da expressão do gene de referência endógena β-actina e uma amostra

normalizadora (grupo C) foi utilizada como base para os resultados de expressão comparativa.

De posse dos valores de TC, que corresponde ao número de ciclos na fase exponencial da

PCR em que a fluorescência ultrapassa o valor basal, foi calculado o ΔTC de cada amostra, na

qual o valor do TC do gene de referência endógena foi subtraído do TC do gene alvo. Em

seguida foram calculados os valores de ΔΔTC, na qual o valor do ΔTC da amostra

normalizadora (grupo C) foi subtraído do ΔTC das amostras teste (demais grupos

experimentais). Os valores do ΔΔTC obtidos foram utilizados em uma fórmula aritmética

para o cálculo final da diferença de expressão dos genes entre as amostras analisadas, dada

por 2ΔΔTC.

4.5. Análises estatísticas

Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média (dados paramétricos) ou

mediana [valor mín./valor máx.] (dados não paramétricos). Utilizamos P<0,05 como valor de

significância e o teste estatístico one-way ANOVA seguido do pós-teste de Tukey para dados

paramétricos ou o teste de Kruskal Wallis seguido do pós-teste de Dunns para dados não

paramétricos. A análise estatística foi realizada com o auxílio do software GraphPad Prism

versão 5.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

63

5. RESULTADOS

5.1. Análise temporal dos efeitos do paracetamol sobre a função hepática

Para caracterização do modelo de hepatotoxicidade induzido por APAP foi realizada a

dosagem sérica das enzimas hepáticas ALT (A) e AST (B), sendo os resultados expressos em

UI (Figura 12). Em relação à atividade de ALT, foi observado que essa enzima manteve-se,

significativamente, elevada em 3h, 6h, 12h e 24h após a overdose de APAP quando

comparada ao grupo C. A atividade da enzima AST, também, mostrou-se elevada em 3h, 6h,

12h e 24h após a overdose de APAP quando comparada ao grupo C. O pico da atividade foi

observado 3 horas após intoxicação, mostrando uma queda em 6 horas. A atividade elevou-se

em 12 horas quando comparada às 6 horas e, retornou a decair em 24 horas quando

comparada as 3 e 12 horas após a intoxicação.

Os resultados mostraram que a dose de APAP administrada foi capaz de gerar uma

injúria hepática, caracterizando o modelo de hepatotoxicidade.

Figura 12. Efeitos do paracetamol sobre a função hepática.(A) Atividade sérica de alanina

aminotransferase (ALT) e (B) aspartato transaminase (AST) de camundongos C57BL/6

eutanasiados em diferentes tempos após a intoxicação com paracetamol (APAP). C: Grupo

Controle; 3h: camundongos eutanasiados 3 horas após a intoxicação; 6h: camundongos

eutanasiados 6 horas após a intoxicação; 12h: camundongos eutanasiados 12 horas após a

intoxicação; 24h: camundongos eutanasiados 24 horas após a intoxicação. Os resultados são

expressão em média ± erro padrão da média (n = 6), P <0,05 e a ≠ de C, b ≠ de 3h, c ≠ 6h, d

≠ 12h.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

64

5.2. Análise temporal dos efeitos do paracetamol sobre o sistema glutationa

Sabendo que este modelo de hepatotoxicidade causa desequilíbrio redox e a depleção

inicial da GSH devido ao metabolismo do APAP, a análise do sistema GSH é, também, uma

forma de validar o modelo experimental. Ainda, através da análise temporal foi possível

entender o status redox no tecido hepático e escolher dois tempos para o estudo dos possíveis

efeitos protetores do licopeno.

Nos experimentos cujos resultados são apresentados na figura 13 analisamos as

concentrações de GSHt (A), GSH (B), GSSG (C), e relação GSH/GSSG (D) no fígado de

camundongos C57BL/6 eutanasiados em diferentes tempos após intoxicação com APAP.

A concentração de GSHt (A) apresentou uma diminuição evidente no fígado 3 horas

após a administração do APAP (Grupo 3h) quando comparada ao C e seus níveis foram

reestabelecidos nos demais tempos (Grupos 6h, 12h e 24h). Ainda, o grupo 12 horas

apresentou um aumento nos níveis de GSHt quando comparado ao grupo 6h.

Com resultado semelhante, a concentração da GSH (B) apresentou uma diminuição

evidente no fígado 3 horas após a administração do APAP (Grupo 3h) quando comparado ao

C e seus níveis foram reestabelecidos nos demais tempos (Grupos 6h, 12h e 24h). Esses

resultados confirmam a depleção da GSH nas horas iniciais após a overdose, confirmando o

modelo de hepatotoxicidade utilizado.

Com relação à GSSG (C), o gráfico mostra uma redução em sua concentração hepática

3 horas após a administração do APAP quando comparado ao C. Sua concentração parece se

reestabelecer a níveis semelhantes ao do C no tempo de 6 horas após a intoxicação e, há um

aumento de GSSG em 12 horas e 24 horas após intoxicação com APAP quando comparado

aos demais grupos (Grupos C, 3h e 6h). O pico de GSSG é observado após 12 h da

intoxicação com APAP.

Ao analisar a relação entre GSH/GSSG, foi observada uma diminuição da relação no

grupo 12h quando comparado aos grupos C, 3h e 6h, sugerindo que o desequilíbrio redox se

estabeleceu 12 horas após a intoxicação com APAP.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

65

Figura 13. Efeitos do paracetamol sobre o sistema glutationa. Quantidades de glutationa

total (GSHt)(A), reduzida (GSH) (B), oxidada (GSSG) (C) e relação GSH/GSSG (D) no

fígado de camundongos C57BL/6 eutanasiados em diferentes tempos após intoxicação com

paracetamol (APAP). C: Grupo Controle; 3h: camundongos eutanasiados 3 horas após a

intoxicação; 6h: camundongos eutanasiados 6 horas após a intoxicação; 12h: camundongos

eutanasiados 12 horas após a intoxicação; 24h: camundongos eutanasiados 24 horas após a

intoxicação. Os resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 6), P <0,05

e a ≠ de C, b ≠ de 3h, c ≠ 6h, d ≠ 12h.

5.3. Efeitos da dose única de licopeno sobre os parâmetros bioquímicos de função

hepática e indicadores séricos do perfil lipídico após intoxicação com paracetamol

Através dos resultados do Experimento 1, que sugerem que o início do desequilíbrio

redox ocorre nas 12 horas após a intoxicação com APAP, optou-se por estudar os efeitos do

licopeno em fígado de camundongos, em 12 e 24 horas após intoxicação com APAP.

Em relação à enzima ALT (Tabela 6), foi observado um aumento significativo de sua

atividade em todos os grupos de 12 horas intoxicados com APAP (A12, L10+A12 e

L100+A12) quando comparados ao grupo C. Da mesma forma, em 24 horas a atividade de

Resultados

Bandeira, A.C.B.

66

ALT permaneceram elevadas em todos os grupos experimentais de APAP quando

comparados ao C.

Com resultado semelhante, a atividade de AST (Tabela 6) mostrou-se aumentada em

todos os grupos de 12 e 24 horas intoxicados com APAP (A12, L10+A12, L100+A12, A24,

L10+A24 e L100+A24) quando comparados ao grupo C.

Ainda na tabela 6, analisamos as concentrações de CT (mg/dL), colesterol HDL

(mg/dL) e a FA (CT – colesterol HDL).

Os grupos A24, L10+A24 e L100+A24 mostraram uma diminuição do CT, em 24

horas, quando comparados ao C.

Em relação ao HDL, o grupo que recebeu apenas óleo de girassol (grupo O), obteve

um aumento sérico dessa lipoproteína quando comparado ao C. E tanto em 12 horas quanto

em 24 horas, os grupos experimentais APAP apresentaram uma diminuição de HDL quando

comparados ao grupo C e ao grupo O, com exceção do grupo L100+A12, que em 12 horas,

teve uma diminuição do HDL apenas quando comparado ao grupo O. Ainda, o grupo

L100+A24 apresentou um diminuição significativa de HDL em 24 horas quando comparado

ao seu par no tempo 12 horas.

Ao analisar a FA, foi observado que o grupo experimental L100+A12 apresentou um

aumento dessa fração quando comparado ao C. Não houve diferença entre os grupos

experimentais APAP, em 24 horas, quando comparados ao C.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

67

Tabela 6. Parâmetros bioquímicos séricos

C O A12 L10+A12 L100+12 A24 L10+A24 L100+A24

ALT (UI) 11,2±1,7 19,3±3,7 157,5±4,5a 153,0±5,4a 161,1±2,3a 142,0±0,8a 143,2±1,2a 145,9±0,8a

AST (UI) 38,6±6,1 71,4±5,3 169,4±18,3a 181,2±3,7a 188,0±2,2a 97,4±10,6a 109,0±1,6a 111,9±3,7a

CT (mg/dL) 76,0±2,7 96,2±3,5 62,6±4,3 65,5±7,3 98,6±10,2 43,4±4,4a 46,9±5,2a 40,5±3,5a

HDL (mg/dL) 53,7±1,7 68,0±3,2a 32,4±2,9a,b 24,1±3,9a,b 43,3±2,6b 20,0±2,7a,b 20,4±5,0a,b 16,0±4,9a,b

FA (mg/dL) 22,3±2,1 27,4±3,6 35,9±5,2 35,6±8,9 47,5±11,4a 28,9±2,5 26,5±2,4 37,0±6,4

Abreviações: ALT: Alanina aminotransferase; AST: Aspartato transaminase; CT: Colesterol total; HDL: lipoproteína de alta densidade; FA:

Frações aterogênicas; C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12

h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10 mg/kg +

paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. One-way-ANOVA seguido do pós-teste de tukey (P < 0,05). a ≠

do C; b ≠ do O (n = 7).

Resultados

Bandeira, A.C.B.

68

5.4. Efeitos da dose única de licopeno sobre o sistema glutationa no fígado de

camundongos intoxicados com paracetamol

Sabendo que o licopeno apresenta uma relevante ação antioxidante como uma das suas

principais características, nós analisamos a sua influência no desequilíbrio redox hepático

induzido pela overdose de APAP. Na figura 14, analisamos os níveis de GSHt (A), GSH (B),

GSSG (C) e a relação GSH/GSSG (D).

Em relação à GSHt, os grupos experimentais L10+A12 e L100+A12 apresentaram

uma diminuição de GSHt comparados ao A12. Em 24 horas, os grupos A24, L10+A24 e

L100+24 apresentaram um aumento significativo de GSHt quando comparados ao C e apenas

L10+A24 e L100+24 mostraram-se aumentados quando comparados aos seus respectivos

grupos em 12 horas (L10+A12 e L100+12) (Figura 14A).

A concentração de GSH apresentou-se diminuida no grupo L100+A12 quando

comparado a A12. Em 24 horas, os grupos L10+A24 e L100+A24 apresentaram um aumento

de GSH quando comparados aos seus respectivos grupos em 12 horas (L10+A12 e L100+12)

(Figura 14B).

Os níveis de GSSG mostraram-se alterados na maioria dos grupos experimentais

APAP, com aumento de sua concentração em ambos os tempos, de 12 e 24 horas, quando

comparados ao C. Em 12 horas apenas observamos que houve uma diminuição de GSSG no

grupo L10+A12 quando comparado a A12. E em 24 horas, o grupo A24 apresentou uma

redução de GSSG quando comparado ao grupo A12 (Figura 14C).

Por fim, ao realizar a relação GSH/GSSG, observou-se uma diminuição da relação no

grupo A12 quando comparados ao grupo C. Os demais grupos não apresentaram diferenças

estatísticas quando comparados ao grupo C (Figura 14D).

Resultados

Bandeira, A.C.B.

69

Figura 14. Influência da dose única de licopeno sobre o sistema glutationa no modelo de

overdose por paracetamol. (A) Concentração de Glutationa total (GSHt) (nmol/ml), (B)

Glutationa reduzida (GSH), (C) Glutationa oxidada (GSSG) e (D) Razão GSH/GSSG no

fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10 mg/kg e 100

mg/kg) 1 hora antes da intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e eutanasiados em 12

e 24 horas após overdose. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h;

L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100

mg/kg + paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10

mg/kg + paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. Os

resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠

de A12, d ≠ L10+A12,e ≠ L100+A12.

5.5. Efeitos da dose única de licopeno sobre as enzimas de defesa antioxidante no

fígado de camundongos intoxicados com paracetamol

A fim de avaliar o potencial antioxidante da dose única de licopeno no estresse

oxidativo induzido por APAP, a resposta de diferentes enzimas antioxidantes foi testada.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

70

Nos experimentos cujos resultados são apresentados na figura 15, analisamos as

enzimas GPx e GR.

Não foram observadas diferenças em relação a atividade da GPx em nenhum do

grupos experimentais quando comparados ao grupo C (Figura 15A).

Ao analisar a GR, foi observado um aumento de sua atividade nos grupos A12,

L10+A12 e L100+A12 quando comparados ao grupo C, porém, nos grupos eutanasiados 24 h

após a overdose de APAP, a atividade da enzima não foi estatisticamente diferente de C e

mostrou-se diminuida quando comparada aos demais grupos eutanasiados 12 horas após a

overdose de APAP (Figura 15B).

Na figura 16, analisamos as enzimas antioxidantes CAT e SOD.

As atividades da CAT e da SOD não apresentaram diferenças estatisticamente

significativas entre os grupos experimentais e o grupo C.

Figura 15. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade de glutationa peroxidase

e glutationa redutase no modelo de overdose por paracetamol. (A) Atividade de glutationa

peroxidase – GPx (U/mL) e (B) Glutationa redutase – GR (U/mL) no fígado de camundongos

C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10 mg/kg e 100 mg/kg) 1 hora antes da

intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e eutanasiados em 12 e 24 horas após

overdose. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo

licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg +

paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10 mg/kg +

paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. Os resultados

são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠ de A12, d ≠

L10+A12,e ≠ L100+A12.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

71

Figura 16. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade da catalase e da

superóxido dismutase no modelo de overdose por paracetamol. (A) Atividade da Catalase –

CAT (U/mg ptn) e (B) Superóxido dismutase – SOD (U/mL) no fígado de camundongos

C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10 mg/kg e 100 mg/kg) 1 hora antes da

intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e eutanasiados em 12 e 24 horas após

overdose. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo

licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg +

paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24: grupo licopeno 10 mg/kg +

paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 24 h. Os resultados

são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠ de A12.

5.6. Efeitos da dose única de licopeno sobre os marcadores de dano oxidativo no


Com o objetivo de avaliar a influência da dose única de licopeno no dano oxidativo

causado pela overdose por APAP, quantificamos os marcadores através do TBARS (Figura

17A) e da proteína carbonilada (Figura 17B).

Em relação ao TBARS, foi observado que houve um aumento significativo do dano no

grupo L10+A12 quando comparado ao grupo C. Em 24 horas, foi observado um aumento do

dano no grupo A24 quando comparado aos grupos C e A12. A dose única de licopeno na

menor concentração foi capaz de reduzir o dano causado pelo APAP 24 horas após a

intoxicação, ou seja, observou-se uma diminuição do TBARS no grupo L10+A24 quando

comparado ao grupo A24. O grupo L100+A24 não teve redução significativa em relação a

A24 e mostrou-se aumentado quando comparado a C.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

72

Ao quantificar as proteínas carboniladas não foi observada diferença estatistica nos

grupos eutanasiados 12 horas após overdose por APAP (A12, L10+A12 e L100+A12) quando

comparados ao grupo C. Já em 24 horas, a concentração de proteínas carboniladas em A24

apresentou aumento quando comparado ao grupo C e, ambas doses de licopeno foram capazes

de reduzir os níveis de carbonilação de proteínas. Logo, L10+A24 e L100+A24 mostraram

uma redução quando comparados ao grupo A24.

Os dados acima sugerem que o licopeno mostrou-se efetivo na proteção contra o dano

oxidativo causado pelo APAP.

Figura 17. Influência da dose única de licopeno sobre os marcadores de dano oxidativo no

modelo de overdose por paracetamol. (A) Concentração de substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico – TBARS (nmol/mg ptn) e (B) de proteínas carboniladas (nmol/mg ptn) no








de A12, f ≠ de A24.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

73

5.7. Efeitos da dose única de licopeno sobre a atividade da gelatinase MMP-2 no


Para avaliar os efeitos da dose única de licopeno nos distúrbios da matriz extracelular

induzidos por APAP, a atividade de MMP-2 foi avaliada por zimografia em amostras de

fígado.

Ao analisar a intensidade das bandas claras (Figura 18A) e o gráfico densitométrico

(Figura 18B), observou-se uma atividade gelatinolítica elevada de MMP-2 no grupo O e nos

animais eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP (A12) quando comparados ao

grupo C. Além disso, a dose única de licopeno, na maior concentração (grupo L100+A12), foi

capaz de diminir significativamente a atividade de MMP-2 quando comparado ao grupo A12.

O grupo L10+A12 não alterou a atividade de MMP-2, sendo incapaz de reveter a desordem

estabelecida pelo APAP. Nos grupos eutanasiados 24 horas após a overdose de APAP (A24,

L10+A24 e L100+A24) não foram observadas diferenças significativas quando comparados

ao grupo C.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

74

Figura 18. Influência da dose única de licopeno sobre a atividade de MMP-2 no modelo de

overdose por paracetamol. (A) Bandas claras de 72 kDa no gel da zimografia (B) e gráfico

densitométrico demonstrando a atividade da metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) no








de A12.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

75

5.8. Efeitos da dose única de licopeno sobre a necrose tecidual hepática de

camundongos intoxicados com paracetamol

A fim de avaliar os efeitos da dose única de licopeno na lesão hepática induzida pela

overdose de APAP, secções do fígado foram coradas com HE para vizualização do

parênquima hepático.

As figuras 19A e 19B mostram a histologia com morfologia normal do tecido hepático

nos grupos C e O, respectivamente. Nos grupos A12 e A24 (Figuras 19C e 19F,

respectivamente), o dano celular é visível, observando-se grandes áreas de necrose,

hemorragia e áreas de degeneração hidrópica. Em ambos grupos pré-tratados com a dose

única de licopeno e expostos ao APAP (L10+A12 e L100+A12) (Figura 19D e 19E,

respectivamente) houve danos, porém, em menor extensão quando comparando-se ao A12.

Em 24 horas, somente a dose mais baixa de licopeno (L10+A24) (Figura 19G) foi capaz de

melhorar a aparência morfológica geral em comparação ao grupo A24. Esses resultados foram

confirmados através da quantificação da área de necrose através da análise morfométrica. A

figura 20, mostra a diminuição significativa da porcentagem da área de necrose nos grupos

pré-tratados com a dose única de licopeno (L10+A12 e L100+A12) quando comparados ao

grupo A12. Em 24 horas, a área de necrose foi menor no grupo L10+A24, porém, não no

grupo L100+A24 quando comparados ao grupo A24.

Esses dados mostraram que o licopeno parece ter um efeito protetor contra a

toxicidade exercida pelo APAP no tecido hepático.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

76

Figura 19. Fotomicrografia representativa e porcentagem de área de necrose hepática.

Secções de fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados com duas doses de licopeno (10

mg/kg e 100 mg/kg) 1 hora antes da intoxicação com APAP (500 mg/kg/dose única) e

eutanasiados em 12 e 24 horas após overdose. Figuras A e B retratam a histologia hepática

normal (grupos C e O, respectivamente), figuras C, D e E (grupos A12, L10+A12 e

L100+A12, respectivamente), figuras F, G e H (grupos A24, L10+A24 e L100+A24,

respectivamente). Coloração: hematoxilina e eosina (HE). Aumento: 400x. Setas: Áreas de

necrose.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

77

Figura 20. Influência da dose única de licopeno sobre a necrose tecidual hepática no

modelo de overdose por paracetamol. A figura I representa a porcentagem de área de

necrose hepática nos grupos experimentais. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo

paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12:

grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h; A24: grupo paracetamol 24 h; L10+A24:

grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 24 h; L100+A24: grupo licopeno 100 mg/kg +

paracetamol 24 h. Os resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P

<0,05 e a ≠ de C, c ≠ de A12, e ≠ L100+A12, f ≠ A24.

5.9. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre os parâmetros

bioquímicos de função hepática e indicadores séricos do perfil lipídico após intoxicação

com paracetamol

Ainda com base no experimento 1 e após análise dos resultados do experimento 2,

optou-se pelo estudo do efeitos do pré-tratamento prolongado com licopeno em camundongos

C57BL/6 eutanasiados 12 horas após a intoxicação com APAP.

Na tabela 7 encontram-se os resultados relativos aos parâmetros bioquímicos séricos

(enzimas hepáticas ALT e AST, CT, HDL e FA).

Resultados

Bandeira, A.C.B.

78

As enzimas hepáticas ALT e AST encontraram-se elevadas 12 horas após

administração do APAP (grupo A12) quando comparadas ao grupo C, mostrando a existência

da injúria do órgão. Não foi observada a diminuição da atividade da enzima nos grupos pré-

tratados por 14 dias com ambas doses de licopeno e posteriormente intoxicados com APAP

(L10+A12 e L100+A12) quando comparados ao A12, mostrando que o licopeno não teve

influência sobre a atividade dessas enzimas.

Em relação ao CT, nos grupos A12 e L10+A12 houve diminuição do conteúdo de CT

quando comparado ao grupo C. O grupo que recebeu pre-tratamento com a dose mais alta de

licopeno, L100+A12, não mostrou diminuição de CT quando comparado ao grupo C. Por

outro lado, houve um aumento de 38% do conteúdo de CT em L100+A12 quando comparado

ao grupo A12.

Todos os grupos expostos ao APAP apresentaram redução da quantidade de HDL

quando comparados ao grupo C, independente do pré-tratamento com o licopeno.

Ainda, a quantidade de FA não foi diferente em nenhum dos grupos experimentais

quando comparado ao grupo C.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

78

Tabela 7. Parâmetros bioquímicos séricos

C O A12 L10+A12 L100+A12

ALT (UI)

22,0±1,8

15,9±0,8

166,0±1,7a

162,0±2,7a

164,1±2,5a

AST (UI) 41,5±4,6 40,2±1,9 143,8±2,5a 139,6±1,6a 139,8±1,6a

CT (mg/dL) 69,3±3,5 82,8±3,6 42,2±3,5a 41,0±4,4a 58,2±5,8

HDL (mg/dL) 39,9±1,7 42,2±2,3 10,8±0,6a 9,0±0,9a 17,0±4,5a

FA (mg/dL) 29,4±4,8 41,0±2,3 28,8±2,6 30,0±2,8 41,1±3,5

Abreviações: ALT: Alanina aminotransferase; AST: Aspartato transaminase; CT: Colesterol total; HDL: lipoproteína de alta densidade; FA:

Frações aterogênicas; C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12

h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. One-way-ANOVA seguido do pós-teste de tukey (P < 0,05). a ≠ do C (n = 7).

Resultados

Bandeira, A.C.B.

79

5.10. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o sistema

glutationa no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol

A análise do sistema glutationa mostrou uma redução na quantidade de GSHt no grupo

A12 quando comparado ao grupo C, o que era esperado visto que a intoxicação por APAP

causa a depleção de GSH nas primeiras horas após a overdose. Essa redução de GSHt foi

revertida nos grupos pré-tratados com licopeno, portanto, houve um aumento de GSHt nos

grupos L10+A12 e L100+A12 quando comparado a A12 (Figura 21A).

O conteúdo da GSH mostrou resultado similar ao da GSHt. No grupo A12 houve

redução de GSH quando comparado ao grupo C e o pré-tratamento com o licopeno (L10+A12

e L100+A12) reverteu essa situação (Figura 21B).

A figura 21C mostra que houve um aumento de GSSG no grupo A12 quando

comparado ao grupo C e este aumento manteve-se no grupo L10+A12. No grupo pré-tratado

por 14 dias com a dose mais alta de licopeno (L100+A12) houve uma diminuição do

conteúdo de GSSG quando comparado ao grupo L10+A12, ainda não havendo diferença

estatística quando entre os grupos L100+A12 e C.

A relação GSH/GSSG mostrou-se diminuída no grupo A12 e no grupo L10+A12

quando comparados ao grupo C, representando um possível estado de desequilíbrio redox, o

que não foi observado no grupo L100+A12, já que esse foi estatisticamente igual ao grupo C.

Os resultados acima apresentados sugerem que o pré-tratamento durante 14 dias com o

licopeno teve efeitos importantes sobre o sistema glutationa.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

80

Figura 21. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o sistema

glutationa no modelo de overdose por paracetamol. (A) Concentração de Glutationa total

(GSHt)(nmol/ml), (B) Glutationa reduzida (GSH), (C) Glutationa oxidada (GSSG) e (D)

Razão GSH/GSSG no fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos

com 10 ou 100 mg/kg de licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C:

grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10



de A12, d ≠ L10+A12.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

81

5.11. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre enzimas de

defesa antioxidante no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol

Sobre a atividade das enzimas CAT e SOD, os resultados podem ser observados nos

gráficos da figura 22.

A overdose por APAP reduziu a atividade da enzima CAT 12 horas após a intoxicação

quando comparado ao grupo C. Já o pré-tratamento durante 14 dias com o licopeno

reestabeleceu a atividade da enzima, logo, houve aumento de atividade nos grupos L10+A12

e L100+A12 quando comparados as grupos A12 (Figura 22A).

Em relação a SOD, observou-se um aumento de sua atividade no grupo A12 quando

comparado aos grupo C, bem como os grupos pré-tratados durante 14 dias com o licopeno,

L10+A12 e L100+A12, e porteriormente intoxicados com APAP, também apresentaram

aumento da atividade da SOD quando comparados ao grupo C. L10+A12 e L100+A12 não

foram diferentes de A12 (Figura 22B).

Esses dados confirmam que o pré-tratamento prolongado com licopeno exerce uma

influência sobre a atividade da CAT.

Figura 22. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a atividade de

enzimas antioxidantes no modelo de overdose por paracetamol. (A) Atividade da Catalase –

CAT (U/mg ptn) e (B) Superóxido dismutase – SOD (U/mL) no fígado de camundongos

C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos com 10 ou 100 mg/kg de licopeno e

eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C: grupo controle; O: grupo óleo; A12:

grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h;

L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. Os resultados são expressão em

média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, c ≠ de A12.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

82

5.12. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre os marcadores

de dano oxidativo no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol

Mais uma vez, a fim de avaliar o efeito do pré-tratamento durante 14 dias com o

licopeno sobre o dano oxidativo causado pela overdose de APAP, a quantidade de TBARS e

proteínas carboniladas foram avaliadas (Figura 23).

A análise de TBARS mostrou um aumento da peroxidação lipídica no grupo

intoxicado com APAP (A12) quando comparado ao grupo C. Os grupos L10+A12 e

L100+A12 apresentaram uma diminuição da peroxidação lipídica quando comparados ao

grupo A12, demonstrando um efeito protetor do licopeno (Figura 23A).

A figura 23B representa o resultado de carbonilação de proteínas que mostrou um

perfil similar ao resultado de TBARS. Houve um aumento de proteínas carboniladas no grupo

A12 quando comparado ao grupo C e uma diminuição no grupo L100+A12 quando

comparado ao grupo A12. Não houve diferenças estatísticas relacionadas ao grupo L10+A12.

Os dados acima sugerem que o pré-tratamento com o licopeno durante 14 dias foi

efetivo na proteção contra o dano oxidativo causado pela exposição ao APAP.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

83

Figura 23. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre marcadores de

dano oxidativo no modelo de overdose por paracetamol.(A) Concentração de substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS (nmol/mg ptn) e (B) de proteínas carboniladas

(nmol/mg ptn) no fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos





de A12.

5.13. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre o perfil

inflamatório em camundongos intoxicados com paracetamol

A intoxicação por APAP desencadeia um grande número de desordens hepáticas,

como por exemplo, desordens de caráter inflamatório. Sabendo disso, nosso trabalho analisou

o comportamento de CCL2 e IL-22 em amostras de soro e a expressão do RNAm de IL-1β,

IL-6 e IL-10 no fígado de camundongos pré-tratados durante 14 dias com licopeno e

posteriormente expostos ao APAP.

A quantidade de CCL2 mostrou-se elevada no grupo O quando comparado ao grupo C

e os demais grupos, A12, L10+A12 e L100+A12, apresentaram uma redução de CCL2

quando comparados ao grupo O, porém não houve diferenças em relação ao C (Figura 24A).

Em relação a IL-22, um aumento no grupo O quando comparado ao grupo C. Não

houve diferenças do conteúdo de IL-22 nos demais grupos quando comparados ao grupo C

(Figura 24B).

Resultados

Bandeira, A.C.B.

84

A expressão do RNAm para IL-1β aumentou em 67% no grupo A12 quando

comparado ao grupo C, embora não tenha sido estatisticamente significativo. O pré-

tratamento com o licopeno reduziu a expressão de IL-1β, portanto, L10+A12 e L100+A12

apresentaram uma diminuição da expressão de IL-1β quando comparado ao grupo A12. Em

relação à expressão gênica de IL-6 observamos uma diminuição no grupo A12 quando

comparado ao grupo C e os grupos pré-tratados, L10+A12 e L100+A12, não apresentaram

diferenças em relação aos demais grupos. Ainda, a expressão da citocina IL-10 não

apresentou diferenças estatísticas entre os grupos (Tabela 8).


CCL2 e IL-22 no modelo de overdose por paracetamol (A) Atividade de CCL2 (quimiocina

ligante 2 (motivo C-C) (µg/mL) e (B) de IL-22 (Interleucina-22) (ng/mL) no soro de

camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos com 10 ou 100 mg/kg de

licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C: grupo controle; O: grupo

óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12

h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. Os resultados são expressão

em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C, b ≠ de O.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

85

Tabela 8. Razão de expressão de mRNA

C O A12 L10+A12 L100+A12

IL-1β

1,00±0,0

1,01±0,6

1,67±0,4

0,68±0,4c

0,58±0,2c

IL-6

1,00±0,0

0,77±0,7

0,32±0,2a

0,37±0,3

0,40±0,4

IL-10

1,00±0,0

1,38±1,4

0,45±0,2

0,57±0,4

0,30±0,2

Abreviações: IL-1β: interleucina -1β; IL-6: interleucina- 6; IL-10: interleucina- 10; C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol

12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. One-way-ANOVA

seguido do pós-teste de tukey (P < 0,05). a ≠ do C; c ≠ do A12 (n = 7).

Resultados

Bandeira, A.C.B.

86

5.14. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a atividade da

gelatinase MMP-2 no fígado de camundongos intoxicados com paracetamol

A fim de avaliar a influência do pré-tratamento durante 14 dias com o licopeno sobre a

atividade da MMP-2 no parênquima hepático após intoxicação com APAP, a técnica da

zimografia foi realizada (Figura 25).

A figura 25A mostra as bandas que foram analisadas pela intensidade da cor clara. No

gráfico obtido por densitometria (Figura 25B), houve um aumento da atividade da MMP-2 no

grupo A12 quando comparado ao grupo C. Os grupos pré-tratados com licopeno (L10+A12 e

L100+A12) foram capazes de reverter o aumento da atividade de MMP-2 provocado pela

overdose de APAP, mostrando que o licopeno tem um importante efeito de modulação

relacionado à MMP-2, como já foi visto no experimento 2 (Figura 18B).


MMP-2 no modelo de overdose por paracetamol. (A) Bandas claras de 72 kDa no gel da

zimografia (B) e gráfico densitométrico demonstrando a atividade de metaloproteinase de

matriz 2 (MMP-2) no fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos





de A12.

Resultados

Bandeira, A.C.B.

88

5.15. Efeitos do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a necrose

tecidual hepática de camundongos intoxicados com paracetamol

O APAP é um agente hepatotóxico que causa danos ao parênquima hepático, como já

foi observado nos resultados do experimento 2. A fim de avaliar o efeito do pré-tratamento

com licopeno durante 14 dias consecutivos sobre a porcentagem de área de necrose após

exposição ao APAP, foi realizada a análise das lâminas histológicas bem como a morfometria

das áreas de interesse. Os grupos C (Figura 26A) e O (Figura 26B) apresentaram histologia

hepática normal, enquanto os demais grupos que receberam APAP (A12, L10+A12 e

L100+A12) apresentaram grandes áreas de necrose (Figura 26C, 26D e 26E,

respectivamente). Os grupos A12 e L10+A12 apresentaram um aumento significativo da

porcentagem da área de necrose quando comparados ao grupo C. O grupo L100+A12 não se

mostrou significativimente diferente do grupo C e apresentou uma menor área de necrose

quando comparado ao grupo A12, apesar de não ser estatisticamente significante (Figura 27).

Resultados

Bandeira, A.C.B.

89

Figura 26. Fotomicrografia representativa da área de necrose hepática. Secções de fígados de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias

consecutivos com 10 ou 100 mg/kg de licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. Figuras A e B retratam a histologia

hepática normal (grupos C e O, respectivamente), figuras C, D e E (grupos A12, L10+A12 e L100+A12, respectivamente). Coloração:

hematoxilina e eosina (HE). Aumento: 400x. Setas: áreas de necrose. Abreviações: C: grupo controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol

12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg + paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h (n = 7).

Resultados

Bandeira, A.C.B.

90

Figura 27. Influência do pré-tratamento prolongado com o licopeno sobre a porcentagem

de área de necrose no modelo de overdose por paracetamol.(A) Porcentagem da área de

necrose no fígado de camundongos C57BL/6 pré-tratados por 14 dias consecutivos com 10

ou 100 mg/kg de licopeno e eutanasiados 12 horas após a intoxicação por APAP. C: grupo

controle; O: grupo óleo; A12: grupo paracetamol 12 h; L10+A12: grupo licopeno 10 mg/kg

+ paracetamol 12 h; L100+A12: grupo licopeno 100 mg/kg + paracetamol 12 h. Os

resultados são expressão em média ± erro padrão da média (n = 7), P <0,05 e a ≠ de C.

Discussão

Bandeira, A.C.B.

91

6. DISCUSSÃO

O uso abusivo do APAP, seja por falta de conhecimento ou mesmo intencional, vem

sendo a principal causa de intoxicação e lesão hepática observada na clínica em muitos países

(Reuben et al., 2010). Desta forma, sabendo das propriedades antioxidantes do licopeno e dos

efeitos prejudicais do APAP no metabolismo redox, a hipótese da atual pesquisa foi verificar

se o pré-tratamento com o licopeno, seja ele em dose única ou mesmo um pré-tratamento

prolongado, seria capaz de modular e/ou melhorar o quadro de intoxicação.

Antioxidantes que podem mitigar os efeitos danosos de EROs têm sido o foco de

pesquisas recentes (Rao e Rao, 2007). O efeito protetor de alguns tipos de alimentos é

atribuído à presença de compostos fitoquímicos como carotenóides, tocoferóis e polifenóis, os

quais possuem propriedades antioxidantes. Com base nesses estudos, produtos alimentícios e

suplementos dietéticos com significante potencial antioxidante têm sido o foco de intensas

pesquisas (D'angelo et al., 2009).

O licopeno vem sendo amplamente estudado, principalmente em relação às suas

características preventivas. Esse composto é classificado como um carotenóide que possui

uma cadeia de hidrocarbonetos acíclicos altamente insaturados contendo onze (11) ligações

conjugadas e duas (2) ligações não conjugadas. Devido a essa característica de possuir uma

grande quantidade de ligações conjugadas, o licopeno apresenta uma potente capacidade

antioxidante (Trejo-Solís et al., 2013). Dentre os carotenóides, o licopeno é considerado o

mais poderoso antioxidante e, estudos já demonstraram seus efeitos protetores em diversas

doenças (Di Mascio et al., 1989; Jacques et al., 2013; Ono et al., 2015; Vilahur et al., 2015;

Wang et al., 2015).

O presente estudo foi dividido em três experimentos, de forma que o primeiro

experimento (Experimento 1) teve como objetivo o estabelecimento do modelo experimental

de toxicidade hepática e, para isso, foram avaliados os marcadores de função hepática e o

comportamento do sistema glutationa perante a intoxicação pelo fármaco APAP. Tendo

estabelecido o modelo, realizou-se o segundo experimento (Experimento 2) com o objetivo

principal de estudar o efeito da dose única de licopeno no modelo de hepatotoxicidade

induzido pelo APAP. Em seguida, realizou-se o último experimento (Experimento 3) que teve

como objetivo estudar o efeito de um pré-tratamento de 14 dias com o licopeno no modelo de

hepatotoxicidade. Em ambos os Experimentos 2 e 3, os grupos que receberam apenas o

Discussão

Bandeira, A.C.B.

93

licopeno nas doses de 10 ou 100 mg/kg foram realizados e não apresentaram diferenças

estatísticas quando comparados ao grupo controle (dados não mostrados).

O presente trabalho foi um estudo pioneiro, visto que foi a primeira vez que se

investigaram os efeitos do licopeno no modelo de hepatotoxicidade induzida por APAP, o que

pôde ser observado através de uma breve pesquisa na base de dados PubMed. Até a presente

data (Janeiro de 2017), foram encontrados apenas quatro artigos científicos ao utilizarmos

para a busca de pesquisa as palavras-chave “lycopene and acetaminophen” ou “lycopene and

APAP”. Destes quatro artigos indexados, dois foram produtos dessa tese, a saber: 1)

Lycopene pretreatment improves hepatotoxicity induced by acetaminophen in C57BL/6 mice;

2) Lycopene inhibits reactive oxygen species production in SK-Hep-1 cells and attenuates

acetaminophen-induced liver injury in C57BL/6 mice. Já os outros dois artigos apresentavam

objetivos distintos à nossa proposta. O primeiro artigo, de Le Marchand et al. (Le Marchand

et al., 1997), estuda os efeitos estimulantes do paracetamol e do café sobre a atividade da

enzima CYP1A2, sugerindo efeitos inibitórios dos estrogênios, alcoóis e fontes alimentares,

como tocoferóis, sobre a atividade desta enzima em humanos. O segundo artigo, de

Jamshidzadeh et al. (Jamshidzadeh et al., 2008), estudou os efeitos do extrato de tomate sobre

o estresse oxidativo, em diferentes órgãos, induzido por diferentes modelos de toxicidade em

ratos. Um dos modelos que foi utilizado é o modelo de intoxicação por APAP e, o extrato de

tomate foi utilizado como um tratamento durante 7 dias consecutivos após estabelecida a

hepatotoxicidade, o que figura uma importante limitação do estudo de Jamshidzadeh et al.,

visto que o modelo de overdose por APAP é um modelo reversível em ratos após a retirada do

insulto. A falta de estudos na literatura associando o licopeno ao paracetamol acabou por

limitar a presente discussão em alguns pontos, como a confrontação dos nossos dados com

outros resultados da literatura, porém, por outro lado, tornou o estudo inédito e de

significativa contribuição para a comunidade científica.

O modelo de overdose por APAP em roedores é um dos mais populares modelos in

vivo e amplamente utilizado para testes de novas estratégicas terapêuticas, que incluem

principalmente, os testes com produtos naturais (Jaeschke et al., 2011). A fim de estabelecer

esse modelo e adequá-lo ao nosso grupo de pesquisa, foi realizada uma análise temporal após

intoxicação com 500 mg/kg de APAP. Conforme esperado, a atividade de ALT e AST

mostrou-se aumentada em todos os tempos de eutanásia testados. Altas doses de APAP têm

sido associadas com a alta atividade de ALT e AST (Kozer et al., 2003).

Discussão

Bandeira, A.C.B.

94

O conteúdo de GSH apresentou uma depleção inicial. No entanto, em pouco tempo

esta foi restabelecida. Os dados da GSH e da relação GSH/GSSG mostraram que o pico do

desequilíbrio redox ocorreu 12 horas após intoxicação com APAP. O estudo de Jaeschke et al.

(Jaeschke et al., 2011) confirma que a lesão hepática, em modelos experimentais, se

desenvolve entre 3 e 5 horas, apresentando picos em torno das 12 horas após a overdose.

Essas características da intoxicação por APAP já estão bem estabelecidas na literatura

(Williams et al., 2014) e nossos achados estão de acordo com os dados de estudos

previamente publicados.

Muitos estudos correlacionam a toxicidade induzida pelo APAP ao estresse oxidativo

(Saito et al., 2010; Jaeschke et al., 2012; Mcgill et al., 2012). Devido aos efeitos antioxidantes

conhecidos do licopeno, o Experimento 2 foi realizado, associando o pré-tratamento com a

dose única de licopeno à lesão hepática induzida por APAP. Inicialmente, foi demonstrado

que o licopeno não foi capaz de reduzir a atividade de ALT e AST em 12 e 24 horas após

overdose de APAP. Similarmente, camundongos C3HeB/FeJ que receberam doses tóxicas de

APAP e foram pré-tratados com o antioxidante alopurinol não reduziram a atividade de ALT

a níveis basais (Williams et al., 2014). No entanto, em um estudo com camundongos

C57BL/6 pré-tratados com 5 mg/kg de sulforafano e intoxicados com 300 mg/kg de APAP 30

minutos após o pré-tratamento, mostrou que o sulforafano foi capaz de reduzir os níveis de

ALT e AST 6 horas após a overdose (Noh et al., 2015). Ainda, outro estudo com extrato de

Baccharis trimera, mostrou a diminuição da atividade de ALT e AST sérica em ratos Fisher

expostos a 835 mg/kg de APAP (Pádua et al., 2014). Os diferentes resultados encontrados na

literatura podem ser explicados pela utilização de diferentes compostos terapêuticos,

diferentes doses e modelos experimentais.

Nesse mesmo experimento, o perfil lipídico dos animais intoxicados apresentou

alterações. As concentrações de CT e de HDL apresentaram uma diminuição significativa. Já

está descrito na literatura que doenças hepáticas agudas e crônicas apresentam níveis

reduzidos dos componentes do perfil lipídico (Cicognani et al., 1997; Manka et al., 2014),

isto porque, nessas doenças, existe uma perda de funcionalidade tecidual, com uma

quantidade elevada de hepatócitos mortos (Manka et al., 2014), o que explica a redução de

HDL nos grupos que apresentaram dano hepático, visto que o fígado é o principal produtor de

apolipoproteínas (Tsai et al., 2009).

Discussão

Bandeira, A.C.B.

95

Posteriormente, nossos resultados demonstraram que o licopeno atuou sobre os

biomarcadores de defesas antioxidantes no modelo de overdose por APAP. A menor dose de

licopeno reduziu os níveis de GSSG no tempo de 12 horas. Gupta et al. (Gupta et al., 2013),

observaram que o hepatocarcinógeno N-nitrosodietilamina desencadeia estresse oxidativo no

fígado de camundongos fêmea balb/c e, o pré-tratamento com o licopeno foi capaz de

reestabelecer o equilíbrio do sistema de defesa antioxidante. Da mesma forma, o tratamento

com extrato de tomate por sete dias consecutivos após uma alta dose de APAP foi capaz de

previnir o estresse oxidativo em ratos Spraguey-Dawley (Jamshidzadeh et al., 2008).

No presente estudo, o licopeno demonstrou que possui um efeito protetor contra os

danos causados pelo estresse oxidativo, o qual é causado pelo modelo de toxicidade hepática

induzida pela overdose de APAP. Foi observado que o licopeno atuou reduzindo tanto a

peroxidação lipídica, quanto a carbonilação de proteínas. Nossos resultados corroboram com

os resultados do estudo apresentado por Pádua et al. (Pádua et al., 2014), no qual, ratos Fisher

pré-tratados com uma dose única de Baccharis trimera e intoxicados com APAP reduziram o

conteúdo de peroxidação lipídica e de proteínas carboniladas no fígado. Resultados

semelhantes, em relação à peroxidação lipídica, foram obtidos por Jamshidzadehet al.

(Jamshidzadeh et al., 2008). O tratamento com o extrato de tomate após a overdose de APAP

reduziu os níveis de TBARS em ratos Spraguey-Dawley.

Metaloproteinases de matriz (MMPs) são enzimas proteolíticas responsáveis pela

clivagem de muitas proteínas de matriz extracelular (Toth e Fridman, 2001). Alguns membros

da família de MMPs, como a gelatinase MMP-2, estão associados com uma variedade de

doenças cardiovasculares (Sawicki, 2013; Liu et al., 2014), invasões tumorais e metástase

(Toth e Fridman, 2001). Ainda, existem evidências que o estresse oxidativo eleva a atividade

da MMP-2 (Kameda et al., 2003). Durante a intoxicação por APAP, as MMP-2 e MMP-9 são

encontradas elevadas indicando sua participação no desenvolvimento do dano hepatocelular e

da disfunção da microcirculação hepática (Ito et al., 2005). O presente estudo mostrou que em

animais intoxicados com APAP, houve um aumento da atividade de MMP-2 após 12 horas de

intoxicação e, a maior dose de licopeno foi capaz de reduzir a atividade da gelatinase a níveis

basais. Corroborando com o resultado em questão, um estudo demonstrou que a silimarina foi

capaz de melhorar a fibrose hepática induzida por tioacetamida através da supressão da

atividade de MMP-2 em ratos (Chen, I. S. et al., 2012). Com isso, nossos dados sugerem que

Discussão

Bandeira, A.C.B.

96

o licopeno tem um efeito protetor nos estágios iniciais do processo de reparo tecidual, visto

que ele foi capaz de reduzir a atividade da MMP-2.

A morte de hepatócitos e outros tipos celulares hepáticos é uma das características das

doenças hepáticas e já é bem estabelecido que as lesões hepáticas induzidas por fármacos

desencadeiam grandes áreas de necrose tecidual (Malhi et al., 2006). De acordo com a análise

histopatológica, o licopeno atuou protegendo o fígado de uma lesão ainda maior. Os

camundongos expostos ao APAP demonstraram uma extensa área de necrose e, o pré-

tratamento com a dose única de licopeno melhorou a aparência do parênquima hepático,

diminuindo a porcentagem de áreas de necrose.

Em nosso estudo observamos melhores resultados do licopeno 12 horas após a

intoxicação por APAP, quando comparamos 12 h vs 24 h. O que pode ser explicado pelo fato

das concentrações plasmáticas e teciduais do licopeno reduzirem entre 12 e 24 horas após a

overdose de APAP. Sabe-se que o licopeno é rapidamente metabolizado em modelos murinos,

tendo um pico plasmático de concentração de 4 a 8 horas e então rapidamente decaindo

(Mathews-Roth et al., 1990; Moran et al., 2013).

O efeito protetor do licopeno observado pode ser atribuído não somente às suas

propriedades antioxidantes, porém também, é possível que ele interfira no metabolismo do

APAP e/ou ainda participe do processo de reparo tecidual. Estudos têm demonstrado que os

carotenóides são capazes de inibir a atividade das enzimas do CYP450. Um estudo conduzido

por Astorg et al. (Astorg et al., 1997), sugere que o licopeno atue na proteção contra lesões

pré-neoplásicas causadas por carcinógenos via CYP2E1 em fígado de ratos. Portanto, sabendo

que a intoxicação por APAP é iniciada pelo NAPQI, um metabólito reativo formado pelo

CYP450 durante o metabolismo do APAP, as substâncias capazes de inibir ou modular a

atividade de CYP450, também seriam capazes de proteger o fígado contra a toxicidade do

APAP, o que poderia ser um dos mecanismos de proteção do licopeno durante o modelo de

overdose por APAP, em adição às suas propriedades antioxidantes. Durante a overdose do

APAP, o funcionamento das células hepáticas é completamente alterado devido à morte

celular por necrose, levando a liberação de mediadores inflamatórios como a proteína de alta

mobilidade Box 1 (HMGB1) (Scaffidi et al., 2002). As células de Kupffer, umas das

principais células envolvidas na defesa hepática, participam da geração de repostas

inflamatórias pelo recrutamento de neutrófilos, monócitos T ou B, linfócitos e células “natural

killer” (NK) ao sítio da lesão. Mediadores inflamatórios gerados pelas células de Kupffer

Discussão

Bandeira, A.C.B.

97

incluem o NFκB, o TNF-α, a IL-1, a IL-6, quimiocinas e EROs. Esses mediadores, por

conseguinte, ativam macrófagos, levando a uma série de eventos que culminam na lesão

tecidual (Ramaiah e Jaeschke, 2007). Alguns estudos têm demonstrado a habilidade do

licopeno como anti-inflamatório, atuando em importantes vias de sinalização, inibindo a

sinalização de HMGB1 (Lee et al., 2012), JNK, NFκB (Ip e Wang, 2014), e IL-1 e IL-6

induzidos por TNF-α (Gouranton, Thabuis, et al., 2011). O NFκB, por exemplo, é um fator de

transcrição importante que coordena as respostas inflamatórias. Ele relaciona-se com as

respostas imune, inata e adaptativa, e ainda, diferenciação celular, proliferação e

sobrevivência em quase todos os organismos multicelulares. Sua atividade é regulada pela

degradação citoplasmática do inibidor do kappa B (IκB). Após estímulos inflamatórios, o IκB

sofre modificações através de fosforilação, liberando o dímero NFκB que, por conseguinte, se

transloca para o núcleo, causando transcrição de genes inflamatórios (Mitchell et al., 2016). A

JNK é um membro da superfamília da MAPK (proteína quinase ativada por mitógenos). A

JNK pode ativar uma grande variedade de cascatas de sinalização celular através de sua

fosforilação e, ainda, ativar membros da família da proteína célula-B de linfoma 2 (Bcl-2)

(Saito et al., 2010). Sobre a HMGB1, essa é uma proteína nuclear que participa de diversas

atividades no núcleo incluindo transcrição, replicação, reparo de DNA e montagem

nucleossomal. Além do seu papel no núcleo, a HMGB1 também pode se translocar para o

citoplasma, onde pode ativar o processo de autofagia ou, para o meio extracelular, onde ela

atua como uma molécula DAMP (padrão molecular associado ao dano) que alerta células

vizinhas e o sistema imune de um perigo imediato, desencadeando a inflamação. Portanto, no

meio extracelular, a HMGB1 está envolvida com o recrutamento de células inflamatórias para

o local da lesão, contribui para a resposta inflamatória promovendo a produção de citocinas e

quimiocinas pró-inflamatórias e, ainda, pode contribuir com o reparo tecidual e a cicatrização

(Venereau et al., 2016). O licopeno pode estar atuando em algumas dessas vias de sinalização,

modulando a inflamação, o que conseqüentemente, poderia estar melhorando o processo de

regeneração tecidual.

Igualmente ao observado no segundo experimento, no Experimento 3, o pré-

tratamento prolongado com o licopeno também não foi capaz de inibir a atividade das

enzimas ALT e AST elevadas pela overdose de APAP. Não existe um consenso acerca da

capacidade do licopeno modular a atividade de enzimas hepáticas. Na literatura, essa questão

tem sido observada em diferentes estudos que demonstram diferentes respostas enzimáticas.

Em um estudo com ratos Sprague-Dawley, o licopeno não reduziu a atividade da enzima AST

Discussão

Bandeira, A.C.B.

98

em um modelo de doença hepática gordurosa não alcoólica (Piña-Zentella et al., 2016). Da

mesma forma, Williams et al., não conseguiram demonstrar, em sua pesquisa, a redução da

atividade da ALT após o pré-tratamento com alopurinol ou oxipurinol no modelo de lesão

hepática induzido por APAP em camundongos C3HeB/FeJ, apesar de terem encontrado

resultados satisfatórios em outros parâmetros analisados (Williams et al., 2014). Em

contrapartida, o licopeno reduziu a atividade de ALT e AST em um modelo de

hiperhomocisteinemia em ratos (Yefsah-Idres et al., 2016). A atividade de ALT e AST são os

mais frequentes biomarcadores utilizados para avaliar lesões hepaticas. Porém, o mecanismo

celular que controla a liberação dessas enzimas ainda não é bem compreendido e sabe-se que

pode não ter relação direta com o ambiente redox hepático (Contreras-Zentella e Hernández-

Muñoz, 2016). Sendo assim, acreditamos que o licopeno atuou melhorando a lesão hepática

induzida pelo APAP, provavelmente influenciando vias que não tiveram relação direta com a

atividade sérica das enzimas ALT e AST.

No experimento 3, foram observadas modificações no perfil lipídico dos animais

tratados com a maior dose de licopeno. Em relação ao CT, foi observada a redução dos níveis

séricos nos grupos intoxicados, exceto no grupo pré-tratado com 100 mg/kg de licopeno. Os

níveis séricos de colesterol HDL também foram afetados nos grupos experimentais. Como já

foi discutido anteriormente, os resultados observados estão relacionados a grande perda de

funcionalidade hepática, o que leva a produção reduzida dos componentes do perfil lipídico

(Cicognani et al., 1997; Tsai et al., 2009; Manka et al., 2014).

A overdose por APAP desencadeia uma cascata de eventos que resultam na morte de

hepatócitos e, o estresse oxidativo tem um papel chave na exarcebação da doença, o que já foi

discutido anteriormente. Nesse experimento, houve modificações nos biomarcadores dos

animais que receberam apenas o APAP, resultante de danos e estresse oxidativo, o que já era

esperado. Já se sabe que o licopeno é o carotenóide mais eficiente na supressão do oxigênio

singleto, sendo duas vezes mais potente que o β-caroteno e dez vezes mais potente do que o

α-tocoferol, em estudos in vitro (Di Mascio et al., 1989). Ainda, ele pode atuar em reações

iniciadas por radicais livres como o radical hidroxila e os radicais peróxidos (Holzapfel et al.,

2013). Características do licopeno, como a sua lipossolubilidade e a sua estrutura química

podem estar relacionadas com o seu potencial na prevenção de doenças que envolvem o

estresse oxidativo como um dos fatores chave. Ele é incorporado nas membranas celulares e

esse é um importante fator de proteção. Ainda, como já foi visto, o licopeno contém um

grande número de duplas ligações, uma característica que reforça sua capacidade antioxidante

Discussão

Bandeira, A.C.B.

99

(Rao e Rao, 2007; Friedman, 2013; Fiedor e Burda, 2014). O pré-tratamento prolongado com

o licopeno foi efetivo na prevenção da oxidação dos lipídios de membrana e proteínas e

preveniu a redução de defesas antioxidantes como, CAT, SOD e GSH, em nosso modelo

experimental. Nossos resultados foram similares a outras publicações onde o licopeno foi

capaz de modular o desequilíbrio redox. Em um estudo com ratos Wistar

hiperhomocisteinêmicos tratados com licopeno (5 mg/kg) por 3 meses obsevou-se uma

redução na concentração de malondialdeído (Yefsah-Idres et al., 2016). Piña-Zentella et al.,

demonstraram que o tratamento com licopeno (20 mg/kg) por 4 semanas em ratos Sprague-

Dawley aumentou a atividade da SOD e da CAT em um modelo de doença hepática gordurosa

não alcóolica (Piña-Zentella et al., 2016). Em um modelo de isquemia/reperfusão hepática em

ratos, o licopeno reduziu os níveis de malondialdeído e aumentou a atividade da CAT

(Bayramoglu et al., 2015). A administração do licopeno em ratos Wistar com

hepatocarcinogênese induzida por dietilnitrosamina reduziu os níveis de malondialdeído,

reforçando a atividade da SOD, CAT e GPx e a quantidade de GSH (Sahin et al., 2014).

Ainda, Sheik-Abdulazeez et al., mostraram que o licopeno foi capaz de reduzir o estresse

oxidativo em um modelo de lesão hepática induzida por D-galactosamina/lipopolissacarídeo

em ratos Wistar, reduzindo a quantidade de malondialdeído e reforçando as defesas

antioxidantes, como CAT, SOD e GSH (Sheik Abdulazeez e Thiruvengadam, 2013).

A IL-22 é um membro da família da citocina IL-10 e representa uma molécula efetora

importante na ativação de células T helper (Th) 22, Th1 e Th17, células T citotóxicas (Tc),

células T gamma/delta (γδ), células NK e células T natural killer (NKT). A IL-22 é conhecida

por ter um papel chave nas defesas antimicrobianas, regeneração e proteção contra danos,

porém, já se sabe que essa citocina tem seu papel em distúrbios inflamatórios podendo atuar

tanto de forma protetora, quanto patogênica (Xing et al., 2011). O papel da IL-22 na

inflamação hepática ainda é obscuro (Park et al., 2011). A natureza dúbia dessa citocina

depende do órgão e das outras citocinas presentes. No fígado, a IL-22 parece atuar

positivamente sobre a sobrevivência dos hepatócitos (Xing et al., 2011). A IL-22 também

pode atuar como um mediador pró-inflamatório durante o desenvolvimento das lesões

hepáticas induzidas por fármacos através da ação sinérgica com as células Th17 (Lai et al.,

2015).

A CCL2 é um membro da família das quimiocinas. Ela pode ser secretada em resposta

a sinais emitidos por citocinas pró-inflamatórias, por exemplo. Tem um papel importante no

Discussão

Bandeira, A.C.B.

100

recrutamento seletivo de monócitos, linfócitos e neutrófilos. Portanto, a CCL2 é um

importante fator quimiotático e, com isso, tem um papel importante em várias condições

patológicas e em diferentes órgãos. Os principais indutores da expressão de CCL2 são a IL-1,

TNFα, interferon gamma (IFNγ), porém outras citocinas e fatores de crescimento como IL-4,

fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF), fator estimulador de colônia de

granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de

crescimento e transformação beta (TGF-β), bem como lipopolissacarídeos, EROs e

complexos imunes podem induzir a CCL2 (Haller et al., 2016).

No presente estudo foi observado que não houve diferença nos níveis de IL-22 e de

CCL2 sérico entre o grupo controle e os grupos que receberam APAP. Ainda, não foram

observadas diferenças na presença do pré-tratamento prolongado, mostrando que o licopeno

não teve influências em relação a IL-22 e CCL-2. Curiosamente, foi observado um aumento

significativo de IL-22 bem como de CCL2 no grupo tratado com o veículo do licopeno, o óleo

de girassol. O óleo de girassol é um óleo rico em ácidos graxos mono e poliinsaturados,

destacando-se o ácido linoléico, um membro da família ômega 6 (Masi et al., 2012). Os

ácidos graxos poli-insaturados ômega 6 e ômega 3 são ácido graxos essenciais que devem ser

obtidos através da dieta visto que os humanos e nem mesmo outros mamíferos são capazes de

sintetizá-los endogenamente devido a falta de enzimas específicas (Simopoulos, 2016). Sabe-

se que a presença do óleo de girassol na dieta reduz o conteúdo de triacilglicerol plasmático,

além de apresentar efeitos benéficos sobre o perfil lipídico. Porém, devido as suas

características químicas, o óleo de girassol pode atuar como pró-inflamatório, atuando

diretamente sobre os macrófagos (Masi et al., 2012). Um desequilíbrio da relação ômega

6/ômega 3 a favor do ômega 6 é considerado pró-trombótico e pró-inflamatório (Simopoulos,

2016).

Sabendo das características dos biomarcadores inflamatórios estudados, IL-22 e

CCL2, os quais podem atuar mediando eventos pró-inflamatórios e, das características do

óleo de girassol, é possível compreender os resultados observados no grupo controle negativo.

O óleo de girassol puro, em contextos específicos, pode ter favorecido eventos inflamatórios.

O mesmo foi observado no resultado da figura 15, onde se observou um aumento da atividade

da MMP-2 no grupo que recebeu o óleo. Sabe-se que a enzima MMP-2 também está

relacionada com eventos pró-inflamatórios.

Discussão

Bandeira, A.C.B.

101

A IL-1β atua como uma citocina pró-inflamatória (Laskin, 2009) e, já foi descrito na

literatura que a exposição ao APAP leva ao seu aumento na corrente sanguínea (Imaeda et al.,

2009). Nossos dados confirmaram que a lesão hepática induzida por APAP aumentou a

expressão do RNAm para IL-1β em 67% no fígado. Ainda, o pré-tratamento com o licopeno

foi capaz de diminuir a expressão do RNAm para IL-1β, mostrando uma possível ação

imunorregulatória do licopeno. A IL-10 é conhecida na literatura como uma citocina anti-

inflamatória (Laskin, 2009) e, em algumas pesquisas, utilizando camundongos deficientes

para IL-10 ou mesmo inibidores dessa citocina, foi observada uma exarcebação da

hepatotoxicidade induzida por fármacos (Bourdi et al., 2002; Kumagai et al., 2009). Já a

citocina IL-6 parece ter um papel dúbio nos sistemas biológicos, podendo atuar tanto como

pró-inflamatória, quanto anti-inflamatória (Scheller et al., 2011). Existem fortes evidências da

importância da IL-6 na modulação da inflamação em diferentes modelos experimentais, como

por exemplo, auxiliando no equilíbrio dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (Xing et al.,

1997; Petersen e Pedersen, 2006). Estudos têm demonstrado que a ausência de IL-6 pode

piorar o curso de uma doença (El-Assal et al., 2004; Deng et al., 2009), indicando que esta

possui importância como mediador anti-inflamatório. No presente estudo, a expressão gênica

de IL-6 encontrou-se diminuída após a intoxicação por APAP. Resultados semelhantes foram

encontrados por Goto et al., no qual culturas primárias de células de Kupffer intoxicadas com

APAP e expostas ao lipopolissacarídeo (LPS) apresentaram um aumento nos níveis de IL-1β

e, concomitantemente, uma redução de IL-6 e IL-10 (Goto et al., 2015). O pré-tratamento

prolongado com o licopeno não foi capaz de aumentar a expressão do RNAm para IL-6

quando comparado aos animais intoxicados, porém também não foi diferente do grupo

controle.

As metaloproteinases de matriz estão envolvidas na degradação da matriz extracelular,

como já foi discutido (Benyon e Arthur, 2001). Elas possuem uma importante ação tanto em

eventos fisiológicos como também em eventos patológicos. A MMP-2 é particularmente

importante na exarcebação dos processos inflamatórios, aumentando a atividade biológica de

IL-8, IL-1β, e TNF-α, e está relacionada à progressão, invasão e metástase de tumores

(Kurzepa et al., 2014). Nos casos de lesão hepática aguda, os hepatócitos, células sinusoidais

hepáticas e células inflamatórias contribuem, todas, para aumentar a expressão de MMP-2

(Benyon e Arthur, 2001). Os dados encontrados na literatura vão de encontro aos resultados

obtidos no estudo, onde a intoxicação por APAP levou a um aumento da atividade de MMP-

2. Em um estudo de Bhatia et al., camundongos fêmea balb/c que receberam N-

Discussão

Bandeira, A.C.B.

102

nitrosodietilamina, um indutor de carcinoma hepatocelular, foram tratados com o licopeno (5

mg/kg) três vezes ao dia, durante 10 semanas. Ao fim do experimento, observou-se uma

redução na atividade gelatinolítica da enzima MMP-2 (Bhatia et al., 2015). Similarmente,

nosso estudo encontrou uma diminuição na atividade da gelatinase após o pré-tratamento

prolongado com o licopeno, resultados que também observamos no experimento anterior.

A overdose por APAP é um modelo de lesão hepática rápida devido aos seus

mecanismos de lesões iniciais durante o metabolismo do fármaco. É possível observar as

modificações histológicas nas primeiras horas após a intoxicação. Em camundongos, grandes

áreas de necrose na região centrolobular podem ser encontradas após a overdose (Malhi et al.,

2006; Kon et al., 2007). Em nosso experimento, foi observado mais de 50% de áreas de

necrose 12 horas após overdose, o que demonstra a agressividade do modelo experimental em

questão. Infelizmente, não foi possível observar um efeito protetor do pré-tratamento

prolongado com o licopeno no parênquima hepático e, conseqüentemente, não houve

diminuição na porcentagem de área de necrose com nenhuma das doses utilizadas. Se as

análises histológicas tivessem sido realizadas em tempos diferentes, posteriores a intoxicação,

poderíamos ter observado melhores efeitos do licopeno no tecido hepático, visto que, foi

demonstrada a modulação de biomarcadores inflamatórios, especialmente dos parâmetros de

estresse oxidativo e da atividade de MMP-2 pelo pré-tratamento prolongado com o licopeno.

Conclusões

Bandeira, A.C.B.

103

7. SUMÁRIO E CONCLUSÕES

Os resultados apresentados nesse estudo concluem que:

No experimento 1, a intoxicação por APAP foi capaz de causar uma injúria hepática,

confirmada pela elevação das enzimas ALT e AST e, foi observado que a depleção da GSH

ocorre nas primeiras horas após a overdose. Esses resultados confirmam a eficácia do modelo

experimental.

No experimento 2, o licopeno reduziu o dano oxidativo sugerido principalmente pela

diminuição da carbonilação de proteínas e reduziu as áreas de necrose melhorando o aspecto

geral da lesão. Ainda, observamos que o licopeno atuou de forma mais evidente 12 horas após

intoxicação por APAP, provavelmente devido às concentrações plasmáticas e teciduais mais

altas do licopeno nas primeiras horas após intoxicação.

No experimento 3, o licopeno não reduziu a atividade das enzimas hepáticas ALT e

AST, como observado no experimento anterior, porém atuou mais uma vez como antioxidante

aumentando a atividade da CAT, aumentando o conteúdo de GSHt e GSH e reduzindo a

concentração de GSSG. O dano oxidativo foi reduzido, com diminuição de TBARS e

proteínas carboniladas. O licopeno atuou modulando aspectos inflamatórios e reduzindo a

atividade de MMP-2, provavelmente melhorando aspectos do reparo tecidual, apesar de não

se ter observado melhora nos aspectos histológicos.

O licopeno é um composto natural capaz de melhorar os danos causados pela

intoxicação por APAP em camundongos C57BL/6, como visto nesse estudo. Mais

experimentos são necessários para concretizar e compreender os efeitos hepatoprotetores do

licopeno nesse modelo animal.

Conclusões

Bandeira, A.C.B.

104

Tabela 9. Tabela comparativa dos efeitos do licopeno nos experimentos 2 e 3

Legenda - NR: não realizado; - : sem efeito; ↑: aumentou em comparação ao grupo intoxicado

com APAP; ↓: diminuiu em comparação ao grupo intoxicado com APAP

Dose única/10

mg/kg

Dose

única/100

mg/kg

14 dias/10

mg/kg

14 dias/100

mg/kg

12h 24h 12h 24h 12h 12h

ALT - - - - - -

AST - - - - - -

CT - - - - - -

HDL - - - - - -

FA - - - - - -

GSHt ↓ - ↓ - ↑ ↑

GSH - - ↓ - ↑ ↑

GSSG ↓ - - - - ↓

GSH/GSSG - - - - - -

GPX - - - - NR NR

GR - - - - NR NR

CAT - - - - ↑ ↑

SOD - - - - - -

TBARS - ↓ - - ↓ ↓

Proteínas

carboniladas

- ↓ - ↓ - ↓

CCL2 NR NR NR NR - -

IL-22 NR NR NR NR - -

IL-1β NR NR NR NR ↓ ↓



MMP-2 - - ↓ - ↓ ↓

Área de

necrose

↓ ↓ ↓ - - -

Limitações do Estudo

Bandeira, A.C.B.

105

8. LIMITAÇÕES DO ESTUDO

O presente estudo limitou-se, principalmente, por ser um estudo experimental

utilizando modelo animal, limitando uma possível comparação com resultados em seres

humanos. Ainda, foram utilizadas metodologias distintas para a dosagem da enzima

superóxido dismutase.

Referências Bibliográficas

Bandeira, A.C.B.

106

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA

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Anexos

Bandeira, A.C.B.

120

ANEXO 1

Anexos

Bandeira, A.C.B.

121

Anexos

Bandeira, A.C.B.

122

ANEXO 2

Anexos

Bandeira, A.C.B.

123

ANEXO 3

Anexos

Bandeira, A.C.B.

124

ANEXO 4

Anexos

Bandeira, A.C.B.

125

ANEXO 5

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