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VIROLOGIA AMBIENTAL:

Desafios da Detecção de Vírus

Gastrentéricos em Águas e AlimentosDra. Adriana de Abreu Corrêa

Pesquisadora Visitante

Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental

Setembro/2011

Conjunto de fatores físicos, químicos, bióticos e climáticos, que age sobre um determinado organismo ou uma comunidade ecológica, determinando a forma de convivência e de

sobrevivência de quem nele habita.

Meio Ambiente

MEIO AMBIENTE

O QUE RECEBEMOS …

Meio Ambiente

O QUE DEVOLVEMOS …

Meio Ambiente

•Hidrocarbonetos;

•Metais Pesados;

•Pesticidas;

•Toxinas Marinhas;

•Potenciais Carcinógenos;

•Alergenos;

•Materiais Radioativos;

•Patógenos: Agentes Causadores de Alguma Enfermidade (em geral, EPISÓDIOS AGUDOS).

Meio Ambiente

FONTES DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL

Diversas Doenças

Bactérias

Protozoários

Vírus

Biotoxinas

Meio Ambiente

A água atua como carreador passivo do agente infeccioso

Agentes etiológicos : patógenos excretados nas fezes, capazes de iniciar uma infecção

Doenças de Veiculação Hídrica

Doenças transmitidas pelo consumo de águaou alimentos contaminados ou após

contato direto pela pele ou ingestão de águas de recreação poluídas

Bact�rias:Coliformes fecais, Vibrio spp., Salmonella spp., Listeria sp., Clostridiumsp., Aeromonas spp., E.coli, Yersinia enterolytica, Campylobacter sp.,

etc.)

Parasitas:Cryptosporidium sp.; Giardia sp., etc.

V�rus : Vírus Entéricos

AGENTES MICROBIOL�GICOS ASSOCIADOS COM DOEN�AS

DE VEICULA��O H�DRICA

“WATERBORNE e FOODBORNE DISEASES”

Doenças de Veiculação Hídrica

Vias de contaminação dos alimentos

-Cultivo de Moluscos Bivalvesem águas contaminadas

- Manipuladores contaminados(sinto ou assintomáticos)

- Fômites contaminados

- Irrigação e/ou lavagem dos alimentos com água contaminada

Vírus em Alimentos

- 1914 – Primeiro surto viral de origem alimentar – Poliomielite relacionadoao consumo de leite.

- 1956 e 1962 - Primeiros surtos de HAV por moluscos bivalves, na Su�cia e EUA, respectivamente.

- No in�cio da d�cada de 1970, surtos n�o-bacterianos de gastroenterite foram registrados, mas nenhum agente p�de ser isolado in vitro. Estudos posterioresfocaram na transmiss�o viral por moluscos bivalves, e no potencial risco de transmiss�o viral pelo uso de �gua contaminada para irriga��o.

- 1990 - Disponibilidade de m�todos moleculares, os v�rus foram implicados como os principais agentes etiol�gicos de doen�as de origem alimentar no mundo.

Virus em Alimentos: Histórico

v�rus da hepatite A,norov�rus, astrov�rus e

rotav�rus

DISTINTAS FAM�LIAS VIRAIS IGUAL VIA DE TRANSMISS�O: FECAL – ORAL

Vírus Entéricos

- N�O ENTEROPATOG�NICOS OU QUE CAUSAM DOEN�AS N�O RELACIONADAS AO EPIT�LIO INTESTINAL –

POLIOVIRUS, COXSACKIE A E B, ECHOVIRUS, HAV, HEV

- V�RUS RESPONS�VEIS PELAS GASTRENTERITES AGUDAS EM HUMANOS –ROTAVIRUS, ADENOVIRUS ENT�RICOS,

ASTROVIRUS E CALICIVIRUS

- ENTEROPAT�GENOS SEM RELA��O CAUSAL COMPROVADA – CORONAVIRUS, ENTEROVIRUS, TOROVIRUS,

PARVOVIRUS E REOVIRUS.

Vírus Entéricos

MAIS DE 15 GRUPOS DIFERENTES DE V�RUS INCLUINDO 140 SUBTIPOS DIVIDIDOS DE ACORDO A EPIDEMIOLOGIA

(Abdel-Moety et al, 2008)

Doenças Virais de Veiculação Hídrica

GRANDE N�MERO DE PART�CULAS VIRAIS ELIMINADAS NAS FEZES DE INDIVIDUOS INFECTADOS (105 – 1011/G)

BAIXA DOSE INFECCIOSA (O CONTATO COM APENAS UMA �NICA PART�CULA VIRAL � CAPAZ DE DESENCADENAR UMA INFEC��O

ESTABILIDADE DOS V�RUS

• NO ESGOTO: RESISTEM AOS TRATAMENTOS

• NOS SEDIMENTOS: ADSORVEM-SE AOS SEDIMENTOS

• NOS MOLUSCOS: ADSORVEM-SE AOS TECIDOS (BR�NQUIAS E TRATO GASTROINTESTINAL)

Disseminação Viral no Ambiente

2,4 bilhões de pessoas não dispõem de tratamento de água morbidade e mortalidade devido a doenças causadas por microorganismos presentes em água.

Segundo o Banco Mundial, mais de 2,2 milhões de pessoas morrem anualmente devido ao consumo de água contaminada (JFSP, 04/12/2004).

¼ dos leitos hospitalares são ocupados por pacientes com complicações decorrentes de infecções de veiculação hídrica.

Aumento do número de surtos de doenças virais entéricas de veiculação hídrica.

(Straub & Chandler, 2003)

Virologia Ambiental

NÚMERO DE CASOS DE GASTRENTERITES EM CRIANÇAS < 5 ANOS

18 milhões de hospitalizações

111 milhões de casos domiciliares

2 bilhões de casos

25 milhões de consultas

1.7 milhão de óbitos

40-60% dos casos de etiologia viralAho, 2000 et al.; Mitchell, 2002; Kosek, 2003; Parashar et al., 2003 ; WHO 2005

Ministério da Saúde, 20023.070 óbitos de crianças < 5

anos por doenças diarréicas em todo o Brasil ( 1/3 viral)

Virologia Ambiental

Virologia Ambiental

Qual a importância de conhecimentos sobre a Virologia Ambiental???

Estudos Epidemiólogicos

Vias de Transmissão

Controle de Contaminação

VIROLOGIA AMBIENTALQUANDO COMEÇOU?

Virologia Ambiental

História, Metodologias, Aplicação e Desafios

1965 - I Confer�ncia Internacional – “Transmission of

Viruses by the Water Route”, Cincinatti, Estados

Unidos da Am�rica

Objetivos deste Encontro :

- Desenvolver métodos quantitativos adequados para detectar a

transmissão viral através da água

- Verificar como os vírus podem sobreviver, sem serem detectados, em

condições nas quais se consegue eliminar coliformes fecais

- Determinar quais as doses infecciosas virais para humanos

- Estudar a persistência viral em águas de esgoto (reuso)

- Intensificar esforços para conhecer o agente infeccioso da hepatite

viral

Virologia Ambiental : Histórico

- Papel dos moluscos na transmissão de doenças virais humanas; Evolução das técnicas de Concentração

Virologia Ambiental : Histórico

- 1979 – Organiza��o Mundial da Sa�de, Genebra

“Report of WHO Scientific group of Human Viruses in water, wastewater and soil”

• Reuni�o de experts, relat�rio para planejamento em sa�de

p�blica e economia – pa�ses desenvolvidos e em

desenvolvimento: import�ncia, riscos, m�todos de detec��o,

�reas de estudo.

D�cada de 1970 e in�cio de 1980:

D�cada de 1980 – Nova Era para a Virologia Ambiental

1. Reconhecimento do vírus da Hepatite E como vírus entérico capaz de produzir surtos de veiculação hídrica

2. Adaptação do HAV para replicar em cultura de células e desenvolvimento de ensaios sensíveis para detecção de antígeno de HAV

3. Desenvolvimento de métodos de concentração de HAV4. Reconhecimento do envolvimento de HAV em surtos de veiculação

hídrica5. Surtos de gastrenterites não bacterianas causados por calicivirus6. Demonstração do envolvimento dos rotavirus com responsáveis pela

diarréia infantil7. Reconhecimento de adenovirus entéricos, calicivirus e astrovirus

como responsáveis por quadros de gastrenterite aguda8. Reconhecimento de que surtos de hepatites e gastrenterites podem

ser causado pela transmissão de vírus no ambiente

Virologia Ambiental : Histórico

D�cada de 1990 - �gua e Microbiologia 1. In�meros artigos e livros publicados2. Recursos humanos formados3. Cursos e Congressos

D�cada de 2000 - S�culo XXI 1. Aumento significativo de publica��es cientificas (5X) quando

comparada com a d�cada de 90;

1. SYMPOSIUM COST 929 - “CURRENT DEVELOPMENTS IN FOOD AND ENVIRONMENTAL VIROLOGY” Pisa, 9-11 October 2008;

Food and Environmental VirologyEditor-in-Chief: Nigel Cook

ISSN: 1867-0334 (print version)Journal no. 12560

Springer US

Virologia Ambiental : Histórico

3. Peri�dico espec�fico para a �rea de Virologia Ambiental (2010)

Metodologias moleculares de detec��o e

caracteriza��o de virus fastidiosos.

Virologia Ambiental : Histórico

Virologia Ambiental no Brasil

em 2004

Virologia Ambiental : Histórico

Virologia Ambiental : Histórico

Curso Teórico - Prático de Virologia Ambiental

Florianópolis, junho de 2006UFSC/FIOCRUZ

BRASILVirologia Ambiental

no Brasilem 2011

Virologia Ambiental : Histórico

1. Esclarecimento de surtos2. Desenvolvimento e validação de metodologias3. Controle microbiológico da água 4. Monitoramento ambiental5. Desinfecção 6. Avaliação de risco

- Matrizes ambientais:

Água de consumo humano (Mineral), Água de reuso (águas residuárias), Água de recreação (lagoas, rios, piscinas, praias)Água de lastro; Águas subterrâneas; Lodo e sedimentos; Superfícies e Alimentos

Virologia Ambiental

APLICAÇÕES

coleta, clarificação, concentração, descontaminação/remoção de inibidores detecção específica dos vírus

- Padronização e validação intra e interlaboratorial

- Uso Controle interno

Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas

Análise de vírus em amostras ambientais

envolve diferentes etapas:

Evitar a perda de viabilidade

Diminuir volume da amostra

Reduzir inibidores

Concentração e detecção

de vírus no ambiente

Detectar qualitativamente e quantitativamente

Virologia Ambiental: Questões Técnico-científicas

CONTROLE INTERNO

Bacteriofágo PP7 Mengo virus

Norovirus murino

DESAFIOS

VIRUS INFECCIOSOS x

NÃO-INFECCIOSOS

Virologia Ambiental: Questões Técnico-científicas

INDICADORES VIRAIS Vírus RNA

Vírus DNA - JCPyV Adenovirus

MAIOR RECUPERAÇÃO VIRAL

FBVE – Food Borne Viruses in EuropeGrupo de 13 paises europeus para reunir informa��es sobre epidemiologia,

monitoramento e rotas de infec��o de v�rus ent�ricos, principalmente norov�rus.

Vírus em Alimentos: Questões Técnico-científicas

Butot et al., 2007. Appl Environ Microbiol. 2007; 73, 186-92.

Vírus em Alimentos: Questões Técnico-científicas

Métodos de detecçãoVirologia Ambiental : Questões Técnico-científicas

MÉTODOS DE DETECÇÃO DE VÍRUS EM AMOSTRAS CONCENTRADAS:

PCR ou RT-PCR (QUALITATIVO) PCR em tempo real - QPCR ou RT-QPCR (QUANTITATIVO)

1. MOLECULARES: Detecção da Presença do GENOMA viral

ISOLAMENTO DO MATERIAL GENÉTICO VIRAL (DNA/RNA)

Etapa SUPER Importante

Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas

MÉTODOS DE DETECÇÃO DE VÍRUS EM AMOSTRAS CONCENTRADAS:

2. INFECCIOSIDADE: Detecção da Presença vírus VIÁVEIS

Cultivo Celular in vitro

Células Não

Infectadas

Células Infectadas

(efeito citopático)

Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas

51

Ensaios de Infecciosidade Viral

ICC/PCR (PCR integrado ao cultivo celular)

PFU (Placas de Lise)

IFA (Imunofluorescencia

indireta)

Ensaio Enzimático

TCID50( Dose Infecciosa Mínima)

Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas

Métodos de detecção: vantagens e desvantagensVirologia Ambiental : Questões Técnico-científicas

Centro Colaborador OPAS/OMS em Saúde Pública e Ambiental

EXPERIÊNCIA DA FIOCRUZ

Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental

Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental:

- Referência Regional para Rotaviroses- Referência em Virologia Ambiental

Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental:

- Referência Regional para Rotaviroses- Referência em Virologia Ambiental

Laboratório de Desenvolvimento Tecnológico em Virologia

Laboratório de Desenvolvimento Tecnológico em Virologia

OBJETIVOS

Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental

Metodologías para concentração de virus por diferentes métodos

Validar métodos moleculares para a detecção viral em diferentes matrizes ambientais

Detectar e caracterizar vírus em águas ambientais e alimentos, contribuindo para o esclarecimento de surtos

de gastrenterites aguda e hepatites de veiculação hídrica de modo a possibilitar ações epidemiológicas efetivas no

controle destas infecções.

LINHAS DE PESQUISA

Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental

1. Avaliação da disseminação ambiental dos vírus da hepatite A e E responsáveis pelas hepatites de

transmissão entéricas2. Avaliação de risco pela contaminação viral em águas

ambientais3. Avaliar os Rotavírus, Astrovírus, Norovírus e

Adenovirus entéricos como indicadores de saneamento ambiental através da detecção e

caracterização molecular destes vírus.4. Detecção e quantificação de Norovírus em

ecossistemas aquáticos e animais5. Estabilidade de norovirus em matrizes ambientais

Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental

PARTICIPANTES

Dr. Marize Pereira MiagostovichDr. José Paulo Gagliardi LeiteDr. Adriana de Abreu Corrêa

Dr. Ana Maria Coimbra GasparDr. Jaqueline Mendes de OliveiraDr. Débora Regina Lopes dos Santos

Túlio Machado FumianCarmen Baur VieiraTatiana PradoAna Caroline GanimeJulia Fioretti

PESQUISADORESPESQUISADORES

Alunos de Pós Graduação

Alunos de Pós Graduação

Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental

Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental

Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental

Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental

Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental

AGRADECIMENTOS

adriac@ioc.fiocruz.br