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Validação de Métodos Bioanalíticos

Curso de Farmacologia Clínica

Universidade Mogi das Cruzes

Abril 2004

Nas últimas décadas, houve um aumento de

métodos bioanalíticos aplicados à cromatografia

para a determinação qualitativa e quantitativa de

fármacos, produtos acabados, matérias primas e

amostras biológicas, em todas as fases do desen-

volvimento do fármaco desde a pesquisa até a rea-

lização de estudos de bioequivalência.

Assim, devido este aumento e a globalização

da economia, a adoção de um sistema de qualida-

de reconhecido universalmente aceito, é requisito

fundamental.

Portanto, o entendimento do que constituí

uma validação de métodos cromatográficos, possi-

bilita a garantia de um nível satisfatório de qualida-

de na validação metodológica (Massart et al., 1998;

Swartz & Krull, 1998).

Desde o final dos anos 80, a importância da

validação de métodos bioanalíticos e suas influên-

cias na avaliação e interpretação dos resultados,

transformou-se em alvo de amplas discussões pre-

sentes em diversas Conferências tanto nos EUA

quanto na Europa e consequentemente fornecer

adequadas diretrizes em relação aos parâmetros

exigidos na validação analítica (Shan et al., 1991 e

1992; Dadgar, 1995; Cartwright et al., 1991 e Arnoux

& Morrison, 1992) .

A correta avaliação dos Estudos Biofarma-

cêuticos só pode ser alcançada se a exatidão dos

dados analíticos forem obtidos (Pachla et al.,1986).

Além disso, essa exatidão depende de crité-

rios fundamentais empregados, não só em relação

à adequada interpretação desses resultados, como

também na aplicação da confiabilidade e na totali-

dade do desempenho do método bioanalitico.

Assim, podemos destacar os principais critérios

fundamentais empregados na validação de métodos

bioanalíticos:

Avaliação da droga e estabilidade do analito .

Seletividade/Especificidade.

Linearidade e modelo de calibração.

Precisão e Exatidão.

Sensibilidade, Limite de Quantificação e Detecção

Recuperação

* Pachla et al., 1986; Buick et al., 1990; MacDouglas e Crummett, 1980; Taylor, 1983;

Brooks e Weinfeld,1985; Dadgar e Smith, 1986; Inman et al., 1987 e Shan et al., 1987.

Modernos métodos bioanalíticos são funda-

mentados em relação a uma variedade de técnicas

físicoquímicas e biológicas á saber:

• Métodos Químicos: Cromatografia (CG, HPLC) e

uma variedade de processos utilizando métodos

de espectrometria de massa (MS) tais como MS-

MS e combinações de técnicas tais como CG-

MS,LC-MS.

• Métodos Biológicos: baseados em procedimen-

tos de imunoensaios; em particular o Radioimu-

noensaio (RIA), imunoensaio de múltiplas enzi-

mas (EMIT) e ensaio de imunoabsorção de enzi-

mas ligadas (ELISA).

• Métodos microbiológicos

Tais métodos analíticos devem ser cuidado-

samente pré- validados na fase de desenvolvimento

e também validados durante o ensaio analítico, para

garantir que os mesmos sejam satisfatoriamente

realizados e que a confirmação das especificações

pré-determinadas seja encontrada; além disso,

gerar confiabilidade nos resultados obtidos (Buick

et al., 1990; Jackson, J. A; 1994; Shan et al., 1992).

Para tanto, os mesmos envolvem

procedimen-

tos de determinação e quantificação de moléculas

orgânicas com amplas propriedades físico- quími-

cas, onde cada composto deve ser avaliado de acor-

do com as suas propriedades individuais e também

levando em consideração a complexidade analítica e

as concentrações almejadas (Jackson, J. A 1994).

Seleção e Desenvolvimento

Pode-se considerar que a etapa crítica no Es-

tudo Biofarmacêutico é o desenvolvimento e valida-

ção de ensaios bio-analíticos, que consistem de

experimentos realizados para encontrar condições

necessárias para a quantificação do analito em

questão.

Isto requer conhecimentos das propriedades

físico-químicas da droga para que o processo de

desenvolvimento seja racional e individualizado.

Assim, todos os critérios envolvidos no desen-

volvimento analítico deverão ser registrados em

relatórios de acompanhamento analítico (Snyder,

1988; Jackson, J.A 1994).

Padrões

• Análise de Drogas ou seus Metabólitos é invariávelmete feita através de amostras “contaminadas”, curvas de calibração e amostras de controle de qualidade (QC).

• Padrões de Referência autenticados devem ser utilizados no estudo. Preferivelmente o mesmo composto.

• Caso contrário um sal, base, ácido ou éster do composto pode ser usado.

Escolha da Procedência:

• Padrões certificados (U.S.Pharmacopea)

• Padrões disponíveis comercialmente de fontes de conhecida reputação.

• Padrões com pureza documentada, específicamente sintetízados por laboratórios comerciais.

Deflazacort (DFZ) 21-Hydroxy DFZ (21-OH DFZ)

21-Acetate Dexamethazone (21-Ac DXM, I.S.)

O

HO

H H

H O

NO

OH

O

HO

H H

H O

NO

O

O

O

HO

F H

H

OHO

O

O

A realização de uma pesquisa bibliográfica é

a primeira etapa para a busca do método bioanalíti-

co. Uma vez existindo o método, ele deverá ser tes-

tado quanto a sua reprodutibilidade.

Na inexistênciade um método bioanalítico para

um determinado fármaco, o centro analítico deve

desenvolver um método que responda satisfatória-

mente ao estudo desejado..

Para a aplicação deste fato, consideram-se os

seguintes tipos de validação:

Validação Total

Validação total é de importância no desen-

volvimento e implementação de um método quando

aplicado pela primeira vez ou quando for utilizado

para determinar um novo analito nesta mesma

condição analítica.

Validação Parcial

Validações parciais são modificações do

método já validado. Uma validação parcial pode

compreender desde uma pequena determinação de

precisão/exatidão a até quase uma validação total.

No desenvolvimento de um método é nece-

ssário verificar toda a metodologia de preparação

da amostra, a qual envolve os processos de extra-

ção, separação, purificação, identificação e quanti-

ficação do fármaco na matriz biológica.

Para tanto, podemos dizer que nesta fase,

temos duas etapas distintas á saber:

• Pré-Validação

• Objetivo: Avaliar os parâmetros de desempenho do método.

• Deve ser realizado para cada matriz biológica e cada espécie

química estudada.

• Deve ser realizado com pelo menos 3 lotes da matriz biológica,

onde cada lote é coletado de uma fonte diferente.

• Cada lote deve conter:

– Uma curva de calibração utilizando a matriz pura,

matriz + I.S. e 5 a 8 pontos com a faixa de

aplicação do método.

– Amostras de Controle (n 5) de Qualidade de

Baixa concentração (QCA) Média concentração e

(QCB) Alta concentração (QCC) e Limite de

Detecção (LOQ QC).

Nesta fase consiste na realização de alguns

ensaios preliminares visando à determinação dos

seguintes parâmetros:

Exatidão, precisão e recuperação;

Linearidade e limites de quantificação;

Seletividade.

• Validação do Método

É a fase propriamente dita do

desenvolvimen-

to e estabelecimento da metodologia com o objeti-

vo de definir o ensaio bioanalítico.

Neste caso, a padronização de um método

bio-analítico típico inclui a determinação dos se-

guintes parâmetros fundamentais á saber:

Especificidade e Seletividade;

Linearidade;

Precisão e Exatidão;

Sensibilidade, Limite de quantificação e

detecção;

Recuperação;

Estabilidade ;

Protocolo do Ensaio Bioanalítico

Uma vez que o método bioanalítico foi desen-

volvido e totalmente validado, um manual de proce-

dimentos operacionais padronizados (POPs) para o

mesmo deve ser documentado.

Portanto, todas as análises do método em

questão devem ser submetidas conforme procedi-

mentos do respectivo POP.

Alterações podem afetar significativamente

resultados finais como por exemplo, a substituição

por um outro tipo de coluna, uma mudança signifi-

cativa no comprimento de onda durante as análises

e ou mudança no procedimento de extração, requer,

no mínimo, revalidação parcial do método analítico.

As amostras biológicas dos voluntários a

serem investigadas são processadas preferencial-

mente em duplicata e totalmente “randomizadas” e

podem estar compreendidas em:

• Uma única lista

• Em série de listas analíticas

Importante que a análise de amostra bioló-

gica de um voluntário esteja compreendida em uma

única corrida analítica com a finalidadede minimizar

efeitos da variabilidade do inter-ensaio (Dighe e

Adams, 1991).

Uma Lista analítica é constituída por * :

– Amostras analíticas em duplicata a ser

determinadas.

– Uma curva de calibração em duplicata utilizando

a matriz pura, matriz + I.S. e 5 a 8 pontos

correspondendo faixa de aplicação do método.

* Shan et al., 1992; Jackson, J.A 1994

– Amostras de Controle (n 5) de Qualidade de

Baixa concentração (QCA) Média concentração e

(QCB) Alta concentração (QCC) dispostos em

intervalos para monitorar o desempenho

analítico.

Parâmetros da Validação Bioanalítica

Especificidade - Seletividade

A especificidade de um método é definida

quando o mesmo produz uma única resposta analí-

tica para um único analito.

Já a seletividade é definida como a

habilidade

de uma técnica analítica em distinguir e quantificar,

ou não, uma droga em relação a outras resposta de

diferentes componentes presentes nos fluidos bio-

lógicos.

Assim, uma vez que as técnicas

cromatográ-

ficas produzam respostas que possam ser distin-

guidas das demais resultantes dos diferentes inter-

ferentes presentes na matriz biológica; o termo se-

letivo é usualmente aplicado como parâmetro, na

validação dos métodos bioanalíticos (Karnes et al.,

1991; Dadgar e Brunett, 1995).

Diversos interferentes podem surgir

durante

o desenvolvimento de um método analítico, á saber:

• Endógenos: compreende um amplo número de

compostos orgânicos de alto e baixo peso

molecular (hormônios, lipídeos, proteínas, etc.),

metabólitos de fármacos, precursores, produtos

de degradação do analito, co-administração de

fármacos e vitaminas.

• Exógenos: impurezas presentes nos reagentes

empregados no processamento das amostras

analíticas, componentes utilizados na manufatura

dos recipientes de acondicionamento e ou uma

incompleta lavagem dos mesmos (Buick et al.,

1990; Dadgar et al., 1995).

• Análise da especificidade e seletividade

emprega-sede no mínimo seis fontes de

amostras de matriz biológica branco obtida sob

controladas condições, avaliando-se o horário da

coleta, ingestão de alimentos, e outros fatores

considerados importantes ao método.

• Cada “branco” deve ser avaliado em relação a

interferentes, utilizando-se o método de extração

proposto e as condições analíticas em questão

(HPLC, LC/MS/MS).

• Os resultados são confrontados com os obtidos

de uma solução aquosa do analíto em

concentrações ao Limite de Quantificação (LOQ).

• Qualquer interferência significativa no tempo de

retenção da droga, do metabólitos ou do padrão

interno (I.S.) deve ser rejeitado (Shan et al., 1992;

ISO/DIS 5725-1 - 5725-3, 1994).

• Interferência em mais que 20% em relação a

concentração do LOQ, o método deve ser alterado

para eliminar os interferentes (Causey et al., 1995;

Doing et al., 1990 e Dadgar et al., 1995).

• Nicotina, drogas OTC e seus metabólitos, como

cafeína, aspirina, acetoaminofen e ibuprofeno

devem ser testados.

• Se mais de um analíto é avaliado, cada um deve

ser injetado separadamente.

Blank SampleI.S.

21-OH DFZ

21-OH DFZ (1ng/mL) + I.S. I.S.

21-OH DFZ

Linearidade*

É considerada como a habilidade de se obter

resultados diretamente proporcionais à concentra-

ção do analito na amostra.

*International Conference of Harmonization - ICH, Guideline

for Validation of Analytical Procedure Methodology, 1996;

Comissionof European Communities – Comittee for Proprie-

tary Medicinal Products 111/5626/94 final draft, 1994; Buick et

al., 1990.

A avaliação da curva de calibração, recomen-

rdam o uso:

• 5 a 8 determinações que correspondem ao intervalo

entre o valor superior e inferior da substância em exame,

que atendam aos requisitos de precisão, exatidão e

linearidade.

Pennickx et al., 1996; Shan et al., 1992; Hill et al., 1992; Metha, 1898; Massart et al., 1998 e Hartmann et al., 1998.

Quatro fatores devem ser empregados no

desenvolvimento da curva de calibração:

• Precisão e exatidão menor ou igual a 15% nas

determinações nominais da curva de calibração,

exceto para as concentrações do LOQ.

• Precisão e exatidão menor ou igual a 20% nas

determinações nominais do LOQ.

• Pelo menos quatro das seis concentrações

nominais devem estar de acordo com critérios

acima mencionados, incluindo os pontos do LOQ

e os pontos de calibração de menor concentra-

ção.

• Valor de coeficiente de correlação linear ou igual

ou maior que 0.95.

21-OH DFZ

0 100 200 300 4000

100

200

300

400

500

Concentração Teórica (ng/mL)

Co

nce

ntr

açã

o E

xpe

rim

en

tal

(ng

/mL)

r>0.999

21-Hydroxy DFZ (21-OH DFZ)

O

HO

H H

H O

NO

OH

21-Acetate Dexamethazone (21-Ac DXM, I.S.)

O

HO

F H

H

OHO

O

O

100ng/mL

20ng/mL

100L

Razão: 5

O Padrão Interno (I.S.) tem como finalidade corrigir erros e\ou

perdaspor transferências e pipetagem. Uma vez

quesua concentração é conhecida podemos

corrigir a concentração do analito

desassociando o volume.

Voluntário 08 - 1:30h após administração

I.S.

21-OH DFZ

Precisão e Exatidão

Exatidão RuimPrecisão Boa

Exatidão BoaPrecisão Boa

Exatidão RuimPrecisão Ruim

Exatidão BoaPrecisão Ruim

Precisão

É definida como grau de concordância entre

os resultados de análises individuais,quando o pro-

cedimento analítico é aplicado em diversas vezes

em uma mesma amostra analítica, em idênticas

condições experimentais.

Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Causon, R. 1997 e

Brittain, 1998.

Além disso, é expressa como a porcentagem

do coeficiente de variação (C.V) ou o desvio padrão

relativo da média geométrica dos valores das repli-

catas de cada determinação nominal :

Precisão =% CV = (dp/média) x 100

dp = nc2- (c)2 : n (n-1)

Onde:

CV = coeficiente de variação

dp = desvio padrão

n = número de dados

c= concentração calculada

* De acordo com a ICH de 1996 a precisão pode ser medida em dois diferentes níveis :

• Repetibilidade (Precisão intra-ensaio): é definida

como a habilidade de repetições de uma

metodologia empregada nas mesmas condições

laboratoriais, da utilização do mesmo corpo de

analistas, dos mesmos equipamentos e dos

mesmos reagentes analíticos em um curto

intervalo de tempo, considerando a realização do

ensaio analítico em um único dia .

* Relatório final da ISO (International Organization for Standardiza- tion, 1990/1991), Swartz e Kull ,1998; Hartmann et al., 1994; Causon, R. 1997; Shan et al., 1992; Buick et al.,1990

• Reprodutibilidade (Precisão inter-ensaio): é definida

como a habilidade de repetições da mesma

metodologia analítica aplicada sob diferentes

condições laboratoriais como, por exemplo,

mudanças de analistas, reagentes e equipamentos

em subsequentes ocasiões que podem

compreender várias semanas ou até meses.

* Shan et al., 1992; USPXX 1990; Brooks, 1985; Hartmann et al, 1994 e Buick et al., 1990.

A avaliação da precisão intra e inter ensaio,

recomendam o uso:

• 5 á 10 determinações em replicata para cada

nível de concentrações nominais pré-

estabelecidas das amostras de controle de

qualidade.

• Emprega-se três níveis de concentração: baixo,

que pode ser o LOQ; médio e alto, que estejam

compreendidos dentro do intervalo de limite

especificado do procedimento analítico.

Exatidão

É definida como o grau de concordância

entre os valores individuais encontrados em rela-

ção aos valores reais ou nominais

* Causon, R. 1997; Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Brittain,

1998 e Mehta, 1989.

Além disso, é expressa como a porcentagem

do erro padrão relativo da média geométrica dos

valores das replicatas de cada determinação nomi-

nal :

% E.R = (V. exp - V. t) / V. t x 100

Onde,

V. exp: Valores Experimentais

V. t: Valores teóricos

Normalmente os ensaios para a exatidão

poderão se realizados:

• Um único dia “ Exatidão Intra-ensaio”

• Dias diferentes “Exatidão Inter-ensaio”

• Emprega-se três níveis de concentração: baixo, que pode ser o LOQ; médio e alto, que estejam compreendidos dentro do intervalo de limite especificado do procedimento analítico.

• 5 á 10 determinações em replicata para cada nível de concentrações nominais pré-estabelecidas das amostras de controle de qualidade.

* Buick et al., 1990 e Shan et al,. 1992 e 2000.

Sensibilidade, Limite de Detecção (LOD), Limitede Quantificação (LOQ)

A metodologia analítica é dito sensível quan-

do pequenas mudanças nos padrões de calibração

podem gerar grandes variações na resposta do ins-

trumento analítico. Portanto, ela está relacionada

com inclinação (“slope”) da curva de calibração.

* IUPAC, 1976;Causon, 1997 e Mehta, 1989

Limite de Detecção representa a mais baixa

concentração do composto de investigação que

pode ser detectada em relação à amostra biológica

branco com certo limite de confiabilidade.

• É estabelecido através de análises de soluções

com concentrações conhecidas e decrescentes do

analito até que o nível detectável seja 2 a 3 vezes

superior ao ruído da linha de base cromatográfica

* Swartz e Krull, 1998; Metha, 1989; Mehta, A.C 1987; Mehta A.C 1989;

Brittain, 1998 e BuicK et al.,1990.

O Limite de Quantificação representa a mais

baixa concentração de um composto de investiga-

ção que atende os requisitos para precisão e exati-

dão do ensaio analítico.

• É estabelecido através da a razão 5:1 entre o sinal

e o ruído da linha de base cromatográfica no

tempo de retenção do analito.

• de 5 a 6 determinações em replicata para cada

nível de concentração pré-estabelecida das

amostras de controle de qualidade do LOQ.

* Swartz e Krull, 1998; Causon, R. 1997 e Buick et al., 1990.

Recuperação

Recuperação de um analíto em um estudo é a

resposta obtida de uma quantidade do analito adi-

cionada e recuperada da matrixbiológica e compa-

rada a resposta obtida do padrão puro.

A recuperação avalia a eficiência da extração

e sua variabilidade. Embora recuperações próximas

de 100% sejam desejáveis, baixas recuperações po-

dem ser utilizadas (50-60%) se forem precisas, exa-

tas e reprodutíveis.

Os experimentos de recuperação devem

ser

realizados comparando-se os resuldatos de amos-

tras extraidas a três concentrações diferentes ( alta,

média e baixa ) com padrões não extraidos que

representam 100%.

Para o estudo da recuperação:

• Emprega-se três níveis de concentração: baixo, que pode ser o LOQ; médio e alto, que estejam compreendidos dentro do intervalo de limite especificado do procedimento analítico.

• 5 á 10 determinações em replicata para cada nível de concentrações nominais pré-estabelecidas das amostras de controle de qualidade.

* Mehta, 1989; Causon, R. 1997 e FDA – Guideline for Industry / Bio-analytical Method Validation final draft ,1998 e 2001

Estabilidade

A Resolução RDC Nº 84 de 19 de março de

2002 e FDA, 1997 , estabelecem que que o estudo

da estabilidade deve ser considerada durante a fase

de desenvolmento analítico.

Neste sentido, os estudos de estabilidade

foram classificados em:

• Curta duração:

– Congelamento e descongelamento: - 70 ou - 20°C

por 3 ciclos; recongelamento de 12- 24hs;

– Condições de Análise: 20 - 25°C, tempo máximo

de análise do lote;

– Condições de Auto Sampler: 25°C; tempo

máximo de análise do lote;

• Média duração:

– temperatura - 20 °C;

– Avaliar no tempo zero, um, dois quatro, oito e

dezesseis dias de armazenamento.

• Longa duração;

– deve compreender no tempo entre a data da primeira coleta das amostras e a data da análise da última amostra

– 03 temperaturas de estocagem,4, - 20 e - 70ºC

• Soluções-padrão;

– Deve ser avaliada à temperatura ambiente por

no mínimo 6 horas.

– Se a solução estoque e padrão interno são

refrigeradas ou congeladas por um período de

quatorze dias,

Considerações

• Preparar três á cinco determinações das concentrações de controle de qualidade (baixa, média, e alta) juntamente com o padrão interno nas amostras biológicas e comparar nas condições determinadas com as mesmas amostras recém preparadas.

• Um composto é considerado estável se sua decomposição não ultrapassar 20% da sua concentração inicial ou não ultrapassar o limite estabelecido no protocolo de validação . O prazo de validade é estabelecido com base neste parâmetro

Critérios de Aceitabilidade

• Precisão: Os CV% do inter-day para os QCs é

15%, e 20% para o LOQ QC, avaliados em um

mínimo de 3 lotes.

• Exatidão: A média dos valores do inter-day devem

ser menores que 15% do valor nominal dos

QCs, e não desviar mais que 20% para LOQ QC.

• Sensibilidade: O menor ponto da curva de

calibração aceitável como limite de quantificação

(LOQ) do método é aquele com CV% 20% (inter-

day).

• Especificidade:

– Respostas de picos interferentes no mesmo

tempo de retenção do analíto devem ser menores

que 20% da resposta de um LOQ.

– Respostas de picos interferentes no mesmo

tempo de retenção do padrão interno (I.S.) devem

ser menores que 5% da resposta de um I.S.

utilizado nos estudos.

• Estabilidade: Teste de Longo-Prazo, Curto-Prazo,

Freezer and Thaw, Soluções de Estoque e Auto-

Sampler são propostos no SOP e variam de

estudo para estudo

Guia da Validação

Obtenção do Material Biológico Obtenção do Método Analítico

Referência Bibliográfica

AdequaçãoDesenvolvimento

do Método

Não disponívelDisponível

Pré - Validação

Estabilidade Método Validado

Obtenção do Plasma

Congelamento

Recebimento

Armazenamento

Pré - Validação

Condição Analítica Definida

Seletividade

Recuperação

Limite de Quantificação

Linearidade

Precisão

Exatidão

Parâmetros de Aceitabilidade

Estabilidade

InterferênciaSem Interferência

< 60%> 60%

> 20%< 20%

< 15%

> 15%

> 15%

> 15%< 15% O.K

< 15%

Restrições

Estabilidade

Curta duração

Média duração

Longa duraçãoIniciar o Estudo

Compatível tempo

Compatível tempo

Não compatível tempo

Não compatível tempo

Não compatível tempo

Redefinir tempo de Estudo de Estocagem

Voluntários

Obtenção do Material Biológico

Obtenção do Plasma

Congelamento

Recebimento

Armazenamento Estabilidade

O.K Inicio do Estudo

Aplicação do Método Validado

Corrida do Lote

APROVADO

O.K O.K O.K

Curvas C.QsAmostras

RELATÓRIO