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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN
CECLIA FABIANA DA GAMA FERREIRA
EFEITO DA APLICAO DO CAMPO ELTRICO NA FORMAO DE FILMES PROTICOS
DE GlnB-Hs SOBRE SUBSTRATOS SLIDOS
Curitiba
2012
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CECLIA FABIANA DA GAMA FERREIRA
EFEITO DA APLICAO DO CAMPO ELTRICO NA FORMAO DE FILMES PROTICOS
DE GlnB-Hs SOBRE SUBSTRATOS SLIDOS
Tese apresentada como requisito parcial obteno de grau de Doutor. rea de concentrao: Engenharia e Cincia dos Materiais,
Programa de Ps-Graduao em Engenharia e Cincia dos Materiais - PIPE. Setor de Tecnologia, Universidade Federal do Paran.
Orientador: Prof. Paulo Csar de Camargo
Co-orientadora: Prof. Elaine Machado Benelli
Curitiba
2012
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Embora o bvio nem sempre seja evidente,
revolucionrio
A. H. Albuquerque
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Agradecimentos
- Aos meus pais, Sandra e Valentin, pelo apoio, incentivo e carinho incondicionais por toda a vida.
- Ao Prof. Dr. Paulo Csar de Camargo pela orientao de tantos anos a frente do microscpio de
fora atmica, confiana e muita pacincia.
- A Prof. Elaine Machado Benelli pela amizade, auxlio em geral, orientao nas pesquisas, sugestes
oportunas e por discusses construtivas.
- Ao Prof. Ivo A. Hmmelgen pela utilizao do laboratrio e dos equipamentos e ao seu aluno de
doutorado Wagner Moura e Serbena pelo apoio nas medidas.
- Ao Divo e todos os demais professores e amigos pelas horas de treino, cuidados e descontrao.
- Ao Juliano e a equipe de Travessias da ASUFEPAR pelas horas de treino/relaxamento na piscina.
- Ao Leonardo Schneider pelas conversas construtivas e destrutivas no MFA.
- Ao Eduardo Bach pela amizade, ateno e carinho de todos esses anos.
- Ao Atair dos Santos por me mostrar o caminho.
- A Alcione A. Savariani e aos amigos pelo suporte fundamental.
- Ao Pai
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Resumo
O efeito do campo eltrico externo sobre a formao de filmes de protena GlnB-Hs e sobre
os componentes da soluo tampo foi analisado por curvas de corrente em funo do campo
eltrico e por microscopia de fora atmica (MFA). A protena GlnB de Herbaspirillum seropedicae
(GlnB-Hs) globular, homotrmerica (36 kDa) e com estrutura tridimensional j determinada por
difrao de Raios-X. Concentraes de 10 nM e 100 nM de GlnB-Hs nativa e 10 nM de protena
desnaturada foram depositadas sobre lamnula siliconizada e mica sob temperatura e umidade
ambientes. Imediatamente aps a deposio, campos eltricos mximos de 30 kV/m e 75 kV/m
foram aplicados, com taxas de variao de 3 e 30 V/s. As correntes medidas so correntes de
superfcie e foram analisadas como sendo de corrente de transporte. Para todos os sistemas
analisados necessrio um campo eltrico mnimo (valor crtico) para a corrente ser significativa.
Dependendo do substrato e dos componentes da soluo este campo pode variar de 10 kV/m a 37
kV/m. As imagens de MFA mostraram filmes com alto grau de organizao direcional. Tanto nas
curvas de I-E quanto nas imagens de MFA, o componente Tris-HCl do tampo tem papel
determinante no comportamento das curvas de corrente eltrica e na interpretao das imagens de
MFA. Sobre a lamnula siliconizada somente as solues contendo protena mostraram evidncias de
orientao com o campo eltrico aplicado. Enquanto que, sobre a superfcie da mica a formao de
filmes com orientao preferencial devido ao E foram obtidos na presena e ausncia de GlnB-Hs. O
transporte da protena GlnB-Hs sobre a mica observado pelas imagens de MFA foi comprovado por
imunodeteco. Estes resultados mostram que o campo eltrico aplicado favoreceu a organizao
direcional dos filmes de protena GlnB-Hs e podem contribuir para o entendimento da formao de
filmes proticos sob campo eltricos aplicados.
Palavras chave: campo eltrico, filme de protena GlnB-Hs, mica, lamnula siliconizada, corrente em
funo do campo eltrico, microscopia de fora atmica.
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Abstract
The effect of an external electric field on the formation of protein GlnB-Hs films and on its
buffer solution on solid surfaces has been analyzed by current vs electric field curves and atomic
force microscopy (AFM). The Herbaspirillum seropedicae GlnB protein (GlnB-Hs) is a globular, soluble
homotrimer (36 kDa) and the three-dimensional structure was already determined by X-Rays
diffraction. Concentrations of 10 nM and 100 nM native GlnB-Hs and 10 nM denatured protein were
deposited on siliconized glass slides and on mica at ambient conditions. Immediately after solutions
deposition a maximum electric field of 30 kV/m and 75 kV/m where applied with rates of 3 and 30
V/s. The measured currents were current surfaces and were analyzed as transport current. Electric
current started to flow only after a minimum electric field (critical value) for all systems analyzed.
Depending on the substrate and components of the solution the threshold electric field varies from
10 kV /m to 37 kV/m.The AFM images showed films with high degree of directional organization. The
Tris-HCl buffer compound has a decisive role both in the electric current curves pattern as in the AFM
images interpretation. On siliconized glass slides evidence of film orientation with the applied electric
field was only observed in the AFM images when native and denatured protein were present in the
solution. On mica surface films with preferred orientation with applied E were obtained in the
presence and absence of GlnB-Hs. The protein GlnB-Hs transport on mica observed by AFM images
was confirmed by imunoblotting. These results showed that the applied electric field favored
directional organization of the protein GlnB-Hs films and may contribute to understand the
formation of protein films under applied electric fields.
Keywords: electric field, GlnB-Hs protein film, mica, siliconized glass slide, current vs electric field,
atomic force microscopy.
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Lista de Figura
Figura 2.1: Unidade bsica da protena formando o esqueleto polipeptdico. R1 e R2 simbolizam o
radical [Adaptado de 15].........................................................................................................................6
Figura 2.2: Desenho esquemtico da -hlice (direita) e da folha- anti-paralela (esquerda). A
primeira representao mostra todos os tomos no esqueleto polipeptdico, com as cadeias laterais
representadas pela cor roxa, enquanto que o segundo desenho mostra os smbolos usualmente
utilizados para representar a alfa-hlice e a folha em modelos esquemticos de protenas.
[Adaptado de 15]............................................................................................................................ ......8
Figura 2.3: Diagrama do trmero da protena GlnB de H. seropedicae....................................................9
Figura 2.4: Estado de cargas (a-c) e superfcie molecular (d-f) da protena GlnB-Hs. a) e d) face
inferior, b) e e) face lateral e c) e f) face superior [Adaptado de 20]. Imagem e conveno de cores
(RASMOL)..............................................................................................................................................11
Figura 2.5: Desenho esquemtico da dupla camada eltrica formada na interface da superfcie
carregada em contato com um lquido inico e a correspondente distribuio do potencial eltrico
vs a distncia z da parede. s representa o potencial negativo da superfcie, i corresponde a camada
interna composta por co- e contraons e d referente a camada externa composta somente por
contraons hidratados. A distncia caracterstica da camada de difuso dada pelo comprimento de
Debye (1/k) [Adaptado de 25]...............................................................................................................13
Figura 2.6: Diagrama das possveis orientaes de adsoro para uma protena retangular de
dimenses a x b x c em relao s demais protenas............................................................................17
Figura 2.7: Resumo dos modelos cinticos de adsoro. Um desenho esquemtico de cada
mecanismo de adsoro [Adaptado de 30]...........................................................................................17
Figura 2.8: Desenho esquemtico de uma protena com quatro lados interagindo com substratos
de superfcies compatveis. Uma face da protena hidrofbica, outra carregada negativamente,
outra carregada positivamente, outra de carter hidroflico neutro [44].............................................20
Figura 2.9: Esquema do fluxo eletroosmtico. A) Dimenses de um microcanal, W a largura, h a
altura e L o comprimento e a direo do fluxo e B) Desenho esquemtico do fluxo osmtico em um
tubo capilar de superfcie negativa [Adaptado de 9]............................................................................25
Figura 2.10: Desenho esquemtico da tcnica de monitoramento de corrente. Dois reservatrios com
solues eletrolticas com diferentes concentraes esto ligados por um microcanal. Inicialmente a
soluo menos concentrada (em preto) do reservatrio B preenche o microcanal. Quando um campo
eltrico aplicado a soluo mais concentrada (em cinza), reservatrio A, escoa pelo microcanal via
EOF, substituindo a soluo inicial [8]...................................................................................................29
-
Figura 2.11: Curva tpica de corrente em funo do tempo obtida pela tcnica de monitoramento de
corrente [8].............................................................................................................. ..............................29
Figura 2.12: Desenho esquemtico de um dipolo.................................................................................31
Figura 2.13: Desenho da orientao das molculas polares sob a influncia de um campo eltrico
externo [Adaptado de 63].....................................................................................................................31
Figura 2.14: Desenho esquemtico da interao dipolo-dipolo. a) Campo eltrico externo induz
dipolos (flechas brancas) nas partculas coloidais e interaes entre as mesmas com distncia R e b)
quando o campo forte suficiente partculas coloidais formam uma cadeia ao longo do campo
aplicado [69]............................................................................................................ ..............................34
Figura 2.15: Desenho esquemtico da dupla camada eltrica formada na interface da partcula em
contato com um lquido inico [Adaptado de 9]...................................................................................35
Figura 2.16: Desenho ilustrativo da eletroforese. Uma dupla camada eltrica origina na superfcie de
uma partcula carregada negativamente e foras resultantes de um campo eltrico externo
[Adaptado de 9].............................................................................................................................. .......36
Figura 2.17: Curva esquemtica mostrando a dependncia da fora de interao sonda-amostra em
funo da distncia entre elas. A fora proveniente do potencial de interao entre dois ou mais
tomos, as foras positivas so atrativas e acima da linha de fora zero as foras so repulsiva e cada
regio determina um modo operacional do microscpio [78]..............................................................39
Figura 2.18: Desenho esquemtico dos componentes do microscpio de fora atmica [Adaptado de
83]............................................................................................................................ ..............................40
Figura 2.19: Desenho esquemtico do modo contraste de fase. A sonda oscila sob o efeito de um
atuador e a diferena de fase D entre o atuador e o fotodetector, gerada durante a passagem da
sonda por materiais diferentes [Adaptado de 15]................................................................................42
Figura 4.1: Desenho esquemtico do substrato mica. A mica foi cortada em retngulos de 20 mm X 5
mm. As extremidades foram pintadas com tinta condutiva para fazer contado com eletrodos. As
superfcies limpa da mica para formao do filme de protena de 4 mm ou 10 mm.........................44
Figura 4.2: Desenho esquemtico do substrato lamnula siliconizada. A) substrato lamnula
siliconizada e B) design da canaleta feita com pasta de silicone sobre lamnula siliconizada (0, 43 X
0,43 X 4 mm). A lamnula foi cortada em retngulos de 20 mm X 10 mm e sobre esta canaletas de
silicone em pasta com uma mscara rgida. As extremidades foram pintadas com tinta condutiva para
fazer contado como eletrodos................................................................................................. .............45
Figura 4.3: Desenho esquemtico da deteco da protena GlnB-Ab sobre mica................................48
Figura 4.4: Desenho esquemtico do arranjo experimental para aplicao de tenso nas solues
depositadas sobre mica. A amostra foi ligada em srie com dois resistores. O multmetro ligado ao
resistor R1 de 43.7 K. Na mica, as solues foram depositadas imediatamente adjacentes a tinta
-
condutiva no eletrodo negativo. Na lamnula siliconizada, as solues preencheram o espao entre os
eletrodos. Na equao calculada pelo software VA a voltagem sobre a amostra, V o valor de
tenso medido sobre o resistor R1 e VT a tenso aplicada.................................................................50
Figura 5.1: Topografia da lamnula siliconizada (sem aplicao do campo eltrico). A) somente o
substrato lamnula siliconizada e B) sistema lamnula siliconizada com a canaleta de polisiloxano.....51
Figura 5.2: Topografia do substrato lamnula siliconizada aps tenso de 0 a 300 V. A) - B) sem
canaleta e C) - D) com canaleta de polisiloxano. A) e C) sob umidade relativa acima de 70 % e B) e D)
com H2O miliQ preenchendo o espao entre os eletrodos. Aps a gua de o volume ter evaporado a
superfcie das lamnulas foram analisadas............................................................................................52
Figura 5.3: Grfico corrente vs campo eltrico aplicado sobre a lamnula siliconizada. Curvas obtidas
sob A) umidade relativa do ar de 100 % a 40% e B) 15 l de H2O miliQ foram depositados sobre o
substrato................................................................................................................................................53
Figura 5.4: Grfico de corrente em funo do campo eltrico aplicado sobre o sistema lamnula
revestida com organosilano com canaleta de polisiloxano. Curvas obtidas com umidade relativa do ar
de 40% e acima de 70 % e com 5 l de H2O miliQ preenchendo todo o espao entre os
eletrodos............................................................................................................................................ ...53
Figura 5.5: Grfico de corrente eltrica com voltagem constante de A) 100 V para a lamnula
siliconizada e B) 500 V para a lamnula siliconizada e mica. A umidade relativa inicial de 100 %.
Depois de aproximadamente 450 s, a umidade de 60 %. A umidade relativa final de 40 %...........54
Figura 5.6: Grfico de corrente em funo do tempo com tenso constante: Linha em negrito: 100 V,
linha contnua: 300 V e linha pontilhada: 500 V. A) Substrato + canaleta de polisiloxano em umidade
relativa acima de 60 % e B) Substrato + canaleta de polisiloxano + 5 l de H2O miliQ. O ponto 2 indica
quando a tenso atinge a voltagem determinada.................................................................................55
Figura 5.7: Topografia dos filmes obtidos pelos componentes da soluo tampo sob efeito de um
campo eltrico externo de 0 a 75 KV/m. A) 50 mM NaCl, B) 50 mM Tris e C) soluo tampo............56
Figura 5.8: Grfico de corrente em funo da tenso aplicada sobre os componentes da soluo
tampo na canaleta sobre lamnula siliconizada. Linha tracejada: soluo tampo, linha contnua:
soluo de 50 mM NaCl e linha ponto-trao: soluo de 50mM de Tris-HCl pH
8.............................................................................................................................................................56
Figura 5.9: Topografia dos filmes obtidos pelas solues de protena GlnB-Hs sobre a lamnula
siliconizada+canaleta de polisiloxano sob efeito de um campo eltrico externo de 0 a 75 KV/m. A)
nativa 10 nM (soluo A), B) nativa 100 nM (soluo B) e C) desnaturada 10 nM (soluo C).............57
Figura 5.10: Grfico de I-E das solues de protena GlnB-Hs sob a influncia do campo eltrico
externo sobre a lamnula siliconizada. Linha contnua: soluo de 10 nM de GlnB-Hs nativa, linha
-
tracejada: a soluo de 100 nM de GlnB-Hs nativa e linha em negrito: soluo 10 nM de GlnB-Hs
desnaturada.................................................................................................................. ....................58
Figura 6.1: Frmula estrutural da molcula de organosilano, em que R so grupo qumicos que
podem ser orgnicos ou inorgnicos.....................................................................................................60
Figura 6.2: Superfcies hidrofbicas. Quanto maior o grau de hidrofobicidade da superfcie, maior o
ngulo de contato com a gota de gua. Superfcie (a) superhidroflica = 0, (b) com molhabilidade
parcial 0 < < 180 e (c) superhidrofbica = 180 [93] ....................................................................61
Figura 6.3: Grfico de corrente em funo da umidade relativa. Quanto maior a umidade, maior o
valor de corrente medido sobre a superfcie da lamnula siliconizada.................................................63
Figura 6.4: Desenho esquemtico mostrando os caminhos formados pelos agregados de molculas
de gua adsorvidas na superfcie do substrato slido e o possvel caminho percorrido pela corrente
(vermelho) [Adaptado de 99]................................................................................................................64
Figura 6.5: Grfico de frao revestida por umidade relativa nas condies em que as medidas de
corrente por campo eltrico foram realizadas, temperatura de 30 C e presso de vapor de 4233
Pa...........................................................................................................................................................65
Figura 6.6: Grfico de potncias dissipadas x corrente da lamnula siliconizada e mica (referentes as
Fig. 5.5-A e 5.6-B) com voltagens constantes de 100 V e 500 V............................................................66
Figura 6.7: Cargas cruzando uma seo reta em um microcanal devido a um campo externo aplicado
[Adaptado de 50]...................................................................................................................................71
Figura 6.8: Grfico da generalizao do comportamento observado para as curvas de corrente em
funo do campo eltrico aplicado, exceto para a soluo 50 mM de NaCl.........................................71
Figura 6.9: Desenho esquemtico da molcula de Tris. Em vermelho so as OH- e em azul o NH2+
[103].............................................................................................................................. ........................72
Figura 6.10: Dipolo eltrico em um campo eltrico. Se as foras atuantes no forem iguais (F1 F2) a
molcula migrar no sentido do maior F [Adaptado de 50]..................................................................72
Figura 6.11: Desenho esquemtico de uma estrutura do grafite cristalino. Folhas com os tomos de
carbono (roxa) em arranjo hexagonal [Adaptado de 104]. Resoluo da rede atmica dos tomos de
grafite (carbono ordenado hexagonalmente) no plano cristalinos. Imagens obtidas no modo de
contato [105].........................................................................................................................................73
Figura 6.12: Desenho esquemtico das foras sobre a protena GlnB-Hs sob um campo eltrico
aplicado. A fora de arraste se sobrepe na protena, que em pH 8 apresenta excesso de carga
negativa na superfcie............................................................................................................................77
Figura 7.1: Topografia da superfcie da mica muscovita recm clivada obtida por MFA operando no
modo de contato. A) rea de 100 m2 e B) aumento de 6x da rea maior...........................................80
-
Figura 7.2: Topografia da gua miliQ sob efeito de campo eltrico aplicado sobre mica. A) Prximo ao
anodo (lado depositado) e B) prximo ao catodo.................................................................................81
Figura 7.3: Imagens topogrficas do efeito do campo eltrico de 75 kV/m nos componentes das
solues controles. A) C) reas prximas ao anodo (lado no qual a soluo foi depositada) e de D)
F) reas prximas ao catodo. A) e D) soluo de 50 mM NaCl, B) e E) soluo de 50 mM Tris-HCL pH 8
e C) e F) soluo tampo.......................................................................................................................82
Figura 7.4: Grfico de corrente em funo do campo eltrico para as solues controles depositadas
paralelo ao anodo e um campo eltrico externo de 0 a 75 kV/m, com taxa de variao de 3 V/s. Linha
contnua: substrato mica de 4 mm de comprimento, linha tracejada: gua miliQ, linha em negrito:
soluo de 50 mM NaCl, linha com bolinhas brancas: soluo de 50 mM Tris-HCl pH 8 e linha de
bolinhas pretas: soluo tampo...........................................................................................................83
Figura 7.5: Topografia dos filmes de soluo A (A e C) e B (B e D) sob efeito de um campo eltrico de
75 kV/m sobre a mica. Regies prximas ao anodo A)-B) e ao catodo C)-D)........................................84
Figura 7.6: Filme da soluo de protena GlnB-Hs 10 nM desnaturada sob efeito de um campo
eltrico de 75 kV/m sobre a mica. rea prxima ao anodo A) Topografia e B) fase e rea prxima ao
catodo C) topografia..............................................................................................................................85
Figura 7.7: Grfico de corrente em funo do campo eltrico aplicado as solues de protena
depositadas ao lado do anodo sobre mica. Linha contnua: Soluo de GlnB-Hs 10 nM nativa, linha
tracejada: soluo de GlnB-Hs 100 nM nativa e linha em negrito: soluo de GlnB-Hs 10 nM
desnaturada...........................................................................................................................................85
Figura 7.8: Efeito da tenso de at 300 V com passo de 3 V/s aplicados sobre as solues controles na
mica muscovita. Lado do anodo A)-C) e ao lado do catodo D)-F) das solues: 50 mM NaCl A) e D), 50
mM Tris-HCl pH 8 B) e E) e da soluo tampo C) e F)..........................................................................86
Figura 7.9: Grfico de corrente em funo do campo eltrico das solues controles depositadas
paralelo ao anodo e uma tenso de 0 a 300 V aplicada, com taxa de variao de 3 V/s. Linha
contnua: substrato mica de 10 mm de comprimento, linha tracejada: gua miliQ, linha em negrito:
soluo de 50 mM NaCl, linha com bolinhas brancas: soluo de 50 mM Tris-HCl pH 8 e a linha com
bolinhas pretas: soluo tampo...........................................................................................................87
Figura 7.10: Topografia dos filmes da soluo de protena 10 nM nativa (A e E), 100 nM nativa (B e D)
e 10 nM desnaturada (C e F) expostas a um campo de 30 kV/m com taxa de variao de 3 V/s sobre
mica. reas prximas ao anodo (lado no qual a soluo foi depositada) A) a C) e reas prximas ao
catodo D) a F)........................................................................................................................................88
Figura 7.11: Grfico de corrente em funo do campo eltrico aplicado s solues de protena
depositadas ao lado do anodo sobre mica e expostas a uma tenso de 0 a 300 V com taxa de variao
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de 3 V/s. Linha contnua: soluo de GlnB-Hs 10 nM nativa, linha tracejada: soluo de GlnB-Hs 100
nM nativa e linha em negrito: soluo de GlnB-Hs 10 nM desnaturada...............................................89
Figura 7.12: Efeito da tenso de at 300 V com passo de 30 V/s aplicados sobre as solues controles
na mica muscovita. Lado do anodo A)-C) e ao lado do catodo D)-F) das solues: 50 mM NaCl (A e D),
50 mM Tris-HCl pH 8 (B e E) e da soluo tampo (C e F).....................................................................91
Figura 7.13: Grfico de corrente em funo do campo eltrico das solues controles depositadas
paralelo ao anodo e uma tenso de 0 a 300 V aplicada, com taxa de variao de 30 V/s. Linha
contnua: substrato mica de 10 mm de comprimento, linha tracejada: gua miliQ, linha em negrito:
soluo de 50 mM NaCl, linha com bolinhas brancas: soluo de 50 mM Tris-HCl pH 8 e linha com
bolinhas pretas: soluo tampo...........................................................................................................92
Figura 7.14: Topografia dos filmes de soluo de protena GlnB-Hs nativa 10 nM (A e C) e 100 nM (B
e D) sob efeito de um campo eltrico de 30 kV/m sobre a mica. Regies prximas ao anodo A)-B) e ao
catodo C)-D).............................................................................................................................. .............93
Figura 7.15: Filme da soluo de protena GlnB-Hs 10 nM desnaturada sob efeito de um campo
eltrico de 30 kV/m sobre a mica. rea prxima ao anodo A) Topografia e rea prxima ao catodo B)
topografia e C) fase...............................................................................................................................93
Figura 7.16: Corrente em funo do campo eltrico aplicado as solues de protena depositadas ao
lado do anodo sobre mica e expostas a uma tenso de 0 a 300 V com taxa de variao de 30 V/s.
Linha contnua: soluo de GlnB-Hs 10 nM nativa, linha tracejada: soluo de GlnB-Hs 100 nM nativa
e linha em negrito: soluo de GlnB-Hs 10 nM desnaturada................................................................94
Figura 7.17: Radiograma dos controles. A) Superfcie recm clivada da mica, soluo tampo
depositada paralelamente ao eletrodo negativo (sinalizado na imagem) sobre a mica com B) 10 mm e
C) 4 mm de comprimento entre os eletrodos.......................................................................................95
Figura 7.18: Radiograma das solues de protena depositadas paralelas ao eletrodo negativo sem
aplicao de campo sobre mica de 4 mm (A a C) e 10 mm (D a F) de comprimento entre os eletrodos.
Concentraes de GlnB-Hs de nativa 10 nM (A e D), nativa 100 nM (B e E) e desnaturada 10 nM (C e
F).............................................................................................................................. ..............................95
Figura 7.19: Radiograma das solues de protena sob efeito de campo eltrico sobre mica com 4
mm de distncia entre eletrodos. Soluo de GlnB-Hs de A) 10 nM nativa, B) 100 nM nativa e C) 10
nM desnaturada....................................................................................................................................96
Figura 7.20: Radiograma das solues de protena sob efeito de campo eltrico sobre mica com 10
mm de distncia entre eletrodos e com taxa de variao de 3 V/s. Soluo de GlnB-Hs de A) 10 nM
nativa, B) 100 nM nativa e C) 10 nM desnaturada................................................................................96
-
Figura 7.21: Radiograma das solues de protena sob efeito de campo eltrico sobre mica com 10
mm de distncia entre eletrodos e com taxa de variao de 30 V/s. Soluo de GlnB-Hs de A) 10 nM
nativa, B) 100 nM nativa e C) 10 nM desnaturada................................................................................97
Figura 8.1: Desenho esquemtico de uma estrutura ideal de mica muscovita. Folhas tetradricas
duplas de (Si, Al)205 so ligadas eletrostaticamente por ons de potssio. A distncia perpendicular
entre as folhas de 10. [Adaptado de 79]. Topografia da mica muscovita (001) depois de ser
atacada com cido fluordrico por 3 horas. Anlise realizada em modo dinmico e imagem de
512X512 pixel. Cantilever de 10 m, freqncia de ressonncia de 4,6 MHz e velocidade de varredura
de 40 Hz [113]........................................................................................................ ................................98
Figura 8.2: Representao da molhabilidade da gota. A molhabilidade de uma superfcie slida o
resultado das interaes moleculares existentes entre o fluido e o substrato slido, se revelando
como a relao entre foras de coeso e adeso. medida que as foras de adeso aumentam em
relao as foras de coeso, mais afinidade a superfcie slida ter com a fase lquida......................99
Figura 8.3: Desenho esquemtico do sistema analisado. A soluo de protena depositada sobre a
mica, ao lado do anodo (1). Imediatamente aps uma tenso de at 300 V aplicada com taxas de
variao do campo eltrico diferentes. Atravs de foras agindo sobre os ons e molculas da soluo
a interface lquido-ar comea a escoar (2). No final de um tempo t a soluo reveste toda a superfcie
da mica entre os eletrodos (3)............................................................................................... ..............100
Figura 8.4: Grfico da generalizao do comportamento observado para as curvas de corrente em
funo do campo eltrico aplicado.....................................................................................................101
Figura 8.5: Sistema fsico anlogo a soluo de protena (dieltrico) entre os eletrodos. Campo
eltrico entre as placas de um capacitor com dieltrico (cinza). A carga superficial no dieltrico
enfraquece o campo original entre as placas [Adaptado de 50].........................................................102
Figura 8.6: Desenho esquemtico da soluo depositada paralelo ao polo negativo sobre a mica com
a fonte desligada. A frente no uniforme e a molhabidade da soluo foram observados
opticamente........................................................................................................................................105
Figura 8.7: Movimentao da protena causada pelo momento de dipolo induzido em um campo
eltrico no uniforme [Adaptado de 116]...........................................................................................107
Figura 8.8: Interao das molculas presentes na soluo com 50 mM Tris-HCl pH 8. Interao A) Tris-
Tris, B) Tris-H2O e C) molculas de gua..............................................................................................108
Figura 8.9: Modelo esquemtico da molcula de gua coadsorvida com tomo de Na sobre Ru (0 0 1)
[Adaptado de 123]. A molcula de gua reorienta-se com o aumento de Na presente na
superfcie.............................................................................................................................................109
-
Figura 8.10: Espectro de FTIR/ATR para filmes formados por 100 nM GlnB-Hs nativa (linha em preto)
e a soluo tampo. As duas alm de apresentarem pico na regio caracterstica da protena tambm
tem um sinal muito pequeno (destacado em vermelho)....................................................................111
Figura 8.11: Anlise por MEV-CL. A) Imagem de MEV, B) imagem por catodoluminescncia do filme
formado pela deposio de 10 nM GlnB-Hs nativa paralela ao anodo. Espectro obtido do filme
formado pela soluo controle Tris-CL pH 8. Observa-se no espectro que a faixa de emisso para os
aminocidos da protena GlnB-Hs apresenta sinal para o Tris............................................................112
Figura 8.12: Trajetrias de partculas em escoamentos unidimencionais laminar e turbulento
[93].............................................................................................................................. ........................115
Fig. Ap. 2.1: Desenho esquemtico do arranjo experimental para aplicao de tenso nas
solues............................................................................................................................. ..................131
Fig. Ap. 3.1: Topografia dos filmes de protena GlnB-Hs 10 nM nativa (A e C), 100 nM (B e E) e
desnaturadas (C e F) formados sobre mica (A a C) e lamnula siliconizada (D a F)..............................133
Fig. Ap. 3.2: Topografia dos filmes formados pela deposio de A) gua miliQ e B) soluo de 50 mM
de Tris-HCl pH 8 sobre mica.................................................................................................................134
-
Lista de Tabelas
Tabela 4.1: Concentrao final de protena GlnB-Hs e dos componentes da soluo tampo nas
solues aps diluio...........................................................................................................................45
Tabela 5.1: Anlise das curvas das solues de protena sobre lamnula siliconizada (referente a Fig.
5.10).............................................................................................................................. .........................59
Tabela 6.1: Potncia dissipada para a curva corrente em funo do tempo com tenso constante da
lamnula siliconizada com canaleta de polisiloxano sob umidade relativa acima de 70 % (referente a
Fig. 5.6-A)...............................................................................................................................................67
Tabela 6.2: Potncia dissipada para a curva corrente em funo do tempo com tenso constante da
lamnula siliconizada com canaleta de polisiloxano e 5 l de H2O miliQ preenchendo o espao entre
os eletrodos (referente a Fig. 5.6-B)......................................................................................................68
Tabela 6.3: Fora de arraste sofrida pelas protenas GlnB-Hs sob campo eltrico externo..................77
Tabela 7.1: Anlise das curvas das solues de protena sobre mica com taxa de variao de 3 V/s
(referente a Fig. 7.11)............................................................................................................................89
Tabela 8.1: Comprimento de onda de excitao e emisso para os aminocidos tirosina e fenilalanina
presentes na protena GlnB-Hs............................................................................................................111
Tabela 8.2: Nmero de Reynolds para a gua miliQ depositada sobre mica exposta ao campo eltrico
em diferentes taxas de variao..........................................................................................................114
-
Nomenclatura
Abreviaes
Ab Azospirillum brasiliense
CL catodoluminescncia
DCE dupla camada eltrica
DEF - dieletroforese
EF eletroforese
EOF fluxo eletroosmtico
FTIR espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier
FTIR/ATR espectroscopia de reflectncia total atenuada
Hs Herbaspirillum seropedicae
MEV microscpio eletrnico de varredura
MFA microscopia de fora atmica
MVS microscopia de varredura por sonda mecnica
PALS espalhamento de luz com fase alternada
RSA adsoro randmica sequencial
XPS espectroscopia de fotoeltrons gerados por Raios-X
Lista de smbolos
a raio da partcula (m)
A rea da seo transversal (m2)
A0 amplitude livre (m)
Ar amplitude real (m)
c concentrao das espcies de ons (mol/l)
cp calor especfico (J/gK)
C capacitncia (F)
-
d distncia da parede do canal (m)
D coeficiente de difuso (m2/s)
e carga do eltron (C)
E vetor campo eltrico (V/m)
F fora (N)
Fws frao revestida (%)
h altura do canal (m)
I corrente eltrica (A)
J densidade de corrente (A/m2)
1/ comprimento de Debye (m-1)
k constante dieltrica do material (C/Vm)
K constante de Boltzmann (J/K)
kcant constante de mola do cantilever (N/m)
K() fator Clausius-Mossotti
L comprimento do canal (m)
L0 comprimento caracterstico (m)
n nmero total de espcies carregadas no sistema
p momento de dipolo (C.m)
P presso (Pa)
PPV presso de vapor (Pa)
Pe permetro (m)
Pd potncia dissipada (W)
q magnitude da carga (C)
Q carga (C)
Qcant fator de qualidade
R distncia de separao entre os dois tomos (m)
Re nmero de Reynolds
Ri resistncia ()
t tempo (s)
tw espessura atribuda para molcula de gua ()
-
T temperatura absoluta (K)
u vetor velocidade (m/s)
u magnitude da velocidade (m/s)
U potencial de interao (V)
UR umidade relativa (%)
V tenso (V)
wcant frequncia de ressonncia (Hz)
W largura do canal (m)
z valncia do on
Letras gregas
0 permissividade do vcuo (C/Vm)
m permissividade do meio (C/Vm)
ngulo de separao (graus)
s condutncia da superfcie (S)
frequncia do meio aplicada (Hz)
potencial eltrico (V)
mobilidade (m2/Vs)
viscosidade (Pa.s)
densidade de carga
i resistividade (S/m)
f condutividade do meio (S/m)
p condutividade da partcula (S/m)
MW tempo de relaxao da partcula (s)
gradiente
t variao de tempo (s)
ngulo de contato (graus)
variao de fase
potencial zeta (V)
-
Sumrio
1. Introduo.................................................................................................................................1
1.1. Organizao da tese..............................................................................................................4
2. Reviso bibliogrfica.................................................................................................................6
2.1. Protenas..............................................................................................................................6
2.1.1. Estrutura tridimensional das protenas.......................................................................7
2.1.2. Estrutura tridimensional da protena GlnB-Hs..............................................................8
2.1.3. Propriedades inicas das protenas..............................................................................9
2.1.4. Propriedades inicas da protena GlnB-Hs..................................................................10
2.2. Formao de filmes finos proticos sobre substratos slidos Adsoro de protena..........12
2.3. Efeito do campo eltrico na adsoro de protena...............................................................21
2.3.1. Fluxo eletroosmtico................................................................................................25
2.3.1.1. Escoamentos eletroosmticos em superfcies livres.............................................27
2.3.1.2. Tcnica de monitoramento de corrente...............................................................28
2.3.2. Dieletroforese...........................................................................................................30
2.3.3. Eletroforese..............................................................................................................34
2.4. Cristalizao bidimensional de protenas............................................................................37
2.5. Microscpio de fora atmica.............................................................................................37
2.5.1. Princpio fsico do funcionamento do MFA..............................................................38
2.5.2. Princpio mecnico do funcionamento do MFA........................................................39
2.5.2.1. Modo dinmico..................................................................................................41
2.5.2.2. Imagem da fase..................................................................................................41
3. Objetivos..................................................................................................................................43
3.1. Objetivo geral.....................................................................................................................43
3.1. Objetivos especficos..........................................................................................................43
4. Procedimento experimental..................................................................................................44
4.1. Materiais............................................................................................................................44
4.1.1. Mica muscovita........................................................................................................44
4.1.2. Lamnula siliconizadas..............................................................................................44
4.1.3. Soluo estoque de protena GlnB-Hs........................................................................45
4.1.4. Solues controles....................................................................................................46
4.1.5. Solues para imunodeteco..................................................................................46
-
4.1.6. Fonte e Multmetro para aplicao de tenso...........................................................46
4.2. Mtodos.............................................................................................................................46
4.2.1. Deposio das solues sobre a mica para aplicao de tenso..................................46
4.2.2. Deposio das solues sobre lamnula siliconizada para aplicao de tenso.............47
4.2.3. Efeito da umidade nos valores de corrente na lamnula siliconizada...........................47
4.2.4. Deteco da protena GlnB-Ab sobre a superfcie da mica..........................................47
4.2.5. Anlise por microscopia de fora atmica (MFA) dos filmes formados sobre a mica e
lamnula siliconizada...........................................................................................................48
4.2.6. Obteno dos grficos de corrente em funo do campo eltrico...............................49
5. Resultados: Efeito do campo eltrico na organizao dos filmes formados sobre a
lamnula siliconizada...................................................................................................................51
5.1. Efeito da umidade relativa do ar nas medidas de corrente eltrica e imagens de MFA........51
5.2. Efeito do campo eltrico sobre as solues controles depositadas na canaleta de
polisiloxano...................................................................................................................................55
5.3. Efeito do campo eltrico sobre as solues de protena GlnB-Hs depositadas na canaleta de
polisiloxano...................................................................................................................................57
6. Discusso: Efeito do campo eltrico na organizao dos filmes formados sobre a
lamnula siliconizada...................................................................................................................60
6.1. Efeito da umidade relativa do ar nas medidas de corrente eltrica e imagens de MFA........60
6.2. Efeito do campo eltrico sobre as solues controles depositadas na canaleta de
polisiloxano...................................................................................................................................68
6.3. Efeito do campo eltrico sobre as solues de protena GlnB-Hs depositadas na canaleta de
polisiloxano...................................................................................................................................75
7. Resultados: Efeito do campo eltrico na organizao dos filmes formados sobre
mica..............................................................................................................................................80
7.1. Efeito do campo eltrico sobre o substrato e na gua miliQ depositada sobre mica............80
7.2. Campo eltrico de 75 kV/m com taxa de variao de 3 V/s.................................................81
7.2.1. Solues controles....................................................................................................82
7.2.2. Solues de protena GlnB-Hs....................................................................................84
7.3. Campo eltrico de 30 kV/m com taxa de variao de 3 V/s.................................................86
7.3.1. Solues controles....................................................................................................86
7.3.2. Solues de protena GlnB-Hs....................................................................................88
7.4. Campo eltrico de 30 kV/m com taxa de variao de 30 V/s............................................... 90
7.4.1. Solues controles....................................................................................................90
-
7.4.2. Solues de protena GlnB-Hs....................................................................................92
7.5. Deteco da protena GlnB-Ab sobre a superfcie da mica...................................................94
7.5.1. Controles: superfcie da mica e soluo tampo.........................................................95
7.5.2. Campo eltrico de 75 kV/m com taxa de variao de 3 V/s.........................................96
7.5.3. Campo eltrico de 30 kV/m com taxa de variao de 3 V/s.........................................96
7.5.4. Campo eltrico de 30 kV/m com taxa de variao de 30 V/s.......................................97
8. Discusso: Efeito do campo eltrico na organizao dos filmes formados sobre a
mica..............................................................................................................................................98
8.1. Efeito do campo eltrico sobre o substrato e gua miliQ depositada sobre mica................98
8.2. Grficos de I-E das solues controles e solues de protena GlnB-Hs depositadas sobre
mica.............................................................................................................................................100
8.3. Imagens de microscopia de fora atmica das solues controles e solues de protena
GlnB-Hs sobre mica......................................................................................................................106
8.4. Deteco da protena GlnB-Ab sobre a superfcie da mica.................................................110
9. Concluses.............................................................................................................................117
9.1. Trabalhos futuros..............................................................................................................119
10. Referncia Bibliogrfica......................................................................................................120
Apndice 1. Resumo das amostras preparadas e resultados de corrente em funo do campo
eltrico e imagens de MFA...........................................................................................................129
Apndice 2. Medida de corrente em funo do campo eltrico...................................................131
Apndice 3. Filmes formados sem campo eltrico aplicado........................................................133
-
1. Introduo
A interao de biomolculas com superfcies slidas determina caractersticas de importncia
fundamental para o desenvolvimento de filmes finos e suas aplicaes em nanotecnologia,
biomateriais e processos biotecnolgicos. As protenas apresentam diversidade estrutural e de
distribuio superficial de cargas o que favorece processos de adeso em substratos slidos. Os
processos de adeso envolvem tanto cintica de ligao quanto rearranjos estruturais de protenas.
Atualmente, vrios estudos procuram medir, prever, controlar e entender a conformao de
protenas, superestrutura e os detalhes cinticos das interaes destas biomolculas com a superfcie
[1, 2, 3, 4].
A funo de uma superfcie revestida com protenas depende das propriedades estruturais
da macromolcula, uma vez que sua funo biolgica esta diretamente ligada a sua estrutura
tridimensional que determinada pela sua sequncia de aminocidos.
A possibilidade de controlar filmes proticos tendo seus componentes adaptados e
otimizados para uma dada aplicao seria uma situao ideal. Na realidade, estamos longe desta
realidade. A complexidade das macromolculas, a influncia dos componentes da soluo de
protena e as caractersticas polares da superfcie slida dificultam o controle no posicionamento
espacial durante o momento da adeso das molculas.
Filmes finos formados pela deposio de soluo de protena GlnB de Herbaspirillum
seropedicae em mica foram caracterizados por MFA e XPS [5]. Na mica a interao da protena GlnB-
Hs fraca e a estrutura dos arranjos supramoleculares formados depende da concentrao de sal
presente na soluo de protena [5]. Alm disso, o NaCl e especialmente o Tris existentes na soluo
de protena limitam a resoluo e distino de arranjos supramoleculares na superfcie da mica,
podendo influenciar na interpretao dos resultados [5].
A superfcie do filme protico formado pela deposio da soluo de protenas em diferentes
concentraes sobre mica depositada por spin coating foi analisada por espectroscopia de
infravermelho [dados ainda no publicados]. Os grficos mostram a limitao da tcnica de preparo
na formao de filmes de protena GlnB-Hs, devido a fraca adeso destas protenas no substrato
[dados ainda no publicados]. Alm disso, os resultados mostram que os componentes da soluo de
protena (Tris-HCl e NaCl) tem maior afinidade com a superfcie da mica do que prpria GlnB-Hs.
Substratos diferentes foram usados na formao do filme de protena GlnB-Hs com
deposio por drop deposition para estudar a influncia do substrato na organizao de possveis
auto-arranjos dos componentes da soluo de protena por MFA [dados no publicados]. Superfcies
de mica, grafite piroltico e lamnula de vidro siliconizada foram utilizadas devido s diferentes
1
-
caractersticas polares e de molhabilidade. Pelas imagens de MFA observou-se arranjos lineares
sobre os substratos de grafite e lamnula siliconizada [dados ainda no publicados]. A clivagem em
diferentes planos do grafite e as cadeias polimricas do silicone podem ser a causa da organizao
linear das protenas observadas sobre estes substratos.
Uma maneira de controlar a homogeneidade espacial, orientao e razo de crescimento de
camadas de protenas atravs da aplicao de um campo eltrico externo [6, 7, 8, 9]. Muitas
protenas alinham e migram na presena de um campo eltrico por apresentarem carga lquida e
caractersticas polares.
A dificuldade de medir simultaneamente os mecanismos de adsoro e os efeitos de um
campo eltrico externo atuando sobre protenas em uma interface slida faz com que o interesse no
assunto aumente o nmero de pesquisas com diversas tcnicas, contribuindo para elucidar a adeso
de biomolculas em slidos [6, 7, 8, 9, 10].
Estudos anteriores investigaram a adsoro de protena em uma superfcie slida sob a
influncia de um campo eltrico utilizando um dos eletrodos da clula eletroqumica para formao
do filme e, assim, medir a influncia da quantidade de material adsorvido e espessura de camada [6],
orientao [10] e regulao de ligao entre antgeno-anticorpo [11].
Neste trabalho a migrao da soluo de protena GlnB-Hs sob efeito de campo eltrico
utilizado como sistema alternativo para controlar arranjos formados na interface lquido-superfcie
slida. Um volume de soluo de protena GlnB-Hs depositado sobre um substrato slido (mica e
lamnula de vidro siliconizada) e submetida a campos eltricos variados. Os filmes obtidos podem ser
usados como base para nucleao de cristais de protena e estudos de interao entre as protenas
da famlia PII.
A protena GlnB faz parte da famlia do tipo PII [12]. Esta biomolcula transdutora de sinal
envolvida na regulao da atividade das protenas relacionadas com a utilizao de fonte de
nitrognio [12, 13]. A protena GlnB-Hs globular, trimrica (36 kDa) e sua estrutura tridimensional
foi determinada por difrao de Raios-X [14].
As curvas de corrente em funo do campo eltrico aplicado foram analisadas procurando-se
entender a formao do filme resultante de diversos fenmenos como a migrao dos ons da
soluo, polarizao e arraste da protena e a evaporao da gua de soluo. A morfologia destes
filmes foi avaliada por microscopia de fora atmica (MFA) para caracterizao das possveis
estruturas supramoleculares altamente organizadas formadas.
A influncia do campo eltrico externo na organizao dos componentes da soluo de
protena na formao dos filmes foram avaliados em diferentes condies, como valor mximo de
campo eltrico aplicado, taxa de variao do campo eltrico, concentrao e estado da protena
GlnB-Hs na soluo e caracterstica hidrofbica dos substratos.
2
-
Modificaes feitas no protocolo de imunodeteco, mtodo usado em bioqumica e biologia
molecular para deteco especfica de protenas em uma dada amostra, permitiu a verificao da
migrao da protena GlnB-Hs diretamente sobre a superfcie da mica.
Com este estudo pretende-se contribuir para o entendimento dos fatores envolvidos na
formao de filmes proticos, suas estruturas supramoleculares e verificar se estes arranjos
supramoleculares podem ser organizados de forma a facilitar a cristalizao de protenas, para
estudar a sua estrutura e, consequentemente, a sua funo.
3
-
1.1. Organizao da tese
A tese esta organizada como se segue:
No Captulo 3 (Reviso Bibliogrfica) faz-se uma reviso geral sobre os efeitos do campo
eltrico sobre partculas carregadas em soluo, em especfico sobre protenas. Primeiramente, uma
viso geral sobre estruturas tridimensionais de protenas, em particular a estrutura tridimensinal e a
distribuio de cargas na superfcie da protena GlnB-Hs. Segue-se uma introduo sobre adsoro de
protenas em substratos slidos, os aspectos cruciais que devem ser levados em considerao no
preparo do filme e interao da soluo com as superfcies hidroflicas e hidrofbicas. A influncia do
campo eltrico sobre os componentes da soluo e a introduo de conceitos relacionados com
eletrocintica, como eletroosmose, dieletroforese e eletroforese tambm so discutidas neste
captulo. Ainda so descritos os princpios da tcnica de microscopia de fora atmica (MFA) usada
para analisar os filmes obtidos pela deposio da soluo de protena GlnB-Hs em substratos slidos
expostas a um campo eltrico externo. Diversos conceitos apresentados neste captulo tm o
objetivo de situar o leitor nas diversas tecnologias disponveis no uso de fluidos para a formao de
filmes finos.
O Captulo 4 (Procedimento Experimental) descreve os materiais utilizados e os mtodos
para aplicao do campo eltrico nas solues. As diferentes condies de deposio e arranjo
experimental e valores de campo aplicados para a obteno de filmes proticos altamente
organizados sobre lamnula siliconizada e mica.
Os Captulos 5 e 6 (Resultados e Discusso, respectivamente) so dedicados aos resultados e
discusso dos filmes de protena GlnB-Hs obtidos sobre a lamnula siliconizada quando expostos a um
campo mximo de 75 kV/m. No Captulo 6 descrita a caracterizao da superfcie da lamnula
siliconizada, apresentada a relao da umidade relativa do ar com as medidas de corrente e a
interferncia do substrato na organizao do filme protico. Neste captulo descreve-se ainda a
interpretao das curvas de corrente por campo eltrico, correspondentes s solues e a influncia
dos componentes da soluo tampo. A explicao da organizao das protenas observada por
imagens de MFA complementa esta parte do trabalho.
No Captulo 7 e 8 so apresentados os resultados e discusses, respectivamente, dos filmes
organizados de protena GlnB-Hs expostos a campos eltricos de 75 e 30 kV/m, em diferentes taxas
de variao do campo. As solues controle e de protenas foram depositadas paralelamente ao polo
negativo (por conveno nesta tese chamado de anodo). As medidas de curvas de corrente fornecem
informaes sobre a interao das partculas com o substrato, o nmero de portadores de carga e a
sua mobilidade sobre a superfcie da mica sob um campo eltrico aplicado. As imagens de MFA
4
-
mostram se h transporte de massa via eletroforese e dieletroforese e se as protenas orientam-se.
No Captulo 8 ainda discutida a eficincia da deteco direta da protena GlnB-Hs adsorvida sobre
mica e diferenciao desta das molculas de Tris em relao a tcnicas como espectroscopia no
infravermelho e por catodoluminescncia.
O nono captulo (Concluso) dedicado s concluses obtidas das imagens de MFA, das
curvas de corrente por campo eltrico e a deteco da protena GlnB-Hs por interao antgeno-
anticorpo na superfcie da mica, alm da sugesto de aplicabilidade para os filmes altamente
organizados obtidos.
5
-
2. Reviso Bibliogrfica
2.1. Protenas
Protenas so cadeias polimricas flexveis de alto peso molecular que participam de todos os
processos celulares. A multiplicidade de funes desempenhadas pelas protenas resulta do grande
nmero de diferentes formas tridimensionais que estas podem assumir j que a sua funo
determinada pela estrutura [15].
Quimicamente, as protenas so polmeros orgnicos formada pela ligao covalente de
aminocidos (ligao peptdica). Os aminocidos so formados: do grupo carboxila (-COOH) do
primeiro aminocido e com o grupo amina (R-NH2-) do segundo aminocido atravs de ligaes
covalentes (ligaes peptdicas) com a perda de uma molcula de gua, formando o chamado
esqueleto polipeptdico (Figura 2.1).
Normalmente, so encontrados 20 tipos de aminocidos nas protenas e sua sequncia
definida pelo cdigo gentico. Cada aminocido possui uma cadeia lateral diferente ligada ao
carbono .
As cadeias laterais (R1 e R2 da Figura 2.1) conferem a cada aminocido suas caractersticas
qumicas prprias. As cadeias laterais so formadas por aminocidos apolares e polares, carregados
positiva ou negativamente.
Figura 2.1: Unidade bsica da protena formando o esqueleto polipeptdico. R1 e R2 simbolizam o radical
[Adaptado de 15].
A versatilidade qumica que os 20 aminocidos comuns possuem de importncia vital para
a funo das protenas. Assim, alm dos 20 aminocidos padres cada qual com diferentes
propriedades qumicas, os resduos na protena podem, tambm, ser alterados quimicamente por
modificaes ps-traducionais (eventos de processamento covalente que mudam as propriedades
das protenas por clivagem proteoltica ou por adio de um grupo qumico a um ou mais
aminocidos).
6
-
2.1.1. Estrutura tridimensional das protenas
As protenas podem ter quatro nveis estruturais:
1) Estrutura primria: nvel estrutural mais simples e importante formado pela sequncia de
aminocidos ligados covalentemente ao longo da cadeia polipeptdica que originar todo o arranjo
espacial da molcula.
2) Estrutura secundria: dado pelo arranjo espacial de aminocidos prximos na sequncia
primria da protena, devido a rotao das ligaes entre os carbonos dos aminocidos e seus
agrupamentos amina e carboxila.
As estruturas secundrias mais frequentes so: as -hlice e as folhas- (Figura 2.2).
Nas -hlice o esqueleto polipeptdico est estreitamente enrolado ao longo do maior eixo
da molcula e os grupos R dos resduos de aminocido projetam-se para fora do esqueleto helicoidal
em direo perpendicular ao eixo da hlice (Figura 2.2). A estabilizao desta estrutura ocorre pelas
ligaes de ponte de hidrognio entre o grupamento CO de cada aminocido, com o grupamento NH
do aminocido que est situado a quatro unidades adiante na sequncia linear, sendo que todos os
grupamentos NH e CO formam pontes de hidrognio.
A outra estrutura frequente a folha-, em que a cadeia polipeptdica forma uma estrutura
em zig-zag em que as cadeias laterais de aminocidos distantes de dois resduos interagem (Figura
2.2). A estrutura estabilizada por pontes de hidrognio formadas entre o NH de uma fita com o
CO de outra fita , formando a estrutura em folha. Os grupos R (cadeia lateral) alternam-se para cima
e para baixo ao longo do esqueleto estendido.
7
-
Figura 2.2: Desenho esquemtico da -hlice (direita) e da folha- anti-paralela (esquerda). A primeira
representao mostra todos os tomos no esqueleto polipeptdico, com as cadeias laterais representadas pela
cor roxa, enquanto que o segundo desenho mostra os smbolos usualmente utilizados para representar a alfa-
hlice e a folha em modelos esquemticos de protenas. [Adaptado de 15].
3) Estrutura terciria: resulta do enovelamento das estruturas secundrias. Neste caso,
aminocidos distantes na cadeia polipeptdica passam a interagir. A estrutura estabilizada por
interaes fracas (pontes de hidrognio, interaes eletrostticas e hidrofbicas) e em alguns casos
por interaes fortes (ligaes covalente), por exemplo, as pontes de sulfeto.
Se a protena monomrica, ou seja, s apresenta uma cadeia polipeptdica a estrutura
terciria corresponde ao maior nvel estrutural da protena e a estrutura terciria confere a estas
protenas sua atividade biolgica.
4) Estruturas quartenrias: quando as protenas apresentam duas ou mais cadeias
polipeptdicas a estrutura quartenria o ltimo nvel estrutural da protena. Esta estrutura
caracterizada pela interao de cadeias laterias de aminocidos de cadeias polipeptdicas diferentes.
2.1.2. Estrutura tridimensional da protena GlnB-Hs
A protena GlnB uma protena globular que faz parte da famlia de protenas do tipo PII
[12].
8
-
As protenas da famlia PII so encontradas em bactrias, arqueas e plantas e auxiliam na
coordenao do metabolismo de nitrognio, carbono e energia controlando a atividade de protenas
e enzimas envolvidas nas respostas celulares a estes sinais.
GlnB uma protena transdutora de sinal envolvida na regulao da atividade das protenas
relacionadas com a utilizao de fontes alternativas de nitrognio [12] em muitas bactrias, incluindo
a Herbaspirillum seropedicae [13].
H. seropedicae uma bactria gram-negativa, diazotrfica que foi isolada da rizosfera de
gramneas, razes de milho, sorgo e arroz e de caules e folhas de diferentes culturas de cana-de-
acar, bananeira e abacaxizeiro [16, 17, 18].
Sua estrutura tridimensional foi determinada por difrao de Raios-X [14]. As protenas GlnB-
Hs so homotrmeros de 36 kDa e cada monmero formado por um ncleo que contm um duplo
motivo que bem conservado entre as protena da famlia PII (Figura 2.3).
As maiores diferenas estruturais so observadas nas 3 alas que se estendem a partir deste
ncleo: as alas T, B e C. A ala B contm o motivo Walker A (GXGKX) que responsvel pela ligao
a nucleotdeos (Fig. 2.3). A ala T, em geral, contm o resduo Tyr51 ou Ser49 que em alguns
organismos, podem sofrer modificaes ps-traducionais por uridililao ou fosforilao,
respectivamente. A ala C-terminal que pode apresentar estrutura do tipo -turn ou hlice 310.
Figura 2.3: Diagrama do trmero da protena GlnB de H. seropedicae.
As folhas do motivo esto alinhadas no interior da cavidade central e as -hlices
situam-se na periferia da protena. O interior da cavidade central hidrofbico. Entre os monmeros
formam-se trs cavidades laterais que so constitudas majoritariamente por aminocidos
hidroflicos.
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2.1.3. Propriedades inicas das protenas
As propriedades inicas das protenas, determinadas primeiramente pelas cadeias laterais dos
aminocidos, so dependentes do pH e da fora inica da soluo que contm a protena.
Quando h equilbrio entre as cargas negativas e positivas dos grupamentos inicos de um
aminocido ou de uma protena, a carga lquida da molcula zero e o valor de pH em que isso
acontece conhecido como ponto isoeltrico, pI. Abaixo ou acima do pI, as protenas possuem
cargas positivas ou negativas na superfcie, interagindo eletrostaticamente uma com as outras.
A adio de sal na soluo comprime a camada de solvatao das protenas e diminui a
interao entre as mesmas. Conforme a concentrao de sal na soluo vai aumentando, mais
molculas do solvente associam-se aos ons da soluo. Como resultado, menos solvente fica
disponvel para participar da camada de solvatao das protenas, expondo padres hidrofbicos na
superfcie da protena.
Em uma concentrao baixa de sal os biopolmeros estaro em um estado mais relaxado e
expandido na soluo, fornecendo maior potencial de ligao para os stios [19]. Conforme a
concentrao inica aumenta o polmero fica mais compacto e comprimido, formando um denso
ncleo e fornecendo uma menor possibilidade de interao [19]. Assim, quanto mais condensada a
estrutura da biomolcula em alta concentrao inica mais fraca a ligao com a superfcie, devido a
menores foras de adeso com o substrato.
2.1.4. Propriedades inicas da protena GlnB-Hs
A face inferior do trmero, por conveno, a face que possui a volta C e contm resduos
carregados negativamente (Figura 2.4-a e 2.4-d). A outra face (face superior) da protena
positivamente carregada (Figura 2.4-c e 2.4-f). As cargas positivas so localizadas na face lateral da
protena, ao redor da volta B (Figura 2.4-b e 2.4-e).
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Figura 2.4: Estado de cargas (a-c) e superfcie molecular (d-f) da protena GlnB-Hs. a) e d) face inferior, b) e e)
face lateral e c) e f) face superior [Adaptado de 20]. Imagem e conveno de cores (RASMOL).
As cargas de valor mais baixo (negativa) passam do vermelho at o azul, valor mais alto
(positiva) (RASMOL) [20]. O azul claro corresponde volta B, onde esto concentradas as cargas
positivas.
A superfcie molecular da GlnB-Hs (Figura 2.4-d, 2.4-e e 2.4-f) mostra a distribuio de cargas
na superfcie do trmero, na qual os resduos cidos da cadeia lateral esto representados em
vermelho, os resduos bsicos em azul e os demais em branco. Os resduos hidrofbicos esto
situados preferencialmente no interior da protena (branco), entre as folhas e nas -hlices, e os
resduos polares encontram-se na superfcie da protena. A face inferior apresenta uma maior
concentrao de cargas negativas, a face superior um equilbrio na distribuio de cargas e na lateral
observa-se uma maior quantidade de cargas positivas, devido presena da volta B.
Desta maneira, as protenas apresentam diversidade estrutural e de distribuio superficial
de cargas o que favorece processos de adeso em substratos slidos. Os processos de adeso
envolvem tanto cintica de ligao quanto rearranjos estruturais de protenas. Atualmente, vrios
estudos procuram medir, prever, controlar e entender a conformao de protenas, superestrutura e
os detalhes cinticos das interaes destas biomolculas com a superfcie [1, 2, 3, 4].
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2.2. Formao de filmes finos proticos sobre substratos slidos Adsoro de protenas
Adeso de protenas em superfcies realmente um fenmeno comum, em qualquer interface
slida que as protenas entrem em contato muito provavelmente estas aderiro. O estudo da
adsoro de protena tem como objetivo primrio entender o comportamento destas biomolculas
depositadas na superfcie. Assim, os dados experimentais contem tipicamente informaes
macroscpicas resultante do comportamento individual de uma ou vrias protenas. Neste ponto o
desenvolvimento de modelos que descrevam matematicamente um dado experimental pode
desvendar ou confirmar detalhes do processo de adsoro. Entretanto, modelos so restritos aos
limites experimentais nos quais suas hipteses podem ser testadas e a generalizao para outros
sistemas deve ser feitas com cautela.
Muitas substncias adquirem uma superfcie carregada eletricamente quando colocadas em
contato com um meio aquoso [8, 9, 21, 22]. A estabilidade da disperso coloidal sensvel a adio
de eletrlitos e a superfcie carregada das partculas coloidais. As superfcies podem ficar carregadas
eletricamente por meio de vrios mecanismos, tais como [9]:
1) Ionizao de grupos de superfcie. Dissociao de grupos cidos e bsicos de xidos
resultando em cargas negativas e positivas, respectivamente;
2) Dissoluo diferencial dos ons de superfcie de cristais moderadamente solveis. Por
exemplo, dissoluo preferencial de ons de Ag em relao a halogenetos de prata;
3) Substituio isomrfica. Argilas podem trocar ons adsorvidos ou estruturais com um de
menor valncia, produzindo uma superfcie negativamente carregada;
4) Superfcies de cristais carregados. Pode acontecer quando um cristal quebrado e
superfcies com diferentes propriedades so expostas;
5) Adsoro especfica de ons. Adeso especfica de ons de surfactantes.
A presena da eletroneutralidade intuitiva, pois no h distribuio espacial preferencial
dos ons na soluo. O movimento Browniano suficiente para criar uma homogeneidade na
distribuio dos ons na soluo [9].
Entretanto, quando a superfcie colocada em contato com o lquido que possui propriedades
polares e na ausncia de reaes qumicas, uma superfcie carregada se formar [8, 9, 21]. Este
aparecimento do potencial eletrosttico pode ocorrer devido a diferentes mecanismos qumicos,
como a ionizao dos grupos da superfcie e a adsoro de ons especficos, por exemplo [9].
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Esta superfcie carregada afeta os ons na soluo. Os ons de cargas opostas a da superfcie
sero atrados, enquanto que os de mesma carga sero repelidos. Este fenmeno ocorre para a
neutralizao da superfcie carregada. A regio prxima a superfcie slida na qual h a redistribuio
de ons livres na soluo devido aos ons na superfcie d origem a chamada dupla camada eltrica
(DCE) [9, 23, 24, 25]. A Figura 2.5 apresenta um esquema da DCE.
Figura 2.5: Desenho esquemtico da dupla camada eltrica formada na interface da superfcie carregada em
contato com um lquido inico e a correspondente distribuio do potencial eltrico vs a distncia d da
parede. s representa o potencial negativo da superfcie, i corresponde camada interna composta por co- e
contraons e d referente camada externa composta somente por contraons hidratados. A distncia
caracterstica da camada de difuso dada pelo comprimento de Debye (1/k) [Adaptado de 25].
Como representado na Figura 2.5, a carga da superfcie balanceada pelo acmulo de um
nmero igual de cargas opostas que podem estar tanto ligadas fisicamente superfcie e imveis
para formar a chamada camada de Stern (camada interna) como podem estar presentes na
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atmosfera difusa acima da superfcie, com os ons em rpidos movimentos para dentro e fora da
camada de Stern, conhecida como camada de difuso [9, 21,23].
Os ons da camada de difuso podem mover-se para dentro e fora da dupla camada eltrica
para a soluo. A camada difusa expande-se a uma distncia na ordem do comprimento de Debye
(1/), que depende somente das propriedades da soluo eletroltica e no das caractersticas da
superfcie carregada [26]
= ( ci e
2 zi2
m 0KTi )
1/2 (2.1)
em que ci a concentrao de ons na soluo, e a carga do eltron, z a valncia do on, 0 e m
so a permissividade dieltrica do vcuo e do meio,respectivamente, K a constante de Boltzmann
e T a temperatura do sistema. O potencial atravs da camada difusa decresce exponencialmente.
Desta forma, a capacidade de um on em determinar a espessura da dupla camada eltrica
depende, principalmente, de sua valncia e de seu tamanho (que influencia em sua polarizabilidade e
facilidade em ser hidratado).
H um equilbrio da distribuio inica com a camada difusa, permitindo o uso da
distribuio de Boltzmann para relacionar a concentrao inica com o potencial eletrosttico [9]. A
importncia do potencial eletrosttico ao alcance da DCE vem da fora de corpo, que nesta escala
no pode ser negligenciado. Para achar a fora de corpo efetiva exercida pela DCE, a distribuio dos
ons na regio da dupla camada deve ser encontrada [21]. Sabendo-se que a distribuio inica de
uma certa espcie segue a distribuio de Boltzmann e dada por [9, 21]:
ci = ci exp(zi e
KT) (2.2)
em que ci a concentrao inica das espcies i, ci a concentrao inica no estado neutro
( = 0), zi a valncia dos ons, e a carga do eltron, o potencial eletrosttico da distribuio
da parede, K a constante de Boltzmann e T a temperatura absoluta.
A densidade de carga inica i afetada somente pelas cargas da parede dada por [9, 21]:
i = 2. e. zici . sinh(zi e
KT) (2.3).
A distribuio do potencial eletrosttico da DCE pode ser achada atravs da relao de
Poisson
d2
dy 2=
i
m (2.4)
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substituindo a eq. (2.3) na (2.4) e para uma fina DCE o termo hiperblico fica reduzido ao primeiro
termo da expanso de Taylor (aproximao de Debye-Hckel), ento temos que [9, 21]
d2
dy 2= k. (2.5).
Uma propriedade importante da DCE o potencial eletrosttico no plano de cisalhamento
imaginrio, chamado de potencial zeta, denotado por . Este corresponde ao plano que separa as
parcelas de fluido que se movem em direes opostas em fenmenos fsicos da camada fixa (camada
de Stern) [8, 25].
Uma interface formada entre duas fases distintas, geralmente, possuem uma energia de
superfcie maior que a fase da soluo. Como resultado, esta interface apta para ser
termodinamicamente estabilizada adsorvendo qualquer substncia que difira das molculas do
solvente.
Como as protenas so, geralmente, molculas carregadas em solues aquosas, a presena
destas duplas camadas eltricas com seus campos eltricos associados influenciar na interao com
o substrato [23].
As condies nas quais os experimentos de adsoro so realizados possuem uma influncia
decisiva no comportamento e arranjo final da protena aderida.
A construo da interface substrato-protena deve respeitar as exigncias: a imobilizao na
superfcie da protena com estrutura tridimensional estvel e preparo da amostra mantendo o
ambiente apropriado para evitar ou minimizar mudanas conformacionais [27, 28].
Sendo assim, fatores como propriedades das protenas, as caractersticas da superfcie do
substrato, a preparao da soluo de protena (e.g. concentrao de molculas, pH, concentrao
inica, surfactantes), mtodo de deposio da soluo, condies ambientes, tais como temperatura
e umidade e os limites de medida do meio de anlise do filme obtido devem ser levados em
considerao no preparo de um filme protico.
Parmetros externos como temperatura, pH, concentrao inica e composio do tampo
determinam o estado de equilbrio e a cintica de adsoro das protenas atravs do controle de
cargas na soluo que podem modificar o estado de equilbrio estrutural da protena [29, 30, 31]. A
estabilidade da disperso coloidal sensvel adio de eletrlitos e a carga de superfcie das
partculas dispersas.
Com relao s propriedades das protenas, a carga, dimenses, estabilidade da estrutura,
composio de aminocidos e conformao so fatores que podem afetar a quantidade adsorvida
[30, 31]. A estabilidade estrutural da protena de particular importncia devido possibilidade de
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existir um ou mais estados de adsoro, diferindo em energia de adsoro. A complexa estrutura
pode ser decomposta em domnios individuais exibindo propriedades especficas como
carregado/no carregado ou polar/no polar [30].
Interaes protena/superfcie so influenciadas pelas propriedades da biomolcula e da
superfcie do substrato. Caractersticas da superfcie incluindo a energia de superfcie, polaridade,
carga e morfologia devem ser levadas em considerao [29, 30]. A escolha do substrato
determinada pelo contexto do projeto cientfico e pela tcnica experimental utilizada, tais como a
transparncia tica, condutividade eltrica ou planicidade da superfcie. Comumente utilizada a
modificao qumica do substrato para ampliar seu uso em determinadas tcnicas [29, 30].
Apesar da espessura da camada adsorvida ser geralmente considerada igual a uma
monocamada, o detalhe morfolgico das estruturas formadas depende do mtodo de deposio. Os
mtodos de deposio variam em tempo de incubao, tempo de evaporao do solvente e difuso
molecular que podem induzir modificaes no filme [29].
A chegada da protena na interface direcionada por difuso, interaes hidrofbicas
eletrostticas, ganho de entropia das molculas do solvente ou pela modificao da concentrao de
ons na soluo [28, 30]. Em contato com a superfcie do slido os componentes da soluo de
protena, na ausncia de reaes qumicas, formaro uma superfcie carregada e esttica resultante
de diferentes mecanismos qumicos, tais como ionizao de grupos de superfcie, adsoro de ons
especficos na superfcie e do movimento aleatrio das molculas [23].
O modo mais simples de fixar uma protena na superfcie atravs da adsoro, em que foras
atrativas fixam as molculas na superfcie [32]. Pode existir uma grande variedade de foras fsicas
atuantes na interface protena-substrato durante a adsoro, tais como foras eletrostticas, foras
capilares, interaes hidrofbicas ou polares, foras de van der Waals, foras Coulombianas, foras
cido-base de Lewis, entropia conformacional e hidratao [2, 32, 33].
Na adsoro, geralmente, h falta de especificidade, estequiometria e fora direcional das
ligaes covalentes [33]. Pensando desta maneira, os tomos continuam com suas distribuies de
cargas inalteradas, apenas com uma perturbao, e mesmo assim so fortes o suficiente para manter
arranjos atmicos e moleculares estveis em slidos e lquidos em temperatura ambiente [33].
Protenas so molculas complexas e assimtricas, no se comportam como partculas rgidas
simtricas que adsorvem/desorvem da interface. Quando a forma da protena estimada retangular
com dimenses moleculares de a x b x c, geralmente so considerados dois tipos de configurao
para a molcula adsorvida, i. e., uma atravs do eixo longo (unio final com final) e outra pelo eixo
menor (unio lado-a-lado) perpendicular a superfcie (Figura 2.6).
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Figura 2.6: Diagrama das possveis orientaes de adsoro para uma protena retangular de dimenses a x b x
c em relao s demais protenas.
Protenas podem adsorver em duas ou mais orientaes distintas. Uma simplificao e uma
reviso esquemtica de alguns modelos cinticos mais importantes desenvolvidos esta presente na
figura 2.7.
Figura 2.7: Resumo dos modelos cinticos de adsoro. Um desenho esquemtico de cada mecanismo de
adsoro [Adaptado de 30].
O modelo mais simples de adsoro o de Langmuir que leva em considerao a adsoro e
desoro de partculas em stios distintos da superfcie (Fig. 2.7-A) [34, 35]. Uma das maiores
desvantagens do modelo de Langmuir foi sanada pelo desenvolvimento do modelo de adsoro
randmica sequencial (random sequencial adsorption, RSA) que leva em considerao a adsoro das
protenas da soluo em stios de ligao aleatrios com proibio de um nmero de stios por
ocupao ou por restrio da vizinhana (Fig. 2.7-B) [36, 37].
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McGuire et. al 1995 [38] propuseram um modelo de dois estados no qual as protenas
poderiam adsorver em um estado reversvel ou irreversvel na superfcie, chamado de modelo de
transio (Fig. 2.7-C). Dois mecanismos de adsoro so concebveis: um em que todas as protenas
devem inicialmente adsorver em um estado reversvel e pode subsequentemente mudar para um
estado irreversvel. O outro uma adsoro paralela das protenas em ambos os estados.
Uma extenso do modelo de transio foi proposta por Szllsi et al. 2004 [39] pela
introduo de um nmero indefinido de diferentes estados que a protena pode adsorver,
aumentando a afinidade com a superfcie (Fig. 2.7-D). A transio de estados entre molculas
vizinhas na superfcie permitida, superando a limitao que somente duas conformaes distintas
de protena so possveis.
O modelo desenvolvido Wahlgren e Elofsson implementa explicitamente a interao lateral
entre as protenas adsorvidas (Fig. 2.7-E) [40]. O modelo inclui a adsoro de dois tipos de
monmeros com diferentes resistncias de desoro e a adsoro de dmeros que podem deslocar
monmeros pr-adsorvidos na superfcie. A transio dos monmeros da soluo e aderidos so
linearmente dependentes da concentrao de dmeros presentes no substrato.
Wertz e Santore apresentaram dois modelos simples denominados de modelo de
deslocamento e rolamento (displacement and rollover model) que pode explicar tanto o efeito de
saturao que frequentemente ocorre na cintica de adsoro de protenas (Fig. 2.7-F) [34]. O
modelo de deslocamento a princpio anlogo ao efeito Vroman (relacionado com o tamanho das
protenas, as de menor peso molecular e de menor superfcie ativa adsorvem antes), exceto que s
h uma espcie de protena. Esta protena adsorvida rpida e fracamente superfcie na unio final
com final e, lentamente vai sendo adsorvida mais fortemente com a lateral. Como consequncia, no
estado de no equilbrio (inicial), a superfcie esta revestida com protenas unidas pelas
extremidades. A longo prazo, as protenas unidas lado-a-lado sero predominantes na superfcie,
conforme a sua afinidade com a superfcie aumenta e sua taxa de desoro diminui.
Em contraste com o modelo de deslocamento, o modelo de rolamento permite a transio
de protenas adsorvidas unidas pelas extremidades para aquelas unidas lado-a-lado, sendo que a
adsoro direta pela lateral no possvel [34].
Um modelo que implementa elementos de praticamente todos os modelos acima foi
desenvolvido por Rabe el al. 2007 [41]. O modelo contm 3 tipos diferentes de estados adsorvidos,
um estado inicial irreversvel, um estado intermediria reversvel e um final irreversvel (Fig. 2.7-G).
Inicialmente, enquanto a superfcie esta vazia ou parcialmente coberta, as protenas na soluo
adsorvem na superfcie exclusivamente pelo estado irreversvel. A transio entre o estado inicial e
intermedirio um resultado da unio lado-a-lado entre as protenas e acontece quando um
revestimento crtico da superfcie atingido. Protenas no estado intermedirio passam por mais
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uma transio at o estado final. Esta transio muito mais lenta e envolve algum rearranjo
conformacional. O revestimento dependente das primeiras transies implica que um grande
nmero de protenas adsorvidas abruptamente muda sua afinidade com a superfcie de irreversvel
para reversvel.
O modelo proposto por Minton descreve o crescimento dos agregados bidimensionais de
protena na superfcie (Fig. 2.7-H) [42]. Neste modelo cada ligao de i-mero (i = mono, d, tri, etc)
com a superfcie tem a tendncia especfica de atrair mais protenas, aumentando os agregados. As
protenas so adsorvidas como espcies individuais na superfcie, as quais podem difundir e unir-se a
agregados pr-existentes ou podem se depositar diretamente na borda do agregado bidimensional.
Mais tarde, Rabe et al. 2008 [43] usaram as ideais chaves de Minton em um novo e
simplificado modelo de rastreamento (Fig. 2.7-I). Foi sugerido que a aproximao das protenas da
soluo so atradas verticalmente para a superfcie devido sobreposio das foras eletrostticas
das protenas pr-adsorvidas na superfcie. Na direo lateral para a superfcie, entretanto, a
distribuio das cargas das protenas pr-adsorvidas e das protenas que esto sendo adsorvidas leva
a uma repulso. A soma de todas as interaes eletrostticas leva a uma adsoro guiada pelas
outras molculas j adsorvidas. Este mecanismo necessariamente leva a uma formao de reas que
contm uma maior e menor densidade de molculas.
A adsoro de protenas em superfcies hidroflicas neutras (Figura 2.8) tende a ser
relativamente fraca, enquanto que adsoro de protenas em superfcies hidrofbicas forte e
parcialmente irreversvel [44]. Adsoro em superfcies carregadas depende da carga da protena, o
pH e a concentrao inica da solu
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