universidade de são paulo escola de educação física e esportes – ribeirão preto leonardo r....

Universidade de São PauloEscola de Educação Física e Esportes –

Ribeirão Preto

Leonardo R. Silveira

EFEITO DA ATIVIDADE FÍSICA NA REGULAÇÃO

DA EXPRESSÃO GÊNICA

HistóricoPrimeiras evidências de que o DNA é o material genético:

• F. Miescher, 1868- extraiu DNA do núcleo celular pela primeira vez (nuclein).

• O. Hertwing, 1884 - demonstrou que a fertilização de ovos dependia da união de dois núcleos - um do óvulo e outro do esperma

–Hertwing suspeitou que “nuclein” fosse o material da hereditariedade. Hipótese que caiu em esquecimento durante os próximos 60 anos.

• O. Avery, C. MacLeod e M. MacCarty, em 1944 - demonstraram em experimentos com Pneumococcus que o DNA é o material genético

1950:

-Não conhecia a seqüência de amino ácidos de

nenhuma proteína.

- Não sabia que os amino ácidos numa proteína

permanecem arranjados numa seqüência

exata.

Nature - 25 de abril de 1953“A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid”

J. Watson and W. Crick• “We wish to suggest a structure for the salt of

deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest….”

1960: Foi definida a primeira estrutura tridimensional

de uma proteína, definida por cristalografia.

Hoje conhecemos a seqüência primária de amino ácidos de

centenas de milhares de proteínas a partir dos genes que as

codifica.

A informação genética consiste

primariamente em instruções para fazer

proteínas!

A informação genética de todos os animais é escrita na

linguagem universal das seqüências de DNA, e a

seqüência de DNA pode ser obtida por técnicas

bioquímicas simples, que hoje praticamente todos os

laboratórios de pesquisa podem dominar.

cytosine

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

O DNA sempre tem duas fitas de ácidos nucléicos enroladas em hélice

• As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por

PONTES DE HIDROGÊNIO

• Para que o pareamento ocorra, a DUAS FITAS têm que

ser ANTIPARALELAS

• O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio

• O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio

O DNA é uma molécula com polaridade:uma extremidade 5’- P e

uma extremidade 3’-OH

• A SEQÜÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO

5’ 3’

Interações fracas entre macromoléculas (interações de curta distância)

• Ligações de van der Waals

• Ligações eletrostáticas

• Ligações (pontes) de Hidrogênio

• Interações Hidrofóbicas

Acetil -CoA

TCA

Cycle

GLUT

Glucose

G-6-P

Pyruvate Lactate

Extrac

Cytosol

LactateGlucose

Acetil -CoA

TCA

Cycle

GLUT

Glucose

G-6-P

Pyruvate Lactate

Extrac

Cytosol

LactateGlucose

CPT-I

FA-CoA - Oxid

CPT-II

CAT

FFAT

FFA

Facyl-CoA

CPT-I

FA-CoA -

CPT-II

CAT

FFAT

FFA

Facyl-CoA

NAD FAD

NADH FADH2

I IIIII IVe-

e- e- e-

F0

++++

+ + + + + + + + + + + +

- - - - - - - - -(Δ )

(Δ pH)

AD

P/A

TP

Tra

nsp

orte

r

-Muscle activity

-Active transporte

-Biosynthesis

-Metabolism

NAD FAD

NADH FADH2

I IIIII IVe-

e- e- e-

F0

++++

+ + + + + + + + + + + +

- - - - - - - - -(Δ )

(Δ pH)

AD

P/A

TP

Tra

nsp

orte

r

-Muscle activity

-Active transporte

-Biosynthesis

-Metabolism

O2 H2OO2 H2O

H+ H+H+

H+

H+ H+H+

H+

ADP+Pi

ATP

ADP+Pi

ATP

FFA

FFA

Fatty acyl-CoA

CPTI

CPTII

translocase

acyl-CoA-oxidation

FATp GT

Glucose-6P

Fructose-6P

Fructose-1,6-bi-P

PFK

Glucose

Pyruvate

cytosol

M. matrix

Lactate

Lactate

HK

Acetyl-CoA

oxaloacetate citrate

isocitrate

2-oxoglutarate

Succinyl-CoA

succinate

fumarate

malate

(-)

(-)

(-)

PC

(-)

FFA

Randle and Newsholme, Lancet, 1963

Malonyl-CoA

Acetyl-CoA(-)

PDH

ACC

leve

Con

sum

o d

e gl

icog

ênio

Glicose

ÁCIDOS GRAXOS

moderada intensa

Oxi

daç

ão d

e gl

icos

e e

AG

Modification in gene expression in stimulated and contralateral soleus muscle isolated one hour after electrical stimulation.

Gene bank accession

number

Gene name ES/ Ct

CL/ Ct

Metabolism

M22413 Carbonic anhydrase 3 8,5 1,3 M31788 Phosphoglycerate kinase 1 5,7 1,2 U73525 Thioredoxin 2 19,5 6,4 Y00404 Superoxide dismutase 1 23,9 5,5 M11670 Catalase 14,0 8,0

X56600 Superoxide dismutase 2 31,8 14,3 D12770 Solute carrier family 25 (mitochondrial adenine nucleotide

translocator) member 4 7,4 1,3

U09540 Cytochrome P450, subfamily 1B, polypeptide 1 4,1 1,7 M21208 Cytochrome P450, subfamily 17 13,6 6,9 L03294 Lipoprotein lipase 7,7 2,9 J04171 Glutamate oxaloacetate transaminase 1 6,7 1,4 M18467 Glutamate oxaloacetate transaminase 2 6,6 3,0 J05405 Heme oxygenase 2 6,2 3,5 D30647 Acyl-Coenzyme A dehydrogenase, very long chain 4,5 1,7 U22424 Hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 2 17,1 7,7 M23995 Aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A4 8,6 4,7 X15958 Enoyl Coenzyme A hydratase, short chain 1 24,7 9,4 J05029 Acetyl-Coenzyme A dehydrogenase, long-chain 15,7 7,0 D30035 Peroxiredoxin 1 20,6 6,1 X12367 Glutathione peroxidase 1 6,2 1,1

Muscle & Nerve, 2009 (in press)

• Eletroforese BidimensionalPROTEOMA

Exercício Físico

Transcrição Gênica

Adaptações celulares

Neufer PD and Dohm GL. Exercise induces a transient increase in transcription of the GLUT-4 gene in skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol 265: C1597–C1603, 1993.

Transportadores de glicose

Silveira LR et. al., J. Cell Physiol. 2008

Enzima citrato sintase

Pilegaard et al., 2000

Efeito agudo do exercício na transcrição gênica

Efeito agudo do exercício na transcrição de genes envolvidos com o metabolismo celular

Free Radical in Biology and Medicine, 43(3):353-61, 2007.

European J. Appl. Physiol., 102(1):119-26, 2007.

Efeito agudo do exercício na transcrição de genes envolvidos com o metabolismo celular

Pilegaard et al., 2002

Efeito da disponibilidade de nutrientes na transcrição gênica

Efeito da elevada disponibilidade de lipídios

Silveira et al., 2008

Adaptações ao exercício Crônico

Puigserver P & Spiegelman BM (2003). Endoc Reviews 24, 78-90.

PGC- 1 (peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)- coactivator 1)

Sinalização intracelular

Hood DA et al., 2001

Hood DA et al., 2001

Narkar et al., Cell, 2008

AICAR

EFFECT OF ROS ON BASAL GENE EXPRESSION

Efeito da contração muscular e do tratamento antioxidante

EFFECT OF ROS INDUCED BY CHRONIC MUSCLE CONTRACTION AND ANTIOXIDANTS

TREATMENT ON GENE EXPRESSION

Efeito acumulativo da transcrição sobre expressão de proteína

60

80

100

1 2 3 4

20

40

Dias de Treinamento

% a

cim

a d

o c

on

tro

le

RNAm

60

80

100

1 2 3 4

20

40

Dias de Treinamento

% a

cim

a d

o c

on

tro

le

RNAm

60

80

100

1 2 3 4

20

40

Dias de Treinamento

% a

cim

a d

o c

on

tro

le

RNAm

80

100

1 2 3 4

20

40

Dias de Treinamento

% a

cim

a d

o c

on

tro

le

RNAm

80

100

1 2 3 4

20

40

Dias de Treinamento

% a

cim

a d

o c

on

tro

le

1 2 3 4

20

40

Dias de Treinamento

% a

cim

a d

o c

on

tro

le

20

40

Dias de Treinamento

% a

cim

a d

o c

on

tro

le

RNAm

proteína

Silveira, L. R. ; Pilegaard, H. ; Kusuhara, K. ; Curi R ; Hellsten, Y. BBA ( Molecular Cell Research) 1763:969-976, 2006.

Estresse oxidativo e sistema antioxidante em músculo de animais treinados

Am J Physyol, 2002

Intracellular sources of ROS and RNS in skeletal muscle

Arginine + O2 Citruline + NO

PMN

O-2 SOD H2O2

H+

·OH

O-2

H2O2

ONOO-

NO

ONOO-

H2O2

·OH

O-2

.OH

HOCl

MPO

SOD

H2OCAT

H2O

GSH-PX

intracellular extracellular

ONOO.

“Fe2+”“Fe2+”

“Fe2+”

Cl- + H2O2

O-2

O2

Lipid peroxidation

Gene expression

antioxidants

(+)

(-)Ca++

Proteinoxidation

XO

Arachidonic acid

mitochondria

Peroxysome NADPH

oxidase

XO

Arq. Bras.Endoc.Metab. 48(6):812-822, 2004

NOS

Hipótese

Alteração do balanço redox afeta o metabolismo de ácido graxo e glicose

no músculo esquelético durante a contração.

RAT SKELETAL MUSCLE CELL CULTURE

Produção de H2O2 em Células Musculares Esqueléticas

Controle NAC (1 mM)0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

***

Incubação com Amplex + HRP

Flu

ore

scê

nci

a

*

In vitro ROS detection

2O

(Flu

ore

scê

nc

ia)

GPX/GSH/CAT

*

0

50

100

150

200

control H2O2

#

0

20

40

60

80

100

130

Basal stimulated

p < 0.05

p < 0.01

p < 0.01

Control

NAC

GPX + GSH + CAT

Flu

ore

scen

ce

* ** *

#

Efeito do tratamento antioxidante na expressão e no conteúdo de GLUT4 em condição basal

0

50

100

Control NAC

NAC

GL

UT

- 4/

GA

PD

H

mR

NA

(%

) *

0

10000

20000

30000

não estimulado

Un

ida

de

s

control NAC

*

46 kDa -

A.U

Metabolismo de glicose

Expressão do GLUT4 mediada por contração

Control

Stimulated

NACStimulated + NAC

Controle

Controle

12 h

oras

Controle0

25

50

75

100

125

150

175

3h 12h 24h

p <0.05 p <0.05

*

GL

UT

- 4/

GA

PD

H m

RN

A (

%)

GL

UT

- 4/

GA

PD

H m

RN

A (

%)

0

50

100

150

p <0.05

Sem tratamento enão estimulado

H2O2

Control H2O2

*

3h

Efeito da contração no conteúdo de GLUT4

Sem NAC

NAC

Controle H2O20

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Basal Stimulated

0

10000

20000

30000

p <0.05

Un

ida

de

s

* #

Control

Basal H2O2

*

46 kDa -

46 kDa -

Transporte de glicose

0.0

0.1

0.2

0.3

Basal Stimulated 2 O 2

p <0.05

p <0.05p <0.05

Control NAC

Cap

taçã

o d

e

2-d

eso

xi-[

2.6-

3H

]-D

-glic

ose

(µm

ol/m

g d

e p

rote

ína)

H2O2

p <0.05

Expressão da HK-II mediada por contração

NAC

0

50

100

150

Control

Stimulated NAC

HK

II/G

AP

DH

mR

NA

(%

)

0

25

50

75

100

125

150

175

Sem tratamento e

3h 12h 24h

**

Stimulated + NAC

Control H2O2

3h

Atividade da HK H

ex

ok

inas

e(n

mo

l/min

/mg

de

pro

tein

a)

Control

NAC

0

1

2

3

4

Basal Stimulated

p <0.05

p <0.05

H2O2

p <0.05

Expressão da PFK-I mediada por contração

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Control H2O20.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.3

*

3h 12h 24h

PF

K/G

AP

DH

mR

NA

(%

)

Control

Stimulated

Stimulated + NAC

*

3h

Atividade da PFKP

ho

sph

ofr

uct

ok

ina

se

(nm

ol/m

in/m

g)

Control

NAC

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Basal Stimulated H2O2

*

***

Lactate

Control

NAC

(µm

ol/µ

g p

rote

in)

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

Basal Stimulated H2O2

***

*

Expressão da CPT-I

Control NAC0

50

100

150

200

250

*

CP

T-I

/GA

PD

H m

RN

A (

%)

Metabolismo de ácido graxo

Conteúdo de CPT-I

0

10000

20000

30000

AU

Control NAC

88 kDa

Expressão de CPT-I mediada por contração

0

50

100

150

200

250

0

50

100

NAC

Control

Stimulated NAC

Stimulated + NAC

3h 12h 24h

CP

T-I

/GA

PD

H m

RN

A (

%)

***

*

P > 0.05

Basal H2O2

Efeito da contração muscular no conteúdo de CPT-I

NAC

Control

0

10000

20000

30000

AU

*

88 kDa -

Basal Stimulated

*

* P < 0.05 compared to basal

0

10000

20000

30000

AU

88 kDa -

Basal H2O2

P >0.05

Oxidação de palmitato

0.00

0.05

0.10

[14 C

O2]

(um

ol/m

g p

rote

in)

prod

ucti

on

Control

NAC

Basal Stimulated H2O2

* * *#

Músculo

Experimentos in vivo

-30 0 30 60 90 120 min

- Anestesia - Cânula

Infusão - salina - AGCL

Est. Elétrico (+) Est. Elétrico (-)

S1 S4 S5S2 S3

preparação

Contrações Intensas

Efeito do tratamento antioxidante na força de contração muscular

Gra

ma-

forç

a/kg

10 20 30 40 50 600.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Tempo (s)

10 20 30 40 50 600.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

Tempo (s)

Control

NAC

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

*

Gra

ma-

forç

a/kg

Control NAC

Força de contração máxima

Resistência à Fadiga

NAC

Control

0 10 20 30 40 50 60 7050

75

100

125

Time (min)

Fo

rce

(%)

*

***

Detecção de EROs em músculo incubado em Krebs (95% O2 + 5% CO2)

Controle Contração

0

50

100

150

200

250

*

#

*

Flu

ore

scên

cia

po

r g

ram

ad

e p

eso

mu

scu

lar

(%

do

co

ntr

ole

)

NAC

Control

Conclusão

leve

Con

sum

o d

e gl

icog

ênio

Glicose

ÁCIDOS GRAXOS

moderada intensa

Oxi

daç

ão d

e gl

icos

e e

AG

- Aumento ROS

- Menor atividade antiox

-Aumento Glut-4

- Aumento Enz. glicolíticas

-Captação de glicose

- Aumento de força

- Maior ativ antioxidante

- Menor produção ROS

- Aumento de CPT-I

- Aumento da -oxidação

-Aumento da resistência

Silveira LR et al. (2008) J. Cell Physiol

Doenças metabólicas

Silveira LR et. al., J. Cell Physiol. 2008

Reid & Durham. Annual NY Acad Sci 2003.

μ H+

I II III IV

H+ATP/ADP

μ H+

I II III IV

H+ATP/ADP

e-e- e-e-

e- e-e- e-e- e-e-e- e-e-e-e-e-

e- + O2 O-2

Matriz

M. Ext

O2

H+H+H+

NADH FADH2

Δμ H+

I II III IV

H+ATP/ADP

e- e-e-+ O2 H2O

Matriz

O2

Desacoplador

H+

H+H+H+

JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY 210:7–15 (2007)

2 min2 min

20 nMoles O20 nMoles O22

10.110.1

15.815.8

16.116.1

9.49.4

SMMSMM

GDPGDP

BSABSA

LipovenosLipovenos

**

Silveira LR et al., Cell Physiol Biochem, 2007

1 - Glicose Glicose

2 - Glicose Glicose + Insulina

3 - Glicose + Insulina

Glicose + Insulina 4 - Glicose + Palmítico (1mM)

5 - Glicose

Glicose + Insulina

6 - Glicose + Insulina + Palmítico

Glicose + Insulina +Palmítico

Glicose + Insulina

PRÉ-INCUBAÇÃORADIOATIVO

0 4 5

Tempo (h)

-Glicose (5 mM)

- Insulina (100uU/mL)

- Palmítico (1 mM)

Experimentos in vitro

0

1

2

3

4

5

6

7

8C

apta

ção

de

glic

ose

um

ol/g * *

*

# #

Captação de glicose

Após 4h de incubação

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

control glucose +Ins

glucose+Palmitic

acid

glucose +Ins+ palmitic

acid

glucose +Insulin (20x)

H2O

2 (n

M)

*

*

*

NADPH oxidase – P47

47 Kda -

37 Kda -25 Kda -

N N - - + +

(+) palmitate

(N) positive control

37 kda -

29 kda -

19 kda -

c c p p

(c) control

(p) Palmitic acid

6.6 kda -

Biochimica Biophysica Acta 1757:57–66, 2006.

Cell Biochem Function, 2006

Resitência à Insulina e Atividade Mitocondrial

glucose

Citrate

glucose 6-P

Pyruvate

Citrate

Isocitrate

α-Ketoglutarate

Succinyl-CoA

Succinate

Fumarate

Malate

Oxaloacetate

Isocitrate

α-Ketoglutarate

Pyruvate

Acetyl-CoA

FFA

Acyl-CoA

Acyl-CoA

CPT2

CPT1Malonyl-CoA

Malate

NADH

NAD+

acetyl-CoA

Lipid

oxaloacetate

NADPH NADP+

malate

NADHNAD+

NADH

NAD+

NAD+

NADH

NAD+

NADH

NAD+

NADH

FADH2

FAD+ET

CcME

cME

mME

NADPH

NADP+

CoA

AT

P

PDH

MDH

PC

β-o

xid

ati

on

O2-

NADPH

NADP+

Biochem Nutrition, 2009 (submitted)

3. ANAPLEROSE COMO REGULADORA DA ATIVIDADE MITOCONDRIAL E DA SENSIBILIDADE A INSULINA EM MÚSCULO

ESQUELÉTICO Josiane Miranda

2. EFEITO DA CONTRAÇÃO MUSCULAR E DO TRATAMENTO ANTIOXIDANTE NA ATIVIDADE ANAPLERÓTICA MITOCONDRIAL

E NO CONTEÚDO DOS TRANSPORTADORES DE GLICOSE (GLUT-1/4) EM CULTURA DE CÉLULAS MUSCULARES

EXPOSTAS AO ÁCIDO PALMÍTICOFelipe N Damas

1. REGULAÇÃO DA ATIVIDADE ANAPLERÓTICA NO CICLO DO ÁCIDO TRICARBOXÍLICO E SECREÇÀO DE INSULINA EM RATOS OBESOS

Cláudio C. Zoppi

PROJETOS EM ANDAMENTO

Agradecimentos- Laboratório de Fisiologia CelularDr. Rui Curi

-Laboratório de Pâncreas e Endócrino e MetabolismoDr. Everardo M CarneiroDr. Antônio C. Boschero

- Laboratório Bioenegética Dr Aníbal VercesiDra Luciane C Alberici

-Copenhagen Muscle Research CenterDra Ylva HellestenDr. Jens BangsboDra. Heriette Pilegaard

- Fapesp, Capes e CNPq.