tecnologia do dna recombinante -...

MARCADORES

MOLECULARES

Genética

•Melhoramento na agricultura até séc. XIX

“arte” e seleção inconsciente

•1900s - Descoberta dos princípios genéticos

•1920-50 - Melhoramento genético científico

•1970-80 - Utilização de marcadores genéticos

moleculares

•Marcadores genéticos são unidades herdáveis

simples

• Polimorfismo de DNA resulta acúmulo de

mutações

– pontual ou inserção/deleção

– macro-rearranjos: translocações, inversões,

deleções

• Obj: identificar polimorfismo diretamente do

DNA e associar a genes de grande ou

pequenos efeitos no fenótipo

marcadorescromossomo

Aplicações

• Genética de populações

• Análise de fluxo gênico

• Variação genética

• Seleção Natural

• Relações filogenéticas

• Mapeamento cromossômico

•Seleção assistida

•Conservação de recursos genéticos

•Importância agronômica

Histórico de Marcadores

• Hunter & Markert (1957) - marcas bioquímicas

desenvolveram isozimas em gel de amido

• RFLP por Botstein et al. (1980)

• PCR por Mullis & Faloona (1987)

• RAPD por Rafalski et al. (1990)

• SSR por Akkaya et al. (1992)

• ISSR por Zietkiewicz et al. (1994)

Isozimas

As isozimas têm sido usadas em pesquisas de

biologia evolutiva principalmente através do

estudo detalhado de um loco e as suas

variantes alélicas (alozimas) e a utilização de

muitos locos para estudos populacionais.

• herança mendeliana simples.

• codominância, penetrância completa

• ausência de pleiotropia e de interações epistáticas

• disponíveis na população apresentando grande

diversidade

• nível de polimorfismo genético detectável em

cada loco é limitado

Vantagens e desvantagens

Restriction Fragment LengthPolymorphism - RFLP

•RFLP examina diferença em tamanho de

fragmentos de restrição de DNA específicos

•Polimorfismo deriva de mutação pontual,

inserção, deleção

•Utiliza-se DNA celular total

•Requer DNA puro de alto peso molecular

Sítios de restrição

Vantagens e desvantagens

•Reprodutível

•Marcadores co-dominantes

•Simples

•Trabalhoso

•Caro

MINI-SATÉLITE OU VNTR

• Variable number of tandem repeats

•Sequências repetidas de 15 a 100pb, repetidos 50X

•Utilizado: identificação de variedades, cultivares

clones

análise de diversidade genética

paternidade

DNA Fingerprint

•VNTR – variable number of tandem repeats

DNA

Fingerprint

Teste de Paternidade

Teste de paternidade

DNA Fingerprint

RAPD

(Random Amplified Polymorphic

DNA)

Random Amplification of Polymorphic DNA - RAPD

•Amplifica sequências anônimas de DNAusando primers arbitrários

--10 bases com >50% G+C

•PCR com um único primer

•Método rápido para detecção de polimorfismos

•Marcador dominante

•Problemas de reprodutibilidade

Vantagens e desvantagens

•Rápido

•Simples

•Baixo custo

•Sem uso de radio-isótopos

•Marcador dominante

•Problemas de reprodutibilidade

•Problemas de interpretação

Microssatélites (SSR)

•Sequence-Tagged Microsatelites (STMS)

• também conhecido como microssatélite ou

Simple Sequence Repeat (SSR)

•Normalmente locus simples e multi-alélico

•Co-dominante

•Sequências de 2 a 10pb repetidas

MARCADORES MOLECULARES

DE MICROSATÉLITES (SSR)

Microsatélites• SSR – Simple Sequence Repeats

– Pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos

repetidos em tandem - Amplificados via PCR

– Classe de marcadores moleculares mais polimórficos

Sinonimias

SSR (Simple Sequence Repeats);

STMS (Sequence Tagged Microsatellites);

SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);

Onde são encontrados ???

Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)

Plantas: (AT)n

Mitocôndrias

Consistem de pequenas sequências (“sequence

motif ”) com 1 a 4 nucelotídeos de comprimento,

repetidas em tandem.

Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC

Dinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC

Trinucleotídeos TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC

Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC

Características: Altamente polimórficos e codominantes (ambos os alelos

de um indivíduo heterozigoto são visualizados)

Detecção de locos SSR (PCR)

CACACA

GTGTGT

CACACA

GTGTGT

(CA)3

(CA)3

Amostra 1 Amostra 3Amostra 2

•Mapeamento genético

•Diagnóstico de doenças

•Investigação forense

•Análise populacional

•Estudos ecológicos

•Paternidade

•Biologia da conservação

Aplicações dos Microsatélites

Como os microsatélites são formados ?

Modelos para explicar os processos mutacionais

envolvidos na formação das repetições

•Escorregões da DNA polimerase

•Crossing over desigual

Fita nascente

Fita molde

Replicação

+1 repeat -1 repeat

Slippage

Misalignment

•Altamente reprodutível e informativo

• detecção por PCR

•distribuição homogênea no genoma

•Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dosprimers

•Construção de bibliotecas genômica

• sequenciamento

•Triagem dos melhores primers

Vantagens e desvantagens

AFLP

(Amplified Fragment Length

Polymorfism)