tÉcnicas imunolÓgicas. um teste sorolÓgico pode ser qualitativo, semi-quantitativo ou...
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TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
UM TESTE SOROLÓGICO PODE SER QUALITATIVO, SEMI-QUANTITATIVO OU QUANTITATIVO ...
• Qualitativo: + ou – • Semi-quantitativo: amostra testada foi diluída
– a maior diluição que apresentar reação é o seu título (ex. + ate a diluição 1:320)
• Quantitativo: informa quantidade absoluta do material detectado.
IMPORTANTE : Finalidade do teste - 1.Triagem 2.Diagnóstico
?
Alguns fatores que afetam as medições das reações Ag/Ac
• Afinidade• Avidez• Taxas Ag-Ac• Reações Cruzadas
Anticorpos:• Monoclonais• Policlonais
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
• Técnicas sem uso de marcadores– Reações de Precipitação– Reações de Aglutinação
• Técnicas com uso de marcadores– ELISA– Citometria de fluxo– Imunofluorescência– Radioimunoensaio
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
• PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese
• AGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de Coombs
• IMUNOENSAIOS- Radioimunoensaio- ELISA - Imunofluorescência - Citometria de Fluxo
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
SENSIBILIDADE DE DIFERENTES TESTES DE IMUNODIAGNÓSTICO
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
ZONA DE EQUIVALÊNCIA
EFEITO PRÓ - ZONA
EFEITO PÓS - ZONA
IMUNODIFUSÃO DUPLA
Possui baixa sensibilidade ; demorado (18-24 hrs)
Utiliza uma matriz de ágar
Ag + Ac = linha de precipitação visível
Ac
Ag Ag
Ac
Ag Ag
Ac
Ag Ag
• As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação
• Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
Utilização da técnica : caracterizar antigenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imunes
• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:
• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:
Ac
• Interpretação– Diâmetro do anel é
proporcional à concentração do Ag
• Método de Mancini– Anticorpo no gel– Antígeno no poço– Vice-versa
IMUNODIFUSÃO RADIAL
Ag Concentração
Dia
met
er2
AgAgAgAg
Ac no gel
IMUNODIFUSÃO RADIAL
Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas
Fácil, baixo custoUtiliza uma matriz de ágarÉ quantitativa
IMUNOELETROFORESE
+ -
Ag
Ag
1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna
canaleta
2- Anti-soro na canaleta
canaleta
3- Difusão e precipitação
• Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
• As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.
• Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. • Ag e Ac formam arcos de precipitação.• É qualitativo• Utiliza lâminas recobertas com ágar
Útil para detectar gamopatias monoclonais, como mieloma múltiplo e a macroglobulinemia
IMUNOELETROFORESE
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
• Pode ser direta ou indireta• + sensíveis qtidade de Ac 500 vezes menorpartículas
amplificam a reação• Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-
quantitativo)
Agregação visível de partículas
EritrócitosBactériasFungoslátex
USO: Tipagem ABOTestes confirmatórios para sífilis, FR
2) Reagente (anticorpo anti A, B):
AGLUTINAÇÃO DIRETA
1) Amostra de sangue na placa teste:
Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
Partículas que apresentamdeterminantes antigênicosnaturais na sua superfície
+ Ac = Aglutinação
3) Controle negativo:
4) Mistura-se:
HemáciasBactériasProtozoários
AGLUTINAÇÃO DIRETA5) Leitura do resultado:
negativo positivo
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste);
AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas:
• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.
Aglut +
Aglut -
Ags solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias)
AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX: FATOR REUMATÓIDE
•Fator Reumatóide: Anticorpos que reconhecem epítopos presentes na fração cristalizável (Fc) da molécula de IgG. A maioria destes Acs são da classe IgM porém pode-se encontrar também Acs IgA e IgG.
•Teste: Visualização de aglutinação das partículas de látex revestidas pelo antígeno (no caso IgG humana ou de coelho)
•Interpretação: No caso de artrite reumatóide surge uma alta quantidade de FR de alta afinidade
Causas virais HBV, HCV, Mononucleose, influenza, AIDS, pós vacinação
Doenças auto-imunes
Artrite Reumatóide, Lúpus Eritematoseo sistêmico, Esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Sjörgren, cirrose biliar, hepatite auto-imune, etc
Neoplasias Após irradiação ou quimioterapia
Infecções bacterianas
Tuberculose, sífilis, hanseníase, salmonelose, endocardite bacteriana subaguda, brucelose, borreliose
Doenças parasitárias
Malária, esquistossomose, filariose, tripanossomíase
Enfermidades em que o encontro de FR é comum
TESTE DE COOMBS (Antiglobulina)
• DIRETO : Detecta Ac ligados a eritrócitos
• INDIRETO: Detecta Ac anti-eritrócitos no soro
1.Permite detectar incompatibilidade Rh - DHRN (mãe produz IgGantiRh).
2.R. medicamentosa3.R. transfusional
Teste baseado na inibição da aglutinação devido a competição com antígeno solúvel.
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.
Resultado negativo:(ausência de hCG na urina): ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.
Princípio da técnica:
• Anticorpos ou antígenos são conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiações UV, emite luz no espectro visível.
• A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um microscópio de fluorescência
• Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT).
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
IFA direta:• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes
de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele.
IFA indireta: • pesquisa de antígenos ( plasmódio em hemácia) e de anticorpos ( sífilis,
toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, doença de chagas, malária, etc)
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Treponema pallidum
Pneumocystis carinii
Tripanosoma cruzi
Giardia lamblia
• Separação de células marcadas por fluorescência;• Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou Antígenos do
Conjunto de Diferenciação (CD)• Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente.• É um teste qualitativo e quantitativo. • Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em
uma corrente através de um feixe de Laser.
CITOMETRIA DE FLUXO ( célula medida em movimento )
CD 4
CD 18
CD 125
CD 147
CITÔMETRO DE FLUXO
• SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO
• SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ.• SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS
ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.
CD4
CD8
CD20
USO
Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas Isolar populações celularesQuantidade, tamanho, granulosidade; Distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ags Tamanho celular.
APLICAÇÕES CLÍNICAS DA CITOMETRIA DE FLUXO
- Análise da subpopulação linfocítica- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas, HIV- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas- Análise de reticulócitos- Detecção de anticorpos antiplaquetários
- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)
- Avaliação imunológica de paciente transplantado
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
• O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
• O produto final ação da enzima sobre o substrato = COR• Produto final corado leitura em fotocolorímetro. • Principais tipos de ELISA: indireto, direto e competitivo.
Vantagens do ELISA:-Utiliza reagentes estáveis-Teste de alta sensibilidade-Seguros e de baixo custo-Não trabalha com radioisótopos-pode ser adaptado tanto a testes simples quanto à automação-Não depende de formação de precipitado, aglutinado, etc.
Direto = Ag Indireto = Ac
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
substrato
Qualitativos Quantitativos
Ac marcados com Enzimas
+ +Ag
Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase
DIRETO OU SANDUÍCHEINDIRETO
= COR
Ponte de corte (“ cut-off”) : é o limiar de reatividade; define o limite entre um teste negativo e um teste positivo
ESTE EXEMPLO É DE ELISA DIRETO OU INDIRETO?
CURVA PADRÃO - ELISA
RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Moléculas marcadas com isótopo ( I 125 ,I 131 ) Marcações:
I125: emite raios gama H3: raios beta
Desvantagem manipulação de isótopo radioativo.
RADIOIMUNOENSAIO
• Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas (urina ou soro de atletas), etc.
• Vantagens:– Alta sensibilidade– Permite medidas rápidas e precisas– Limiar de detecção em nanogramas e picogramas.
• Desvantagens:– Custo– Vida média dos reagentes– Risco operacional (radiação)
RADIOIMUNOENSAIO
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