técnicas de laboratorio utilizadas en el estudio de la embriología

EMBRIOLOGÍA

Rama de la biología que se ocupa delestudio del desarrollo de los embrionesanimales. Su ámbito de investigacióncomprende el desarrollo del huevofecundado y del embrión, y el crecimientodel feto.

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Un microscopio es, básicamente, un sistema óptico quetransforma un objeto en una imagen, la cual amplificadetalles característicos del objeto. Con el microscopio deluz se resuelven detalles del orden del micrón, mientras quecon el microscopio electrónico se alcanzan a resolverobjetos del orden de los angstrom.

Dentro de la familia de microscopios electrónicos, seencuentran el microscopio electrónico de transmisión(TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM); El SEMprovee información sobre morfología y características de lasuperficie, mientras que con el TEM permite observar laestructura interna y detalles ultra estructurales.

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION

Mediante el microscopio electrónico de transmisión podemosestudiar la ultra estructura de un material orgánico oinorgánico. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio demateriales no- biológicos y biológicos podemos nombrar :

•Identificación de bordes de grano e interfaces en metales.•Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.•Realización de estudios de histoquímica para identificarcompuestos específicos.•Estudios de ultra estructuras de tejidos vegetales y animales.•Reconocimiento de virus.•Estudios de citoquímica.•Estudios de estructuras moleculares.

MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM)

Mediante el SEM se estudian:•Morfología superficial de minerales, catalizadores, etc. •Electrodepósitos•Adherencia fibra-matríz en polímeros. •Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos. •Formas de cristalización de minerales. •Control de calidad de catalizadores industriales. •Morfología superficial interna de partículas poliméricas. •Morfología de tejidos u órgano animales y vegetales. •Estudio de moléculas •Reconocimiento de fósiles.

Espermatozoides bovinos.

Realización de cortes

Los tejidos encastrados en parafina o plástico son finamenterebanados (cortados) usando un dispositivo llamadomicrotomo. Hay dos tipos de microtomos más comunes:rotatorios y de deslizamiento. En los del último tipo, enbloque con la muestra permanece quieto y la cuchilla esdeslizada contra el tejido durante la brazada de corte,rebanando secciones individuales, como contraste almicrotomo de deslizamiento donde la cuchilla se mueve enrelación a la muestra, el microtomo de rotación cortarebanadas de tejido moviendo el bloque del materialencastrado contra la superfiice de una cuchilla fija. Losmicrotomos de rotación son comunes a los microscopios deluz y electrónico.

1. Cortar bloques de parafina o de elástico que conetengan una muestradel tejido cada una.2. Montar los bloques con el tejido en una matriz soporte, hecha demadera o metal, y recortar el bloque en una superficie rectangular otrapezoidal.3. Montar y ajustar el bloque sobre el microtomo.4. Preparar la cuchilla del microtomo (afila una cuchilla de acero o hazcuchillas de cristal).5. Haz secciones individuales o seriadas. Temporalmente guarda cintas (porejemplo en cajas de papel fotográfico).6. Cortar cintas de parafina que cubran el 75% de la superficie delportaobjetos para permitir la expansión de la parafina.7. Hacer flotar secciones individuales o cintas sobre agua (± 4% deformalina) en portaobjetos subbed (subbing no es necesario para cortesrealizados en plástico.8. Calentar a 42ºC menos de 15 min en una placa calefactora para relajarlas tira de secciones; entonces quitar el líquido con una pipeta oabsorbiéndolo con una toalla de papel doblada.9. Secar overnight en un horno a 42ºC para asegurarse la adherencia alportaobjetos o en microondas durante 15-30 minutos a 42ºC.

Factores que influyen en la calidad de los cortes

•Infiltración•Orientación•Rigidez•Temperatura•Humedad•Dureza del material

FIJACIÓN DE EMBRIONES

Tiene por objeto matar las células y conservarlas, hastadonde sea posible, en el estado en que se encontrabandurante la vida. Por lo tanto es un método histológicodestinado a obtener preparados duraderos que conservanla estructura morfológica y química de las células y tejidosal estado vivo y que permite realizar, posteriormente, losprocedimientos de coloración o de identificación quefacilitan el completo conocimiento de su constitucióníntima.

Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a losagentes físicos que se utilizan para tal fin.

Micrografía del embrión del cnidario

Clytia hemisphaerica fijado durante la

gastrulación en la que se aprecian las

células (rojo), los núcleos (azul) y los

cilios (verde)

Cualidades que debe tener un fijador

1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post - mortem (autolisis, desintegración, etc.)2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, colorantes, etc.)5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

Fijadores Químicos

Son los más utilizando; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y fijadores compuestos o mezclas fijadores cuando varias sustancias intervienen en su constitución.

1. Fijadores Simplesa) Formol al 10%, es el más usado. b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotisdesecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc)d) Acido ósmico al 1 ó 2 %,e) Bicromato de potasio al 3 - 5%.

2. Fijadores CompuestosEn su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno o atenuar sus defectos.a) Líquido de Fleming, mezcla cromo - osmio - acética.b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato - sublimado - acética.c) Líquido de Helly, mezcla Zenker - formold) Líquido de Bouin, mezcla picro - formos - acética.e) Líquido de Duboscq - Brasil, o Bouin alcohólico.

Fijadores Físicos1. Disecación2. Calor Seco3. Calor húmedo4. Frío5. Congelación y desecación.

HISTOQUÍMICA

Técnica para localizar sustancias químicas específicas o sitios deactividad química en las estructuras morfológicas que se hanperturbado lo mínimo posible. Por lo general se congelainmediatamente el tejido o embrión en nitrógeno líquido y se seccionacon un micrótomo especial de baja temperatura que recibe el nombrede criostato. Se coloca el tejido en un portaobjetos de vidrio y sesomete a una reacción química específica que conduce a la deposiciónde un producto coloreado en el sitio de la actividad enzimática o en ellugar en donde se concentran ciertas moléculas. Para llevar a cabo laobservación histoquímica han de plantearse una serie de operacionesdestinadas a la obtención de preparaciones de tejido, fijadas ysusceptibles de ser apreciadas con nitidez al microscopio.

AUTORRADIOGRAFÍATécnica que permite localizar un isótopo radiactivo, al interior de lascélulas o tejidos, mediante técnicas semejantes a los que se utilizanen fotografía.Típicamente se coloca un embrión o parte de él en una solución quecontiene un aminoácido radiactivamente marcado o un precursor deDNA o RNA. Después de un lapso dado, se extrae el embrión de lasolución radiactiva y se secciona para analizarse en el microscopio,pero además de los procedimientos histológicos normales, lassecciones de tejidos se cubren con una emulsión fotográfica,conservándose en la oscuridad durante varias semanas. Las emisionesradiactivas del isótopo, las cuales se han incorporado a las proteínasdel embrión, impiden la emulsión durante el periodo de exposición. Acontinuación la emulsión se revela, de manera muy semejante a laspelículas fotográficas. Después se depositan gránulos de plata en laemulsión sobre las células que contienen átomos marcados parautilizarlos como guía, con objeto de localizar las estructuras marcadasen el microscopio.

1º.-Inyección del producto radiactivo.2º.- Al transcurrir el tiempo aproximado de asimilación del producto, elanimal se anestesia y perfunde con fijador, sólo cuando el producto conel isotopo no se soluble. Si el producto es soluble se sacrifica el animalpor decapitación, rápidamente se extrae el órgano y se congela.3º.-Incluir y cortar en parafina, resiana epoxi, o cortar por congelación.4º.-Colocar, en cuarto oscuro, sobre el portaobjetos con el corte, lapelícula de fotografia, cuidando que la cara con la emulsión fotográficaquede en contacto con el corte.5.- Guardar en una caja oscura y colocar en frigorífico durante 7 dias,para empezar, al término de los cuales:6º.- Se saca, en cuarto oscuro, y se revela la película fotográfica como sehace habitualmente con los negativos en blanco y negro. Si la impresiónha sido buena, se procede a la coloración del corte, y si no ha sidobuena, se coloca otra vez con otra película fotográfica sobre los portas yse deja impresionando en el frigorífico mas tiempo. Repitiendo laoperación de nuevo.

Autorradiografía de un corte demédula espinal y sus cubiertas.

HIBRIDACIÓN IN SITU

La técnica de hibridación in situ está basada en la capacidad queposeen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, laexistencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resultacomplementaria con otra secuencia.Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediantela utilización de una sonda (formada por una secuencia de ADNpreviamente conocida) marcada con un isótopo radiactivo, lapresencia de determinada secuencia de ADN o ARNcomplementaria, en la muestra a estudiar.Lo que se produce mediante la utilización de esta técnica es: Lahibridación (unión), de la sonda marcada, con la secuencia abuscar (en el caso de estar presente en la muestra) yposteriormente mediante técnicas específicas (autoradiografía oinmunohistoquímica), la transformación de la secuencia en algovisible

Figura 1. Hibridación fluorescente in situ (FISH) en cromosomas metafásicos de un paciente con síndrome de Williams. Se observan las señales de referencia (flechas verdes) en ambos cromosomas 7 y la señal crítica en 7q11.23 (flecha amarilla) en sólo uno de los cromosomas 7, es decir, hay delecCión.

MICROCIRUGIAS

Técnica quirúrgica que se realiza con la ayuda de lentes de aumento(lupas o microscopios operatorios), para el manejo preciso detejidos y restaurar lo mejor posible la anatomía funcional de losórganos de la reproducción.La microcirugía se utiliza en vez de, o como complemento de lareproducción asistida. nuestro objetivo, un bebé. Si esto no funcionautilizar alternativas aceptables.Una variante de microcirugía es la micromanipulación de gametos yembriones como ICSI (inyección del espermatozoide dentro delóvulo). La microcirugía también se puede realizar por víaendoscópica en casos seleccionados, esto además del instrumentaladecuado requiere un entrenamiento especial.Debemos recalcar que con indicaciones específicas la utilización de lamicrocirugía permite excelentes resultados en infertilidad, sinembargo, si existen otros factores asociados las posibilidades de éxitodisminuyen y en estos casos se requiere reproducción asistida.

Microdisección Mediante Captura con Láser

Un método que se está utilizando para minimizar el daño celular ycapturar los patrones de proteínas precisos en las célulascancerosas y normales es la microdisección mediante captura conláser (LCM, por sus iniciales en inglés). Los investigadores utilizanun haz de láser de baja energía y una película especial detransferencia para llevar una célula deseada fuera de la sección detejido, dejando todas las células no deseadas. Ellos puedenentonces recolectar todas las proteínas que estaban presentes enlas células seleccionadas, mapear el patrón de proteínas yalmacenar la información en una base de datos de computadora(ordenador).La microdisección mediante captura con láser ofrece variasventajas para el estudio de proteínas.

RASTREO

Se han utilizado muchos tipos de marcadores para rastrear losmovimientos de las células en el embrión en crecimiento. Los tiposde tintes que pueden aplicarse a las células vivientes sin dañarlas,como el sulfato azul de Nilo y el rojo neutro, reciben el nombre decolorantes vitales. Los cambios de posición de las células tratadascon estos colorantes pueden seguirse durante el transcurso de unperiodo extenso de crecimiento, antes que el colorante se torne tandifuso que resulte imposible su identificación. La marcación tambiénpuede llevarse a cabo al colocar en pequeños grupos de célulaspartículas de carbón fisiológicamente inerte, finamente dividido,como las de carbón de sangre. Los resultados de experimentos enlos que participan las marcaciones de carbón se utilizarán cuando sehable de los movimientos celulares en la vecindad de la líneaprimitiva del polluelo.

Una innovación reciente en las técnicas de rastreoconsiste en inyectar a las células diminutas cantidadesde peroxidasa de rábano picante (PRP), enzimadistribuida por toda la célula y cuya presencia puedemostrarse por varias reacciones. Cuando se divide unacélula que tiene PRP inyectada, la enzima se distribuyeen las células hijas. Puesto que persiste en la progeniecelular, la PRP se ha tornado en una importanteherramienta para mapear linajes celulares. Laperoxidasa de rábano picante pueden inyectarse en unade las células del embrión temprano, al cual se lepermite desarrollarse por algún tiempo parea despuésseccionarse.

USO DE MARCADORES GENÉTICOS

Son útiles en los estudios de desarrollo,generalmente como rastreadores. De particularvalor han sido las cepas de ratones que handesarrollado diferencias isoenzimáticas en la formade ciertas enzimas. La identificación mediantetécnicas electroforéticas de isoenzimas específicasha mostrado ser de utilidad como un métodorastreador.

TÉCNICAS DE CULTIVO

Una de las formas más interesantes de estudiar el desarrolloembrionario estriba en cultivar componentes de embriones, y hastaembriones completos, en un medio artificial.El material embrionario se coloca en platos o tubos de vidrio oplástico y se rodea con un medio de cultivo artificial, diseñado parasemejarse en la mayor medida posible al medio que circunda almaterial en su sitio normal embrionario. El medio de cultivo idealse define químicamente en su totalidad; sin embargo, confrecuencia es necesario añadir factores biológicos indefinidos comosuero, y hasta extractos de embriones completos, para proveer losfactores de crecimiento necesarios. Existe cada vez mayorconocimiento que la naturaleza del sustrato que se coloca en lascélulas, sea el plástico del plato o el material adicional de matrizextracelular, es una determinante considerable para el éxito delcultivo.

TÉCNICA DE RADIACIÓN

Se han utilizado varias formas de radiación en losestudios embriológicos, principalmente para causar algúndaño en partes del embrión. Para realizar ciertosexperimentos, se enfocan rayos X en pequeñas regionesdel embrión con objeto de obtener un área circunscritade lesión al tejido, así como para inactivar un grupo decélulas. En ocasiones se utilizan rayos ultravioleta para elmismo fin, pese a que carezcan del poder de penetraciónprofunda de los rayos X. Los rayos láser han resultado seruna valiosa herramienta para producir lesiones localizadasagudas en el embrión. Es tal su precisión que puedendestruir pequeñas regiones de cromosomas individuales.

LA CLONACIÓN

Proceso por el que se consiguen copias idénticas de un organismo,célula o molécula ya desarrollado de forma asexual.

ECOGRAFÍA DE EMBRIONES

La ecografía, ultrasonografía o ecosonografía es unprocedimiento de imagenología que emplea los ecos deuna emisión de ultrasonidos dirigida sobre un cuerpo uobjeto como fuente de datos para formar una imagen delos órganos o masas internas con fines de diagnóstico.Un pequeño instrumento "similar a un micrófono"llamado transductor emite ondas de ultrasonidos. Estasondas sonoras de alta frecuencia se transmiten hacia elárea del cuerpo bajo estudio, y se recibe su eco. Eltransductor recoge el eco de las ondas sonoras y unacomputadora convierte este eco en una imagen queaparece en la pantalla.

LA AMNIOCENTESIS

Prueba prenatal común que consiste en extraer una pequeñamuestra del líquido amniótico que rodea al feto para examinarlo.Se utiliza para diagnosticar, o con mucha mayor frecuencia,descartar la presencia de ciertos defectos congénitos y trastornosgenéticos. La amniocentesis es la prueba prenatal más comúnutilizada para diagnosticar defectos congénitos cromosómicos ygenéticos. Existe otra prueba prenatal, llamada muestra del villuscoriónico, que permite diagnosticar la mayoría de los defectoscongénitos detectables mediante una amniocentesis. La muestradel villus coriónico se practica en una etapa anterior del embarazo(generalmente entre las semanas 10 y 12) en comparación con laamniocentesis (que suele realizarse entre las semanas 15 y 20),pero puede conllevar un riesgo ligeramente mayor de abortoespontáneo que la amniocentesis.

El líquido amniótico y las células cutáneas del feto queflotan en él se someten a análisis. Las células se separandel líquido amniótico y se cultivan en un laboratoriodurante 10 a 12 días. A continuación, se analizan lascélulas para detectar anomalías cromosómicas o defectoscongénitos genéticos. Por lo general, los resultados seobtienen dentro de las dos semanas.