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Serviço Público Federal
Universidade Federal de Goiás Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia - Mestrado Área de Concentração – Biologia Celular e Molecular
FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA
Avaliação do Potencial Citotóxico, Genotóxico e Antitumoral do Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) em Diferentes
Linhagens Celulares
Goiânia 2010
FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Biologia, Área de concentração em Biologia Celular e Molecular. Orientadora: Prof. Dra. Elisangela de Paula Silveira Lacerda.
Goiânia 2010
Avaliação da Atividade Citotoxica, Genotóxica e Anti-Tumoral do Composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) sobre
Diferentes Linhagens Celulares
Flávia de Castro Pereira B.Sc1 *
Profª. Dr.ª Elisângela de Paula Silveira Lacerda1
1 Laboratório de Genética Molecular e Citogenética. ICB I - sala 200. Campus II. Universidade Federal de Goiás.
* Correspondência: silveiralacerda@gmail.com Elisângela de Paula Silveira Lacerda Universidade Federal de Goiás Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Geral
Janeiro/ 2010
iii
Programa de Pós-Graduação em Biologia Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluna: FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA Orientadora: Profa. Dra. ELISÂNGELA DE PAULA SILVEIRA LACERDA
Membros: 1. Dra. ELISÂNGELA DE PAULA SILVEIRA LACERDA
2. Dr. ALZIR AZEVEDO BATISTA
3. Dra. SIMONE MARIA TEIXEIRA DE SABÓIA-MORAIS
ou
4. Dr. CLÁUDIO CARLOS DA SILVA
5. Dra. LEE CHEN CHEN
Data: 22/01/2010
iv
Dedicatória
Aos meus pais, Maria Francisca Pereira de Castro e Orlando de Castro Sobrinho,
exemplo de coragem, vida e amor. Obrigada pelo incentivo, compreensão, amor,
dedicação e orações em todos os momentos da minha vida. A vocês, o meu eterno
amor.
Ao meu namorado Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova Costa, pelo amor, dedicação,
carinho e compreensão, que sempre esteve presente em todos os momentos.
Obrigada por nunca desistir de mim, e por todo apoio e amor nesses seis anos
juntos.
Ao meu irmão Patrick Carlos de Castro, por sempre estar presente em minha vida.
v
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus por mais esta etapa de aprendizagem em minha
vida, mas, acima de tudo, o agradeço por sempre ter me colocado no caminho certo,
por nunca me deixar enfraquecer em meio às adversidades.
Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho e, em especial, à minha orientadora, Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira
Lacerda, pelo exemplo de pesquisadora a ser seguido, que me ensinou grandes
lições sobre conduta profissional e pessoal e a quem dedico profunda admiração,
respeito e carinho. Muito do que sou, devo a você. Obrigada por estar sempre
presente e, o mais importante, obrigada por acreditar em mim.
Ao Prof. Dr. Luis Alfredo Pavanin e sua equipe do Laboratório de Química da
Universidade da Federal de Uberlândia, pela síntese e fornecimento do composto de
Rutênio, muito importante para a realização deste trabalho.
À Profa. Dra. Marize Campos Valadares Bozinis pela disponibilidade do Laboratório
de Farmácia para leitura das amostras.
À equipe do Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, em especial aos
meus amigos César Augusto Sam Tiago Vilanova Costa, Aliny Pereira de Lima,
Alessandra Braga de Santana, Manuela Rocha Rezende, Hugo Delleon da Silva e
Lucas Gomes Carlos Pereira, obrigado pela confiança e auxílio durante o mestrado e
acima de tudo, pela amizade.
vi
A todos os estagiários do Laboratório de Genética Molecular e Citogenética em
especial à Franciely Mariana dos Santos Melo, Wanessa Carvalho, Mariana Pedrosa
Batista, Darline Kist Engelmann e Osmar Nunes de Oliveira que me auxiliaram em
partes da pesquisa.
À minha colega Polyana Lopes Benfica, pela leitura das amostras no citômetro de
fluxo.
Aos funcionários da Universidade Federal de Goiás; pelo auxílio e compreensão no
decorrer da pesquisa.
Ao Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, pela estrutura
didática e técnica para a realização dos estudos e trabalhos do mestrado.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa, CNPq, pela bolsa de estudos.
À toda a minha família pelo incentivo.
vii
“Não importa o que você faça ou sonhe que possa fazer: comece logo. A audácia,
por si só, atrai criatividade, poder e magia”.
“Goethe”
viii
SUMÁRIO
Lista de Figuras da Introdução e da Revisão de Literatura........................... x
Lista de Figuras e Tabelas do Artigo 1............................................................ xi
Lista de Figuras do Artigo 2.............................................................................. xii
Lista de Figuras e Tabelas do Artigo 3............................................................ xii
Lista de Anexos.................................................................................................. xiv
Siglas e Abreviaturas......................................................................................... xv
Resumo............................................................................................................... xviii
Abstract............................................................................................................... xx
1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 23
1.1. Câncer........................................................................................................... 23
1.2. Compostos de Rutênio no Tratamento do Câncer........................................ 25
2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 30
2.1. Ciclo Celular.................................................................................................. 30
2.2. Apoptose....................................................................................................... 32
2.3. Quimioterapia antineoplásica ....................................................................... 37
2.4. Compostos baseados em metal usados na terapia antitumoral .................. 40
2.5 Complexos de Rutênio e seu Mecanismo de Ação................... 45
2.6. Cultura de Células ........................................................................................ 55
2.7. Citotoxicidade................................................................................................ 57
3. JUSTIFICATIVA............................................................................................... 60
4. OBJETIVOS..................................................................................................... 62
4.1. Objetivo Geral............................................................................................... 62
ix
4.2. Objetivos Específicos ................................................................................... 62
5. METODOLOGIA.............................................................................................. 63
5.1. Sintese do Composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) ........ 63
5.2. Teste Allium cepa.......................................................................................... 64
5.3. Droga antitumoral controle............................................................................ 65
5.4. Preparação do composto de Rutênio para ensaios biológicos in vitro.......... 65
5.5. Meio de cultura celular.................................................................................. 66
5.6. Linhagens celulares tumorais e normais ...................................................... 66
5.7. Cultura de células tumorais........................................................................... 67
5.8. Avaliação do potencial citotóxico e antitumoral............................................. 67
5.9. Ensaio cometa............................................................................................... 70
5.10. Citometria de fluxo: Avaliação das fases do ciclo celular e apoptose......... 72
5.11. Eletroforese em gel de agarose.................................................................. 73
5.12. Análise Estatística....................................................................................... 74
6. PRODUÇÃO CIENTÍFICA............................................................................... 75
6.1. ARTIGO 1..................................................................................................... 77
6.2. ARTIGO 2..................................................................................................... 104
6.3. ARTIGO 3..................................................................................................... 129
7.0. CONCLUSÕES............................................................................................. 158
8.0. CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................... 155
9.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 162
10.0 ANEXOS...................................................................................................... 172
Lista de figuras e tabelas dos Artigos x
LISTA DE FIGURAS E TABELAS DA INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
Tabela 1 – Estimativas, para o ano 2008, do número de casos novos por
câncer, em homens e mulheres, segundo localização primária........... 25
Figura 1 – Pontos de checagem do sistema de controle do ciclo celular.............. 32
Figura 2 – Caracteristicas de uma célula em necrose e apoptose........................ 34
Figura 3 – Via intrínseca e extrínseca da apoptose............................................... 36
Figura 4 – Estrutura química da Cisplatina............................................................ 41
Figura 5 – Estrutura química de antitumorais a base de platina............................ 42
Figura 6 – Diferentes tipos de adutos DNA-cisplatina, para uma dada seqüência aleatória. O aduto intrafita 1,2-GG (superior esquerdo) é considerado uma lesão crítica................................................................................... 43
Figura 7 – Estrutura química do composto NAMI-A (transimidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio).................................. 44
Figura 8 – Estrutura do composto de Rutênio KP1019 {Indazolium trans-[(tetracloreto)bis(1H-indazol)rutênio(III)]}............................................ 45
Figura 9 – Mecanismo de ação do rutênio no ambiente da célula tumoral....... 48
Figura 10 – Estrutura Química do Composto de rutênio Cloreto de cis-Tetraaminodiclororutênio (III)........................................................... 54
Figura 11 – Complexo de Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III)............. 54
Figura 12 – Classificação de leitura para o Ensaio Cometa................................ 71
Lista de figuras e tabelas dos Artigos xi
LISTA DE FIGURAS E TABELAS DO ARTIGO 1 Figure 1 – Mitotic index of A. cepa root tips exposed to cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) and Pb (NO3)2……………………...………… 86
Figure 2 – Chromosomal aberrations in root tip cells of A. cepa L. exposed to Ruthenium complex (a, b, d, and e) and lead nitrate (c, f, g, and h)... 89
Table 1 – Cytogenetic Analysis of A. cepa Root Cells Exposed to Different Concentrations of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate and Lead Nitrate for Different Periods………………...…… 91
Lista de figuras e tabelas dos Artigos xii
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO 2 Figure 1 – Chemical structure of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)
Dithionate………………………………………………………………. 124
Figure 2 – Anti-proliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium (III) Dithionate compound towards A-549 and MRC-5 cell lines…… 125
Figure 3 – Cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards A-549 and MCR-5 cell lines ............ 126
Figure 4 – Proliferation of A-549 tumor cells cultured in the presence of different concentrations of cis-[RuCl2(NH3)4]Cl compound……...…. 127
Figure 5 – DNA agarose gel electrophoresis profile of A-549 cells cultured in the presence of cis-[Ru(C2O2)(NH3)4]2(S2O6) compound…………... 128
Lista de figuras e tabelas dos Artigos xiii
LISTA DE FIGURAS E TABELAS DO ARTIGO 3
Figure 1 – Chemical structure of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate………………………………………………………………... 152
Figure 2 – Anti-proliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line………………………... 153
Figure 3 – Cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line (a and b)…………….. 154
Figure 4 – Induction of DNA strand breaks of A-549 cells cultured in the presence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound…………...….. 155
Figure 5 – Cell cycle profile histogram of K562 cells treated with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate…………………..... 156
Table 1 – Cell cycle analysis of K562 tumor cell lines after treatment with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate…………………….. 157
Siglas e Abreviaturas xiv
ANEXOS Anexo 1 – Artigo 1 “Cytotoxic and genotoxic effects of cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on the root meristem cells of Allium
cepa “, publicado no periódico Biological Trace Element Research, Springer, (2009)
128, 258-268;
Siglas e Abreviaturas xv
SIGLAS E ABREVIATURAS
AIF – Fator indutor de apoptose, do inglês Apoptosis-Inducing Factor;
Bad – Agonista de morte celular associado a BCL2, do inglês BCL2-associated
agonist of cell death
Bak – Protéina destruidora de Antagonistas de BCL2, do inglês BCL2-
antagonist/killer 1;
Bax – Proteína X associada à BCL2 , do inglês BCL2- associated X protein;
Bcl2 – Proteína reguladora anti-apoptótica, do inglês B-cell CLL/lymphoma 2.
Bcl-w – Proteína reguladora anti-apoptótica, agonista de Bcl2;
Bcl-Xs – Proteína reguladora pró-apoptótica antagonista de Bcl2;
Bid – Proteína reguladora pró-apoptótica antagonista de Bcl2, do inglês BH3
interacting domain death agonist;
Bik – Proteína reguladora pró-apoptótica antagonista de Bcl2, do inglês BCL2-
interacting killer
cis-Pt (II) – Cisplatina II;
DD – Domínio de morte celular, do inglês Death Domain;
DIABLO – Proteínas ligantes de IAP com baixo ponto isoelétrico, do inglês direct IAP
binding protein with low PI;
DL50 – Dose Letal 50%;
DMSO – Dimetilsulfóxido;
DNA – Ácido Desoxirribonucléico;
Et al. – e outros, do latin et alii;
Fas – receptor de superfície envolvido na ativação da apoptose (pertence a família
TNF);
Siglas e Abreviaturas xvi
Fase M – fase de mitose do ciclo celular;
Fase S – fase de síntese do ciclo celular;
FDA (E.U.A.) – Food and Drug Administration, agência regulatória de alimentos e
medicamentos dos Estados Unidos da América;
FLIPs – Proteína inibitória homóloga a FLICE, do inglês FLICE-like inhibitory protein;
G0 – Do inglês Gap, intervalo. Fase Gap0 do ciclo celular;
G1 – Do inglês Gap, intervalo. Fase Gap1 do ciclo celular;
G2 – Do inglês Gap, intervalo. Fase Gap2 do ciclo celular;
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana;
IAPs – Proteinas inibidoras de apoptose, do inglês Inhibitors of Apoptosis Proteins;
IC50 – Inibição de Concentração 50%;
INCA – Instituto Nacional de Câncer;
Kbp – quilopares de bases;
KP1019 – Composto Indazolium trans-[(tetracloreto)bis(1H- indazol)rutênio(III)];
Mcl-1 – Leucemia mielóide - sequência 1, do inglês Myeloid Cell Leukemia
Sequence 1;
mg.kg-1 – Miligrama por quilograma;
mg.mL-1 – Miligrama por mililitro;
MS – Ministério da Saúde.
NAMI A – Composto trans-imidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio;
NCI – Instituto Nacional do Cancer dos Estados Unidos da América, do inglês
National Cancer Institute;
NO – Óxido Nitrico;
NGFr – Fator de crescimento de nervos, dos inglês Nerve Growth Factor;
Omi/HtrA2 - proteína A requerida em altas temperaturas;
Siglas e Abreviaturas xvii
pH – potencial hidrogeniônico
RM175 – Composto de Rutênio [(h6-C6H5C6H5)Ru(en)Cl]+;
RNA – Ácido Ribonucléico;
Ru (II) – Rutênio em estado de oxidação II;
Ru (III) – Rutênio em estado de oxidação III;
Ru (IV) – Rutênio em estado de oxidação IV
SMAC – Segundo ativador de caspase derivado da mitocôndria, do inglês Second
Mitochodria-Derived Activator of Caspases;
Tf – Proteína transferrina;
TNF – Fator de necrose tumoral, do inglês Tumor Necrosis Factor;
TRAIL-R1 – Superfamília do Receptor 1 do Fator de Necrose Tumoral, do inglês
Tumor necrosis factor receptor 1;
Abstract xviii
RESUMO Apesar do sucesso da cisplatina e dos medicamentos à base de platina, o
mercado de fármacos ainda é acessível para novas drogas á base de metal que
oferecem uma melhor viabilidade, tais como a administração oral, o que pode ajudar
a diminuir os efeitos colaterais graves e custos clínicos. Além disso, novos estudos
concentram-se na investigação de novas drogas com maior eficácia, ou seja, drogas
que interajam de forma diferente com o DNA, o que pode levar à superação da
resistência inata ou adquirida de certos tipos de tumores. Dentre os vários
complexos a base de metais desenvolvidos, os complexos de rutênio (III)
representam uma nova família de promissores agentes anticâncer. No presente
estudo foi investigado in vitro o efeito do composto Ditionato de cis-
Tetraamino(oxalato)rutênio(III) sobre a viabilidade celular, distribuição das fases do
ciclo celular, mecanismos de indução de apoptose e danos a molécula de DNA. Os
resultados provenientes da análise do teste Allium cepa mostraram um efeito tempo
dose-dependente. A avaliação mostrou que a concentração de rutênio teve um
impacto maior do que o tempo de exposição. O efeito também se mostrou
cumulativo, com uma quase completa inibição da mitose em uma concentração de
rutênio de 0,1 mg mL-1 ou superior por períodos superiores a 24 h. Por outro lado, os
resultados não revelaram efeitos clastogênicos significativos nas células
meristemáticas expostas ao complexo de rutênio (III). A comparação entre os
valores dos Índice Mitótico de células meristemáticas de cebolas tratadas com o
complexo de rutênio em relação às células tratadas com nitrato de chumbo também
mostrou que o complexo de rutênio induziu uma inibição mitótica média oito vezes
maior do que o chumbo. Notadamente, as freqüências de anomalias e aberrações
celulares mitóticas foram quase quatro vezes e três vezes menores,
respectivamente. Os resultados mostram que o composto estudado causa
Abstract xix
significativa redução da proliferação das células A549 com viabilidades entre 55,5%
para 24,6% quando tratados com 40 µM por 24 e 48h; e 32% para 18,2% quando
tratados com 150 µM por 24 e 48h. O composto de rutênio(III) induz moderada
(31,9% e 39,6% para concentrações 10 e 40 µM, respectivamente) para alta
degradação (74% para a concentração 150 µM) para avaliação da atividade
citotóxica das células A549 (IC50= 33,72 µM). Quanto à linhagem de fibroblasto de
pulmão humano normal MRC-5, não mostrou redução significativa na proliferação
celular na presença do composto. Quando tratadas com altas concentrações do
Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) por 48 horas, celulas MRC-5 mostraram
viabilidades altas de 85% e 78,4% para 40 µM e 150 µM, respectivamente. A
atividade citotóxica e antiproliferativa revelou que a cultura de células K562 nas
concentrações de 40 e 150 μg mL-1 do composto de Rutênio(III) mostrou redução
significativa na proliferação 72h de exposição, com viabilidades de 88,2% para
55,6% quando tratadas com 40 µM por 24 e 72h; e 76,2% para 26,7% quando
tratadas com 150 µM por 24 e 72h. O composto de Rutênio(III) induziu baixa [22,4%
(24h) para 28,2% (48h) e 29,8% (24h) para 35,7% (48h) para concentrações de 10 e
40 µM, respectivamente] para moderada [44% (24h) e 53% (48h) para
concentrações de 150 µM] atividade citotóxica em células K562. Após a incubação
de 48 h, o valor da IC50 foi de 18,28 µM. Quando comparado o ciclo celular de
células não tratadas, a análise indica que as células foram arrastadas para sub-G1
apresentando um aumento de 1,7 para 2,2 e 2.4% no número de células em sub-G1
por 24, 48 e 72 h, respectivamente, quando comparado com o grupo controle. O
composto também causou um significativo aumento em danos celulares nas
concentrações testadas quando comparado com o controle negativo, o que pode
estar associado com efeitos citotóxicos diretamente no DNA celular.
Palavras-chave: Apoptose, atividade antitumoral, A549, citotoxicidade, Ditionato de
cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III), genotoxicidade, K562.
Abstract xx
ABSTRACT
Despite the resounding success of cisplatin and closely related platinum
antitumor agents, the movement of other transition-metal antitumor agents toward the
clinic has been exceptionally slow. Non-Platinum chemotherapeutic
metallopharmaceuticals hold much promise for the future, and needs to be actively
explored in a large variety of tumor types in combination therapies. The preparations
of metallocomplexes with potential antitumor activity has been one of the main
targets of transition metal chemistry since Rosenberg’s discovery of cisplatin {cis-
diamminedichloridoplatinum(II), cis-[Pt(NH3)2Cl2]} cytotoxic activity in the 1960s. In
1978, cisplatin was approved as the first platinumbased drug for the oncology
treatment, although several negative side-effects (nephrotoxicity, neurotoxicity,
nausea, etc.) had been induced on treated patients. Nevertheless, cisplatin was
followed by carboplatin {cis-diammine-1,1´ -cyclobutanedicarboxylateplatinum(II),
[Pt(NH3)2(cbdc)], approved in 1985} and oxaliplatin {1R,2R-
diamminocyclohexaneoxalatoplatinum(II), [Pt(dach)(ox)], approved in 1996}, which
met requirements of improving antitumor activity and reducing disadvantages of
cisplatin, carboplatin and oxaliplatin represent the second, and third platinum-based
drug generations, respectively. Nowadays, not only platinum-bearing complexes are
extensively studied with the aim to broaden a spectrum of transition metal-based
complexes which could be used in the treatment of cancer. Ruthenium complexes
have shown potential utility in chemotherapy and photodynamic therapy. Ruthenium
complexes generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed to their
specific accumulation in cancer tissues. In vitro and in vivo studies show high
anticancer activity of Ruthenium complexes and some of them are currently
undergoing clinical trials. In the present work we studied the antitumor activity of the
Abstract xxi
Ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against different tumor and normal cells lineages, analising
cell viabilities, cell cycle distribution, apoptosis induction mecanistics and genome
DNA damage. Correlation tests were performed to determine the effects of the time
of exposure and concentration of Ruthenium complex on mitotic index (MI) and
mitotic aberration index on Allium cepa root cells. A comparison of MI results of cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) to those of lead nitrate reveals that the Ruthenium complex
demonstrates an average mitotic inhibition eightfold higher than lead, with the
frequency of cellular abnormalities almost fourfold lower and mitotic aberration
threefold lower. A. cepa root cells exposed to a range of Ruthenium complex
concentrations did not display significant clastogenic effects. The cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate therefore exhibits a remarkable
capacity to inhibit mitosis, perhaps by inhibiting DNA synthesis or blocking the cell
cycle in the G2 phase. Results showed that Ruthenium(III) causes a significant
reduction of proliferation of A549 cells with viabilities ranging from 55.5% to 24.6%
when treated with 40 µM for 24 and 48h; and 32% to 18.2% when treated with 150
µM for 24 and 48h. The Ruthenium(III) compound induced a moderate (31.9% and
39.6% for concentrations 10 and 40 µM, respectively) to high degree (74% for
concentration 32 µM) of cytotoxic activity against A549 cells (IC50= 33.72 µM). On the
other hand, the normal lung fibroblast MRC-5 did not show significant reduction
proliferation in the presence of Ruthenium(III) compound. Even when treated with
higher concentrations of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate for 48
hours, MRC-5 cells showed viabilities ranging from 85% to 78,4% for 40 µM and 150
µM, respectively. The antiproliferative and cytotoxic activity revealed that K562 cells
cultured with concentrations 40 and 150 μg mL-1 of Ruthenium(III) compound showed
Abstract xxii
significant reduction of proliferation after 72h of exposition, with viabilities ranging
from 88.2% to 55.6% when treated with 40 µM for 24 and 72h; and 76.2% to 26.7%
when treated with 150 µM for 24 and 72h. The Ruthenium(III) compound induced low
[22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to 35.7% (48h) for concentrations 10
and 40 µM, respectively] to moderate [44% (24h) and 53% (48h) for concentration
150 µM] of cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h, the IC50 value
was 18.28 µM. Compared to the cell cycle profiles of untreated cells, flow cytometric
analysis indicated a sub-G1 arresting effect of Ruthenium compound on K562 cells,
inducing a 1.7-fold, 2.2-fold and 2.4-fold increase in the number of sub-G1 cells for
24, 48 and 72 h, respectively, when compared to control. The compound also caused
a significant increase in tailed cells in any of the concentrations tested compared with
negative control that can be associated cytotoxicity with direct effect on K562 cells
DNA.
Keywords: cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Cytotoxicity;
Antitumor activity; A549; K562, Ruthenium(III) compounds; immunomodulatory
activity, Apoptosis.
Introdução 23
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer O câncer é o resultado de um acúmulo de alterações genéticas, e
epigenéticas, que comprometem o controle do crescimento celular normal e a
diferenciação terminal, em que o acúmulo de mutações no DNA é a causa
subsequente ao desenvolvimento neoplásico e, consequentemente, ao surgimento
da doença (Hollstein et al., 1999; Lodish et al., 2000; Griffith et al., 2001; Alberts et
al., 2004).
A carcinogênese pode ser compreendida como um processo complexo no
qual se encontram envolvidos muitos genes, particularmente os que regulam a
estabilidade e o reparo do DNA, o crescimento celular, a imunidade e a
quimiorresistência às drogas. Um grupo de genes envolvidos nesse processo é
denominado genes supressores tumorais, os quais parecem agir normalmente,
como reguladores da proliferação celular (Anderson et al., 1994; Nagai, 1999; Sigal
& Rotter, 2000; Cavalcante JR et al., 2002; Gleich & Salamone, 2002).
As causas de câncer são variadas, podendo ser externas ou internas ao
organismo, estando inter-relacionadas. As causas externas referem-se ao meio
ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de uma sociedade. As causas internas
são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, e estão ligadas à
capacidade do organismo de se defender das agressões externas. Há diferentes
tipos de câncer com distintas causas moleculares. As alterações oncogênicas
podem ser divididas em dois grandes grupos: por aquisição (introduzidos por
infecção viral) e desenvolvimento (mutações em protooncogenes) de oncogenes; ou
por alterações genéticas que contribuem para o desenvolvimento do câncer devido à
perda da funcionalidade dos genes supressores de tumor, que protegem as células
Introdução 24
contra a divisão celular descontrolada (Diffley & Evan, 1999; INCA, 2010).
O câncer é uma das doenças mais comuns e graves vistas na medicina
clínica (Jemal et al., 2004). Dados epidemiológicos demonstram que o câncer, de
alguma forma, ataca mais que um terço da população mundial, sendo responsável
por mais de 20% de todas as mortes, e, em países desenvolvidos, chega a ser
responsável por mais de 10% do custo total em cuidados médicos (IARC, 1990;
Cairns, 1995; Barreto et al., 1998; Thompson et al., 2008).
No Brasil, estimativas para o ano de 2009 apontam que ocorreriam 489.270
casos novos de câncer. Os tipos mais incidentes seriam os de próstata e pulmão
para o sexo masculino e mama e colo útero para o sexo feminino (Tabela 01).Em
Goiás, acredita-se que neste mesmo ano, a incidência para novos casos seria de
16.130 para cada 100.000 habitantes (INCA/MS, 2010). Tornando-se o terceiro
grupo de causas de mortalidade, superado apenas por doenças cardiovasculares e
por morte acidental - incluíndo acidentes de trânsito quanto violência urbana - e
consolidando-se como um problema de saúde pública (INCA 2010).
Os termos “câncer”, “neoplasia maligna” e “tumor maligno” são sinônimos e
destinguem-se dos tumores benignos pelas suas propriedades de desdiferenciação,
poder de invasão e capacidade de metastizar-se, isto é, disseminar-se para outras
partes do corpo (Lodish et al., 2000).
Existem três abordagens principais para o tratamento do câncer: excisão
cirúrgica, irradiação e quimioterapia dependendo do tipo de tumor e do seu estágio
de desenvolvimento. A quimioterapia constitui o método mais utilizado para muitos
tipos de tumores e é subclassificada como curativa (controle completo do tumor),
adjuvante (esterilizar células residuais locais ou circulantes, diminuindo incidências
Introdução 25
de metástases à distância), neoadjuvante (redução parcial do tumor) e paliativa
(qualidade de sobrevida) (Laurence et al., 1997; INCA/MS 2009).
Tabela 1: Estimativas, para o ano 2008, do número de casos novos por câncer, em homens e mulheres, segundo localização primária.
Localização Primária Neoplasia Maligna
Estimativa de casos novos Masculino Feminino Total
Próstata 52.350 - 52.350
Mama Feminina - 49.240 49.240
Traquéia, Brônquio e Pulmão 17.800 9.830 27.630 Cólon e Reto 13.310 14.800 28.110 Estômago 13.820 7.680 21.500 Colo do Útero - 18.430 18.430 Cavidade Oral 10.330 3.790 14.120 Esôfago 7.890 2.740 10.630 Leucemias 5.240 4.340 9.580 Pele/Melanoma 2.960 2.970 5.930 Outras Localizações 59.130 78.770 137.900 Subtotal 182.830 192.590 375.420 Pele/não-Melanoma 53.410 60.440 113.850 Todas as Neoplasias 236.24o 253.030 489.270
Fonte: MS/Instituto Nacional de Câncer – INCA
Atualmente, têm sido pesquisadas novas abordagens para o tratamento do
câncer, incluindo a imunoterapia, o uso de inibidores da angiogenes, a terapia com
genes, as modificações da resposta biológica (por exemplo: interferons, fatores de
crescimento hematopoiético, entre outros) e a terapia fotodinâmica (Goodman &
Guilman, 2002).
1.2. Os compostos de Rutênio(III) no tratamento do câncer
Ultimamente, têm-se alcançado grandes avanços no desenvolvimento,
seleção e aplicação de agentes quimioterapêuticos, muitas vezes com sucessos
Introdução 26
clínicos notáveis, como no caso de tratamento para os linfomas ou de agentes
baseados em platina para o tratamento de câncer testicular. A quimioterapia
antineoplásica tem como objetivo o tratamento de diversos tumores malignos,
tornando-se uma das mais importantes e promissoras maneiras de combater o
câncer. Essa forma de tratamento pode ser empregada de forma curativa ou
paliativa, dependendo do tipo e extensão do tumor, além da condição física do
paciente. A associação da quimioterapia a outras formas de tratamento é bastante
comum (Mealey et al., 1994). Seu emprego antes da cirurgia e/ou radioterapia na
tentativa de promover a erradicação de micrometástases constitui a quimioterapia
neo-adjuvante. Porém, o uso depois da cirurgia e/ou radioterapia constitui a
quimioterapia adjuvante (Sonis, 1998).
No entanto, uma grande parte de pacientes com câncer, principalmente os em
estágios avançados, apresentam uma sobrevida bastante pequena. O ataque
indiscriminado promovido pelas drogas antineoplásicas às células de rápida
proliferação, cancerosas ou normais, produz os indesejáveis efeitos colaterais ou
tóxicos conhecidos e extremamente temidos pelos indivíduos que necessitam
submeter-se ao tratamento (Mealey et al., 1994). Uma parcela dos óbitos desses
pacientes acontece, principalmente, devido à administração de uma quimioterapia
ineficaz, especialmente quando se emprega agentes citotóxicos, o que leva a um
aumento da probabilidade de efeitos colaterais e a consequente diminuição da
qualidade de vida do paciente (Egger et al., 2005).
Os agentes alquilantes, de forma geral, têm como alvo a molécula de DNA da
célula tumoral, apresentando geralmente boa eficácia e produzindo aumentos
significativos na expectativa de vida de pacientes com câncer, especialmente
quando associados aos antineoplásicos de diferentes mecanismos de ação (Kelland,
Introdução 27
200). Porém, por sua relativa inespecificidade, tornam-se tóxicos também para os
tecidos saudáveis, principalmente os de maior grau de proliferação.
Conseqüentemente, os esforços agora estão direcionados no sentido de se produzir
agentes mais seletivos. Se isso for possível, poderíamos dispor de drogas mais
eficazes, pois agiriam especificamente nos mecanismos moleculares da neoplasia,
com um grau bem menor de toxicidade (Jung, 2007; Oliveira & Alves, 2002).
Neste contexto, os compostos de rutênio têm sido objetos de grande atenção
por terem propriedades antimetastática e de baixa toxicidade. Os componentes do
rutênio parecem penetrar na célula tumoral e ligar efetivamente ao seu DNA,
realizando ligação cruzada com as duas fitas, sendo então chamados de “cross-
linkers” (Kostova, 2006).
Existem três propriedades principais do rutênio que fazem com que seus
derivados sejam bem apropriados para aplicações biológicas; mudança de ligante –
os complexos de Rutêni (II) e (III) apresentam cinética de mudança de ligante similar
aos complexos de platina (II), sendo importante para as drogas atingirem o alvo
biológico sem serem modificadas; estados de oxidação – o rutênio é o único entre o
grupo de metais em que os estados de oxidação são acessíveis em condições
fisiológicas, permitindo a administração de complexos de Ru (III) que poderão ser
ativados por redução formando complexo de Ru (II) nos tecidos alvos. No sistema
biológico, a redução de Ru (IV) e Ru (III) é favorecida pela glutationa, ascorbato e
proteínas transportadoras de um único elétron, enquanto que o oxigênio e citocromo
oxidase promovem a oxidação do Ru (II); mimetizando o ferro – a baixa toxicidade
das drogas de rutênio é explicada pela habilidade que este elemento tem de imitar o
ferro na ligação a varias biomoléculas, incluindo a transferrina e a albumina. Em
mamíferos, estas duas proteínas são responsáveis pela solubilização e transporte de
Introdução 28
ferro, reduzindo a toxicidade deste metal (Alama et al., 2009; Pereira et al., 2009;
Kostova, 2006; Silveira-Lacerda et al, 2009b; Allardyce & Dyson, 2001).
A redução do Ru (III) para Ru (II) pode ser um mecanismo fundamental da
ativação celular por compostos de rutênio (Depenbrock et al., 1997). Os compostos
de Ru (III) podem ser reduzidos em áreas tumorais com hipóxia, a qual é capaz de
ligar-se rapidamente e causar dano ao DNA (Grguric-Sipka et al., 2003).
Em trabalhos anteriores, foi descrito que os composto Cloreto de cis-
Tetraaminodiclororutênio(III) (cis-[RuCl2(NH3)4]Cl) apresenta atividade citotóxica
sobre linhagem tumoral humanas Jurkat e HeLa, com IC50 de 190 e 3,5µM,
respectivamente (Frasca et al., 2001). Este composto apresentou atividade citotóxica
sobre as linhagens tumorais humanas Jurkat e HeLa, com IC50 de 190 e 3,5µM,
respectivamente (Frasca et al., 2000). Silveira-Lacerda et al., (2009b), trabalhando
com o mesmo composto, verificaram que o mesmo apresentava atividade citostática
significante, em estudos realizados com células tumorais humanas e de
camundongos. Os resultados indicaram que este composto apresentava atividade
citotóxica e genotóxica sobre células tumorais A-20, SK-Br-3, e S-180, onde DNA de
células tumorais tratadas apresentavam fragmentação do material genético.
Esse complexo de rutênio atua como droga citostática ao impedir a
progressão do ciclo celular da linhagem tumoral A-20 e induzir a apoptose.
Observou-se também que a atividade citostática exercida pelo composto de rutênio
sobre células mononucleares do sangue periférico humano foi menor quando
comparadas à atividade citostática deste composto em outras linhagens tumorais
que foram testadas (Silveira-Lacerda, 2009b). Verificou-se ainda que a toxicidade do
composto foi seletiva às células cancerígenas e com potencial efeito
Introdução 29
imunoestimulante sobre células mononucleares do sangue periférico humano
(Silveira-Lacerda, 2009a).
O Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III), assim como o Cloreto de
cis-Tetraamindiclororutênio(III), mostrou ação contra o tumor ascítico Sarcoma 180
in vivo, estatisticamente significativa e dose-dependente, e se mostrou mais efetivo
contra os tumores ascíticos em relação aos tumores sólidos (Barbosa, 2007). Com
este composto, também se tem observado baixa toxicidade frente às células
humanas normais e grande capacidade de bloqueio do ciclo celular de células de
linhagem tumoral.
Estudos indicam que comparados com outras drogas de coordenação, os
compostos baseados em complexos de rutênio estão entre os mais promissores
(Allardyce & Dyson, 2001). Desta forma, o complexos Ditionato de cis-
Tetraammino(oxalato)rutênio(III), assim como o Cloreto de cis-
Tetraamindiclororutênio (III), apresentam grande potencial para o uso clínico por
possuir baixa toxicidade, segundo dados preliminares provenientes de estudos
realizados no laboratório de Genética Molecular e Citogenética do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás.
O modo de ação dos compostos baseados em rutênio pode ser mais amplo e
complexo do que o esperado. É possível que estes compostos possuam a
habilidade de modular o consumo e a liberação de sinalizadores intercelulares, além
de importantes moléculas intracelulares (Clarke, 2003).
O aprofundamento do conhecimento acerca dos mecanismos pelos quais os
complexos organometálicos desempenham suas atividades no ambiente celular é de
suma importância para o sucesso clínico de drogas antitumorais baseadas em
metais, assim como auxiliará imensamente no desenvolvimento de novos compostos
Introdução 30
com elevado potencial clínico e no bem-estar humano (Pereira et al., 2009; Silveira-
Lacerda et al., 2009b).
Revisão de Literatura 31
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Ciclo celular
Nos últimos anos, a noção de proliferação celular evoluiu muito,
proporcionando maior conhecimento da biologia da célula. Por sua vez, esse avanço
está começando a originar novas abordagens para o desenvolvimento de agentes
antineoplásicos. Para se compreender como atuam os grandes antineoplásicos
atuais e como irão atuar os novos medicamentos, é importante se considerar as
características especiais da célula cancerosa (Laurence et al., 1997).
Diversos estudos demonstram que mutações em células somáticas e a
progressão do ciclo celular envolvem a expressão de uma série de genes, dentre
eles muitos oncogenes (Hollstein et al., 1991; Thompson et al., 1993; Alberts et al.,
2004). Os mecanismos de ativação desses genes, que participam na oncogênese,
incluem translocações cromossômicas, mutações de ponto, deleções, inversões e
amplificações do DNA (Merritt et al., 1990; Anderson et al., 1992; Alberts et al.,
2004).
Os cânceres geralmente parecem desenvolver-se por um processo no qual
uma população inicial de células levemente anormais, descendentes de uma célula
ancestral com uma única mutação, evolui em ciclos sucessivos de mutação e de
seleção natural. Em cada estágio, uma célula adquire mais uma mutação que lhe
confere uma vantagem seletiva em relação às células vizinhas, tornando-a mais apta
a prosperar naquele ambiente (Alberts et al., 2004). A evolução do tumor necessita
de uma grande dose de chance e normalmente leva muitos anos. Para esta
evolução, as células cancerosas adquirem propriedades especiais, que incluem
alterações nas vias de sinalização celular que levam as células tumorais a ignorar os
sinais do ambiente que normalmente mantém a proliferação celular sob controle
Revisão de Literatura 32
rígido, as células cancerosas também adquirem uma aversão anormal ao suicídio
(apoptose), de modo que evitam ou rompem as limitações normalmente
programadas para a proliferação; são geralmente instáveis; escapam do tecido
original e sobrevivem, proliferando em novos ambientes (Alberts et al., 2004).
A descoberta de drogas anticancerígenas pode ser resultado de testes
empíricos ou da síntese dirigida de substâncias. Os testes empíricos consistem na
seleção aleatória dos compostos que são testados em animais experimentais com
tumores. A síntese dirigida de substâncias químicas e de produtos biológicos contra
as células tumorais constitui um dos métodos empregados na atualidade, para
triagem de diversas drogas sintetizadas por grandes universidade e laboratórios. As
descobertas podem ser também, resultado de observações feitas ao acaso,
geralmente de substâncias sintetizadas para outras finalidades (Mather, 1998;
Freshney, 2000).
O ciclo celular é composto de duas fases funcionais e duas preparatórias. As
fases funcionais são a fase S, com síntese do DNA, e a fase M, ou mitose, com
segregação dos cromossomos duplicados. As fases preparatórias são a G1 (gap 1)
que prepara a célula bioquimicamente para as fases S e G2 (gap 2), que preparam a
célula para a mitose. As células que não se dividem ativamente podem ser
permanentemente removidas do ciclo por diferenciação ou ficar temporariamente
presas em um estado inerte, chamado de fase G0. (Alberts et al., 2004)
Pontos de checagem do ciclo celular podem interromper o ciclo se
determinados eventos não se completarem. A entrada na mitose é impedida, por
exemplo, quando a replicação do DNA não está completa; a separação dos
cromossomos na mitose é atrasada se alguns dos cromossomos não estiverem
adequadamente fixados no fuso mitótico. O avanço através de G1 e G2 é atrasado
Revisão de Literatura 33
pelos mecanismos de freagem se o DNA no cromossomo estiver danificado por
radiação ou por processos químicos. O atraso nestes pontos de checagem de dano
no DNA fornece tempo para o DNA danificado ser reparado; então a freagem do
mecanismo é liberada e o ciclo celular é retomado (Figura 1) (Alberts et al., 2004).
Figura 1 – Pontos de checagem do sistema de controle do ciclo celular (Alberts et al., 2004).
2.2. Apoptose
É essencial a compreensão da cinética do ciclo celular para o uso apropriado
da atual geração de drogas antineoplásicas. Muitos dos mais potentes agentes
citotóxicos atuam em fases específicas do ciclo celular e, portanto, têm atividade
apenas em células que estão em processo de divisão. Nos estudos in vitro da ação
citotóxica das drogas antineoplásicas, verifica-se que há distúrbios do ciclo celular e,
posteriormente, morte celular, embora cada droga possa apresentar mecanismos de
ação específicos. Isto sugere que vários estímulos citotóxicos iniciam os eventos que
conduzem à morte celular (Freshsney, 2000).
A morte celular pode ocorrer de duas formas: por necrose ou por apoptose
(Moraes et al., 2007). A necrose é a morte celular causada por trauma e, portanto,
Revisão de Literatura 34
há uma resposta inflamatória. As características das células em necrose são o
intumescimento celular e da mitocôndria, o aumento da permeabilidade da
membrana plasmática e ruptura da mesma e a desintegração das organelas e dos
componentes nucleares. A necrose é associada a danos graves como a hipóxia
aguda e a deficiência abrupta de nutrientes (Grivicich et al., 2007).
A apoptose, ou morte celular programada, foi primeiramente descrita em 1972
por Kerr, Wyllie e Currie para designar uma forma de morte celular que se distinguia
da morte por necrose, pois não se observavam danos à membrana plasmática e
nem resposta inflamatória. A apoptose pode ser ativada por diversos estímulos tais
como agentes fisiológicos na embriogênese e no sistema imune. Em condições
fisiológicas, a apoptose é um processo controlado, estando envolvida na
homeostase do tecido, representando um mecanismo de destruição seletiva das
células danificadas, cuja sobrevivência poderia prejudicar o organismo como um
todo. A célula, ao sofrer apoptose, apresenta alterações morfológicas e bioquímicas
distintas daquela em necrose. A célula apoptótica é caracterizada pelo encolhimento
celular, condensação e fragmentação da cromatina, que produz fragmentos de 50 a
300 kpb (Wyllie et al., 1980; Ramenghi et al., 2000; Maurillo et al., 2000; Grivicich et
al., 2007; Moraes et al., 2007).
A célula apoptótica se fragmenta formando os corpos apoptóticos. O
vazamento do citocromo c da mitocôndria para o citosol é uma das primeiras
características bioquímicas que precede as alterações no núcleo da célula em
apoptose (Figura 2). Estas propriedades diferem significantemente das
características de necrose ou morte celular acidental (Moraes et al., 2007).
Revisão de Literatura 35
A desregulação da apoptose pode interromper o delicado balanço entre
proliferação celular e morte celular e contribuir para o aparecimento de neoplasias e
doenças auto-imunes (Tompsom et al., 1993; Danial & Korsmeyer, 2004).
Quando o processo de apoptose é iniciado, ele promove a ativação de
eventos moleculares, que culminam na ativação de proteases, denominadas
caspases, as quais são responsáveis pela iniciação e execução da morte celular. A
regulação deste processo é realizada por fatores inibidores e ativadores da cascata
apoptótica, entre os quais podemos destacar os receptores de morte, pertencentes á
família do receptor TNF (Suda et al., 1993; Reiter et al., 2002), proteínas
pertencentes às famílias Bcl-2, IAPs, FLIPs (Timerbaev et al., 2006; Perianayagam
et al., 2006).
Figura 2 – Caracteristicas de uma célula em necrose (a) e apoptose(b) (Modificado de Anazetti,
2007).
A apoptose pode ser desencadeada por duas vias principais, a intrínseca e a
extrínseca. A chamada via extrínseca é iniciada pela ligação dos receptores de
morte que são membros da superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) e do
Revisão de Literatura 36
fator de crescimento neuronal (NGF). Entre os receptores de morte, estão TNF-R1,
Fas (Apo-1/CD95), TRAIL-R1, TRAIL-R2 e NGF-R. Esses receptores são proteínas
transmembranares contendo uma porção externa, à qual o ligante se associa, e uma
porção citoplasmática, que contem o domínio de morte DD (Death Domain), eles
podem ativar diretamente a via efetora de caspases, moléculas com atividade
proteolítica e que são diretamente responsáveis pelo colapso celular característico
do processo apoptótico (Sharma et al., 2000; Moraes et al., 2007).
Por outro lado, a via intrínseca começa pela ação de diferentes sinais de
estresse intracelular, tais como irradiação, agentes quimioterápicos, vírus, bactérias
e ausência de fatores de crescimento celular, os quais convergem para a
mitocôndria. Esta organela contém, no seu espaço intermembranar, fatores
apoptogênicos, como citocromo c, AIF (Apoptosis-Inducing Factor), pró-caspases 2,
3 e 9, SMAC/DIABLO (Second Mitochodria-DerivedA activator of Caspases/direct
IAP binding protein with low pI), Omi/HtrA2 (High temperature requirement protein-2)
e endonuclease G53. Na presença de sinais apoptóticos, esses fatores são liberados
no citoplasma e alguns deles participam da ativação das caspases. Essa via
apoptótica, centrada na mitocôndria, é conhecida como via intrínseca mitocondrial ou
via de ativação das caspases dependente da mitocôndria (Sharma et al., 2000;
Moraes et al., 2007).
A manutenção desses fatores na mitocôndria ou sua liberação no citoplasma
é determinada por proteínas da família denominada Bcl-2. Por tal motivo, essa
família e a família das caspases são consideradas os principais reguladores do
processo de apoptose (Figura 3).
Existem pelo menos 20 membros da família Bcl-2 identificados até o
momento, os quais podem ser divididos em dois grupos principais, dependendo de
Revisão de Literatura 37
sua função. O grupo pró-apoptótico (Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid, Bik, entre outros)
reúne os membros que induzem a liberação dos fatores apoptogênicos da
mitocôndria no citoplasma, resultando em apoptose. Já o grupo antiapoptótico (Bcl-
2, Bcl-XL, Mcl-1, Bcl-w e Boo, entre outros) reúne os que são responsáveis pela
manutenção desses fatores na mitocôndria, inibindo o processo de apoptose
(Moraes et al., 2007).
Figura 3 – Via intrínseca e extrínseca da apoptose (Modificado de Anazetti, 2007).
Revisão de Literatura 38
É provável que todas as células do corpo humano possuam a capacidade
intrínseca de sofrer apoptose. Isto sugere que todas as estruturas e processos
requeridos em pelo menos uma via de apoptose estão presentes na célula e
provavelmente sejam necessários à sua sobrevivência (Moraes et al., 2007).
Pesquisas realizadas na década de 1990 têm demonstrado que a morte
celular provocada pelas drogas quimioterápicas ocorre principalmente por indução
de apoptose. Esta classe de drogas tem o potencial de restabelecer a apoptose
celular, processo que se encontra alterado em células cancerígenas (Huschtscha et
al., 1998; Guchelaar et al., 1998; Huang & Oliff, 2001; Fesik et al., 2005; Moraes et
al., 2007).
2.3. Quimioterapia antineoplásica
A quimioterapia, tratamento que envolve drogas citotóxicas, tem sido
considerada como uma das principais ferramentas sistêmicas de combate ao câncer.
Pode ser aplicada em diferentes situações clínicas, como no tratamento primário de
neoplasias avançadas, sendo denominada, neste caso, de quimioterapia de indução.
Pode também ser utilizada como tratamento sistêmico após o controle do tumor
primário por cirurgia ou radioterapia. Sempre, no entanto, deve ser considerada a
eficácia da droga em relação ao tipo de tumor (El-Deiry, 1993; Burns & El-Deiry,
1999).
Dentre as principais formas de tratamento do câncer, para os quimioterápicos
há as seguintes classificações: (1) agentes alquilantes, que atuam por meio da
formação de ligações covalentes com o DNA, impedindo sua replicação; (2)
antimetabólicos, que bloqueiam ou subvertem uma ou mais vias metabólicas
envolvidas na síntese do DNA; (3) medicamentos obtidos por produção natural ou
Revisão de Literatura 39
alcalóides; (4) hormônios, dos quais os mais importantes são os esteróides, isto é,
glicocorticóides, estrogênios e androgênios e fármacos que suprimem a secreção de
hormônios ou antagonizam sua ação; (5) imunoterápicos, embora ainda
incipiente; (6) antibióticos, grupo de substâncias com estrutura química diversa,
que interagem com o DNA e inibem a síntese de proteínas; (7) inibidores mitóticos,
que levam à paralisação da divisão celular em metáfase ao atuar sobre a tubulina,
proteína formadora do fuso; (8) outros agentes, com mecanismos de ação que não
permitem a inclusão nos grupos apresentados anteriormente, como, por exemplo, a
dacarbazina, indicada no tratamento do melanoma avançado, sarcomas de partes
moles e linfomas (Rang, 2001; Goodman & Gilman, 2002; INCA, 2007).
No entanto, é importante salientar que os quimioterápicos antineoplásicos
podem atuar indistintamente em células sadias e tumorais, acarretando significativos
efeitos colaterais. As células do tecido hematopoiético, germinativo, aparelho
gastrintestinal e folículo piloso, devido à sua característica de rápida divisão celular,
são particularmente sensíveis a essas drogas. Assim, para favorescer a análise
padronizada desses efeitos, o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI
- National Cancer Institute) desenvolveu, no ano de 1982, o Common Toxicity
Criteria (Critérios comuns de toxicidade) para reportagem de efeitos e estudo de
novas drogas (Nicolini, 1988).
O Common Toxicity Criteria estrutura-se em apresentar efeitos adversos e
categorias em que encaixam esses efeitos: alérgicos/imunológicos, infecções,
auditivos, linfáticos, sangüíneos/da medula óssea, metabólicos, de musculatura
estriada esquelética, cardiovasculares, neurológicos, de coagulação, oculares,
dores, sintomas constitucionais, dermatológicos, pulmonares, endócrinos,
Revisão de Literatura 40
renais/geniturinários, gastrintestinais, malignidades secundárias, hemorragias,
funções sexuais/reprodutivas, hepáticas, e síndromes (NCI, 1999).
Na prática, tem sido difícil estabelecer uma dose efetiva que leve à máxima
destruição das células tumorais, induzindo, no hospedeiro, uma toxicidade reversível
e tolerável. Para a maioria desses quimioterápicos a margem entre a dose efetiva e
a tóxica é estreita, o que parece estar relacionado ao metabolismo da droga, rota e
protocolo de administração, além da sensibilidade intrínseca do tumor à droga.
Sendo que os efeitos colaterais mais comumente observados são toxicidade
hematológica, toxicidade gastrintestinal, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade,
toxicidade pulmonar, disfunções reprodutivas, toxicidade vesical e renal, toxicidade
dermatológica, anafilaxia, neurotoxicidade e alterações metabólicas (Silva et al.,
2003).
Com relação ao metabolismo, as alterações mais comumente verificadas são
hipomagnesemia; hiponatremia – devido à síndrome da excreção inapropriada de
hormônio vasopressina, além de efeitos colaterais primários de alguns
medicamentos, como vômitos persistentes e diurese (Gaffey et al., 1993).
A erradicação completa das células tumorais é conseqüência de múltiplos
fatores que refletem as interações entre o tumor e o hospedeiro, a toxicidade
cumulativa do medicamento, limitando seu uso, a presença de tumor em locais de
difícil acesso ao quimioterápico, o estado geral debilitado do paciente, não
permitindo doses adequadas, alterações na velocidade de crescimento do tumor e
odesenvolvimento de resistência adquirida pelo tumor ao quimioterápico, entre
outros (Gaffey et al., 1993; Menezes, 2007).
Revisão de Literatura 41
2.4. Compostos baseados em metal usados na terapia antitumoral
Metais preciosos já eram usados para propostas medicinais a.C. (há mais de
3500 anos atrás). O ouro foi utilizado em várias áreas da medicina na Arábia e
China. Naquela época, metais nobres eram confiáveis para beneficiar a saúde, pela
sua raridade, contudo, pesquisas recentes têm associado as propriedades
medicinais de drogas inorgânicas com suas propriedades biológicas específicas
(Allardice & Dyson, 2001).
Compostos baseados em metal ampliam a possibilidade de construir
moléculas com ligações mais adequadas para os objetivos específicos da biologia.
Na verdade, íons metálicos apresentam uma grande variedade de números de
coordenação e geometrias, que permitem organizar os ânions nos mais diferentes
ligantes orgânicos (com suas propriedades químicas e biológicas) de forma mais
adequada à distribuição espacial, proporcionando melhor modalidades de ataque às
moléculas alvo (Pizarro et al., 2009).
Em meados dos anos 1960, Rosenberg e colaboradores, descobriram, por
acaso, as propriedades anticancerigenas da cisplatina {cis-[PtCl2(NH3)2]} (Figura 4),
durante as investigações do efeito de campos elétricos sobre o crescimento de
Escherichia coli. Os pesquisadores estavam usando eletrodos de platina em uma
solução contendo cloreto de sódio e sais de amônio, entre outros constituintes,
quando observaram um evento inesperado, as bactérias tornaram-se longos
filamentos e passaram a não se replicar. A divisão celular de E. coli havia sido
inibida. Uma análise mais extensa desta observação levou à conclusão de que o
ciclo replicativo bacteriano foi inibido por complexos amino-platina formados por
eletrólise (Pizarro et al., 2009).
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Figura 4 –
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Revisão de Literatura 43
Figura 5 – Estrutura química de antitumorais a base de platina (Lookich & Anderson, 1998).
Depois de administrada intravenosamente e absorvida por difusão passiva
para o interior das células, a cis-Pt (II) adquire carga positiva durante uma reação de
ativação e reage, rapidamente, com bases púricas de nucleotídeos di- e trifosfatos,
formando ligações cruzadas com GpG e ApG (Figura 6). A posição do N7 das
guaninas é mais reativa do que da adenina e provém um forte sítio na fita de DNA
para ataques nucleofílicos pelos produtos de hidrólise do complexo de platina
(Bakhtiar & Ochiai, 1999).
Entretanto, a eficácia dessas drogas derivadas da platina é limitada pelos
mecanismos de resistência adquirida e inata. O uso da cisplatina na clínica é
também reduzido por apresentar neuro e nefrotoxicidade significantes, enquanto a
carboplatina é associada com a supressão de células da medula óssea (Lokich &
Anderson, 1998).
Essas descobertas têm estimulado a síntese de alguns complexos baseados
em metais do grupo da platina, como drogas potencialmente antitumorais, e que
demonstrem menor toxicidade em relação aos compostos de platina (Clarke, 2003).
Revisão de Literatura 44
Apesar do sucesso da cisplatina e medicamentos à base de platina, o mercado de
drogas ainda é acessível para novas drogas á base de metal que oferecem uma
melhor viabilidade, tais como a administração oral, o que pode ajudar a diminuir os
efeitos colaterais graves e custos clínicos. Além disso, novos estudos concentram-se
na investigação de novas drogas com maior eficácia, ou seja, drogas que interajam
de forma diferente com o DNA, o que pode levar à superação da resistência inata ou
adquirida de certos tipos de tumores (Pizarro et al., 2009) . Alguns resultados
promissores foram obtidos com derivados de diferentes metais, como Pt, Ti, Rh, Au
e Ru (Katsaros & Anagnostopoulou, 2002; Cabrera et al., 2004; Kostova, 2006)
Figura 6 - Diferentes tipos de adutos DNA-cisplatina, para uma dada seqüência aleatória. O aduto intrafita 1,2-GG (superior esquerdo) é considerado uma lesão crítica (Adaptado de Bakhtiar & Ochiai, 1999).
Em 1970, Clarke et al., relataram que pentamino-(purina)-rutênio(III) é capaz
de inibir a síntese de DNA e proteínas em células de carcinoma de nasofaringe in
vitro, o que desencadeou o interesse em complexos de rutênio como potenciais
Revisão de Literatura 45
fármacos anticancerígenos. Durante a década seguinte, Mestroni et al., (1989)
desenvolveu complexos hexacoordenados com Ru(II)dimetilsulfóxido e ligantes de
cloreto, em particular os cis- e trans-RuCl2 (dimetilsulfóxido)4, que apresentam
atividade anticancerígena in vitro e in vivo. Os complexos mostraram interagir tanto
in vitro e in vivo com o DNA, o seu alvo mais provável (Pizarro et al., 2009).
Hoje, existem duas drogas anticancerígenas baseadas em Rutênio em
ensaios clínicos: o NAMI A, desenvolvido em Trieste por Mestroni et al. (1998), e o
KP1019, desenvolvido por Keppler et al. (1996), em Viena. O antitumoral NAMI-A
possui uma citotoxicidade relativamente baixa para as células cancerosas, mas é
particularmente eficaz contra metástases de tumores sólidos, tanto em tumores
experimentais de murinos, quanto em tumores humanos enxertados em
camundongo nude, sendo pouco eficaz em tumores sólidos. A droga já concluiu a
fase I nos ensaios clínicos (Pizarro et al., 2009).
No entanto, em contraste com outras drogas anticâncer baseadas em metal
aqui analisadas, a atividade antimetastática do NAMI-A ocorre devido aos efeitos
combinados sobre o controle da angiogênese (possivelmente porque interfere com o
metabolismo de NO in vivo) e propriedades anti-invasivas para as células tumorais e
nos vasos sanguíneos. Embora tenha sido relatada a interação NAMI-A com o DNA
in vitro, essa ligação pode não contribuir para o seu mecanismo de ação (Vacca et
al., 2002; Pizarro et al., 2009) (Figura 7).
Figura 7 – Estrutura química do composto NAMI-A (transimidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio) (Vacca et al., 2002).
Revisão de Literatura 46
O composto Indazolium trans-[(tetracloreto)bis(1H-indazol)rutênio(III)]
(KP1019 ou FFC14A) (Figura 8) apresentou atividade citotóxica contra carcinoma de
cólon em ratos nas investigações pré-clínicas. O DNA tem sido proposto como um
dos alvos biológicos de KP1019, e também tem sido relatado que a droga
desencadeia a apoptose (Kapitza et al., 2005). No entanto, os mecanismos celulares
de ativação da apoptose ainda estão sob investigação (Egger et al., 2005, Kapitza et
al., 2005; Bergamo & Sava, 2007).
Figura 8 – Estrutura do composto de Rutênio KP1019 {Indazolium trans-[(tetracloro)bis(1H-indazol)rutênio(III)]} (Depenbrock, 1997).
2.5. Complexos de Rutênio e seu Mecanismo de Ação
O Rutênio-102 é o elemento químico metálico de símbolo Ru, pertencente ao
Grupo 8 da tabela periódica, o mesmo do ferro, presente na hemoglobina. Este
elemento químico possui propriedades antitumorais semelhantes à platina,
pertencente ao Grupo 10. É um metal branco, duro e brilhante, com quatro formas
cristalinas em seu estado reduzido. Se uma solução de clorato de potássio lhe é
adicionada, reage explosivamente oxidando-se. Sendo um metal raro, o rutênio teve
sua existência comprovada em 1844 na Rússia, pelo químico alemão Karl Karlovitch
Klaus (Greenwood & Earnshaw, 1997). Este optou por manter o nome sugerido por
Revisão de Literatura 47
seu conterrâneo, Gottfried Wihelm Osann, dedicado desde 1828 à pesquisa de um
novo elemento do grupo da platina a partir de um minério encontrado nos montes
Urais. O nome deriva de Ruthenia, topônimo latino para Rússia. Da classe dos
metais de transição, os compostos de rutênio são sais metálicos cujo mecanismo de
ação parece estar relacionado à sua estrutura espacial octaédrica (Greenwood &
Earnshaw, 1997).
A exploração de complexos de Rutênio para o uso como agente anticâncer foi
iniciada na tentativa de se obter uma droga menos tóxica e mais específica. Um
exemplo de especificidade proposto para complexos de Ru(III) sugere que eles se
liguem a transferrina e, conseqüentemente, podem ser alvos de células neoplásicas
e regulares positivamente a expressão de receptores de transferrina na membrana
celular, devido a um aumento do requerimento de ferro (Huxham et al., 2003).
A Transferrina (Tf), uma glicoproteína de aproximadamente 80 kDa, é o modo
primário de transporte de ferro para células de mamíferos e está relacionada com a
liberação de íons metálicos anticâncer em sítios tumorais (Frasca et al., 2001).
Srivastava et al., (1981) mostraram que rutênio radioativo como o 103RuCl3 liga-se à
soroalbumina humana e à Tf na corrente sanguínea de animais experimentais.
Contudo, o 103Ru-Tf foi preferencialmente encontrado em áreas de tumor,
provavelmente por causa do grande número de receptores para transferrinas na
superfície da célula tumoral (Frasca et al., 2001).
Desde que a Tf humana se encontra somente 30% saturada com o Fe+3 em
condições fisiológicas, é possível que a Tf seja o veículo para outros íons metálicos
trivalentes. Isto é relevante, porque as células tumorais apresentam um
requerimento nutricional elevado, o qual é favorecido pela angiogênese, que
promove o aumento do fluxo sanguíneo, e pelo aumento da permeabilidade das
Revisão de Literatura 48
membranas, resultando numa maior captação de nutrientes (Frasca et al., 2001). Em
muitos casos, a molécula alvo para agentes anticâncer baseados em metal parece
ser o DNA, mas outras interações moleculares também são importantes (Barca et
al., 1999).
O composto de rutênio é caracterizado por um mecanismo completamente
novo de ação: causa uma mudança de transferência de energia nas células (via
mitocôndria). Este princípio é facilitado pela ação da transferrina, considerando que
as células tumorais têm número aumentado de receptores para esta proteína, de
forma que em tecidos saudáveis, a concentração da droga foi presumivelmente mais
baixa e menos ofensiva (Frasca et al., 2001).
Uma das hipóteses sugere que os compostos de Rutênio (III) servem de pró-
drogas que são reduzidas, in vivo, pelas condições citoplasmáticas das células
tumorais: baixas concentrações de O2 em decorrência do consumo atípico de
nutrientes; pH baixo, devido à produção de ácido láctico na glicólise anaeróbia,
compensatória da falta de oxigênio; e à presença de glutationa em níveis
tipicamente altos. Essas alterações no ambiente citoplasmático das células tumorais
podem favorecer a conversão de Rutênio(II) a partir do Rutênio(III), intensificando
ligações ao DNA, com toxicidade seletiva às células tumorais (Figura 9) (Clarke,
2003; Silveira-Lacerda, 2009b).
Os possíveis mecanismos moleculares de ligação ao DNA têm sido
pesquisados. Os resultados sugerem que os complexos de rutênio promovem
crosslinks entre as duas fitas de DNA, possivelmente favorecido pelas restrições
impostas pela geometria octaédrica destes compostos. Este mecanismo difere da
formação de “crosslinks” intrafita induzida pela cisplatina e, conseqüentemente, as
linhagens de células tumorais que têm desenvolvido resistência à cisplatina, pela
Revisão de Literatura 49
aceleração da taxa de reparo de “crosslinks” intrafita, que são ainda susceptíveis aos
complexos de rutênio (Allardyce & Dyson, 2001).
Mestroni et al. (1989) sugeriram que o cis e trans-RuCl2(DMSO)4 interagem
com o DNA in vivo. Estudos de interação in vitro com nucleotídeos resultaram na
ligação entre rutênio e DNA, que ocorre principalmente no N7 da guanina entre
“clusters” na dupla hélice (Küng et al., 2001).
Figura 9 – Mecanismo de ação do rutênio no ambiente da célula tumoral (Adaptado de Clarke, 2003).
A redução do Ru(III) para Ru(II) pode ser um mecanismo fundamental da
ativação celular de drogas de rutênio (Depenbrock et al., 1997). Os compostos de
Revisão de Literatura 50
Ru(III) podem ser reduzidos em áreas tumorais com hipóxia em espécie ativa, a qual
é capaz de ligar-se rapidamente e causar dano ao DNA. Nestas condições,
complexos de aminorutênio podem ser ativados in vivo para coordenar uma
nucleobase em uma forma similar aos experimentos in vitro (Grguric-Sipka et al.,
2003).
O cis e trans-RuCl2(DMSO)4 são conhecidos por exibirem atividade
anticâncer, enquanto o cis-[Ru(acac)2(L)2](CF3SO3) (L=Im=Imidazol ou N-Met-lm)
mostrou citotoxicidade seletiva à hipóxia em alguns carcinomas de camundongo (Wu
et al., 2003). Muitos complexos de rutênio com estado de oxidação II ou III exibem
atividade antitumoral, especialmente contra cânceres metastáticos. Segundo Keppler
& Jakupec (2003) os complexos de rutênio têm atraído a atenção devido aos seus
potenciais antitumorais.
Em estudo feito com Hind[trans-RuCl4(ind)2] e com tris(8-quinolinato)gálio(III),
observou-se que o complexo de rutênio tem atividade particularmente alta contra
tumores coloretais, com melhor biodisponibilidade e concentração plasmática
adequada que o Gálio. Quando comparado ao complexo de Gálio, o composto de
Rutênio apresenta grande capacidade antiproliferativa e capacidade superior de
induzir apoptose in vitro (Seelig et al., 2002; Keppler & Jakupec 2003).
Vilaplana et al., (2006), estudaram o cis-dicloro-1,2-propilenodiamino-
N,N,N0,N0-tetraacetato rutênio (III) (RAP) de fácil solubilidade em água. Sua
atividade antitumoral tem sido avaliada in vivo. Recentes resultados mostraram que
o seu composto possui estabilidade quando se liga ao DNA e os danos causados no
DNA diminuem de acordo com a retirada do complexo de rutênio do meio de cultura.
Revisão de Literatura 51
Outro resultado importante foi obtido com o complexo de Ru(II)-DMSO com
ligantes imidazólicos, o qual desenvolveu atividade anti-metastática contra alguns
modelos tumorais em camundongos (Cabrera et al., 2004).
Estudos iniciais com isômeros de Ru complexado, o cis e trans-
RuCl2(DMSO)4 sugerem que os mesmos têm propriedades anticâncer,
especificamente anti-metástase em doses relativamente não tóxicas (Huxham et al.,
2003). A química sintética de metais de transição é bem desenvolvida,
particularmente com ligantes amino e imino, favorecendo para muitos pesquisadores
a inovação na formulação de novos metalofarmacêuticos.
Devido à estabilização por um forte campo de ligação, a maioria dos estados
de oxidação do rutênio [Ru(II), Ru(III) e Ru(IV)] em solução aquosa são usualmente
octaédrico e, freqüentemente, inertes a substituição de seus ligantes. As vantagens
da utilização dos complexos de rutênioamino no desenvolvimento de drogas são: (1)
os métodos seguros de sintetizar complexos estáveis com estruturas previstas, (2) a
habilidade e afinidade entre os ligantes, na transferência de elétrons e na razão de
substituição e (3) um conhecimento prévio dos efeitos biológicos dos complexos de
Ru (Clarke, 2003). Evidentemente, todos os compostos exibem diferentes
mecanismos de ação baseados na acidez do metal, dos ligantes e do seu estado de
oxidação (Meléncez, 2002; Grguric-Sipka et al., 2003).
Para Kapitza et al., (2003), o complexo trans-
[tetraclorobisindazóliorutenato(III)] e seu sal de sódio análogo, se mostraram efetivos
na terapia de tumor colo-retal autóctone de ratos, e o seu análogo imidazólico
mostrou atividade significativamente mais baixa. O complexo trans-
[tetraclorobisindazóliorutenato(III)] e seu sal de sódio análogo exibiram capacidade
de induzir apoptose, além de despolarização da membrana mitocondrial, redução da
Revisão de Literatura 52
atividade do Bcl2 e ativação da caspase 3. Esses efeitos podem ser parcialmente
inibidos pela N-acetyl-cisteína, indicando envolvimento do estresse oxidativo tanto
na indução da apoptose quanto na indução de danos no DNA. A inibição pela N-
acetil-cisteína é muito mais efetiva em células não malignas, apontando para um
potencial efeito protetor dos tecidos normais pela ação antioxidante.
Para os compostos de Ru(III), a redução in vivo para o Ru(II) pode ser
necessária para sua atividade. A captura celular deste rutênio também parece ser
mediada pela proteína transportadora de ferro, transferrina. Em geral, a
citotoxicidade dos complexos de rutênio está correlacionada com sua habilidade de
se ligar ao DNA. Porém, uma exceção é a atividade antimetastática do NAMI e seu
análogo (ImH)trans-[Ru(Im)(Me2SO)Cl4] que inibe a atividade colagenolítica tipo IV e
reduz o crescimento do tumor (Zhang & Lippard, 2003).
Um dos compostos a base de rutênio mais estudado é o NAMI-A (trans-
imidazoldimetilsulfóxidotetraclororutênio), sendo um dos complexos metálicos
antitumorais mais promissores desenvolvidos (Sava et al., 1999). Este composto
corresponde à molécula de NAMI com um imidazol+H+ no lugar do átomo de Na+.
NAMI-A foi inicialmente testado em modelos in vivo, manifestando efeitos
antimetastáticos, como no carcinoma de Lewis em ratos (Sava et al., 1999; Sava et
al., 2003), e com baixa toxicidade em ratos e cães (Bergamo et al., 2000). O
composto NAMI-A aumenta a espessura da cápsula em torno do tumor primário e da
matrix extracelular dos vasos sanguíneos tumorais e assim, previne a invasão pelas
células tumorais em tecidos e em vasos sanguíneos sadios (Sava et al., 1998).
Também testado em 24 pacientes humanos, inibiu a proliferação das células
cancerígenas (câncer sólido-pulmão) (Sava et al., 2003).
Revisão de Literatura 53
Estudos pré-clinicos com KP418 e KP1019 [trans-
tetraclorobisimidazolrutênio(III)] mostraram atividade promissora no tratamento de
tumores do colo retal (Kapitza et al., 2003; Hartinger et al, 2006). O RM175
[(N6C6H5C6H5)Ru(en)Cl]+, onde en-etilenodiamina é um composto organometálico de
rutênio que possui propriedades citotóxicas para estudos in vitro comparado com a
cisplatina (Aird et al., 2002). Outro complexo metálico de relevância que está sendo
estudado por Eric Meggers, na Universidade de Pensilvânia, o composto de rutênio
indolcarbozol que possui baixos valores de IC50 e mimetismo com estauroporinas
(Atilla-Gokcumen et al., 2006).
O NAMI-A (trans-imidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio) também possui
atividade em tumores sólidos metastáticos, em fase experimental (Sava et al., 2003).
Muitas drogas com compostos metálicos são usadas para outros tipos de
tratamentos além do câncer, como a prata, que é usada para o tratamento de
infecções microbianas, e o ouro, que atua no tratamento do câncer, vírus (HIV),
asma, malária e artrite reumática (Claire & Dyson, 2001).
A empresa farmacêutica MMI - Medical Marketing International anunciou, no
dia 30 de julho de 2007, a conclusão dos testes pré-clínicos de um composto de
rutênio que ela denominou MMI/ONCO 4403. Seus estudos de toxicidade teriam
demonstrado que o composto tem um perfil mais seguro que as substâncias
baseadas em platina. Os testes de toxicidade aguda em doses repetidas com o
MMI/ONCO 4403 não apresentaram supressão da medula óssea ou nefrotoxicidade
significativas, após 28 dias de observação (MMI, 2007).
O composto cloreto de cis-Tetraaminodiclororutênio(III) (cis-[RuCl2(NH3)4]Cl)
revelou apresentar atividade citotóxica sobre as linhagens tumorais humanas Jurkat
e HeLa, com IC50 de 190 e 3,5µM, respectivamente (Frasca et al., 2000). Silveira-
Revisão de Literatura 54
Lacerda et al., (2009b), trabalhando com o mesmo composto (Figura 10), verificou
que o mesmo apresentava atividade citostática significante, em estudo realizados
com células tumorais humanas e de camundongos. Os resultados indicaram que
este composto apresentava atividade citotóxica e genotóxica sobre células tumorais
A-20, SK-Br-3, e S-180, onde DNA de células tumorais tratadas apresentavam
fragmentação do material genético. Esse complexo de rutênio atua como droga
citostática ao impedir a progressão do ciclo celular da linhagem tumoral A-20 e
induzir a apoptose. Observou-se também que a atividade citostática exercida pelo
composto de rutênio sobre células mononucleares do sangue periférico humano foi
menor quando comparadas à atividade citostática deste composto em outras
linhagens tumorais que foram testadas (Silveira-Lacerda, 2009b).
Verificou-se ainda que a toxicidade do composto foi seletiva às células
cancerígenas e com potencial efeito imunoestimulante sobre células mononucleares
do sangue periférico humano (Silveira-Lacerda, 2009a). A citotoxicidade destes
complexos de rutênio parece estar correlacionada com sua ligação ao DNA, no
entanto, o mecanismo de ação destas drogas permanece ainda desconhecido
(Menezes et al., 2007).
Menezes et al. (2007), estudou o mesmo complexo de rutênio e observou que
esse composto possui atividade antitumoral sobre a linhagem tumoral Sarcoma 180
de camundongos in vivo e in vitro; onde valor encontrado para a DL50 foi de 99,76
mg kg-1 de animal, relativamente alta comparada às DL50 observadas para outros
quimioterápicos derivados de metal. De acordo com as análises bioquímica e
hematológica do sangue dos animais correlacionadas a histopatologia dos órgãos, o
complexo de cis-[RuCl2(NH3)4]Cl não provocou efeito toxicológico grave, não foi
genotóxico para células da medula óssea de camundongos, apresentou atividade
Revisão de Literatura 55
bactericida sobre Staphylococcus aureus e Escherichia coli, e demonstrou interagir
com o DNA plasmidial pUC18.
Ribeiro e colaboradores (2009) avaliaram, através de um estudo de
citogenética, cromossomos humanos em metáfase e possíveis fragmentação de
DNA, detecção de aberrações espontâneas e/ou induzidas pelo uso do composto
cloreto de cis-Tetraaminodiclororutênio(III), em cultura de linfócitos humanos do
sangue periférico. Sendo que não se observou alterações em nenhuma das células
tratadas, ou seja, sem danos no DNA.
Figura 10 – Estrutura Química do Composto de rutênio Cloreto de cis-Tetraaminodiclororutênio (III).
O complexo de Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) (Figura 11), assim
como o cis-Tetraamindiclororutênio(III), mostrou ação contra o tumor acístico
Sarcoma 180 in vivo, estatisticamente significativa e dose-dependente, e se mostrou
mais efetivo contra os tumores ascíticos em relação aos tumores sólidos (Barbosa,
2007).
Figura 11 – Complexo de Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III).
Revisão de Literatura 56
Desta forma, o complexo de Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) por
apresentar atividade antitumoral leva à várias investigações dos efeitos das
propriedades químicas e biológicas destes complexos de rutênio, tanto na área dos
antineoplásicos quanto na detecção de diferentes atividades para os mesmos
compostos.
2.6. Cultura de Células
Embora a supremacia das células animais na produção dos biofármacos mais
sofisticados seja um processo recente, consolidado na década de 1990, as primeiras
experiências de cultivo de células animais, ainda que incipientes, datam do inicio do
século XX (Moraes et al., 2007).
As culturas celulares são métodos laboratoriais que, sob condições
apropriadas, tanto vegetais como animais, multiplicam-se e até diferenciam-se,
possibilitando as mais variadas análises científicas. O termo cultura de células
refere-se à cultura de células derivadas dos tecidos originais provenientes de uma
cultura primária, de uma linhagem celular ou de células provenientes do tratamento
por desagregação enzimática, química ou mecânica (Moraes et al., 2007).
A cultura tecidual foi uma das primeiras idéias do início do século XX como
método para estudar o comportamento das células animais, livres das variações
causadas durante a homeostasia normal e da tensão causada, pelo experimento em
si. Considerando as implicações do próprio nome, as técnicas foram elaboradas
primeiramente com fragmentos teciduais não desagregados dos tecidos, e o seu
crescimento era restrito pela migração das células provenientes destes tecidos, com
ocasionais e raras mitoses (Mather, 1998; Moraes et al., 2007).
A demonstração de que os tumores humanos também podiam ser cultivados
Revisão de Literatura 57
in vitro por meio de linhagens celulares contínuas levou ao interesse para a cultura
de células humanas (Mather, 1998; Freshney, 2000).
A maioria das células normais ou malignas tem uma sobrevida curta de
alguns dias ou semanas in vitro. Caso estas se duplique, podem durar cerca de
algumas semanas, ou até meses. Poucas destas células conseguem estabelecer
linhagens e imortalizar-se. A imortalização não é necessariamente uma
característica neoplásica ou de transformação maligna (Mather, 1998; Moraes et al.,
2007).
Culturas preparadas diretamente de tecidos de um organismo, sem a
proliferação celular in vitro, são chamadas de cultura primária, que pode ser feita
com ou sem um passo inicial de fracionamento para separar diferentes tipos de
células (Alberts et al., 2004).
Linhagens de células tumorais são mais fáceis de serem geradas, pois elas
podem se proliferar em alta densidade no frasco de cultura. Propriedades similares
podem ser induzidas experimentalmente em células normais pela transformação
com um vírus de indução. O resultado de linhagem de células transformadas, é que
pode causar tumores se injetadas em animais suscetíveis ao tumor. Ambas as
linhagens de células imortalizadas e transformadas são bastante utilizadas na
pesquisa de células, como fonte de grande número de células de um tipo uniforme,
especialmente aquelas que possam ser armazenadas em nitrogênio liquido a -196ºC
por um período indefinido e reter suas viabilidades, quando descongeladas. Tal fato
é importante se ter sempre em mente, pois células, em ambos os tipos de linhagens,
sempre diferem nos importantes segmentos de seus progenitores normais nos
tecidos de que são derivados (Alberts et al., 2002).
Há inúmeras razões para o não crescimento destas células em culturas como,
Revisão de Literatura 58
por exemplo, um balanço nutricional errôneo, a necessidade de fatores de
crescimento, a necessidade da interação com o estoma para crescimento celular
entre outros pré-requisitos, as aberrações genéticas, a diferenciação terminal e a
senescência natural (Freshney, 2000).
O desenvolvimento de linhagens celulares é frequentemente difícil. A cultura
primária, em geral, não é capaz de propagarem-se devido à nutrição. Apesar disso,
alguns tumores podem ser subcultivados e outros se imortalizam, ou seja,
estabelecem linhagens celulares continuas (Freshney, 2000).
2.7. Citotoxicidade
Definições de citotoxicidade variam, dependendo da natureza do estudo ou
simplesmente da indução das alterações metabólicas. Enquanto um agente
antitumoral pode ser requerido para destruir a célula, demonstrações da toxicidade
de outros fármacos podem requerer análises de mudanças metabólicas ou uma
alteração de sinalização célula-célula, que poderia promover um aumento
inflamatório ou uma resposta alérgica (Flint, 1998 apud Silveira-Lacerda, 2003).
De acordo com Freshney (2000), uma vez que uma célula é retirada de um
ambiente normal in vivo, a questão da viabilidade, particularmente no curso de
manipulação experimental, é fundamental.
Novas drogas, cosméticos e outros compostos químicos partem para os seus
extensivos testes de citotoxicidade. Estes testes normalmente envolvem um grande
número de animais experimentais, embora na Europa, estes experimentos estejam
sujeitos à nova legislação. Existem muitas pressões, sociais e econômicas, para se
desenvolver ao menos parte dos testes de citotoxicidade in vitro. A introdução de
linhagens de células especializadas e culturas organotípicas interativas e o uso
Revisão de Literatura 59
contínuo de culturas estabelecidas podem fazer com que estas propostas sejam
razoávies (Mather, 1998; Freshney, 2000; Moraes et al., 2007).
A toxicidade é um complexo evento in vivo, onde pode haver dano celular
direto, como uma droga anticancerígena citotóxica, efeitos fisiológicos como
transporte através de membrana no fígado, neurotoxicidade no cérebro, efeitos
inflamatórios e outros efeitos sistêmicos. Normalmente é difícil monitorar os efeitos
sistêmicos e fisiológicos in vitro, só que muitos ensaios determinam efeitos a nível
celular ou citotoxicidade. Definições de citotoxicidade variam, dependendo da
natureza do estudo, da mortalidade ou simplesmente da indução das alterações
metabólicas. Enquanto um agente anticancerígeno pode ser requerido para destruir
células, demonstrações da toxicidade de outros fármacos podem requerer análises
de mudanças metabólicas ou uma alteração de sinalização célula-célula, que
poderia promover um aumento inflamatório ou resposta alérgica (Flint, 1998; Moraes
et al., 2007).
Hoje, ensaios citotóxicos são bastante simplificados, baratos e fáceis de
quantificação e reprodução. Embora alguns autores considerem inadequados para o
desenvolvimento de novas drogas, por requererem boa ênfase na especialidade do
alvo molecular e uma precisa regulação metabólica, testes de citotoxicidade são
ainda relevantes, mas é bastante evidente a necessidade de suplementar com
testes refinados que levem a possíveis intervenções metabólicas (Silveira-Lacerda,
2003).
É importante que muitas medidas in vitro possam ser interpretadas em termos
de resposta in vivo das células, ou ao menos que as diferenças existentes entre os
parâmetros in vitro e in vivo sejam claramente compreendidas. Uma resposta tóxica
pode ser medida por alteração na sobrevida ou no metabolismo, enquanto que o
Revisão de Literatura 60
maior problema in vivo pode ser uma resposta tecidual ou sistêmica. Para que testes
in vitro sejam mais efetivos, modelos de respostas devem ser construídos, talvez
utilizando culturas organotípicas reconstruídas de vários tipos de células diferentes e
cultivadas em hormônios apropriados (Mather, 1998; Freshney, 2000).
Tecidos complexos e reações sistêmicas não deveriam ser assumidos, pois
não são simuladas in vitro. Ensaios para respostas inflamatórias, desordens
teratogênicas e disfunções neurológicas podem trazer um provável desentendimento
de interção célula-célula e a interação de hormônios endócrinos (Freshney, 2000).
De acordo com Flint (1998), testes in vitro são usados na avaliação do
potencial de toxicidade ou como parte de uma investigação do mecanismo de
identificação previa na toxicidade in vivo. Por exemplo, nos estágios iniciais de
descobertas farmacêuticas, quando o mínimo é conhecido sobre as propriedades de
uma nova molécula, simples triagens preditivas são apropriadas. Desta maneira, as
triagens de toxicidade são rotineiramente usadas para detectarem novas drogas
citostáticas e antitumorais, e também em outros programas de descobertas de
drogas para determinar se a toxicidade é induzida nas concentrações que tenham o
efeito farmacológico desejado. Desta forma, a descoberta de que os compostos de
Rutênio (III) podem apresentar atividade antitumoral, eleva a necessidade de
investigações sobre os possíveis efeitos em relação ao mecanismo de ação.
Justificativa 61
3. JUSTIFICATIVA
O conhecimento da biologia celular e molecular do câncer tem permitido aos
pesquisadores buscar novos alvos terapêuticos para tratar esta doença e minimizar
seus efeitos tóxicos sistêmicos sobre as células saudáveis. O interesse por novos
fármacos antitumorais a base de metais vem crescendo nestes últimos anos, devido
aos bons resultados obtidos por grupos de cientistas. Estudos revelam que os
complexos de rutênio apresentam uma incrível capacidade de inibir a mitose, o que
pode estar relacionado com a inibição da síntese de DNA, o bloqueio do ciclo celular
na fase G2 ou até mesmo nos processos de expressão gênica.
A habilidade de modular o recebimento e a liberação de mensageiros
celulares e outras moléculas intercelulares, como, por exemplo, o Ca2+ revela que as
ações realizadas pelos complexos de Ru(II) e Ru(III) na célula pode ser mais
complexo e amplo do que se espera, abrindo um importante caminho para se
entender os mecanismos pelos quais os complexos coordenados desempenham
suas atividades no ambiente celular, conhecimento este que é crucial para o
sucesso da aplicação clínica destes complexos.
O estudo com o complexo Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III), por
apresentar principalmente atividade antitumoral in vivo, leva a necessidade de se
realizar uma triagem citotóxica e antitumoral em novas linhagens de células tumorais
e normal ainda não testadas. Isto pode conduzir a uma avaliação mais profunda e
detalhada de forma a permitir a compreensão das diferentes propriedades químicas
e biológicas desse novo composto. Estudando os possíveis efeitos biológicos,
toxicológicos, na estabilidade genômica; o mecanismo de ação, pode-se levar ao
desenvolvimento de fármacos com atividades mais acentuadas e toxicidade
Justificativa 62
diminuída em relação aos fármacos antitumorais atualmente utilizados pela
medicina.
Trata-se de um composto de Rutênio(III), sintetizado no Instituto de Química
da Universidade Federal de Uberlândia que iniciou seus estudos no Laboratório de
Genética Molecular e Citogenética da Universidade Federal Goiás com pesquisas in
vivo. Vê-se a necessidade de estudos pré-clínicos in vitro para maiores
investigações do mecanismo de ação deste complexo de rutênio se tornam
importantes para que se possa definir seu potencial clínico, contribuindo para o
desenvolvimento de uma nova possível droga antitumoral, com propriedades
complementares àquelas exibidas pelos fármacos utilizados na clínica atual.
Objetivos 63
4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GERAL
O objetivo geral do presente estudo foi avaliar o potencial citotóxico,
genotóxico, apoptótico e antitumoral de um novo composto a base de rutênio, o
Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) como substância bioativa de origem
sintética utilizando diferentes linhagens celulares in vitro.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar o efeito inibidor da proliferação celular e potencial genotóxico,
utilizando células meristemáticas de Cebola (Teste Allium cepa);
• Avaliar o efeito inibidor da proliferação celular em linhagens de células
neoplásicas humanas in vitro K-562 (leucemia mielóide crônica), A-549
(carcinoma alveolar de pulmão humano);
• Avaliar o efeito inibidor da proliferação celular em linhagem de células
humanas normais in vitro MCR5 (fibroblasto de pulmão humano);
• Avaliar o efeito do composto de rutênio no ciclo celular e efeito apoptótico,
utilizando citometria de fluxo em linhagens de células neoplásicas;
• Avaliar o nível de degradação de DNA das células tratadas ou não com
diferentes concentrações do composto de Rutênio por meio do teste cometa.
Metodologia 64
5. METODOLOGIA 5.1. Síntese do Composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III)
O composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) foi sintetizado no
Laboratório de Química Supramolecular do Instituto de Química da Universidade
Federal de Uberlândia (UFU), seguindo os procedimentos descritos por Gleu &
Breuel (1938) com algumas modificações adaptadas por Pavanin (1989).
Resumidamente, 1 grama (3,4x10-3 moles) de (RuCl3) foi adicionado a 25 mL de
hidróxido de amônio concentrado e previamente desaerados com argônio. A mistura
foi então refluxada sob argônio até a dissolução do sólido e aparecimento de uma
coloração rosada. Em seguida, adicionou-se 0,7g de Ditionato de sódio à solução
quente, sendo esta em seguida resfriada em banho de gelo, havendo então o
aparecimento de um sólido amarelo-avermelhado {(RuOH(NH3)5}2S2O6), que foi
coletado por filtração, lavado com pequenas quantidades de etanol e éter e secado
ao ar. Uma segunda porção de cristais foi obtida por adição de etanol (50mL). Este
material foi coletado por filtração, lavado com etanol e eter e secado ao ar. O
{(RuOH(NH3)5}2S2O6) foi dissolvido em ácido oxálico saturado (11 mL). A solução foi
então refluxada por aproximadamente 10 minutos sob lâmpada de argônio, havendo
o aparecimento de um precipitado amarelo (cis-[Ru(C2O4(NH3)4]2(S2O6)), a mistura
foi então resfriada para completar a precipitação. Os cristais de (cis-
[Ru(C2O4(NH3)4]2(S2O6)) foram isolados por filtração, lavados com etanol e éter, e
secados ao ar. O (cis-[Ru(C2O4(NH3)4]2(S2O6)) foi dissolvido em HCl a 5 molar
(12mL) e a solução foi refluxada por 10 minutos. A solução foi filtrada a quente e 30
mL de etanol foram adicionados ao filtrado. A solução foi resfriada, havendo então a
formação do sólido, que foi coletado por filtração, lavado com etanol e éter e secado
ao ar, resultando em um rendimento final de 55%.
Metodologia 65
O composto foi caracterizado por espectroscopia na região do ultravioleta,
utilizando um espectrofotômetro HP 8453 com arranjo de diodos, com interface PC
compatível com um HP Vectra XM, apresentando suas bandas características em
312 e 350 nm. Depois de sintetizado, o composto foi posteriormente encaminhado
ao Laboratório de Genética Molecular e Citogenética (UFG) para os estudos in vitro.
5.2. Teste Allium cepa
Os efeitos de inibição do crescimento de células meristemáticas de cebola
foram avaliados de acordo com o protocolo definido por Fiskesjö (1993).
Resumidamente, catáfilos de cebolas, de tamanho, forma e cores similares, além de
peso médio de 90g, foram colocados em água filtrada, trocada a cada 24h e
guardados em temperatura constante de 25o C, com fluxo de ar contínuo, por 120
horas. Os bulbos foram então pesados e suas raízes contadas e medidas
diariamente para estudo de controle morfológico. Uma vez que as raízes atingiram o
tamanho de 4 a 5 cm, as cebolas foram colocadas em uma solução aquosa
contendo Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) nas concentrações de 0,01
mg.mL-1 (38 μM), 0,05 mg.mL-1 (190 μM) e 0,1mg.mL-1 (380 μM) por 24 e 48 h,
sendo que a solução foi trocada a cada 24 horas. Antes da exposição à solução de
rutênio, um quarto das raízes de cada bulbo foi coletada para compor o grupo do
controle negativo. Todos os testes foram repetidos em triplicata, sendo que cada
uma teve um grupo controle onde a solução de rutênio foi substituída por água
destilada, para controle negativo, e nitrato de chumbo(II) [50 μM de Pb(NO3)2], para
controle positivo. Dez raízes de cada bulbo foram coletadas em cada um dos
períodos e concentrações. Estas raízes foram colocadas em uma solução de
Carnoy’s [etanol (99%) e ácido acético glacial (3:1)] por 30 minutos, lavadas com
Metodologia 66
água destilada por três vezes e submetidas à hidrólise com solução aquosa de ácido
clorídrico (HCl) 1N a temperatura de 60°C. As raízes foram então secas e sua região
apical (aproximadamente 0,5 cm da região da ponta da raiz) foi macerada e então
corada com orceína acética. Para o estudo do índice mitótico (IM) e de aberrações
cromossômicas (AC), foram analisadas, em média, 5.000 células de cada bulbo. O
IM foi calculado para cada tratamento através da razão entre o número de células
em divisão divido por 100. Anormalidades celulares, assim como cromossômicas
(células binucleadas e polinucleares, micronucleos, pontes cromossômicas,
cromossômos atrasados e adiantados, cromossomos perdidos, má formação nuclear
e núcleos fragmentados) foram contadas nas células mitóticas e os resultados foram
plotados em tabelas e gráficos, para análise.
5.3. Droga antitumoral controle
Como controle positivo, utilizou-se as drogas Cisplatina (5 a 50 µM) e
Paclitaxel (5 a 50 µM) liofilizadas, obtida comercialmente da Sigma (Sigma-Aldrich
Co St Louis, MO, EUA).
5.4. Preparação do composto de Rutenio para ensaios biológicos in vitro
O composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) foi pesado e
dissolvido em meio de cultura RPMI 1640 ou DMEN suplementado com 10% de soro
bovino fetal na concentração de 2mg.mL-1 (Solução estoque). Posteriormente foi
submetido a um ultra-som para dissolução completa e então o composto foi
esterilizado por filtração em membranas de 0,22 µm. Como controle positivo, foi
utilizado as drogas Cisplatina (50 µM) e Paclitaxel (25 µM).
Metodologia 67
5.5. Meio de cultura celular
Para a manutenção das linhagens de células tumorais, a dissolução dos
compostos testados e a realização dos ensaios biológicos seguiram o protolocolo
indicado pelo American Type Culture Collection (ATCC Rockville, Maryland, EUA)
utilizando-se meio RPMI-1640 ou DMEM (Sigma, St. Louis, MO, EUA) suplementado
com 10% de soro bovino fetal (Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e 1% de
glutamina, eritromicina e estreptomicina (Sigma) em estufa com 5% de CO2 a uma
temperatura constante de 37ºC. O meio RPMI 1640, DMEM e o soro fetal bovino
foram adquiridos da Gibco® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os antibióticos foram
adquiridos da Sigma (Sigma-Aldrich Co St Louis, MO, EUA ).
5.6. Linhagens celulares tumorais e normais
Foram utilizadas às seguintes linhagens tumorais: K562 (leucemia mielóide
crônica), MCR-5 (fibroblasto de pulmão humano) e A549 (câncer de pulmão
humano) provenientes do American Type Culture Collection (ATCC Rockville,
Maryland, EUA).
5.7. Cultura de células tumorais
As células tumorais foram cultivadas em frascos para cultivo celular estéreis
com 75 e 175 cm2, contendo meio RPMI 1640 ou DMEN (de acordo com a
caracterista de cada linhagem), acrescentado de glutamina 2 µmol.L-1, bicarbonato
de sódio 10 mmol.L-1 e soro fetal bovino 10% (v/v), seguindo o protocolo da ATCC
(American Type Culture Collection). Para fins experimentais, as células foram
cultivadas em microplacas de 96 poços, fundo chato com tampa, na presença ou
ausência cisplatina ou Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) conforme as
Metodologia 68
concentrações descritas anteriormente. As células foram incubadas em estufa a
37ºC com atmosfera contendo 5% de CO2.
Para a realização dos ensaios, previamente as linhagens tumorais aderentes
em fase de crescimento logarítmico foram removidas dos frascos de cultura celular
pela adição de 1 mL de tripsina 0,5% em solução tampão Fosfato 0,01 mol.L-1, pH
7,2 em solução salina 0,9% (PBS). Os frascos com solução de tripsina foram então
mantidos sob agitação manual por aproximadamente 60 segundos. Em seguida,
foram adicionados 10 mL de meio completo para neutralizar a tripsina e transferidos
para tubos plásticos.
Para células em suspensão, as mesmas foram retiradas diretamente das
garrafas e transferidas para tubo Falcon para procedimento de lavagem. As células
foram lavadas três vezes por meio da centrifugação a 1000 rpm por 10 minutos em
meio completo. Ao final da última lavagem, as células foram ressuspendidas em 5
mL de meio RPMI completo. Uma alíquota de 10µL da suspensão celular foi
colocada em 90 µL de Azul de Tripano 1% (m:v) (Sigma-Aldrich Co St Louis, MO,
EUA) e contadas em hemocitômetro (Câmara de Neubauer).
5.8. Avaliação do potencial citotóxico e antitumoral (inibição de proliferação
celular)
Para realização do estudo de citotoxicidade sobre as linhagens celulares
tumorais e normais, foram empregados três diferentes ensaios: método de redução
do tetrazólio (que avalia a atividade mitocondrial), o método de viabilidade por azul
de tripano (que avalia a integridade da membrana celular) e o ensaio de
sobrevivência clonogênica (ou eficiência de clonagem) em linhagens celulares (que
avalia se o agente é potencialmente genotóxico). Em todos os ensaios as células
Metodologia 69
foram incubadas com as diferentes concentrações do complexo de rutênio(III). As
mesmas foram incubadas em estufa úmida com 5% de CO2 por 48 h.
• Método de redução do tetrazólio
Para avaliar a atividade citotóxica e antitumoral do composto Ditionato de cis-
Tetraamino(oxalato)rutênio(III) foi utilizado o método colorimétrico do MTT. O
princípio deste método descrito por Mosman (1983) consiste em medir indiretamente
a viabilidade celular pela atividade enzimática mitocondrial das células vivas. Para o
teste do MTT, 2×103 de células foram semeadas em microplacas de 96 poços na
ausência ou presença do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III)
ou cisplatina (droga controle) e incubadas por 24, 48 e 72 h em estufa a 37ºC com
atmosfera contendo 5% de CO2. Ao final do período de incubação, foi adicionado
aos poços de cultivo celular 10 μL de MTT na concentração de 5mg.mL-1, e após 3 h
de incubação com o MTT, foram acrescentados 50 μL SDS a 10% diluído em
HCL/0,01N. A quantificação da densidade óptica (DO) foi medida em
espectrofotômetro (Awareness Technology INE/ Stat Fax 2100). A porcentagem de
viabilidade celular foi determinada a partir da seguinte fórmula:
% Viabilidade = (Absorbância do Tratamento)/(Absorbância do controle negativo)
×100%
• Método de viabilidade por azul de tripano
A viabilidade celular após exposição às drogas pode ser medida pela exclusão
de corantes supravitais como o azul de tripano. O princípio deste teste consiste em
medir indiretamente a viabilidade celular através da integridade de membrana, onde
as células mortas que apresentam a membrana danificada absorvem este corante e
Metodologia 70
consequentemente coram-se em azul, já as células vivas permanecem intactas sem
coloração. Para o ensaio de azul de tripano, foram realizados os mesmos
procedimentos de plaqueamento e período de incubação como os realizados no
ensaio do MTT. No entanto, ao final do período de incubação, alíquota de 10 μL de
suspensão de células foram colocadas em 40 μL de azul de tripano a 1%, e desta
solução foi retirada uma alíquota para análise em câmara de neubauer, segundo
Peres & Curi (2005). Para determinar a porcentagem de viabilidade celular foi
utilizada a mesma fórmula descrita no item anterior. Ambos os ensaios MTT e Azul
de tripano foram utilizados para calcular o valor da concentração que inibe 50% do
crescimento celular (IC50) Para os ensaios, foram realizados três experimentos
independentes feitos em triplicata.
• Ensaio de sobrevivência clonogênica
Para analisar a capacidade proliferativa de células de formarem colônia após
exposição a um determinado agente antiproliferativo utiliza-se o ensaio de
sobrevivência clonogênica. O ensaio de sobrevivência clonogênica foi realizado
segundo Bezerra et al. (2008), onde 3×102 de células tumorais A549 foram
semeadas em frascos de cultura de 25 cm2 por um período de 24 h para aderência
das células, após este período foi retirado todo o meio celular e em seguida as
células foram tratadas com diferentes concentrações do composto Ditionato de cis-
Tetraamino(oxalato)rutênioIII (0,15 a 150 µM) por 24 e 48h. Após os períodos de
tratamento as células foram lavadas com solução de PBS para retirada do composto
e em seguida foi adicionado meio às garrafas. Posteriormente as células foram
incubadas por 10 dias, sendo as culturas observadas diariamente com o auxílio de
microscópio invertido (Leica). Ao final dos 10 dias de incubação o meio foi
Metodologia 71
descartado e as células lavadas com solução de PBS. Em seguida as células foram
fixadas com uma solução de metanol/ácido acético/água por 30 min, após período
de fixação as células foram coradas com Giemsa por 15 min. Para análise das
colônias a garrafas foram escaneadas em impressora (HP) e posteriormente foi feito
a análise com o auxílio do software Clono-Couter (Niyazi et al., 2007).
5.9. Ensaio cometa
O ensaio cometa é um método versátil e sensível para a detecção de quebras
de fita simples e dupla no DNA. Ele tem sido amplamente utilizado como uma
ferramenta para avaliações das respostas celulares aos danos no DNA, podendo ser
aplicado em estudos de genotoxicidade, biomonitoramento, ecotoxicológicos e ainda
alguns estudos que envolvem saúde humana (Tice et al., 2008).
Umas das maiores vantagens do Ensaio Cometa é a possibilidade de sua
aplicação em diferentes tipos celulares que não necessariamente estejam em
proliferação, tanto in vitro quanto in vivo (Collins et al.,1997; Trzeciak et al., 2008). A
versão alcalina do cometa (single-cell gel electroforesis) foi seguida de acordo com
Singh et al., (1988), com pequenas modificações.
As linhagens celulares foram quantificadas e depois foram tratadas com
concentrações diferentes do Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III), controle
positivo (Cisplatina) e negativo, por 24, 48 e 72 horas e então homogeneizados e
misturados em agarose low-melting (baixa fusão) e imediatamente colocada em uma
lâmina que já continha uma camada de gel de agarose a 1%. A lâmina com as duas
camadas de agarose foi colocada a 4°C por 5 minutos. Após foram incubadas em
uma solução de lise (2,5M NaCl, 10mM Tris, 100mM EDTA, 1% Triton X-100 and
10% DMSO, pH10,0) e colocada a 4°C por duas horas para remover proteínas e
Metodologia 72
membranas. Posteriormente, as lâminas foram colocadas na eletroforese com
tampão (300mM NaOH, 1mM EDTA, pH > 13,0). A corrida de eletroforese foi por 20
minutos, a 0,9 V/cm, 300 mA e a 4°C. Todo o procedimento foi realizado no escuro
ou sob luz amarela, de forma a prevenir danos ao DNA. As lâminas foram
mergulhadas em solução de neutralização (0,4M Tris, pH 7,5), lavada com água
destilada e secas a temperatura ambiente.
As lâminas foram preparadas em duplicatas e 100 núcleos analisados (50
núcleos para cada duplicata) utilizando microscópio de fluorescência (Leica)
equipado com filtro de excitação de 515-560nm, um filtro de barreira de 590nm, e
objetiva de 40x.
Figura 12 – Classificação de leitura para o Ensaio Cometa: ausência de cauda, ou seja, sem dano (classe 0); cauda menor do que o diâmetro da cabeça, muito pouco dano (classe 1); cauda até duas vezes o diâmetro da cabeça, pouco dano (classe 2): cauda maior que duas vezes o diâmetro da cabeça, alto dano (classe 3) e sem cabeça, dano máximo (classe 4) (Ribeiro et al., 2009).
Os núcleos sem danos no DNA apareceram intactos e sem cauda. Os
cometas foram classificados pelo software CometScore 15, em classes: ausência de
Metodologia 73
cauda, ou seja, sem dano (classe 0); cauda menor do que o diâmetro da cabeça
(classe 1); cauda até duas vezes o diâmetro da cabeça (classe 2): cauda maior que
duas vezes o diâmetro da cabeça (classe 3) e sem cabeça (classe 4) (Figura 12). As
recomendações para o ensaio cometa consideram tanto avaliações visuais quanto
as avaliações usando software (Burlinson et al., 2007). O total da contagem dos
danos foi de 100 por amostra, perfazendo um total de 500 núcleos (desde a
classificação 0 – sem danos – até classificação 4 – danos totais).
5.10. Citometria de fluxo: Avaliação das fases do ciclo celular e apoptose
O estudo de apoptose tem alterado a maneira de se encarar a ação
antineoplásica de agentes quimioterápicos. Há evidências de que ação antitumoral
de muitas drogas se deve em maior parte à sua ação sobre o limiar de apoptose do
que no potencial destrutivo celular. Desta forma, foram realizados estudos de
apoptose e o potencial antimitótico das células tumorais citadas anteriormente após
tratamentos com diferentes concentrações de rutênio.
• Avaliação da cinética do ciclo celular
Previamente, 5×105 de células tumorais foram cultivadas por 24, 48 e 72
horas na presença ou ausência de Ditionato de cis-Tetraamin(oxalato)rutênio(III). Ao
final do período de incubação, as células tumorais foram coletadas em tubos para
citometria de fluxo, lavadas por três vezes a 900 rpm/5 minutos/10ºC em solução
PBS contendo 1% de soro fetal bovino. Ao final da última lavagem, o sobrenadante
foi desprezado, o “pellet” celular foi levemente agitado e incubado com 3 mL de
MeOH 100%/60 minutos/4ºC. As células foram novamente lavadas uma vez em
solução de PBS a 900 rpm/5 minutos/10ºC, o sobrenadante desprezado e o “pellet”
Metodologia 74
celular ressupendido em 50 µL com solução corante de iodeto de propidio contendo
RNAse 20 µg.mL-1 de RNAse e 10 mg.mL-1 de Iodeto de propídio diluído em PBS.
As células foram incubadas por 30 minutos/4ºC em ambiente escuro e, ao final do
período de incubação, lavadas por mais 3 vezes em solução de PBS, o “pellet”
celular suspendido em 1mL de PBS e levadas para análise no citômetro de Fluxo
FACS Canto II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA).
4.11. Eletroforese em gel de agarose
As células de linhagens tumorais e normais foram incubadas com diferentes
concentrações da droga em estudo durante 48 h, em estufa úmida, com 5% de CO2
no ar. Uma quantidade de 2×106 células foram tratadas com diferentes
concentrações de cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (de 0,15 a 150 µM) por 24 horas a 37
°C e 5% CO2. As células foram então retiradas do tratamento e centrifugadas a
300×g/15 min/10°C e lavadas com PBS. As células foram então ressuspendidas a
uma concetração de 1×106 cells mL-1 em um tampão de extração (Tris-HCl a 1
molar, Na2EDTA a 2 molar, 0,5mg L-1 de SDS) e tratadas com 20 mg L-1 de RNase A
a 37°C por 60 minutos. Passado o tempo, as células foram então incubadas com
proteinase K (100 mg L-1) a 37°C por 60 minutos. Depois da digestão por proteinase
K, foi adicionada solução salina (NaCl a 6 M) e centrifugada a 13,000×g por
10minutos. O sobrenadante foi então coletado e um volume igual de etanol (-20°C)
foi adicionado. As amostras foram então centrifugadas a 13,000×g por 30 minutos a
4°C. O sobredante foi então descartado e os pellets dissolvidos em tampão TE (1×)
e guardados em ultra-freezer (-80°C) até o momento de uso.
A concentração de DNA foi detectada por UV utilizando um espectrofotômetro
(Beckman DU-640, EUA). O DNA (5 µg por tubo) foi transferido para um gel de
Metodologia 75
agarose a 1,5%, que foi submetido a uma eletroforese a 100V cm-1 por 90 minutos.
O DNA nos géis foram visualizados através de transiluminação por ultravioleta, após
a coloração por brometo de etídio (5 µg mL-1) utilizando um sistema de imageamento
Omega® (UltraLum Inc., Claremont, CA, EUA).
4.12. Análise Estatística
Os resultados, expressos através de Média ± DP (ou EPM) e Mediana, foram
organizados e apresentados na forma de gráficos, tabelas, quadros e figuras. A
distribuição de freqüência foi obtida por meio da aplicação do teste do Qui-quadrado
(χ2) sob IC 95%.
Todas as variáveis sob estudo foram testadas para a hipótese de
normalidade. Para verificar diferenças significativas entre os grupos estudados
(toxicidade, anti-inflamatório e antitumoral), foram aplicados através de softwares
(GraphPad Prisma ou SPSS), os testes de análise de variância (ANOVA). Quando
detectada diferença significativa entre os grupos, foi aplicado o teste “t” de Student e
o teste de contraste de Tukey.
A variabilidade ou dispersão dos dados obtidos para um determinado
parâmetro foi medida através da faixa de variação ou range (diferença entre o valor
máximo e o valor mínimo), desvio-padrão da média e variância. Para todos os
grupos, consideram-se estatisticamente significativos quando p<0.
Produção Científica 76
5. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
ARTIGO 1 – Cytotoxic and Genotoxic Effects of cis-Tetraammine
(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on the Root Meristem Cells of Allium cepa.
Autores - Flávia de Castro Pereira, Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa, Aliny
Pereira de Lima, Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, Hugo Delleon da
Silva & Luiz Alfredo Pavanin, Elisângela de Paula Silveira-Lacerda.
Periódico Científico – Biological Trace Element Research, Springer.
Qualis Capes – B3 para Ciências Biológicas I
Situação – Publicado, Biol Trace Elem Res Biological (2009) 128, 258-268 DOI
10.1007/s12011-008-8272-y
ARTIGO 2 – Antitumor activity of the compound cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate against human lung alveolar
carcinoma epithelial cells (A-549).
Autores - Flávia de Castro Pereira, Aliny Pereira de Lima, Cesar Augusto Sam Tiago
Vilanova-Costa, Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, Lucas Carlos Gomes
Pereira, Luiz Alfredo Pavanin, Wagner Batista dos Santos, Elisângela de Paula
Silveira-Lacerda.
Periódico Científico – Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, Elsevier.
Qualis Capes – B1 para Ciências Biológicas I
Situação – Submetido ao periódico.
Produção Científica 77
ARTIGO 3 – Antitumor effects of the compound cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on K562 human erythroleukemia
cells.
Autores - Flávia de Castro Pereira, Aliny Pereira de Lima, Cesar Augusto Sam Tiago
Vilanova-Costa, Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, Lucas Carlos Gomes
Pereira, Luiz Alfredo Pavanin, Wagner Batista dos Santos, Elisângela de Paula
Silveira-Lacerda.
Periódico Científico – Toxicology in Vitro, Elsevier.
Qualis Capes – B1 para Ciências Biológicas I
Situação – Submetido ao periódico.
Artigo 1 78
Artigo 1 - Efeitos Citotóxico e Genotóxico do Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) em Células Meristemáticas de Raiz de
Allium cepa
Pereira, F. C.; Vilanova-Costa, C. A. S. T.; Lima, A. P.; Ribeiro, A. S. B. B.; Silva, H. D.; Pavanin, L. A.; Silveira-Lacerda, E. P.
Biol Trace Elem Res (2009) 128:258–268
DOI 10.1007/s12011-008-8272-y Resumo: Os complexos de Rutênio têm atraido muita atenção como futuros agentes
antitumorais baseados em metal de transição. O presente trabalho avalia os efeitos
mitotóxicos e clastogênicos induzidos pelo composto Ditionato de cis-
Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} em células
meristemáticas de raíz de cebola (Allium cepa), após difentes períodos de exposição
e concetração. Testes de correlação foram realizados de forma a se determinar a
influência do tempo de exposição e concentração do composto de Rutênio (III) sobre
p índice mitótico e índice de aberrações cromossômicas. A comparação entre os
Índices Mitóticos resultantes da exposição do meristema de cebola ao Ditionato de
Rutênio(III) e a Nitrato de Chumbo(II) revela que o complexo de Rutênio(III)
apresenta uma capacidade de inibição de mitose cerca de oito vezes maior que o
composto de chumbo, assim como um capacidade de causar aberrações
cromossômicas cerca de quatro vezes menor que o nitrato de chumbo. As células de
Allium cepa exposta a diferentes concentrações do complexo de Rutênio(III) não
mostraram ter sofrido efeitos clastogênicos significativos. O composto também
mostrou uma grande capacidade de inibir a mitose de células meristemáticas de
cebola, que pode estar associada à inibição da síntese de DBA ou pelo bloqueio do
ciclo celular, possivelmente na fase G2. Futuras inverstigações acerca do mecanismo
de ação deste complexo de Rutênio poderão auxiliar na determinação de seu
potencial clínico assim como contribuir para o desenvolvimento de um novo fármaco
antitumoral baseado em metal com propriedades complementares àquelas
mostradas pelas drogas antitumorais atualmente utilizadas na clínica médica.
Palavras-chave: Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III), Citotoxicidade,
Genotoxicidade, Allium cepa, Compostos de Rutênio(III).
Artigo 1 79
Cytotoxic and genotoxic effects of cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on the root meristem cells
of Allium cepa
Flávia de Castro Pereiraa (pereirafc@gmail.com)
Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costaa* (vilanovacosta@gmail.com)
Aliny Pereira de Limaa (alinypereiralima@gmail.com)
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiroa (agarbio@hotmail.com)
Hugo Delleon da Silvaa (hugo_bioufg@yahoo.com.br)
Luiz Alfredo Pavaninb (pavanin@gmail.com)
Elisângela de Paula Silveira-Lacerdaa (elacerda@icb.ufg.br)
aLaboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia, Goiás, Brazil.
bInstituto de Química, Universidade Federal de Uberlândia - UFU, Uberlândia, Minas
Gerais, Brazil.
*Corresponding Author: Cesar Vilanova-Costa, e-mail: vilanovacosta@gmail.com
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética
Instituto de Ciências Biológicas - ICB I - Sala 200
Universidade Federal de Goiás
Campus Samambaia (Campus II)
Cx. Postal: 2425-0
Goiânia-GO, Brasil – 74690-970
Phone/Fax +55-62-3521-1481
Cell Phone +55-62-9901-0369
Artigo 1 80
Abstract
Ruthenium complexes have attracted much attention as building blocks for new
transition-metal-based antitumor agents. Present study determines the mitotoxic and
clastogenic effects induced in the root tips of Allium cepa by cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} at
different exposure periods and concentrations. Correlation tests were performed to
determine the Time (h) effect of the time of exposure and concentration of Ruthenium
complex on Mitotic Index (MI) and Mitotic Aberration Index (MAI). Comparing MI
results of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) to lead nitrate, Ruthenium complex
demonstrate an average mitosis inhibition 8-fold higher than lead with cellular
abnormalities frequency almost 4-fold lower and mitotic aberration 3-fold lower.
Results of experiments did not show significant clastogenic effect on A. cepa root
cells exposed to Ruthenium complex at concentrations used. Cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate shows a remarkably capacity to inhibit
mitosis that could be related to inhibition of DNA synthesis or blocking cell cycle in the
G2 phase. Further investigation of the action mechanisms of this Ruthenium complex
is important to define their clinical potential and to contribute to a rational approach for
possibly developing a new antitumor metal-based drug with antitumor properties
complementary to those exhibited by the drugs already in clinical use.
Key-words: Cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Citotoxicity;
Genotoxicity; Allium cepa; Ruthenium compounds.
Artigo 1 81
Funding sources
There are not any financial or personal interests that might be viewed as an
inappropriately influence to work presented. The attached manuscript, "Cytotoxic
and genotoxic effects of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on
the root meristem cells of Allium cepa " was completely financed by governmental
and non-profit institutions, Brazilian National Counsel of Technological and Scientific
Development (CNPq) and Research and Projects Finacing (FINEP).
Present work was supported by Research and Projects Finacing (FINEP)
(Grant No.01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula Silveira-Lacerda) and by
Brazilian National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)
through fellowships to Flávia de Castro Pereira (Grant No. 381302/2007-5), Cesar
Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa (Grant No. 381303/2007-1) and Aliny Pereira de
Lima (Grant No. 370646/2007-0).
Ethical Approval
No studies involving human or experimental animals were conducted in this
work. Only meristematic cells of the onion (Allium cepa) were used. Technique is
suggested as model for environmental monitoring (Fiskesjö, 1985)
Artigo 1 82
1.0 Introduction
Several metallic compounds, recognized as potent antitumor agents, have
been developed and tested in vivo and in vitro (Menezes et al, 2007). Examples of
established antitumor metallodrugs, routinely clinically used, are cisplatin [cis-
diamminedichloroplatinum(II)] and its analogues carboplatin and oxaliplatin (Brabec &
Nováková, 2006). Nevertheless, its clinical utility have been proven limited due a
relatively narrow range of tumors and the development of acquired drug resistance.
Resistance to treatment can occur in certain disease types (ovarian and small cell
lung) or be present as intrinsic drug resistance in less-responsive disease types (non-
small cell lung and colon) (Wernyj & Morin, 2004; Karki et al, 2007). Furthermore,
cisplatin is administered intravenously due to its limited solubility in water and severe
side effects (Wong & Giandomenico, 1999).
Limitations of platinumbased complexes have prompted a search for more
effective and less toxic metal-based antitumor agents. Some of the efforts have been
directed in the design of non-platinum, transition-metal-based antitumor agents and
Ruthenium complexes have attracted much interest as alternative drugs to cisplatin in
cancer chemotherapy (Brabec & Nováková, 2006). During the last two decades a
number of Ruthenium (III) complexes have been synthesized and tested as
anticancer drugs (Kratz et al, 1994; Hartmann et al, 1995).
Ruthenium complexes have attracted much attention as building blocks for new
transition-metal-based antitumor agents. Ruthenium compounds offer the potential
over antitumor platinum(II) complexes currently used in clinic of reduced toxicity, a
novel mechanism of action, the prospect of non-cross-resistance) and a different
spectrum of activity (Zeller et al, 1991; Coluccia et al, 1993; Clarke, 2003; Alessio et
al, 2004). Non-cross-resistance in cisplatin resistant cancer cells and reduced toxicity,
Artigo 1 83
which is in part due to the ability of Ruthenium complexes to mimic the binding of iron
to molecules of biological significance, exploiting the mechanisms that the body has
evolved for non-toxic transport of iron, is a particularly attractive feature of Ruthenium
complexes (Allardyce et al, 2003). In addition, some chemical properties, such as rate
of ligand exchange, range of accessible oxidation states, and ability of Ruthenium to
mimic iron in binding to certain biological molecules make these compounds well
suited for medicinal applications as an alternative to platinum antitumor. Hence,
complexes based on Ruthenium have been proposed as potential antitumor activity
and antimestastatic behavior, showing lower systemic toxicity than platinum com-
pounds (Grguric-Sipka et al, 2003).
Plant bioassays, which are more sensitive and simple than most methods used
to detect the genotoxic effects of environmental pollutants, have been validated in
international collaborative studies under United Nations Envoronmental Program
(UNEP), World Health Organization (WHO) and United States Environmetal Protetion
Agency (US EPA), and demonstrated to be efficient tests for monitoring the
genotoxicity of environmental pollutants (Grant, 1999; Wu et al, 2007). Since Levan
introduced the first Allium test in year 1938, various chemicals have been tested for
their cytogenetic activities using this test (Türkoğlu, 2008). The test allows
investigation of universal mechanisms for meristematic plant cells permitting
extrapolation on animal cells providing valuable information in relation to possible
genotoxicity effect of several chemicals in mammals and especially in human (Yi et al,
2007; Levan, 1938; Ma, 1999).
For the purpose of evaluating the citotoxic effect induced by cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} and the
relevance of its biological activity, this study was carried out to determine the mitotoxic
Artigo 1 84
and clastogenic effects induced in the root tips of Allium cepa by the chemical at
different exposure periods and concentrations. Study results will contribute to a better
understanding of the action mechanism of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)
Dithionate upon the cellular system.
2.0 Materials and Methods
2.1. Cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) synthesis.
Cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) complex was prepared as follows procedure.
PentaamminechloroRuthenium(III) dichloride (1.0 g, 0.0034 mol) was refluxed in
deaerated concentrated ammonium hydroxide (25 ml) under a blanket of argon until
the solution turned dark pink. A stoichiometric amount of sodium Dithionate (0.70 g,
0.0034 mol) was then added to the hot solution from which, upon stirring in an ice
bath, precipitated pentaaminehydroxoRuthenium(III) Dithionate. Addition of 100%
ethanol completely precipitated the salt (1.2 g) which was filtered and air dried. The
off-white salt was dissolved in a saturated solution of oxalic acid dihydrate (12 ml),
and the mixture was refluxed under argon for about 5 min until a yellow solid
precipitated and the mother liquor turned brown. The mixture was cooled and the
yellow cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate was collected by filtration,
washed with ethanol and air dried. The compound was characterized by electronic
spectra at room temperature with HP 8453 spectrophotometer with diodes
arrangement, interfacing a compatible PC HP Vectra XM, using quartz cells. The
electronic spectra of the TetraammineoxalatoRuthenium(III) Dithionate complex
synthesized presenting bands in 260 and 350 nm. Carbon and hydrogen
Artigo 1 85
amicroanalyses were performed by the staff of the Central Analítica of the Chemistry
Institute of Universidade de São Paulo.
2.2. Allium cepa test (Onion test) preparation
Onion meristems (A. cepa) were used as study material. They are considered
one of the best biological models for the study of environmental pollutants (Fiskesjö,
1987). Onions are easy to store and to handle, and the root tip cells constitute a
convenient system for macroscopic (growth, EC50 values) as well as for microscopic
parameters (c-mitosis, stickiness, chromosome breaks). Since these cells possess
important plant activation enzymes, the Allium test has a wide area of application.
Furthermore, results from the test have shown good agreement with results from
other test systems, like eukaryotic as well as prokaryotic (Fiskesjö, 1987; Fiskesjö,
1993).
Inhibitory effects on root growth of onion bulbs (A. cepa) were tested according
to the methods defined by Fiskesjö (Fiskesjö, 1993). Briefly, onion bulbs, similar in
size, shape and color, with average weight of 90g were placed in filtered water,
changed every 24h and kept at a constant temperature of 25oC, with a continuous
airflow, for 120 hours. Bulbs were weighted and their roots counted and measured
daily for morphological control group data.
Once the roots had reached a average length of 4–5cm, they were placed in an
aqueous solution of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate at
concentrations of 0,01 mg.mL-1 (38 μM), 0,05mg.mL-1 (190μM) and 0,1mg.mL-1
(380μM) for 24 and 48 h, the solution was changed every 24h. Prior to Ruthenium
complex exposition, a quarter of roots of every bulb were colleted for negative control.
All the tests were repeated, and each had a control, in which the solution of
Artigo 1 86
Ruthenium complex was substituted with distilled water as negative control and lead
(II) nitrate [50 μM Pb(NO3)2], as positive control. Additionally, bulbs were weighted
and their roots counted and measured daily for exposed group morphological data.
2.3. Preparation of root tip cells and Mitotic index determination.
All the experiments were carried out when the roots reached 4–5cm in length.
Ten roots were cut for each exposition period and concentration. They were placed in
Carnoy’s solution [ethanol (99%) and glacial acetic acid (3:1)] for 30 minutes, washed
with distilled water three times and submitted to hydrolysis with aqueous solution of
chloridric acid (HCl) 1N at 60°C temperature. Roots were dried and their apical
regions (approximately 0.5cm of root tip) were macerated and then dyed using acetic-
hydrochloric orcein. For the study of the mitotic index (MI), chromosomal aberrations
(ChA), an average amount of 5,000 root tip cells for each bulb were used in analysis.
The MI was calculated for each treatment as a number of dividing cells/100 cells.
Cytological abnormalities were scored in the mitotic cells and the results were
tabulated. Most abnormalities were presented with micrographs.
2.4. Statistical Analysis
The values of mean and standard deviation (S.D.) were obtained from the
results of 4 bulbs for each experimental group. Correlation tests were performed to
determine the Time (h) effect of the period of exposure and concentration of
Ruthenium complex on Mitotic Index (MI) and Mitotic Aberration Index (MAI). One-
way analysis of variance (ANOVA) and Dunnet’s t test were used to determine
significant difference (F=19.04, P<0.01) among groups exposed to Ruthenium
complex, lead nitrate (CAS 10099-74-8) (positive control) and purified water (CAS
Artigo 1 87
7732-18-5)(negative control). Statistical analyses were preformed and graphics were
done using GraphPad Prism 4 computer program (1992-2005 GraphPad Software,
Inc.)
3. Results and Discussion
3.1. Effect of Ruthenium complex on mitotic index
The mitotic index permits estimate the frequency of cellular division. The
inhibition of mitotic index can be attributed to effects of the environment chemicals on
DNA/protein synthesis of the biological system. These effects are manifested by
induction of interphase arrest or cell death.
Results derived from analysis of the effect of concentration and time of
exposure to Ruthenium complex show a decrease of the MI in the exposed roots (Fig.
1) dependent to concentration and period of treatment.
Results of multivariate tests on the MI in root tips of A. cepa exposed to
Ruthenium complex were signficant (*p<0.01). At this point, Ruthenium concentration
showed be more effective than time exposure. This could indicate that subjecting the
root tips to high concentrations for a short period of time is more effective than
Artigo 1 88
exposing them to low concentrations for longer periods. The effect is cumulative, with
a nearly complete inhibition of mitosis at the concentration of 0.1mg.mL-1 or higher for
periods longer than 24h.
Several chemicals have been reported to inhibit mitosis (Türkoğlu, 2008; El-
Ghamery et al, 2000). Reduction in the mitotic activity could be related to inhibition of
DNA sythesis or blocking cell cycle in the G2 phase, preventing the cell from entering
mitosis (Türkoğlu, 2008; Van’t Hof, 1968; Sudhakar et al, 2001). This suggest that cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) may cause inhibition of DNA synthesis.
Silveira-Lacerda studying the effects of cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on Jurkat cells, found that Ruthenium
compound has the ability to block those cells on G2 phase (data not published yet),
hindering cells to enter in mitosis and the decreasing the tumour growth (Silveira-
Lacerda, 2003).
Comparing MI results of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) to lead nitrate, Ruthenium
complex demonstrated an average mitosis inhibition 8-fold higher than lead with
cellular abnormalities frequency almost 4-fold lower and mitotic aberration 3-fold
lower. Results corroborate reports that link Ruthenium compounds to a remarkable
cell inhibition activity instead of cell death promotion, like apoptosis, and clastogenicity
(Menezes et al, 2007; Frasca et al, 2001).
There is substantial cytological data that nucleic acids, particularly nuclear
DNA, are the targets for most Ruthenium antitumor complexes (Frasca et al, 2001).
Clarke discuss about a correlation between cytotoxicity and DNA binding for
representative Ruthenium am(m)ine compounds and their anticancer activity in cell
cultures (Clarke, 2003). This behavior is consistent with DNA binding in vivo of a
number of ammine, amine and heterocyclic complexes such inhibition of DNA
Artigo 1 89
replication, mutagenic activity and induction of the SOS repairs mechanism, binding to
nuclear DNA and reduction of RNA synthesis. EDTA-type complexes of RuIII have
shown anticancer activity, apparently through DNA binding (Clarke, 2003; Carballo et
al, 1997).
Clarke and Frasca also reports that while the initial set of Ruthenium
complexes tested are likely to give rise to others molecules that would bind to DNA
and possibly be mutagenic, the idea of short-circuiting electrons transfer pathways,
synergetically coupled with other subcellular interactions, is one of the possibilities
which RuII and RuIII complexes controls the division and multiplication of determinate
cell types (Clarke, 2003; Frasca et al, 2001).
It is important to consider that preparations of “Ruthenium red” can bind to
polyanions such pectins on plants and protective mucopolusaccharide coat on some
tumor cells, thus concentrating in tumors and inhibiting growth through blocking
transport of Ca2+ on cell membranes (Clarke, 2003). Calcium antagonists transport,
such nifedipine, verapamil, erythrosine-B (and Ruthenium red as well) plays a partially
equal effect on plant tissues and cells. Calcium appears be a ubiquitous signal in all
plant tissues, and playing key regulatory role in response to environmental or
developmental stimuli (Dombrowski & Bergey, 2007). Same effect can be observed in
animal and human cells, where calcium controls a diverse array of cellular processes
from fertilisation through gene transcription, muscle contraction to cell death (Berridge
et al, 1998, Roderick et al, 2003).
3.3. Chromosome aberrations and Micronuclei induction
Results of experiments did not show significant clastogenic effect on A. cepa
root cells exposed to Ruthenium complex at concentrations used (Table 1). In Fig. 2,
Artigo 1 90
some changes are observed in the organization and morphology of the chromosomes
in the root tips exposed to the Ruthenium complex, despite these groups haven’t
shown significant difference to control group. Species of A. cepa bear large and few
chromosomes (2n=16) which are very long, well visible and easily stained, which
makes the evaluation of damages and disturbances in cell division cycle easier,
including aneuploidy, chromatid lag and stekinesis (Fig. 2c) (Grant, 1999; Fiskejö,
1987; Leme & Marin-Morales, 2008).
For all the concentrations and times longer than 24 h the induction of stekinesis
was not evidenced. This phenomenon is considered inductor to aneuploidy and
polyploidy and has been reported as indicative of high toxicity (Fiskejö, 1987;
Marcano et al, 2002; Marcano et al, 2004). Other anomalies had been observed, like
anaphasic bridges (Fig. 2a and 2b), which were accompanied, in some cases, by
chromosomal forwarding (Fig. 2d), isolated chromosomes (chromatids not
migrating)(Fig. 2e), and chromosomes with nondisjunction (chromatids not
separating) for groups exposed only to lead nitrate and the other exposed to lead
Artigo 1 91
nitrate followed by Ruthenium complex treatment. Those anomalies were not detected
in cells treated only with Ruthenium complex.
Lead nitrate results coincide with those reported by other authors for diverse
biological systems (Ribas et al, 1996; Rank & Nielsen, 1997; Alvarez-Moya, 2001;
Rank et al, 2002) and are evidence of lead toxic effect on exposed cells and induction
of chromosome damage in other organisms (Del Campo & Coletto, 1998).
Results reveal that the rate of mitosis abnormalities in groups treated with Ruthenium
complexes are lower than that showed by group exposed to lead nitrate. Although
their percentages increased as the concentrations and duration of the applied
treatment with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate increased, there
were no statistically significant difference between treated groups.
Broken-egg and Binucleated cells were observed on treatment with higher
concentrations of Ruthenium complexes, lead nitrate and lead nitrate plus Ruthenium
treatment. The occurrence of binucleated cells is the result of inhibition of cytokinesis
of cell plate formation. Microtubules have been implicated in cell plate formation and
is well know that heavy metals, such as lead nitrate, interfere on their synthesis
pathway (Duhr et al, 1993; Pejchar et al, 2007; Stummann et al, 2007).
The micronucleus test (MN) is one of the simplest, short-term tests for
biomonitoring, permitting investigates the possible citotoxic and genotoxic effects of
some particular agents on cells (Linde-Arias et al, 2008). Evaluation of the currently
available database indicates that this approach (MN) has a high sensitivity for the
detection of cancer risks in humans (Majer et al, 2001). Hence, this test system might
be a useful tool for identifying genetic damage resulting from occupational and
lifestyle exposure (Kassie et al, 2000; Uhl et al, 2003), on exposed cells to determine
Artigo 1 92
chemical or substance (Majer et al, 2001), as well in chemoprevention trials (Pool-
Zobel et al, 1997; Eisenbrand et al, 2002).
Artigo 1 93
There are several possible hypotheses on the pathways of MN formation. One
of them is the induction of oxidative stress. The induction of reactive oxygen species
(ROS) was found on greater part of cells exposed to heavy and toxic
metals/semimetals, such arsenic (As3+), cadmium(Cd2+), cooper (Cu2+); lead (Pb2+),
manganese(Mn2+), mercury (Hg2+), nickel (Ni2+) and zinc (Zn2+); from plants to
mammalian and humans (Steinkellner et al, 1998; Knasmüller et al, 1998; Knasmüller
et al, 2008). The attacks of ROS on purine and pyrimidine bases and on deoxyribose
in DNA can cause DNA strand breakage, which can increase the probability of
chromosome/chromatid fragmentation, thereby leading to the observed increases of
MN formation (Yi et al, 2007).
The second pathway, and an important one, involves in the changes of protein
sulfhydryl groups (–SH). Binding to sulfhydryl groups, heavy metals can inactivate
some important enzymes involved in DNA repair and expression (Clemens, 2001;
Gebel, 2001), alter DNA repair mechanism and cause an increase in MN frequency
(Patlolla & Tchounwou, 2005).
Although a number of heavy metals are essential micronutrients required for a
wide variety of physiological processes on plants and animals, these same metals can
be toxic at concentrations higher than the threshold concentrations (Nagalaksmi et al,
2001). Furthermore, other metals and metalloids such as cadmium (Cd), lead (Pb) or
arsenic (As), which are generally considered nonessential elements, are potentially
highly toxic due to their activity with S and N atoms in the amino acid side chain, as
described before. A variety of adaptive responses to heavy metal toxicity have been
developed by plants, and the most frequent one is the biosynthesis of the ligands,
which can detoxificate heavy metals by complexing them into compounds (Rauser,
1990; Rauser, 1991; Rauser & Meuwly, 1995). Among the biosynthesised ligands, a
Artigo 1 94
class of oligopeptides with the general structure (γ–Glu–Cys)n–Gly (n=2–11), called
phytochelatins (PCs), and as well as their precursor, glutathione (GSH, γ–Glu–Cys–
Gly), were generally considered to play crucial roles in heavy metal detoxification
(Mehra & Mulchandani, 1995; Mehra et al, 1996).
Bontidean and cols. (2003) studied the possibility of using plant phytochelatins
as biorecognition elements of capacitive biosensors to selectively and sensitively
monitor heavy metals ions. Founds demonstrate that phytochelatin-biosensor has a
broad selectivity, sensing all heavy metals, with different response pattern that
provides additional data for a potential array sensor capable of detecting and
quantifying individual metal ions in a mixture (Bontidean et al, 2003). The absences of
micronucleus and significant chromosome alterations on onions cells exposed to cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate is a indicative that Ruthenium
compound does not exhibit same cytotoxic and genotoxic activities of heavy and toxic
metals/semimetals.
4.0 Conclusions
In summary, an important finding on present study concerns about the effects
of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on the toxicity in Allium cepa bulb cells. Actually, cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate shows a remarkable capacity to inhibit
mitosis that could be related to inhibition of DNA sythesis or blocking in the G2 phase
of the cell cycle.
The ability to modulate uptake and release of ubiquitous intercellular
messengers and important intracellular molecules, as the same way that Ruthenium
red has been probe that of Ca2+ (Clarke, 2003), reveals that RuII and RuIII complexes
actions on cell can be more complex and wider than is usually expected, opening an
Artigo 1 95
important pathway to understand the mechanisms of how metal complexes achieve
their activities in cellular environment, knowledge that is crucial to their clinical
success and to the rational design of new compounds with improved potency for
medicine and human welfare.
Finally, further investigation of the mechanism of action of this Ruthenium
complex is important to define their clinical potential and to contribute to a rational
approach for possibly developing a new antitumor metal-based drug with antitumor
properties complementary to those exhibited by the drugs already in clinic use.
Acknowledgements
This work was supported by Research and Projects Finacing (FINEP) (Grant
No.01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula Silveira-Lacerda) and by
Brazilian National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)
through fellowships to Flávia de Castro Pereira (Grant No. 381302/2007-5), Cesar
Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa (Grant No. 381303/2007-1) and Aliny Pereira de
Lima (Grant No. 370646/2007-0).
Artigo 1 96
5.0 References
Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. 2004. Ruthenium antimetastatic
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Artigo 2 – Atividade Antitumoral do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) em Carcinoma de Células Epiteliais
Alveolares de Pulmão Humano (A549) Pereira, F. C.; Lima, A. P.; Vilanova-Costa, C. A. S. T.; Ribeiro, A. S. B. B.; Silva,
Pereira, L.C.; H. D.; Pavanin, L. A.; Santos, W.B.; Silveira-Lacerda, E. P.
Submetido ao Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. J. Trace Elem. Med. Biol., ISSN: 0946-672X, Elsevier.
Resumo: O carcinoma de pulmão é uma das principais causas de mortalidade por câncer em países industrializados, sendo que o carcinoma de células pequenas do pulmão (CCPP) é responsável por cerda de 80% de todos os casos. O principal tratamento para pacientes com CCPP inclui a quimioterapia com compostos platinados, como a cisplatina [cis-diaminodicloroplatina(II)] e seus análogos, a carboplatina e a oxaliplatina. Todavia, a utilidade clínica destes compostos de platina tem provado ser limitada devido ao seu estreito espectro de tumores suceptíveis à esses fármacos, além do comum desenvolvimento de resistência desenvolvido pelos pacientes. Os complexos de rutênio tem mostrado possuir grande potencial na quimioterapia. No presente trabalho, foi estudada a atividade antitumoral do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} sobre carcinoma de pulmão humano (A549) e sobre fibroblastos sadios de pulmão de fetos humanos (MRC-5). Os resultados mostraram que o composto de Rutêno(III) causou uma redução significativa da proliferação das células tumorais A549, com viabilidades variando de 55,5% para 24,5%, quando as células foram tradadas com 40 µM do composto de Rutênio(III) por 24 e 48h; e de 32% para 18,2% quando tradas com 150 µM do composto de Rutênio(III)por 24 e 48h. O Ditionato de Rutênio(III) mostrou ser de moderado (31.9% e 39.6% para as concentrações 10 e 40 µM, respectivamente) a altamente citotóxico (64% para a concentração de 150 µM) para as células A549 cells (IC50= 33,72 µM). Por outro lado, as células sadias MCR-% não mostraram uma redução significativa de sua capacidade de proliferação na presença do composto de Rutênio(III), mesmo quando tratadas as maiores concentrações de Rutênio (III) utilizadas no presente estudo por um período de 48h. Estas células mostraram viabilidade de 85% a 78,4% para 40 µM e 150 µM, respectivamente. Os resultados indicam que o composto cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) é bastante promissor para futuros estudos como uma potencial droga anti-tumoral para o tratamento do câncer de pulmão. Palavras-chave: Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III), Citotoxicidade, Atividade Antitumoral, A549, MRC-5, Câncer de Pulmão.
Artigo 2 107
Antitumor activity of the compound cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate against human lung
alveolar carcinoma epithelial cells (A549).
Flávia de Castro Pereiraa (pereirafc@gmail.com)
Aliny Pereira de Limaa (alinypereiralima@gmail.com)
Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costaa (vilanovacosta@gmail.com)
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiroa (agarbio@gmail.com)
Lucas Carlos Gomes Pereiraa (pereira.lcg@gmail.com)
Luiz Alfredo Pavaninb (pavanin@ufu.br)
Wagner Batista dos Santosc (wbsantos32@yahoo.com.br)
Elisângela de Paula Silveira-Lacerdaa (silveiralacerda@gmail.com)* aLaboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia, Goiás, Brazil; bInstituto de Química, Universidade Federal de Uberlândia - UFU, Uberlândia, Minas Gerais, Brazil; cFaculdade Patos de Minas - FPM, Patos de Minas, Minas Gerais, Brazil. *Corresponding author: Elisângela de Paula Silveira Lacerda, e-mail: silveiralacerda@gmail.com
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética
Instituto de Ciências Biológicas - ICB I - Sala 200
Universidade Federal de Goiás
Campus Samambaia (Campus II)
Cx. Postal:
Goiânia-GO, Brasil – 74
Phone/Fax +55-62-3521-1481
Cell Phone +55-62-9293-3121
Abstract: Lung cancer is one of the leading cause of cancer mortality in industrialized
Artigo 2 108
countries, with non-small cell lung cancer (NSCLC) accounting for nearly 80%. First-line
treatment for patients with advanced NSCLC includes platinum compounds such cisplatin
[cis-diamminedichloroplatinum(II)] and its analogues carboplatin and oxaliplatin.
Nevertheless, the clinical utility of these drugs has been proven limited due to the relatively
narrow range of tumors affected and the development of acquired drug resistance. Ruthenium
complexes have shown potential utility in chemotherapy. In the present work we studied the
antitumor activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against human lung carcinoma (A549) and normal human fetal
lung fibroblast (MRC-5) cell lines. Results showed that Ruthenium(III) causes a significant
reduction of proliferation of A549 cells with viabilities ranging from 55.5% to 24.6% when
treated with 40 µM for 24 and 48h; and 32% to 18.2% when treated with 150 µM for 24 and
48h. The Ruthenium(III) compound induced a moderate (31.9% and 39.6% for concentrations
10 and 40 µM, respectively) to high degree (74% for concentration 150 µM) of cytotoxic
activity against A549 cells (IC50= 33.72 µM). On the other hand, the normal lung fibroblast
MRC-5 did not show significant reduction proliferation in the presence of Ruthenium(III)
compound. Even when treated with higher concentrations of cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate for 48 hours, MRC-5 cells showed
viabilities ranging from 85% to 78,4% for 40 µM and 150 µM, respectively. The presents
results indicate that cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) is worthy of further development as a
potential anti-tumor drug for lung cancer treatment.
Keywords: cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Cytotoxicity; Antitumor
activity; A549; MRC-5; Lung cancer.
Artigo 2 109
1. Introduction
Lung cancer is one of the leading cause of cancer mortality in industrialized countries,
with non-small cell lung cancer (NSCLC) accounting for nearly 80% (American Cancer
Society, 2009). Although surgery may be curative in early-stage NSCLC, most patients
present with inoperable advanced disease. These patients managed with best supportive care
alone have a median survival time of only 5 months and a 1-year survival rate of
approximately 10% (Shepherd, 2000). First-line treatment for patients with advanced NSCLC
includes platinum compounds such cisplatin [cis-diamminedichloroplatinum(II)] and its
analogues carboplatin and oxaliplatin (Shepherd & Carney, 2000; Brabec & Nováková,
2006). Nevertheless, the clinical utility of these drugs has been proven limited due to the
relatively narrow range of tumors affected and the development of acquired drug resistance.
Resistance to treatment can occur in certain disease types (ovarian and small cell lung
cancers) or present as intrinsic drug resistance in less responsive cases (NSCLC and colon
cancers) (Wernyj & Morin, 2004; Karki et al., 2007). Furthermore, cisplatin is administered
intravenously due to its limited solubility in water and severe side effects (Wong &
Giandomenico, 1999).
Ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and
photodynamic therapy (Clarke, 2003; Ronconi & Sadler, 2007). Ruthenium complexes
generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed to their specific accumulation
in cancer tissues (Sava et al., 1998; Alessio et al., 2004). In vitro and in vivo studies show
high anticancer activity of Ruthenium complexes and some of them are currently undergoing
clinical trials (Jakupec et al., 2005; Hartinger et al., 2006).
The identification of new chemotherapeutics agents is critical for further progress in
the treatment of NSCLC. In comparison to the platinum(II) antitumor complexes currently
used in the clinic, Ruthenium compounds offer potentially reduced toxicity, a novel
Artigo 2 110
mechanism of action, the prospect of non-cross-resistance, and a different spectrum of activity
(Clarke, 2003; Alessio et al., 2004). The reduced toxicity is in part due to the ability of
Ruthenium complexes to mimic the binding of iron to molecules of biological significance,
exploiting the mechanisms that the body has evolved for non-toxic transport of iron (Frasca et
al., 2001). This reduced toxicity, together with non-cross-resistance in cisplatin-resistant
cancer cells, is particularly attractive attributes of these complexes (Allardyce et al., 2003).
Based on these evidences, in the present work we studied the cytotoxic and antitumor
activity of the Ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate
{cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against human lung carcinoma (A549) tumor cell line and
normal human fetal lung fibroblast (MRC-5).
2. Material and methods
2.1. Synthesis of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)
The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) complex (Figure 1) was synthesized at the
Universidade Federal de Uberlândia (UFU, Minas Gerais, Brazil) following a standard
protocol (Pereira et al., 2008). The compound was characterized by electronic spectra at room
temperature with the HP 8453 spectrophotometer with diodes arrangement, interfacing a
compatible PC HP Vectra XM, using quartz cells. Carbon and hydrogen microanalyses were
performed by the staff of the Analitical Centre of the Chemistry Institute of Universidade de
São Paulo (USP, São Paulo, Brazil).
2.2. Cell culture.
The human lung carcinoma A549 (ATCC number CCL-185TM) and normal human
fetal lung fibroblast MRC-5 (ATCC number CCL-171TM) cell lines were obtained from the
American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). The cells were cultured in
DMEM medium (pH 7.2-7.4) supplemented with 100 U mL-1 penicillin G, 100 μg mL-1
Artigo 2 111
streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1.5 g L-1 sodium bicarbonate, 4.5 g L-1 glucose, 10 mM
HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate and 10% fetal calf serum 1% (w/v) (all reagents were
obtained from Gibco, Grand Island, NY) at 37°C, under a 5% CO2 humidified atmosphere.
A549 tumor cells were routinely sub-cultured using 2.5g L-1 trypsin-ethylenedinitrile
tetraacetic acid (EDTA) solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
The cells were disposed into 96 well plates (1×105 cells/well) and cultured in
Dulbecco’s modified eagle’s medium DMEM medium. Cells were harvested at specified
intervals and the number of cells per well was determined by cell counting with a
hemocytometer (Neubauer chamber). Briefly, cells were aspirated, washed in sterile PBS and
an aliquot of the cell suspension was put in Trypan Blue 1% (m/v) (Sigma Chemical Co.) and
counted. Only cell dilutions with > 95% of viable cells were included in the posteriors
analysis
2.3. Cell Viability (Trypan blue staining)
The viability of the cells was evaluated by the trypan blue exclusion assay. The A549
and MRC-5 cells were incubated for 24 h and 48 h with different concentrations of the tested
ruthenium compound (from 0.015 – 150 µM) at 37 °C. Additionally, the positive control was
applied (50 µM of Carboplatin). After incubation, the cells were washed in PBS (pH 7.4) and
suspended in a complete DMEM medium. Then 40 µL of the trypan blue solution (0.4%,
Sigma) and 10 µL of the cell suspension were mixed and after 5 min the percentage of viable
cells was evaluated under brightfield optical microscope using a Newbauer chamber. The
correlation between the viable cells (that excluded trypan blue dye) and dead cells (stained
cells) were assessed. The results are presented as mean±S.D. (standard deviation) from three
independent experiments.
Artigo 2 112
2.4. Cytotoxicity assay.
Cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on MRC-5 and A549 was
measured by modified MTT assay (Mosmann, 1983), which is based on the reduction of
yellow 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue,
insoluble formazan in mitochondria of the living cells. The MTT assay was performed in 96-
well tissue culture plates (Nalge-Nunc, Rochester, NY, USA) as follows: the cells (2 ×
103/well) were seeded in tissue culture plates and incubated with the different concentrations
of Ruthenium compound (from 0.015 – 150 µM) or Carboplatin (50 µM 1) dissolved in a total
volume of 100 μL/well for 24 h at 37 °C and 5% CO2. The cells incubated with medium only
served as a control. Following the exposure to the tested substances, the cells were incubated
with 10 μL of MTT solution (5 mg mL-1) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 3 h. The
microplates were then centrifuged (300×g/15 min/10°C) and the culture media were
discarded. Afterwards 200 μL of PBS/20% of SDS (lauryl sulfate) solution (Sigma-Aldrich,
USA) was added to each well to stop the reaction and plates were kept in the dark overnight.
After the next 12 h the absorbance of dissolved formazan was measured by a Stat Fax 2100
microplate reader (Awareness Technology, Palm City, FL, USA) at 565 nm. The cell viability
was expressed in % related to control (100% of viability). The cytotoxic rate was calculated
as follows: cytotoxicity (%) = [1 - (absorbance of the treated wells / absorbance of the control
wells)] ×100%. The cytotoxic effect of the tested substances was determined in at least three
independent experiments, where each one of the culture plates contained the wells with tested
concentration in triplicate, the wells with control (cells in medium) and the blank (culture
medium alone). The 50% inhibitory concentration (IC50) value was determined using
GraphPad Prism 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Artigo 2 113
2.5. Clonogenic assay
A clonogenic assay was employed to determine the cytotoxicity of different
treatments. A549 cells (1 × 105/well) were incubated with different concentrations of
Ruthenium compound (0.15 – 150 µM) or Carboplatin (50 µM) or Paclitaxel (25 µM)
dissolved in DMEN medium for 24 and 48h at 37 °C and 5% CO2. After the treatments, the
cells were rinsed with 5 ml of PBS three times and then trypsinized. The resuspended cells
were counted with a hemocytometer and plated at dilution of 300 in triplicate in culture
bottles (25 cm2) containing 5 mL of growth medium. The culture bottles were then kept in an
incubator at 37 ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 and air-mixed for 15 days, allowing
viable cells to grow into macroscopic colonies. Then, the medium was removed, and the cells
were fixed [methanol/acetic acid/water (1:1:8, v/v)] and stained using Giemsa 5%. Colonies
with more than 50 cells were counted under an inverted microscope by an observer who was
blinded with regard to the experimental group. The software Clono-Counter (Niyazi et al,
2007) was also used to evaluate the clonogenic growth by densitometric analysis of scanned
grey-scaled photos (200 dpi jpeg-files) of culture flasks. Calculation of survival fraction (SF)
was performed using the equation: SF = colonies counted/cells seeded × (PE/100), taking the
individual plating efficiency (PE) into consideration.
2.6. DNA laddering assay.
Briefly, 2×106 cells (A549) were treated with different concentrations of cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (1.5 – 150 µM) for 48 h at 37 °C and 5% CO2. Cells were harvested
and centrifuged at 300×g/15 min/10°C and washed with PBS. The cells were then
ressuspended at a concentration of 1×106 cells mL-1 in an extraction buffer (10 mmol L-1 Tris-
HCl, 0.1mol L-1 EDTA, 5g mL-1 SDS) and treated with 20 mg L-1 RNase A at 37°C for 60
min, followed by incubation with proteinase K (100 mg L-1) at 37°C for 60 min. An equal
Artigo 2 114
volume of saline solution (NaCl 6 M) was added to the cells and centrifuged at 13,000×g for
10min. The supernatant was collected and 2 volume ethanol (-20°C) were added. The samples
were centrifuged at 13,000×g for 30 min at 4°C. The supernatant was then discarded and the
pellets dissolved in TE buffer (1×). The concentration of DNA was detected using a UV
spectrophotometer (Beckman DU-640, USA). The DNA (5 µg/tube) was transferred to a
1.5% agarose horizontal gel, and electrophoresis was performed at 100V cm-1 for 90 min. The
DNA in the gels was visualized by ultraviolet transillumination after staining with ethidium
bromide (5 µg mL-1) using an Omega® molecular imaging system (UltraLum Inc., Claremont,
CA, USA).
2.7. Statistical analysis.
Three independent in vitro experiments were carried out. Statistical results were
expressed as the mean ± standard deviation of the means obtained from triplicates of each
independent experiment. Correlation tests were performed to determine the effects of
concentration of Ruthenium complex on tumor cell lines. Statistical significance of
differences *(p<0.05) as compared to untreated cells (control) was evaluated by applying
analysis of variance (ANOVA) and Tukey or Dunnet’s post tests, when applicable. The IC 50
(concentration that produces a 50% inhibitory effect on the evaluated parameter) was
graphically obtained from the dose-response curves.
3. Results
3.1. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound reduces proliferation of A549 tumor
cells by Trypan blue staining
Results derived from Trypan blue staining essay revealed that A549 cells cultured with
concentrations 40 and 150 μg mL-1 of Ruthenium(III) compound showed significant reduction
Artigo 2 115
of proliferation with viabilities ranging from 55.5% to 24.6% when treated with 40 µM for 24
and 48h; and 32% to 18.2% when treated with 150 µM for 24 and 48h (Figure 2). On the
other hand, the normal lung fibroblast MRC-5 did not show significant reduction proliferation
in the presence of Ruthenium(III) compound. Even when treated with higher concentrations
of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate for 48 hours, MRC-5 cells showed
viabilities ranging from 85% to 78,4% for 40 µM and 150 µM, respectively.
3.2. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound presents cytotoxic activity towards
A549 tumor cell lines
To verify the cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on A549 and MRC-5
cell lines, tumor and normal cells were cultured for 24 h in the presence of different
concentrations of Ruthenium compound. The results (Figure 3) show that the Ruthenium(III)
compound induced a moderate (31.9% and 39.6% for concentrations 10 and 40 µM,
respectively) to high degree (74% for concentration 150 µM) of cytotoxic activity against
A549 (IC50= 33.72 µM) and a very low cytotoxic effect against MRC-5 cells (17,1% for
concentration 150 µM). The IC50 of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate for
MRC-5 cells could not be assessed with concentrations tested.
3.3. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound reduced the colony forming ability of
A549 tumor cell line
In order to investigate the possible action of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)
Dithionate on the growth and proliferative characteristics of A549, tumor cells grown under
different concentrations of Ruthenium compound (0.15 – 150 µM), Carboplatin (50 µM) and
Paclitaxel (25 µM). The Ruthenium compound reduced the number of A549 colonies at all
concentrations tested and remarkably diminished colony forming ability at concentration 10
Artigo 2 116
µM (Figure 4) revealing a higher cytostatic capability than Carboplatin (50 µM). No colony
was observed when A549 cells were treated with 40 and 150 µM of cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) and 25 µM of Paclitaxel. The control plating efficiency of A549
cells was 0.46 ± 0.02 (n = 09) (Figure 4).
3.4. cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) did not induce apoptosis in A549 cells as verified by
DNA ladder analysis.
To investigated if the inhibition of cell viability by Ruthenium(III) involve apoptotic
cell death, we examined DNA fragmentation using agarose gel electrophoresis. As shown,
A549 cells cultured in the presence of Ruthenium compound not presented DNA
fragmentation pattern in all of the concentration tested (Figure 5).
4. Discussion
Since the introduction of cisplatin in cancer therapy, metal complexes and
organometallic compounds have been gaining importance in oncology (Kostova, 2006; Sanna
et al., 2002). Metal-based compounds increase the possibility of developing molecules better-
suited for binding to specific biological targets. Although platinum-based anticancer therapies
have been used very successfully in the clinic to combat a range of cancers, they are not
universally applicable. Ruthenium complexes appear particularly promising; although they
exhibit lower cytotoxicity as compared to cisplatin, they are better tolerated in vivo (Sanna et
al., 2002; Guichard et al., 2005; Hartinger et al., 2006; Menezes et al., 2007). In the present
work, we studied the cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)
Dithionate cytotoxic towards human lung carcinoma (A549) tumor cell lines and normal
human fetal lung fibroblast (MRC-5).
Artigo 2 117
Measurement of the number of living cells using MTT or similar assays in drug-
treated and control cultures is the most commonly used method in cell-based screening
experiments. The results show that A549 tumor cells treated with a different concentration of
cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate, a Ruthenium-based complex, presented
anti-proliferative effect (Figure 2) and significant cytotoxic activity (Figure 3). Furthermore,
the Ruthenium(III) compound showed very low cytotoxic and anti-proliferative activity on
normal lung fibroblast MRC-5. These results confirm previous observations that
Ruthenium(III) complexes can mediate cytotoxic effects and induce cytotoxicity toward
tumor cells (Sava et al., 1983; Gagliardi et al., 1994; Silveira-Lacerda et al., 2009b).
The selective toxicity of Ruthenium(III) compounds in tumor cells should be related to
its capacity to bind to transferrin, the primary mode of iron transportation into mammalian
cells. Uptake of Ruthenium transferrin was substantially greater in tumors, possibly due to
abnormally increased expression of transferrin receptors on the surface of tumor cells (Kratz
et al., 1994; Frasca et al., 2001; Silveira-Lacerda et al., 2009b).
Taken together, results derived from MTT and Tryplan blue assays indicate that cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate exhibits cellular effects according to
compound concentration and exposure time. As shown by proliferation, cytotoxicity,
profiles, post-incubation allowed us to observe that growth inhibition in A549 cell line was
irreversible, mainly after treatment with higher doses of Ruthenium complex (40 and 150 µM)
for 48 h exposure time. The Ruthenium(III) complex also reduced the clonogenic survival
capabilities of lung cancer cell lines in vitro. Data derived from clonogenic assay indicated
that treatment with Ruthenium exerts growth inhibitory and cytotoxic effects of lung cancer
cell lines in vitro upon short time treatment (24–48 h) with 40 µM of Ruthenium(III)
complex. For A549 tumor cells, concentrations of 40 µM or above Ruthenium were sufficient
to reduce survival of lung cancer cell line. On a mechanistic level our data reveal that
Artigo 2 118
Ruthenium(III) complex could trigger growth-inhibition and induces cell death of tumor cells.
Our previous studies on cell cycle changes after shorter exposure time (Menezes et al., 2007;
Silveira-Lacerda et al., 2009a; Silveira-Lacerda et al., 2009b) compared with this present
work was in favor of lengthening treatment time. The present study confirms the relevance of
prolonging exposure time to Ruthenium complexes, as 48 h of treatment enhances more
efficiently cytotoxicity and induces colony growth arrest in A549 tumor cell line.
Previous investigators have focused on Ru(III) complexes as potential anti-tumour
agents (Guichard et al., 2005). Ru complexes demonstrate similar ligand exchange kinetics to
those of platinum (PtII and PtIV) while displaying only low toxicity. Ruthenium(III) has the
ability to mimic iron in binding to plasma proteins including transferrin and albumin
(Allardyce et al., 2002). Transport and sequestration of Ru into tumour cells may be mediated
via protein transport and receptor mediated uptake (Bergamo & Sava, 2007).
It is important to note that this compound presents similar tumor cytotoxic activity
when compared to other chemotherapeutic agent such Carboplatin (Figure 3), as demonstrated
by MTT essay, where after 24 h of treatment IC50 was 33.72 µM and 50 µM for cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate and Carboplatin, respectively. These results
corroborate previous observations that Ruthenium(III) complexes induces cytotoxicity
towards tumor cells such as human Jurkat, HeLa and SK-BR-3, and murine S-180 and A-20
tumor cell lines (Frasca et al., 2001; Silveira-Lacerda et al., 2009b). Besides being cytotoxic
in vitro for tumor cells, a previous report indicated that cis-[RuCl2(NH3)4]Cl exhibited
antitumor effects in vivo on S180 tumor cells, showing tumor volume reduction and increased
survival time in treated animals (Menezes et al., 2007).
Although the main focus of present study was not determine the type of death incurred
by A549 treated by cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate, previous reports
have shown that Ruthenium-based compounds, in particular Ru(III), can kill other types of
Artigo 2 119
tumor cells by apoptosis (Sanna et al., 2002; Kapitza et al., 2005; Brabec & Nováková, 2006;
Hartinger et al., 2006; Kostova, 2006; Silveira-Lacerda et al., 2009b). The significantly
reduced number of A549 cells in the presence of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)
Dithionate on previous essays suggests that this compound could be inducing cell death via
apoptosis. To examine pro-apoptotic properties of the Ruthenium(III) compound, A549 cells
were cultured in the presence of different concentrations of Ruthenium compound (1.5 – 150
µM) and then DNA ladder analysis was performed via agarose gel electrophoresis.
The DNA fragmentation pattern is an important biochemical sign of apoptosis,
representing DNA cleavage into oligonucleosomal fragments through activation of the
cysteine protease caspase-3, which is involved in the proteolytic cleavage of key downstream
proteins such as poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (Bortner et al., 1995; Clarke &
Stubbs, 1996). This process ultimately results in DNA fragmentation and apoptotic death
(Bortner et al., 1995).
However, results indicates that Ruthenium (III) compound used on present work was
unable to induce internucleosomal fragmentation on DNA or A549 cells, even when exposed
to different and high concentrations. Notwithstanding, results corroborate previous
observations where cisplatin-resistant cell line A549 does not undergo apoptosis even though
this agent causes the up-regulation of the pro-apoptotic genes Fas and Bax and the down-
regulation of the anti-apoptotic Bcl-2 gene (Almeida et al., 2007). Furthermore, few of the
coordinated compounds may function in a manner analogous to cisplatin, which appears to
bend DNA by cross-linking adjacent guanines, thereby causing a class of DNA binding
proteins to adhere to the site. Overall, the broad class of Ruthenium(III) antitumor agents
appears to differ from cisplatin by favoring interstrand rather than intrastrand cross-links
(Clarke et al., 1999).
Artigo 2 120
In agreement with this hypothesis, it was demonstrated that NAMI-A induced
apoptosis in the ECV304 transformed human endothelial and KP1019 in colorectal carcinoma
cell lines via activation of caspase-3 and DNA fragmentation (Bortner et al., 1995; Nunez et
al., 1998; Kapitza et al., 2005). Although this type of binding has been suggested to mimic, to
some extent, cisplatin-induced DNA crosslinking, other types of damage may exist that
dominate or contribute to the biological activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)
Dithionate. Thus, despite cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate was unable
induce DNA laddering on cells A549, other method most sensible to detection apoptosis
should be performed. Broadening the chemotherapeutic arsenal depends on understanding
existing agents with a view toward developing new modes of attack.
Despite the resounding success of cisplatin and closely related platinum antitumor
agents, the movement of other transition-metal antitumor agents toward the clinic has been
exceptionally slow (Clarke et al., 1999). Non-Platinum chemotherapeutic
metallopharmaceuticals hold much promise for the future, and needs to be actively explored
in a large variety of tumor types in combination therapies.
The clinically investigated Ru(III) antimetastatic drug NAMI-A has completed clinical
phase I evaluation, and cutaneous toxicity was dose-limiting. Nausea and vomiting was also
noted. Mild reversible nephrotoxicity was noted and a pre- and post-hydration regimen was
utilized. Neurotoxicity and hepatic toxicities were not identified. Stable disease was identified
in a patient with non-small cell lung cancer (Bergamo et al., 2000).
Besides the already well established NAMI-A and KP-1019 activities on
gastrointestinal, breast, prostate, and ovarian cancers (Bergamo et al., 1999; Pluim et al.,
2004, Bergamo & Sava, 2007), the search for coordinated compounds with lower toxicity and
without secondary side-effects to treat cancer is an aim of cancer-treatment research. The
present study results indicate that Cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) is worthy of further
Artigo 2 121
development as a potential anti-tumor drug that could be used in the treatment of non-small
cell lung cancers.
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge the financial support of Research and Projects
Financing (FINEP) (Grant No.01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula Silveira-
Lacerda), Brazilian National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)
through fellowship to Flávia de Castro Pereira (Grant No. 131960/2008-3) and Coordination
for the Advancement of Higher Education Staff (CAPES) through fellowships to Aliny
Pereira de Lima and Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa.
Funding sources
There are no financial or personal interests that might be viewed as inappropriate
influences on the work presented herein. This manuscript was completely financed by
governmental and nonprofit institutions, Brazilian National Counsel of Technological and
Scientific Development (CNPq), Research and Projects Financing (FINEP) and Coordination
for the Advancement of Higher Education Staff (CAPES).
Ethical Approval
No studies involving humans or experimental animals were conducted in this work.
The human lung carcinoma (A549) cells was purchased from the American Type Culture
Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) and cultured in vitro.
Abbreviations
A549 human lung carcinoma cell line
cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate
Artigo 2 122
DMSO dimethyl sulfoxide
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
IC50 50% inhibitory concentration
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide
MRC-5 human fetal lung fibroblast
NAMI-A imidazolium-trans-DMSO-imidazole-
tetrachlororuthenate
NSCLC non-small cell lung cancer
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Artigo 2 126
Figure 1. Chemical structure of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate.
Artigo 2 127
MRC-5 (24h) MRC-5 (48h) A-549 (24h) A-549 (48h)0
10
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40
50
60
70
80
90
100
C+ (Carboplatin 50 µM)Ru (150 µM)
C- (Cells and Medium)Ru (0.015 µM)Ru (0.15 µM)Ru (1,5 µM)Ru (10 µM)Ru (40 µM)
**
*
** *
Treatment {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)}
Cel
ls V
iabi
lity
(%)
Figure 2. Anti-proliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate
compound towards A549 and MRC-5 cell lines. The tumor and normal cells were cultured in
the presence or absence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.015 – 150 µM) for 24 h and 48 h
as described in Material and Methods. The cell viability was assessed by correlation between
the viable cells (that excluded trypan blue dye) and dead cells (stained cells) using a newbauer
chamber. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent
experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego,
California, USA)]. *p<0.05 vs. negative control.
Artigo 2 128
Figure 3. Cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards A549 and MCR-5 cell lines (a and b). The tumor and normal cells were cultured in the presence or absence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.015 – 150 µM) for 24 h as described in Material and Methods. The ruthenium-based compound cytotoxicity was assessed by measuring the absorbance of dissolved formazan using a microplate reader. The reduction of yellow 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue, insoluble formazan only occurs in mitochondria of the living cells. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs. positive control. # = 0%.Red dotted line = IC50 concentration.
C- (Cell
s and M
edium)
Ru (0.01
5 µM)
Ru (0.15
µM)
Ru (1,5
µM)
Ru (3 µM
)Ru (1
0 µM)
Ru (40 µ
M)Ru (1
50 µM
)
C+ (Carb
oplatin 50
µM)
010
20
30
4050
60
70
80
90100
A549MRC-5
* *
**
*
# #
Treatment {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)}
Cel
ls C
ytot
oxic
ity (%
)
-8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.50
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
A549MRC-5
IC50 = 33.72 µM
cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) concentration (log nM)
Cel
l Via
bilit
y (%
)
a b
Artigo 2 129
C- (Cell
s and M
edium)
Ru 0.15
µM
Ru 1.5 µ
M
Ru 10 µM
Ru 40 µM
Ru 150 µ
M
C+ (Carb
oplatin 50
µM)
C+ (Pac
litaxe
l 25 µ
M)
0
25
50
75
100
125
150
175
200
# # #
* *
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)
Col
onie
s co
unt (
Mea
n ±
S.D
.)
Figure 4. Proliferation of A549 tumor cells cultured in the presence of different concentrations of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound. A549 cells (1 × 105/well) were incubated with different concentrations of Ruthenium compound (0.15 – 160 µM) or Carboplatin (50 µM) or Paclitaxel (25 µM) dissolved in DMEN medium for 24 and 48h at 37 °C and 5% CO2 as described in Material and Methods. After the treatments, the cells were rinsed, trypsinized, resuspended and plated at dilution of 300 in triplicate in culture bottles (25 cm2) that were kept in an incubator for 15 days, allowing viable cells to grow into macroscopic colonies. Then, cells were fixed and stained using Giemsa 5%. Colonies with more than 50 cells were counted under an inverted microscope by an observer who was blinded with regard to the experimental group. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs. negative control. # No colony was observed.
Figure 5
cis-[Ru(
concent
washed
and Me
with et
medium
Ld Ld
5. DNA ag
(C2O4)(NH3
trations of c
, and adjust
thods. Sam
thidium bro
m; C1+ = Ca
A5
C-
arose gel el
3)4]2(S2O6)
cis-[Ru(C2O
ted to 1×10
mples were s
omide and
arboplatin 50
549 cells
150 µM 4
lectrophore
compound
O4)(NH3)4]2(
06 cells mL
subjected to
visualized
0 µM for 48
s culture[Ru(C2O
Ru 48h
40 µM 10
sis profile o
d. 2×106 A
(S2O6) (1.5 -1. The DN
1.5% agaro
by ultrav
8h).
ed in theO4)(NH3)4
µM 1.5µM
of A549 ce
A549 cells
– 150 µM)
A was extr
ose gel elec
iolet transi
e presen4]2(S2O6)
M C+
ells cultured
were cultu
for 48h. Ce
racted as de
ctrophoresis
illumination
nce of c)
Art
d in the pre
ured with d
ells were ha
escribed in
s. Gels were
n (C- = C
is-
tigo 2 130
sence of
different
arvested,
Material
e stained
ells and
Artigo 3 131
Artigo 3 – Efeito Antitumoral do composto coordenado Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) em Células de Leucemia Humana K562.
Pereira, F. C.; Lima, A. P.; Vilanova-Costa, C. A. S. T.; Ribeiro, A. S. B. B.; Silva,
Pereira, L.C.; H. D.; Pavanin, L. A.; Santos, W.B.; Silveira-Lacerda, E. P.
Submetido à Toxicology in Vitro. Toxicol. In Vitro, ISSN: 0887-2333, Elsevier.
Resumo: As leucemias compreendem um grupo de tipos de câncer que afetam significantemente a população e, especialmente, as crianças. A American Cancer Society (ACS) estimou que cerca de 35.070 novos casos de leucemia serão diagnosticados para o ano de 2009, onde cerca de 22.280 adultos e crianças virão à falecer. A quimioterapia é um dos principais tratamentos para a leucemia e a identificação de novos agentes quimioterápicos é um passo crítico para o progresso do tratamentos das leucemias. Os complexos de rutênio geralmente apresentam baixa citotoxicidade, quando comparados com a cisplatina – uma droga comumente utilizada no tratamento de leucemias – atribuídas a sua acumulação específica nos tecidos tumorais. No presente trabalho, foi avaliada a atividade antitumoral do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} contra eritroleucemia humana (K562). Os estudos de sua atividade antiproliferativa e citotoxicidade revelaram que as células tumorais K562 cultivadas com as concentração de 40 e 150 μM de rutênio(III) mostraram uma significativa redução na proliferação das células tumorais após 72h de exposição, com viabilidades variando de 88,2% a 55,6% quando tratadas com 40 µM por 24 e 72h; e de 76.2% para 26.7%, quando tratadas com 150 µM for 24 and 72h, respectivamente. Os compostos de Rutênio(III) induziram uma citotoxicidade variando de baixa [de 22.4% (24h) para 28.2% (48h) e de 29.8% (24h) para 35.7% (48h) para as concentrações de 10 e 40 µM, respectivamente] a moderada [44% (24h) e 53% (48h) para a concentração de 150 µM] frente as células tumorais K562. A análise do ciclo celular por citometria de fluxo indicou uma alta quantidade de células em sub-G1, um forte indicativo de apoptose, induzindo um aumento no número de células em sub-G1 de cerca de 1,7; 2,2 e 2,4 vezes para os períodos de 24, 48 e 72 horas de exposição, quando comparado ao grupo controle. O complexo de rutênio(III) também aumentou significativamente o numero de cometas em culturas de K562 em todas as concentrações utilizadas, o que pode estar associdado à citoxicidade com efeito direto no DNA das células tumorais. Assim, estudos adicionais tornam-se necessários de forma a se determinar os mecanismos de ação e o potencial da atividade antitumoral in vivo do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III). Palavras-chave: Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III), Citotoxicidade, Atividade antitumoral, K562, Compostos de Rutênio(III), atividade imunomodulatória, apoptose.
Artigo 3 132
Antitumor effects of the coordinated compound cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on K562 human
erythroleukemia cells
Flávia de Castro Pereiraa (pereirafc@gmail.com)
Aliny Pereira de Limaa (alinypereiralima@gmail.com)
Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costaa (vilanovacosta@gmail.com)
Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiroa (agarbio@gmail.com)
Lucas Carlos Gomes Pereiraa (pereira.lcg@gmail.com)
Luiz Alfredo Pavaninb (pavanin@ufu.br)
Wagner Batista dos Santosc (wbsantos32@yahoo.com.br)
Elisângela de Paula Silveira-Lacerdaa (silveiralacerda@gmail.com)*
aLaboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia, Goiás, Brazil; bInstituto de Química, Universidade Federal de Uberlândia - UFU, Uberlândia, Minas Gerais, Brazil; cFaculdade Patos de Minas - FPM, Patos de Minas, Minas Gerais, Brazil. *Corresponding author: Elisângela de Paula Silveira Lacerda, e-mail:
silveiralacerda@gmail.com
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética
Instituto de Ciências Biológicas - ICB I - Sala 200
Universidade Federal de Goiás
Campus Samambaia (Campus II)
Cx. Postal:
Goiânia-GO, Brasil – 74
Phone/Fax +55-62-3521-1481
Cell Phone +55-62-9293-3121
Artigo 3 133
Abstract: Leukemia is a major type of cancer affecting a significant segment of the
population, and especially children. The American Cancer Society (ACS) estimated that
35,070 new cases of leukemia would be diagnosed in the United States in 2009, whereas
about 22,280 adults and children would die of leukemia during 2009 (American Cancer
Society, 2009). Chemotherapy is a common treatment for leukemia (Ge et al., 2009).
Ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and photodynamic
therapy (Clarke, 2003; Ronconi & Sadler, 2007). The identification of new chemotherapeutics
agents is critical for further progress in the treatment of leukemia. Ruthenium complexes
generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed to their specific accumulation
in cancer tissues (Sava et al., 1998; Alessio et al., 2004). Based on these evidences, in the
present work we studied the antitumor activity of the Ruthenium(III) compound cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against
human erythroleukemia (K562) tumor cell line. The antiproliferative and cytotoxic activity
revealed that K562 cells cultured with concentrations 40 and 150 μM of Ruthenium(III)
compound showed significant reduction of proliferation after 72h of exposition, with
viabilities ranging from 88.2% to 55.6% when treated with 40 µM for 24 and 72h; and 76.2%
to 26.7% when treated with 150 µM for 24 and 72h. The Ruthenium(III) compound induced
low [22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to 35.7% (48h) for concentrations 10 and
40 µM, respectively] to moderate [44% (24h) and 53% (48h) for concentration 150 µM] of
cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h, the IC50 value was 18.28 µM.
Compared to the cell cycle profiles of untreated cells, flow cytometric analysis indicated a
sub-G1 arresting effect of Ruthenium compound on K562 cells, inducing a 1.7-fold, 2.2-fold
and 2.4-fold increase in the number of sub-G1 cells for 24, 48 and 72 h, respectively, when
compared to control. The compound also caused a significant increase in tailed cells in any of
the concentrations tested compared with negative control, that can be associated cytotoxicity
with direct effect on K562 cells DNA. Additional studies are needed to determine the
molecular mechanisms of the active components and to evaluate the potential in vivo
anticancer activity of the cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate.
Keywords: cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Cytotoxicity; Antitumor
activity; K562, Ruthenium(III) compounds; immunomodulatory activity, Apoptosis.
Artigo 3 134
1. Introduction
Leukemia is a major type of cancer affecting a significant segment of the population,
and especially children. In fact, leukemia is the most frequent childhood cancer, with 26% of
all cases, and 20% mortality (Canadian Cancer Society, 2005). The American Cancer Society
(ACS) estimated that 35,070 new cases of leukemia would be diagnosed in the United States
in 2009, whereas about 22,280 adults and children would die of leukemia during 2009
(American Cancer Society, 2009).
Although the incidence rate for this disease remains relatively unchanged, some
success has fortunately been attained in its treatment. But even if the success of clinical trials
in identifying new agents and treatment modalities has been significant, current treatments
have many limitations related to their side effects and the development of acquired drug
resistance (Jarry et al., 2003). The new therapeutic agents thus needed should be more active
and produce less side effects and they also should act through a mechanism different from that
of cytotoxic agents already used (Menezes et al., 2007; Silveira-Lacerda et al., 2009b).
Chemotherapy is a common treatment for leukemia (Ge et al., 2009). In general the
therapy uses a number of different anticancer drugs, which destroy cancer cells by preventing
them from growing and dividing rapidly. Unfortunately, a number of the body's normal, non-
cancerous cells (e.g., hair cells, red and white blood cells, blood-clotting platelets, and cells of
the gastrointestinal mucosa) also divide rapidly and are harmed by chemotherapy (Ge et al.,
2009; Kim et al., 2002). The side effects of chemotherapy hamper many normal activities of
patients undergoing treatment (Kim et al., 2002).
The preparations of metallocomplexes with potential antitumor activity has been one
of the main targets of transition metal chemistry since Rosenberg’s discovery of cisplatin
{cis-diamminedichloridoplatinum(II), cis-[Pt(NH3)2Cl2]} cytotoxic activity in the 1960s
(Rosember et al., 1965). In 1978, cisplatin was approved as the first platinumbased drug for
Artigo 3 135
the oncology treatment, although several negative side-effects (nephrotoxicity, neurotoxicity,
nausea, etc.) had been induced on treated patients (Kelland & Farrell, 2000). Nevertheless,
cisplatin was followed by carboplatin {cis-diammine-1,1´ -
cyclobutanedicarboxylateplatinum( II), [Pt(NH3)2(cbdc)], approved in 1985} and oxaliplatin
{1R,2R-diamminocyclohexaneoxalatoplatinum(II), [Pt(dach)(ox)], approved in 1996}, which
met requirements of improving antitumor activity and reducing disadvantages of cisplatin,
carboplatin and oxaliplatin represent the second, and third platinum-based drug generations,
respectively (Kelland & Farrell, 2000; Štarha et al., 2009). Nowadays, not only platinum-
bearing complexes are extensively studied with the aim to broaden a spectrum of transition
metal-based complexes which could be used in the treatment of cancer (Štarha et al., 2009).
Ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and
photodynamic therapy (Clarke, 2003; Ronconi & Sadler, 2007). Ruthenium complexes
generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed to their specific accumulation
in cancer tissues (Sava et al., 1998; Alessio et al., 2004). In vitro and in vivo studies show
high anticancer activity of Ruthenium complexes and some of them are currently undergoing
clinical trials (Jakupec et al., 2005; Hartinger et al., 2006).
The identification of new chemotherapeutics agents is critical for further progress in
the treatment of leukemia. In comparison to the platinum(II) antitumor complexes currently
used in the clinic, Ruthenium compounds offer potentially reduced toxicity, a novel
mechanism of action, the prospect of non-cross-resistance, and a different spectrum of activity
(Clarke, 2003; Alessio et al., 2004). The reduced toxicity is in part due to the ability of
Ruthenium complexes to mimic the binding of iron to molecules of biological significance,
exploiting the mechanisms that the body has evolved for non-toxic transport of iron (Frasca et
al., 2001). This reduced toxicity, together with non-cross-resistance in cisplatin-resistant
cancer cells, is particularly attractive attributes of these complexes (Allardyce et al., 2003).
Artigo 3 136
Based on these evidences, in the present work we studied the antitumor activity of the
Ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against human erythroleukemia (K562) tumor cell line.
2. Material and methods
2.1. Synthesis of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)
The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) complex was synthesized at the Universidade
Federal de Uberlândia (UFU, Minas Gerais, Brazil) following a standard protocol (Pereira et
al., 2008). The compound was characterized by electronic spectra at room temperature with
the HP 8453 spectrophotometer with diodes arrangement, interfacing a compatible PC HP
Vectra XM, using quartz cells. Carbon and hydrogen microanalyses were performed by the
staff of the Analitical Centre of the Chemistry Institute of Universidade de São Paulo (USP,
São Paulo, Brazil).
2.2. Cell culture.
The human erythroleukemia (K562) cell line (ATCC number CCL-243TM) was
obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). The
cells were cultured in RPMI 1640 medium (pH 7.2-7.4) supplemented with 100U mL-1
penicillin G, 100μg mL-1 streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1.5 g L-1 sodium bicarbonate, 4.5
g L-1 glucose, 10 mM HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate and 10% fetal calf serum (FCS) (all
reagents were obtained from Gibco, Grand Island, NY, USA) at 37°C, 5% CO2 and
humidified atmosphere.
The cells were disposed into 96 well plates (1×105 cells/well) and cultured in RPMI
1640 medium. Cells were harvested at specified intervals and the number of cells per well
was determined by cell counting with a hemocytometer (Neubauer chamber). Briefly, tumor
Artigo 3 137
cells were aspirated, washed in sterile PBS and an aliquot of the cell suspension was put in
Trypan Blue 1% (m/v) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and counted. Only cell dilutions
with > 95% of viable cells were included in the posteriors analysis.
2.3. Cell Viability (Trypan blue staining)
The viability of the K562 cells was evaluated by the trypan blue exclusion assay. The
tumor cells were incubated for 24 h, 48 h and 72 h with different concentrations of the tested
Ruthenium compound (from 0.015 – 32 µM) at 37 °C. Additionally, Carboplatin (50 µM) and
Paclitaxel (25 µM) were applied as positive control. After incubation, the cells were washed
in PBS (pH 7.4) and suspended in a complete RPMI 1640 medium. Then 40 µL of the trypan
blue solution (0.4%, Sigma) and 10 µL of the cell suspension were mixed and after 5 min the
percentage of viable K562 cells was evaluated under brightfield optical microscope using a
newbauer chamber. The correlation between the viable cells (that excluded trypan blue dye)
and dead cells (stained cells) were assessed. The results are presented as mean±S.D. (standard
deviation) from three independent experiments.
2.4. Cytotoxicity assay.
Cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on K562 was measured by
modified MTT assay (Mosmann, 1983), which is based on the reduction of yellow 3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue, insoluble
formazan in mitochondria of the living cells. The MTT assay was performed in 96-well tissue
culture plates (Nalge-Nunc, Rochester, NY, USA) as follows: the cells (1 × 105/well) were
seeded in tissue culture plates and incubated with the different concentrations of Ruthenium
compound (from 0.15 – 150 µM) dissolved in a total volume of 100 μL/well for 24 h and 48 h
at 37 °C and 5% CO2. The cells incubated with medium only served as a control. Following
Artigo 3 138
the exposure to the tested substances, the cells were incubated with 10 μL of MTT solution (5
mg mL-1) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 3 h. The microplates were then
centrifuged (300× g/15 min/10°C) and the culture media were discarded. Afterwards 200 μl
of PBS/20% of SDS (lauryl sulfate) solution (Sigma-Aldrich, USA) was added to each well to
stop the reaction and plates were kept in the dark overnight. After the next 12 h the
absorbance of dissolved formazan was measured by a Stat Fax 2100 microplate reader
(Awareness Technology, Palm City, FL, USA) at 565 nm. The cell viability was expressed in
% related to control (100% of viability). The cytotoxic rate was calculated as follows:
cytotoxicity (%) = [1 - (absorbance of the treated wells)/(absorbance of the control
wells)]×100%. The cytotoxic effect of the tested substances was determined in at least three
independent experiments, where each one of the culture plates contained the wells with tested
concentration in triplicate, the wells with control (cells in medium) and the blank (culture
medium alone). The 50% inhibitory concentration (IC50) value was determined using
GraphPad Prism 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
2.5. DNA laddering assay.
Briefly, 2×106 cells (K562) were treated with different concentrations of cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 0.15 – 150 µM) for 24 h at 37 °C and 5% CO2. Cells were
harvested and centrifuged at 300×g/15 min/10°C and washed with PBS. The cells were then
ressuspended at a concentration of 1×106 cells mL-1 in an extraction buffer (1 mol Tris-HCl, 2
mol Na2EDTA, 0,5g m L-1 SDS) and treated with 20 mg L-1 RNase A at 37°C for 60 min,
followed by incubation with proteinase K (100 mg L-1) at 37°C for 60 min. An equal volume
of saline solution (NaCl 6 M) was added to the cells and centrifuged at 13,000×g for 10min.
The supernatant was collected and 2 volume ethanol (-20°C) were added. The samples were
centrifuged at 13,000×g for 30 min at 4°C. The supernatant was then discarded and the pellets
Artigo 3 139
dissolved in TE buffer (1×). The concentration of DNA was detected using a UV
spectrophotometer (Beckman DU-640, USA). The DNA (5 µg/tube) was transferred to a
1.5% agarose horizontal gel, and electrophoresis was performed at 100V cm-1 for 90 min. The
DNA in the gels was visualized by ultraviolet transillumination after staining with ethidium
bromide (5 µg mL-1) using an Omega® molecular imaging system (UltraLum Inc., Claremont,
CA, USA).
2.6. Comet Assay
An aliquot of from each K562 culture was taken after 24 and 48 h incubation for the
alkaline version of the comet assay (Ribeiro et al., 2009). The compound cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) was studied at different concentrations (from 10 – 150 µM).
Briefly, 300 μL of the cell suspension was centrifuged for 5 min (500 rpm) in a refrigerated
microcentrifuge (Sorvall Legend Mach 1.6 R, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA). The resulting pellet was homogenized with 80 μL of a low melting point agarose
(0.5%), spread onto microscope slides pre-coated with a normal melting point agarose (1.5%),
and covered with a cover slip. After 5 min at 4°C, the cover slip was removed, and the slides
were immersed in cold lysis solution [2.4 M NaCl, 100 mM ethylenediamine tetraacetic acid
(EDTA), 10 mM Tris, 10% DMSO, and 1% Triton-X, pH 10] for 24 h.
After lysis, the slides were placed in an electrophoresis chamber and covered with
electrophoresis buffer (300 mM NaOH per 1 mM EDTA, pH>13) for a remaining 20 min to
allow DNA unwinding. The electrophoresis proceeded for 20 min (25 V and 300 mA).
Afterwards, the slides were submerged for 15 min in a neutralization buffer (0.4 M Tris– HCl,
pH 7.5), dried at room temperature, and fixed in 100% ethanol for 5 min. All the steps were
conducted in the dark to prevent additional DNA damage. Slide staining was performed
immediately before analysis using ethidium bromide (20 μg mL−1). Slides were prepared in
Artigo 3 140
duplicate, and 100 cells were screened per sample (50 cells from each slide) in a fluorescent
microscope (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) equipped with an excitation
filter of 515–560 nm and a barrier filter of 590 nm using a ×40 objective. The nucleus was
classified according to the migration of the fragments using the software CometScore 15
according to Ribeiro et al., 2009).
For damage index calculation, cells were sorted into four classes, according to tail
size. The damage index (DI) is the sum of classes of the 100 cells analyzed per fish, and may
vary from 0 (all cells undamaged – 0×100) to 400 (all cells highly damaged – 4×100). The
damage index is based on the length of migration and on the amount of DNA in the tail, and it
is considered a sensitive measurement of detectable DNA damage (Grisolia et al., 2009). To
quantify the damage to the DNA, the following formula was used:
DI (au) = N1 + N2 + N3 + N4 S/100
where DI = DNA damage index, au = arbitrary unit, N1 - N4 = nucleoids in levels 1, 2, 3 and
4, S = number of nucleoids analyzed, including level 0.
2.7. Cell Cycle Analysis by flow cytometry
In order to investigate the possible effect of the Ruthenium compound on cell cycle
progression, K562 cells were treated with different concentrations of cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 1.5 – 150 µM) for 24, 28 and 72 h. Briefly, 5×105 cells were
harvested by centrifugation, washed with PBS, fixed with 70% (v/v) cold aqueous ethanol and
stored overnight at -20 ◦C. The fixed cells were washed with PBS and incubated with
propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) containing 0.05% RNase.
Samples were incubated at 4 ◦C in the dark and analyzed by flow cytometry (FACS CantoII,
BD Biosciences, San José, CA, USA). The percentage of cells in G1, S, G2 and sub-G1 was
analyzed using ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME, USA).
Artigo 3 141
2.8. Statistical analysis.
Three independent in vitro experiments were carried out. Statistical results were
expressed as the mean ± standard deviation of the means obtained from triplicates of each
independent experiment. Correlation tests were performed to determine the effects of
concentration of Ruthenium complex on tumor cell lines. Statistical significance of
differences *(p<0.05) as compared to untreated cells (control) was evaluated by applying
analysis of variance (ANOVA) and Tukey or Dunnet’s post tests, when applicable. The IC 50
(concentration that produces a 50% inhibitory effect on the evaluated parameter) was
graphically obtained from the dose-response curves.
3. Results
3.1. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound reduces viability of K562 cells
Results derived from Trypan blue staining essay revealed that K562 cells cultured with
concentrations 40 and 150 μg mL-1 of Ruthenium(III) compound showed significant reduction
of proliferation after 72h of exposition, with viabilities ranging from 88.2% to 55.6% when
treated with 40 µM for 24 and 72h; and 76.2% to 26.7% when treated with 150 µM for 24 and
72h (Figure 2).
3.2. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound presents cytotoxic activity towards
K562 tumor cell lines
To verify the cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on K562 cell lines,
tumor cells were cultured for 24 and 48h in the presence of different concentrations of
Ruthenium compound. MTT reduction assay revealed that Ruthenium compound produced
dose and time-dependent cytotoxic effects on K562 cells. The results (Figure 3a) show that
the Ruthenium(III) compound induced low [22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to
Artigo 3 142
35.7% (48h) for concentrations 10 and 40 µM, respectively] to moderate [44% (24h) and 53%
(48h) for concentration 150 µM] of cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h,
the IC50 value was 18.28 µM (Figure 3b).
3.3. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) induced apoptosis in K562 cells as verified by DNA
ladder analysis.
The significantly reduced number of K562 cells in the presence of cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on previous essays suggests that this
compound could be inducing cell death via apoptosis. To examine pro-apoptotic properties of
the Ruthenium(III) compound, K562 cells were cultured in the presence of different
concentrations of Ruthenium compound (from 0.15 – 150 µM) and then DNA ladder analysis
was performed via agarose gel electrophoresis. K562 cells cultured in the presence of
Ruthenium compound did not present DNA fragmentation (Data not shown).
3.4 The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) presents genotoxic effects against K562 tumor cells.
The alkaline comet assay has been used to assess the possible genotoxicity of cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate against K562 cells. Results indicate that
K562 tumor cells cultured with Ruthenium(III) complex show a significant increase in DNA
damage index in any of the concentrations tested compared with negative control, in a dose-
dependent manner (Figure 4). Results show an average DNA damage index of 59 for 10 µM,
140 for 40 µM, 176 for 150 µM when K562 tumor cells were exposed to Ruthenium(III) for
24 h; and 108 for 10 µM, 154 for 40 µM and 197 for 150 µM, for 48 h of exposition. Thus,
the concentration of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) might be associated cytotoxicity with direct
effect on K562 cells DNA (P<0.05).
Artigo 3 143
3.5 The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) increased the number of K562 tumor cells in sub-
G1 phase, an indicative of apoptosis.
The cell cycle distribution of K562 cells treated with different concentrations of
Ruthenium compound (from 1.5 – 150 µM) for 24, 48 and 72h revealed a prominent
increasing of cells on sub-G1 phase at concentration 40 and 150 µM and reduction on G1, S
and G2 phases. Figure 5 shows that treatment with 40 and 150 µM of cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) for 24, 48 and 72h caused an increase in the proportion of cells in
the sub-G1-peak correlating with fewer cells in G1, S and G2. The fraction of sub-G1 cells
increased from 34.5% in the control to 59% at 24h; 30.7% in the control to 68.6% at 48h;
35.5% in the control to 84.7% for 72h on cells treated with 40 µM of cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. The same effect was observed when A549
tumor cells were treated with 150 µM of Ruthenium(III) compound. The Ru(III) compound
caused a minor S phase accumulation after incubation at concentrations of 40 and 150 µM for
all periods of exposition (Table 1).
4. Discussion
Apoptosis is an active physiological process resulting in cellular self-destruction that
involves specific morphological and biochemical changes in the nucleus and cytoplasm
(Kostova, 2006). Agents that suppress the proliferation of malignant cells by inducing
apoptosis may represent a useful mechanistic approach to both cancer chemoprevention and
chemotherapy. While many anticancer agents have been developed, unfavourable side effects
and resistance are serious problems (Panchal, 1998). Since the introduction of cisplatin in
cancer therapy, metal complexes and organometallic compounds have been gaining
importance in oncology (Kostova, 2006; Sanna et al., 2002). Metal-based compounds increase
Artigo 3 144
the possibility of developing molecules better-suited for binding to specific biological targets
(Sanna et al., 2002; Hartinger et al., 2006).
Ruthenium complexes appear particularly promising; although they exhibit lower
cytotoxicity as compared to cisplatin, they are better tolerated in vivo (Sanna et al., 2002;
Hartinger et al., 2006; Menezes et al., 2007). Thus, there is growing interest in the use of new
organometallics for the treatment of various cancers and the development of safer and more
effective therapeutic agents (Kostova, 2006; Silveira-Lacerda et al., 2009b). In the present
work, we studied the cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)
Dithionate cytotoxic towards human erythroleukemia (K562) tumor cell line.
The antiproliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate, a
Ruthenium-based complex, have been evaluated in vitro against human leukemia (K562) cells
using trypan blue and MTT assay. Inhibition of cell proliferation is an important potency
indicator for chemotherapeutic drugs. As shown in Figures 2 and 3b, the tested compound
induces cell death in a dose and time dependent manner on K562 cells. It is found that the
effect was improved linearly while prolonging the incubation time. The determined IC50
values of this complex, 18.28 µM (Figure 3a), is considerably the same of those of the
commercially used antineoplastic drugs cisplatin (IC50 = 11 µM) and oxaliplatin (IC50 = 18
µM) on the same tumor cell line (Štarha et al., 2009). These results corroborate previous
observations that Ruthenium(III) complexes induces cytotoxicity towards tumor cells such as
human Jurkat, HeLa and SK-BR-3, and murine S-180 and A-20 tumor cell lines (Frasca et al.,
2001; Silveira-Lacerda et al., 2009b).
To explore the mechanisms of the cytotoxic effects produced by cis-
Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate, drug-induced changes in cell cycle
distribution were examined. Compared to the cell cycle profiles of untreated cells, flow
cytometric analysis indicated the sub-G1 arresting effect of Ruthenium compound on K562
Artigo 3 145
cells, as Ru(III) Dithionate already induced a 48.2% increase in the number of sub-G1 cells
after a 48h incubation. The Ru(III) compound caused a minor S phase accumulation after
incubation at concentrations of 40 and 150 µM for all periods of exposition (Figure 5).
Treatment with 40 µM of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) induced respectively a 1.7-fold, 2.2-
fold and 2.4-fold increase in the number of sub-G1 cells when compared to control for 24, 48
and 72 h, respectively (Table 1).
Furthermore, another important biochemical sign of apoptosis was studied: DNA
laddering and fragmentation (data not shown), possibly representing DNA cleavage into
oligonucleosomal fragments through activation of the cysteine protease caspase-3, which is
involved in the proteolytic cleavage of key downstream proteins such as poly (ADP-ribose)
polymerase (PARP) (Bortner et al., 1995; Clarke & Stubbs, 1996). This process ultimately
results in DNA fragmentation and apoptotic death (Bortner et al., 1995). Although this type of
binding has been suggested to mimic, to some extent, cisplatin-induced DNA crosslinking,
other types of damage may exist that dominate or contribute to the biological activity of this
drug prototype.
Several studies have been using this test to corroborate the results obtained in other
assays. In the present study, results derived from DNA laddering assay did not show K562
DNA fragmentation, instead the results shows DNA integrity and even differences on DNA
content. Is important note that this data does not corroborate with more sensitive techniques
such as flow cytometry and comet assay, used in this work. These techniques confirmed that
the Ruthenium(III) compound interfere on cell cycle and induces cells to enter apoptosis.
Thus, we can infer that the technique of DNA gel electrophoresis is not best assay to assess
the degradation of genome DNA.
The present study also evaluated the DNA-damaging effects detected by the alkaline
version of the comet assay in K562 cancer cells. This assay has been used as a test to predict
Artigo 3 146
the risk to develop certain diseases (renal cell carcinoma, cancers of the bladder, esophagus,
and lung) due to susceptibility of the individual to DNA damage (Ribeiro et al., 2009). The in
vitro comet assay is proposed as an alternative to cytogenetic assays in early
genotoxicity/photogenotoxicity screening of drug candidates as well as for neurotoxicity
(Witte et al., 2007).
The alkaline comet assay has been used to assess the genotoxicity of chemicals,
environmental exposures to carcinogens, toxins, and physical agents both in vitro and in vivo
(Trzeciak et al., 2000; Sekihashi et al., 2002). This method was also used to measure DNA
repair capacity in live cells (Banath et al., 1998) and acellular systems (Dusinská et al., 2004).
In our study, cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) shows a significant increase in tailed cells
in any of the concentrations tested compared with negative control (Figure 4). Consequently,
the concentration of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) might be associated cytotoxicity with direct
effect on K562 cells DNA. Thus, it can be deducted that Ruthenium-based compounds present
selectivity to enter both tumor and normal cells. It is known that all the body cells present
transferrin receptors, particularly tumor cells, in which these receptors are found in higher
numbers. Due to these features, higher quantities of Ruthenium complexes penetrate tumor
tissue, reduce Ruthenium (III) to Ruthenium (II) and binding to DNA (guanine), and promote
strand breaks (Clarke & Stubbs, 1996; Lebwohl & Canetta, 1998; Sava & Bergamo, 2000;
Katsaros & Anagnostopoulou, 2002; Galanski et al., 2003; Desoize, 2004). Another
hypothesis is that even in small quantities this compound might enter normal cells, because
Ruthenium (III) complexes are activated only by its reduction when it finds an environment
with high concentration of glutathione, low pH, and occurrence of hypoxia. It is very common
to find tumor cells presenting these conditions since it is known that these cells have high
levels of glutathione and oxygen consumption when the nutrients are quickly used due to their
accelerated development promoting hypoxia (Sava & Bergamo, 2000). Consequently, these
Artigo 3 147
cells need more glycolitic energy, which increases the level of lactic acid in the tissues and
causes a decrease in the media pH. It is worth emphasizing that Ruthenium (III) compounds
can be used as pro-drugs that are activated by in vivo reduction to Ruthenium (II) (Desoize,
2004; Sava & Bergamo, 2000).
Broadening the chemotherapeutic arsenal depends on understanding existing agents
with a view toward developing new modes of attack. Indeed, few of the coordinated
compounds may function in a manner analogous to cisplatin, which appears to bend DNA by
cross-linking adjacent guanines, thereby causing a class of DNA binding proteins to adhere to
the site. Overall, the broad class of Ruthenium(III) antitumor agents appears to differ from
cisplatin by favoring interstrand rather than intrastrand cross-links (Clarke et al., 1999). In
agreement with this hypothesis, it was demonstrated that NAMI-A induced apoptosis in the
ECV304 transformed human endothelial and KP1019 in colorectal carcinoma cell lines via
activation of caspase-3 and DNA fragmentation (Bortner et al., 1995; Nunez et al., 1998;
Kapitza et al., 2005).
Despite the resounding success of cisplatin and closely related platinum antitumor
agents, the movement of other transition-metal antitumor agents toward the clinic has been
exceptionally slow (Clarke et al., 1999). Non-Platinum chemotherapeutic
metallopharmaceuticals hold much promise for the future, and needs to be actively explored
in a large variety of tumor types in combination therapies. Besides the already well
established NAMI-A and KP-1019 activities on gastrointestinal, breast, prostate, and ovarian
cancers (Bergamo et al., 1999; Pluim et al., 2004, Bergamo & Sava, 2007) the present results
indicate that cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) is worthy of further development as a potential
anti-tumor drug that could be used in the treatment of leukemia. Thus, additional studies are
needed to determine the molecular mechanisms of the active components and to evaluate the
Artigo 3 148
potential in vivo anticancer activity of the cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)
Dithionate.
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge the financial support of Research and Projects
Financing (FINEP) (Grant No.01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula Silveira-
Lacerda), Brazilian National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)
through fellowship to Flávia de Castro Pereira (Grant No. 131960/2008-3) and Coordination
for the Advancement of Higher Education Staff (CAPES) through fellowship to Aliny Pereira
de Lima and Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa.
Funding sources
There are no financial or personal interests that might be viewed as inappropriate
influences on the work presented herein. This manuscript was completely financed by
governmental and nonprofit institutions, Brazilian National Counsel of Technological and
Scientific Development (CNPq), Research and Projects Financing (FINEP) and Coordination
for the Advancement of Higher Education Staff (CAPES).
Ethical Approval
No studies involving humans or experimental animals were conducted in this work.
The human lung carcinoma (A-549) cells was purchased from the American Type Culture
Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) and cultured in vitro.
Abbreviations
cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate
DMSO dimethyl sulfoxide
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
Artigo 3 149
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
IC50 50% inhibitory concentration
K562 human erythroleukemia tumor cell line
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide
NAMI-A imidazolium-trans-DMSO-imidazole-
tetrachlororuthenate
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Artigo 3 154
Figure 1. Chemical structure of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate.
Artigo 3 155
C- (Cell
s and M
edium) M)
μ
Ru (0.01
5 M)μ
Ru (0.15
M)μ
Ru (1.5
M)μ
Ru (10
M)μ
Ru (40
M)μ
Ru (150
M)μ
C+ (Carb
oplatin 50
M)μ
C+ (Pac
litaxe
l 25
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
**
24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h24h 48h 72h 24h 48h 72h24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 24h 48h
Treatment {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)}
Cel
l via
bilit
y (%
)
Figure 2. Anti-proliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate
compound towards K562 cell line. The tumor cells were cultured in the presence or absence
of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.015 – 150 µM) for 24 h and 48 h as described in Material
and Methods. The cell viability was assessed by correlation between the viable cells (that
excluded trypan blue dye) and dead cells (stained cells) using a newbauer chamber. The data
show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism
version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs.
negative control.
Artigo 3 156
Figure 3. Cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line (a and b). The tumor cells were cultured in the presence or absence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.15 – 150 µM) for 24 h and 48h as described in Material and Methods. The ruthenium-based compound cytotoxicity was assessed by measuring the absorbance of dissolved formazan using a microplate reader. The reduction of yellow 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue, insoluble formazan only occurs in mitochondria of the living cells. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs. negative control. # = 0%. Dotted line = IC50 concentration for 48h of treament.
C- (Cell
s and M
edium) M)μ
Ru (0.15
M)μ
Ru (1.5
M)μ
Ru (10
M)μ
Ru (40
M)μ
Ru (150
010
20
30
4050
60
70
80
90100
# #24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
** *
*
Treatment {cis-[Ru(C2O2)(NH3)4]2(S2O6)}
Cel
ls C
ytot
oxic
ity (%
)
-7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.50
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
IC50 = 18.28 µM
Cis-[Ru(C2O2)(NH3)4]2(S2O6) concentration (log nM)
Cel
l Via
bilit
y (%
)b a
Artigo 3 157
24h 48h0
50100150200250300350400
Control - (Cell and Medium)Ru (10 µM)Ru (40 µM)Ru (150 µM)C+ (Cisplatin 50 µM)
** * * *
* *
Treatment {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)}
DN
A D
amag
e In
dex
Figure 4. Induction of DNA strand breaks of K562 cells cultured in the presence of cis-
[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound. Cultures of K562 cells were exposed to increasing
concentrations of Ruthenium (III) complex for 24 and 48 h and submitted to SCGE-analysis.
DNA damage index was measured as described in materials and methods section. Results in
the figure represent the mean ±S.D. of 3 independent experiments using triplicate samples.
*Increased above control at P<0.05.
Artigo 3 158
Figure 5. Cell cycle profile histogram of K562 cells treated with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. . Tumor cells were cultured with different concentrations of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 1.5 – 150 µM), maintained for 24, 48 and 72h h, and then collected, washed with PBS, and stained with propidium iodide as described in “Material and Methods” section. PI fluorescence was analyzed by flow cytometry (FACS Canto II, BD Biosciences, San José, CA, USA).
Control Ru 1.5 µM Ru 10 µM Ru 40 µM Ru 150 µM
24h 48h 72h
Artigo 3 159
Control Ru 1.5 µM Ru 10 µM Ru 40 µM Ru 150 µM 24 h Mean ±S.D Mean ±S.D Mean ±S.D Mean ±S.D Mean ±S.DSub-G1 34.45 ±0.6 30.20 ±2.1 31.20 ±1.4 59.00 ±2.3 68.90 ±1.8G1 27.20 ±0.3 25.25 ±2.1 19.55 ±0.9 11.50 ±1.7 14.75 ±0.9S 19.05 ±0.1 27.50 ±1.1 29.10 ±1.1 18.60 ±2.1 11.40 ±0.8G2 14.10 ±0.1 14.85 ±0.8 18.10 ±0.7 9.15 ±1.6 4.00 ±0.1
48 h Sub-G1 30.70 ±0.7 24.65 ±1.1 40.55 ±2.6 68.60 ±1.1 67.60 ±0.1G1 35.65 ±0.6 31.70 ±1.0 14.85 ±2.6 8.35 ±0.4 19.30 ±0.4S 21.35 ±0.4 30.05 ±0.8 26.35 ±2.1 14.35 ±0.9 9.75 ±0.2G2 10.00 ±1.4 12.50 ±0.3 17.05 ±2.3 7.85 ±0.1 2.95 ±0.1
72 h Sub-G1 35.50 ±16.0 34.50 ±1.4 45.95 ±1.1 84.70 ±0.3 70.50 ±2.8G1 35.45 ±10.1 31.75 ±0.5 17.05 ±0.2 4.95 ±0.1 18.70 ±1.0S 20.05 ±4.7 23.80 ±0.6 26.05 ±0.6 7.20 ±0.6 9.25 ±1.6G2 7.45 ±0.8 9.30 ±0.4 10.50 ±0.3 3.10 ±0.1 1.45 ±0.2
Table 1. Cell cycle analysis of K562 tumor cell lines after treatment with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. The percentage of cells in G1, S, G2 and sub-G1 was analyzed using ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME, USA). Percentage of viable cells at each phase of the cell cycle (G0-G1, S, G2-M). Data represent mean values±SD of triplicate samples or a histogram for each condition and cell type. The results shown are representative of at least three similar experiments. *p<0.05 vs. control
Conclusões 160
7. CONCLUSÕES
• O composto Ditionato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) apresentou uma
notável atividade inibitória do ciclo de células meristemáticas de Allium cepa,
ao invés de promover a morte celular ou a clastogenicidade.
• Os resultados provenientes da análise do teste Allium cepa mostraram um
efeito tempo-dose dependentes, onde, quanto maior a dose do complexo de
rutênio e o tempo de tratamento, menor o índice mitótico das células
meristemáticas, mostrando que a concentração de rutênio (III) teve um
impacto maior do que o tempo de exposição;
• O composto Ditionato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) apresentou
atividade antitumoral in vitro sobre as linhagens tumoral de Leucemia mielóide
crônica humana (K562) com IC50 igual a 18,28 µM e Carcinoma alveolar de
pulmão humano (A549) com IC50 igual a 33,72 µM, e leve atividade citotóxica
sobre células normais de Fibroblasto de pulmão humano (MRC-5);
• O composto Ditionato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) induziu a
incapacidade de formação de colônia na linhagem A549 em concentrações
superiores a 40 µM;
• O composto Ditonato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) induziu um alto
percentual de danos no DNA das células tumorais K-562 em concentrações
superiores a 10 µM;
• O composto Ditionato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) interferiu no ciclo
celular das células tumorais K562, afetando a progressão do ciclo celular,
reduzindo o número de células em fase G1, S e G2 e aumentando o
percentual de células em sub-G1, revelando um forte efeito apoptótic.
Referências Bibliográficas 161
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Apesar do grande sucesso alcançado pelos compostos de platina no
tratamento de diferentes tipos de tumores desde a década de 1970, os estudos
envolvendo outros agentes antitumorais baseados em metais de transição têm se
mostrado excepcionalmente escassos.
O modelo presente de tratamento do câncer ainda se baseia, em muito, no
desenvolvimento de agentes farmacológicos que ajam seletivamente sobre as
células de tecidos neoplásicos. Contudo, os agentes quimioterápicos atualmente
disponíveis, manifestam toxicidade significativa sobre os tecidos normais, o que
acarreta maior complicação do seu uso clínico, levando à profundas reflexões sobre
os critérios que se deve considerar acerca dos riscos versus benefícios da
quimioterapia. Apesar disso, os estudos sobre quimioterápicos coordenados não-
platinados têm apresentado resultados bastante promissores. Tais resultados levam
à necessidade de se estudar, ativamente, a grande variedade de agentes
organometálicos em diferentes tipos tumorais, explorando assim, novos mecanismos
de ação, que podem levar ao desenvolvimento de novas terapias contra o câncer.
No presente estudo, utilizamos diferentes metodologias que permitiram avaliar
os efeitos citotóxicos, genotóxicos e antitumoral do organometálico Ditionado de cis-
Tetramino(oxalato)Rutênio(III). Estes testes fazem parte da primeira fase dos
estudos necessários para a liberação de novos medicamentos no mercado, exigidos
pela ANVISA.
Inicialmente, avaliamos a capacidade do composto de Rutênio (III) de inibir a
proliferação celular e de induzir alterações genotóxicas, através do teste Allium cepa,
que utilizam células do meristema apical de bulbos do vegetal cebola. Foram
também realizadas análises de citotoxicidade através do Teste MTT e do teste de
Referências Bibliográficas 162
coloração por Azul de Tripano, que permitiram avaliar um possível efeito citotóxico
do composto de Rutênio(III) sobre células tumorais e sadias de humanos e murinos.
Os resultados provenientes da análise do teste clonogênico, permitiram avaliar a
capacidade das células tumorais e normais em formar colônias após o tratamento
com o composto de Rutênio(III). A análise do ciclo celular e de indução de apoptose
de células tumorais pela citofluorimetria de fluxo, permitiu avaliar o efeito do
composto de Rutênio(III) sobre o processo de divisão celular, assim como a sua
capacidade de induzir apoptose sobre as linhagens tumorais estudadas. A análise
de dano ao DNA, através do ensaio cometa, permitiu avaliar a atividade genotóxica
do composto de rutênio(III) sobre linhagens tumorais e, finalmente, a análise de
fragmentação do DNA, através eletroforese em gel de agarose, permitiu também
avaliar a atividade genotóxica do composto.
A metodologia utilizada neste trabalho vem sendo utilizada por vários
pesquisadores, em diversos tipos de células e para várias finalidades, permitindo
analisar de forma prática, os compostos sintéticos ou derivados de produtos naturais
com potencial atividade antitumoral.
Os nossos resultados indicaram que o composto de Rutênio(III) inibiu a
proliferação celular em células de Allium cepa, sem contudo provocar alterações
clastogênicas significativas, demonstrando que o composto tem reduzida atividade
sobre células normais. A mesma ausência de efeito citotóxico foi observada nas
células de fibroblasto humano MRC5. Estes resultados corroboram os estudos que
apontam que os compostos de rutênio apresentam uma notável atividade inibitória
do ciclo celular de células tumorais, sem, contudo, promover a morte celular ou a
clastogenicidade em células sadias (Frasca et al., 2001; Menezes et al., 2007;
Silveira-Lacerda et al., 2009a). Finalmente, os resultados provenientes do presente
Referências Bibliográficas 163
estudo indicam que o composto organometálico Ditionado de cis-
Tetramino(oxalato)Rutênio(III) {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} é digno de estudos mais
aprofundados que, possivelmente, podem levar ao desenvolvimento de um novo
fármaco com efeito antitumoral.
Referências Bibliográficas 164
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Anexos 174
10. ANEXOS Anexo 1
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