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Preparação de Amostras Biológicas para Microscopia Eletrônica

Patricia Massara Martinelli

Coordenadora

Laboratório de Preparação de Amostras Biológicas

CM-UFMG

Amostras BiológicasKeith Porter, Albert Claude, and Ernest Fullam. 1945. "A Study of

Tissue Culture Cells by Electron Microscopy”. Journal of Experimental

Medicin.

http://www.biologicalelectronmicroscopy.com/a-brief-history-of-micorscopy.html

http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/memb/membrane.jpg

Robertson, JD. 1959. Estrutura

trilaminar da membrana plasmática

Amostras Biológicas• Tipos

– Para MET: amostras de órgãos/tecidos, células em cultivo, microorganismos, vesículas (lipossomas, micelas, etc)

• Amostras finas

• Análise de detalhes na secção da amostra

– Para MEV: amostras de tecidos, células em cultivo, microorganismos, vesículas (lipossomas, micelas, etc), organismos de pequena dimensão (insetos, conchas, sementes, etc), órgãos e fragmentos de órgãos

• Amostras espessas

• Análise de superfície

– Preservação• ~80% de H2O; enzimas; elementos orgânicos

Exposição ao ar

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão

– Resistência ao vácuo• ~80% de H2O

vácuo

H2OH2O

H2O H2O

H2O

H2O H2O H2O

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão

• Espessura da amostra

– Permitir passagem do feixe eletrônico

– Promover resolução

˜50nm

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão

Elementos orgânicos

Baixa densidade de elétrons

Baixo contraste

H

O

C

N

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão

• Contraste na amostra

• PREPARAÇÃO– Manutenção próxima da organização in vivo

» Preservação da arquitetura e composição celular

» Manter relação espacial na célula» Impedir a liberação e ação de enzimas líticas (autólise)» Impedir ação de microorganismos (putrefação)

– Permitir produção de secções ultrafinas– Conferir resistência ao vácuo– Conferir contraste

• FIXAÇÃO, DESIDRATAÇÃO, INCLUSÃO, ULTRAMICROTOMIA, CONTRASTAÇÃO– Efeitos sobre a amostra:

• Endurecimento• Retração• Perda discreta da estrutura

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão

• FIXAÇÃO

– Estabilização da estrutura molecular

– Não desnaturante

– Permite etapas seguintes

– Fixação química

• Aldeídos (pontes intra e interprotéicas)

• Tetróxido de ósmio (lipídeos)

• Mais usada

Máximo 2mm

Aldeído

Tetróxido de ósmio

• DESIDRATAÇÃO – Resistência ao vácuo

– Permite inclusão em resina

• INCLUSÃO EM RESINA– Permite ultramicrotomia

– Resitência ao feixe de elétrons

Etanol50%1x10'

Etanol70%2x15’

Etanol95%2x15

Etanol100%

3x15'

Acetona100%

2x15'

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão

• ULTRAMICROTOMIA– Cortes ultrafinos (50-60nm)

– Telas de cobre, níquel ou ouro

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão

• CONTRASTAÇÃO– Deposição de metais pesados (tetróxido de

ósmio, acetato de uranila, citrato dechumbo)

– Positiva: detalhes internos

– Negativa: contorno da amostra (vírus,bactérias, vesículas, liposomas,macromoléculas)

NegativaPositiva Nakajima et al 2010http://freegreenbee.blogspot.com.br/2014/04/influenza.html

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Transmissão

DIAFRAGMA DE CAMUNDONGO

MASTÓCITO EM COLON HUMANO

LIPOSOMA

ME de transmissãoTomografia

Subramaniam et al., 2003

EDS (Espectroscopia de X-ray porenergia dispersiva)

a) Electron micrograph showing the microstructure of a wheat seed aleurone cell. EDS maps of (b) Os Mα, (b) P Kα and (d) N Kα. (e) Layered image combining all 3 maps.

https://www.azonano.com/article.aspx?ArticleID=3701

• PREPARAÇÃO– Manutenção próxima da organização in vivo

» Preservação da estrutura molecular da superfície a ser analisada

» Manter relações espaciais das estruturas» Impedir a liberação e ação de enzimas líticas (autólise)» Impedir ação de microorganismos (putrefação)» Conferir resistência ao vácuo» Aumentar condutividade e dar estabilidade

• FIXAÇÃO, DESIDRATAÇÃO, (CRIOFRATURA), MONTAGEM, E METALIZAÇÃO

• AMOSTRAS: dimensões maiores

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Varredura

• FIXAÇÃO– Desnecessária em caso de superfícies secas (esqueletos de quitina,

conchas, sementes secas, etc) Secagem comum ao ar

– Fixação química: aldéidos

– Fixação por congelamento ou narcotização (vermes, insetos aquáticos, zooplancton) stress ao entrar em contato com fixador mudança ou perda de ultraestrutura

• Material sobre a amostra, como muco, pode impedir visualização da superfície Lavagem com salina (com leve agitação) Centrifugação leve Álcool, glicerol ou enzimas

AMOSTRAS BIOLÓGICAS ME Varredura

• DESIDRATAÇÃO

– Desnecessária no caso de amostras secas

– Amostras úmidas: secagem sem deformação da superfície mais extensa. Forças de tensão superficial da água durante sua passagem para estado líquido para gasoso

– Secagem em ponto crítico

AMOSTRAS BIOLÓGICAS

ME Varredura

• MONTAGEM

• METALIZAÇÃO:

– Amostras devem tornar-se condutoras (interação com feixe elétrons)

AMOSTRAS BIOLÓGICAS

ME Varredura

CABEÇA ARANHA

CABEÇA MARIPOSA

Através de lentes eletrostáticas é possível mover o feixe de íons em uma área determinada e fazer cortes com resolução nanométrica.

Briggman & Bock, 2012

Karreman et al., 2016

MICROSCÓPIO DE FEIXE

DUPLO: ELÉTRONS + ÍONS (FIB

– focused ion beam)

CRIOTÉCNICAS

CRIOFIXAÇÃO• Congelamento ultrarrápido das células com passagem da água intracelular e

pericelular do estado líquido para o sólido (vitrificação) sem formação de cristais.

• Mantem estado natural da amostra (evita difusão de solutos, deformações

osmóticas e morfológicas, alterações bioquímicas)

• Dispensa fixadores químicos

• CryoEM de amostras hidratadas

SEM CONGELAMENTO CONGELAMENTO NORMAL CONGELAMENTO ULTRARRÁPIDO

CRIOFIXAÇÃO

CRIOFIXAÇÃO

CRIO ULTRAMICROTOMIA

IMUNOMARCAÇÃO

ME TRANSMISSÃO

CRIO FRATURA

CRIO SUBSTITUIÇÃO

FIXAÇÃO QUÍMICA

INCLUSÃO

ME VARREDURA

FIB

RÉPLICA

IMUNOMARCAÇÃO

TEMPERATURA AMBIENTE

High-Pressure Freezing

Congelamento ultrarrápido (-1000ºC/s) com nitrogênio líquido

sob alta pressão (2100 bars);

Única técnica capaz de congelar amostras > 30 µm

Melhor preservação da arquitetura celular e molecular (menos

artefatos);

CRIOFIXAÇÃO

Amostra

Porta-amostra

Porta-amostraFluido extracelular

CRIO-ULTRAMICROTOMIA

Neurofisiona em terminais axônicos(https://www.uthsc.edu/neuroscience/imaging-

center/)

CRIO-FRATURA

https://www.pinterest.co.uk/pin/238690848972886488/

Microscopia Correlativa• Correlação entre imagens de microscopia óptica e eletrônica de

transmissão;

• Identificar moléculas e/ou estruturas imunomarcadas em organelas ouregiões subcelulares;

Market et al., 2016

http://www.ucl.ac.uk/lmcb/users/alexander-agrotis

Microscopia eletrônicaambiental

• Amostra em meio líquido ou gasoso

The original image is the upper epiderml cells of petal in Mazus fauriei and gotten with cryo SEM. Courtesy of Dr. Wann-neng Jane , Institute of Plant and Microbial Biology, Academia Sinica (www.fei.com)

OBRIGADA!