populational structure of schistosoma mansoni assessed by dna microsatellites rodrigues, n. b.,...

Populational structure of Schistosoma mansoni

assessed by DNA microsatellites

Rodrigues, N. B., Coura Filho P., de Souza, C. P., Jannoti Passos, L. K., Dias-

Neto, E., Romanha A. J.International Journal for Parasitology 32

(2002) 843 - 851

Introdução1. Schistosoma mansoni:

Espécie de parasita com nítido dimorfismo sexual e que parasitam o homem e animais.Ocorre na África, Antilhas e América do Sul.Apresenta as seguintes formas durante o ciclo de vida: ovo, miracídio, cercária e adulto.Apresenta endemicidade em cidades de MG, ES e BA.

Vermes adultos

Ciclo de vida do parasita

Cepas de indivíduos da mesma região e de regiões diferentes apresentam diferenças fenotípicas (produção de ovos, manifestações clínicas da doença, susceptibilidade a drogas, etc).Pequena variação genética é observada entre cepas de uma mesma região ou de regiões diferentes.

Através de experimentos de RFLP e RAPD observa-se diferenças moleculares entre espécies de Schistosoma e pouca variação genética entre cepas, mesmo de cepas de diferentes continentes.Análises de regiões polimórficas presentes no mtDNA têm sido realizadas para se estudar a variação genética.

2. Microssatélites:Pequenas seqüências repetidas em tandem (1 – 6 pb) dispersos pelo genoma.Tem sido utilizados para estudos de variação em mamíferos e parasitas.PCR de regiões flanqueadoras de microssatélites possibilitam a análise de variação dentro de uma população usando uma pequena quantidade de DNA.

ObjetivoCaracterizar o padrão de herança de seis loci de microssatélites em S. mansoni,Avaliar a presença desses microssatélites em outras espécies do gênero Schistosoma.

Metodologia1. Parasitas utilizados:

Cepa cultivada em laboratório desde 1959.Parasitas isolados de pacientes e caramujos infectados na cidade de Dionísio.Extração do DNA.

2. Cruzamentos experimentais:Determinar o padrão de herança de alelos microssatélites.32 vermes da cepa cultivada em lab. foram cruzados (16 machos e 16 fêmeas).Obtenção de F1, F2 e F3.Extração de DNA.

3. Procura por microssatélites:Utilização do software RepeatMasker para localização de regiões contendo no mínimo 5 repetições perfeitas de sequencias de DNA depositadas em bancos de dados.Desenho de primers para gerar amplicons de diferentes tamanhos, permitindo analisar diferentes loci de microssatélites.

4. Análises de microssatélites:Através de PCR.Análises simultâneas dos produtos de PCR de diferentes loci.

5. Análise computacional e estatística:Cálculo das frequencias alélicas, genotípicas de todos os loci polimórficos estudados.Cálculo da heterozigosidade observada e esperada no equilíbrio de H-W utilizando o teste qui-quadrado.Análises estimativas da estrutura populacional das cepas obtidas em campo utilizando os índices Fst e Rst.

ResultadosGenebank: análise de 16.000 sequências de DNA e cDNA

622 loci de microsatélites em 481 sequências (3%)Repetições frequentes:

AT – 29.0%AAT – 22.2%AC – 16.2%

Microsatélites perfeitos – 70.0%Mononucleotídeos – 0.9%Dinucleotídeos – 53.9%Trinucleotídeos – 38.9%Tetranucleotídeos – 6.2%

– Seis loci analizados:• Quatro polimórficos: SmBr1, 3, 5 e 6• Dois monomórficos: SmBr2 e 4

– Nenhum desequilíbrio de ligação foi observado nesses loci e nenhum loci demonstrou ser ligado ao sexo.

Os quatro loci demonstraram desvio significativo em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg.

• Padrão de Herança Mendeliana, codominância de alelos e diploidia desses microsatélites foram observadas, mas os dados não foram mostrados.

• Os seis pares de primers foram testados em outras seis espécies de Schistosoma e não houve amplificação

DiscussãoAs sequências avaliadas no GeneBank eram todas Tags de sequências expressadas –3% Durand e colaboradores (2000) encontraram 1% - tamanho do microsatéliteA linhagem LE de laboratório apresentou menor número de alelos ou alelos por locus polimórfico que linhagens isoladas do campo

Essa linhagem apresentou também um número muito menor na heterozigosidade que as demaisManutenção dessas linhagens LE em laboratório por 41 anosSmBr4, localizado na região codoficadora, pode ter sofrido grande pressão de seleção que gerou grande variação desse locus nessas populações.SmBr3, 5 e 6 estão a jusante da região codificadora

SmBr1 localizada numa 3’UTR de um gene que codifica uma proteína similar a uma proteína ligante a cálcio P22 de Mus musculus Fst e Rst apresentaram valores similaresAs populações em torno de Dionísio permanecem não diferenciadas ou pouco diferenciadasA fácil observação de heterozigosidade e de números de alelos é uma ferramenta importante no estudo genético de Schistosoma mansoniEstudos de microsatélite são melhores que análises por mtDNA que tem uma heterozigosidade reduzida e se comporta como genoma haplóide

O estudo reforsa a utilidade de microsatélites como marcadores genéticosSerá possível resolver questões epidemiológicas considerando a estrutura genética de populações de Schistosoma mansoni e sua relação com a morbidade de Esquistossomose

Populational structure of Schistosoma mansoni

assessed by DNA microsatellites

Rodrigues, N. B., Coura Filho P., de Souza, C. P., Jannoti Passos, L. K., Dias-

Neto, E., Romanha A. J.International Journal for Parasitology 32

(2002) 843 - 851