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Outils diagnostiques microbiologiquesactuels et innovants

Emmanuelle Varon

MicrobiologieHôpital Européen Georges-Pompidou, Paris.

Emmanuelle Varon - 2016

Bissonnette et al. Clin Microbiol Infect, 2010Emmanuelle Varon - 2016

Tests diagnostiques rapides

• Tests faciles à utilisero Identificationo +/- Toxineo +/- Résistance aux anti-infectieux

• Résultats rapides (15 min. à 2 heures)o Immunochromatographie (ICT)o PCR / systèmes automatisés

miniatures

• Connaître les limites des tests• CQ• Traçabilité des résultats

Meilleure prise en charge• Antibiothérapie ciblée et adaptée• Limiter la transmission (BMR, MST, …), gérer

l’isolement• Diminuer la durée d’hospitalisation

Bissonnette et al. Clin Microbiol Infect, 2010Cohen-Bacrie et al. PlosOne 2011Emmanuelle Varon - 2016

ImmunoChromatography Tests (ICT)

Ag U

Spté 99%

Faux + Sérum anti-lymphocytaire

Sbté56 à 99%

70 à 88% si urines concentrées

CNR legionelleshttp://nte-serveur.univ-lyon1.fr/hcl2004/CNR_legionelles/

Concentration des urines (centrifugation, 10 à 20 minutes)

Ag urinaires de Legionella pneumophila sérogroupe 1

Chauffage des urines pour éliminer les faux positifs

Emmanuelle Varon - 2016

ImmunoChromatography Tests (ICT)

Négatif Positif

Song et al. Infect Chemother. 2013 Dec;45(4):351-66

Ag urinaires de pneumocoque (Binax Now®)

Emmanuelle Varon - 2016

Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1389–1393

b Beta-lactam and macrolide or fluoroquinolone

Emmanuelle Varon - 2016

Spn carriage and urinary antigen test

Hamer et al. Clin Infect Dis, 2002

Total 66.0 (138/209) 16.0 (33/209)

Pleuro-pneumonies• Utilisation du test n’est pas validée à ce jour dans le

liquide pleural• Cependant

o S. pneumoniae est une des principales étiologies o Cultures sont souvent négatives

• Antibiothérapie préalable++• Autolyse du pneumocoque

• à plusieurs études publiées (enfant ++)o Sensibilité : 71-96%o Spécificité : 71-100%

Revue : Song et al. Infect Chemother. 2013 Dec;45(4):351-66

o +43% de diagnostic étiologique pour les empyèmes à pneumocoqueLe Monnier et al. Clin Infect Dis. 2006 Apr 15; 42(8):1135-40

Antigènes urinaires : quoi de neuf?

• Fluorescence Immunochromatographie (SOFIA –InGen)

o Meilleure sensibilité que ICT BinaxNOW® pour la détection d’antigènes de Legionella groupe 1

Beraud et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015 Sep;34(9):1803-7

o Tests en cours d’évaluation • détection des légionelles des autres groupes• détection des pneumocoques (polyoside C)

• Tests détectant des antigènes spécifiques capsulaires de pneumocoque

o Restreints aux sérotypes vaccinaux PCV13Pride et al. Clin Vaccine Immunol. 2012 Aug;19(8):1131-41

à intérêt limité

Emmanuelle Varon - 2016

Nouvelles techniques d’identification

bactérienne

MALDI-TOF MSMatrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry

• Matrice + échantillon en solution cristalline àCible (plaque métallique)

• Laser à désorption ionisation• Analyseur à temps de vol• Profil de pics (protéines bactériennes) définis

par leur ratio m/z et leur intensité relative

Emmanuelle Varon - 2016

MALDI-TOF MS

• Pics spécifiqueso Genreo Espèceo (Sous-espèce)

• Reproductibles SI conditions de croissance identiques

Carbonnelle et al. Clin Biochem, 2011

Emmanuelle Varon - 2016

MALDI-TOF MS sur colonies

• Temps d’identification bactérienne : quelques minutes

Carbonnelle et al. Clin Biochem, 2011

Emmanuelle Varon - 2016

Et à partir des hémocultures : sur sub-cultures ultra précoces (2 à 3 heures)

Exemples d’espèces bactériennes identifiées par Maldi-TOF MS

• …• Enterobacter cloacae• Enterobacter aerogenes• Enterobacter amnigenus• Enterobacter asburiae• Enterobacter cancerogenus• Enterobacter cowanii• Enterobacter gergoviae• Enterobacter hormaechei• Enterobacter kobei• Enterobacter ludwigii• Enterobacter pyrinus• Enterobacter radicincitans• …

• ….• Granulicatella adiacens• Granulicatella balaenopterae• Granulicatella elegans• Grimontia hollisae• ….

Emmanuelle Varon - 2016

MALDI-TOF MS sur prélèvements

> 105 CFU/mlE. coli 97.6%

Carbonnelle et al. Clin Biochem, 2011Emmanuelle Varon - 2016

Nouvelles techniques de détection de la résistance

aux antibiotiques

MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS

MALDI & Détection rapide de la résistance aux C3G des entérobactéries isolées d’hémocultures• Identification par Maldi-TOF & β-Lacta test sur culture de 3 heures d’une

hémoculture positive• 108 hémocultures positives à entérobactéries

Résistance aux C3G

BLSE

Sensibilité 84,8% 100%Spécificité 100% 96,3%VPP 100% 90,3%VPN 94% 100%Compain et al. J Med Microbiol. 2015

M-P. Fernandez-Gerlinger, ICAAC 2015

Strat B- Conseil ATB sans Maldi ni β-Lacta testStrat C- Conseil ATB avec Maldi & β-Lacta test

Biologie moléculaire

Le diagnostic moléculaire « 16S »

Détermination de la séquence du fragment d’ADN

Comparaison avec des banques de données informatiques

Identification de la bactérie

ADN ribosomal 16S 475pb

Séquences conservées chez toutes les bactéries

Séquences variables spécifiques d’une espèce

PrélèvementCulture négative, recherche de

bactérie non cultivable

Extraction d’ADN

PCR « universelle » d’un fragment d’ADN

présent chez toutes les bactéries

Emmanuelle Varon - 2016

PCR directe sur le sang

• 16S-23S rRNA• 5-18S rRNA 803 enfants, 1673 échantillons

25 micro-organismes (90% des espèces isolées d’hémocultures)

3 réactions PCR temps réel Sensitivity 85.0% (95% CI 78.7 to 89.7%) Specificity 93.5% (95% CI 92.1 to 94.7%)

compared to blood culture

Emmanuelle Varon - 2016

Lucignano et al. J Clin Microbiol 2011

803 enfants, 1673 échantillons

Septifast®/Hémoc

PCR directe sur le sang

Emmanuelle Varon - 2016

Sensitivity of 94·7% (95% CI 93·6 – 95·7) Specificity of 98·8% (98·1 – 99·2)18 h faster than conventional bloodculture method

Prove-it : Amplification and detection of gyrB and parE genes of 50 bacterial species and mecA gene

Emmanuelle Varon - 2016

PCR et hybridationIdentification et détection mecA & PVL (cultures)

- Conjugate control- Universal control

- S. aureus- S. epidermidis

- mecA- PVL

- Color control

MSSA P

VL-

MSSA P

VL-

MSSA P

VL-

MSSA P

VL-

MRSA P

VL-

Genotype®MRSA (Hain)

• A partir d’une cultureo Extractiono PCR avec amorces

biotinyléeso Hybridation sur

bandeletteso Révélation

colorimétrique• Délai 4 h

Emmanuelle Varon - 2016

PCR et hybridationRapid detection of antibiotic resistance

• H. pylorio Fluoroquinoloneso Clarithromycine

• M. tuberculosiso Rifampicineo INH

Genotype® (Hain)

Exemple pour M. tuberculosis

Emmanuelle Varon - 2016

Lab-on-a-chip concept

• Micro plateformes semi-automatisées de biologie moléculaire

o Extraction o PCR real-time simple ou multiplexeo CQI

• Système fermé• Durée de réalisation : environ 1 heure à 1,5

heure • Coût élevé

Emmanuelle Varon - 2016

• À partir de prélèvements sur écouvillonso Strepto B (ou après pré-culture)o C. difficile/Toxine B / clone 027o S. aureus / SARMo VanAo Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae (et urines)

• A partir d’hémoculture +o S. aureus / SARM

• A partir d’échantillonso Enterovirus (LCR)o M. tuberculosis et résistance à la rifampicineo S. aureus / SARM (SCCmec I II, III, IVa, V, VI)

Xpert® Cepheid

Emmanuelle Varon - 2016

PCR multiplexe pour une approche syndromique

• Panel de pathogènes respiratoireso Adenovirus B, C, Eo Coronavirus 229E, HKU1, NL63, OC43o MERS-CoVo Bocaviruso Metapneumoviruso Rhinoviruso Influenzae A, AH1, AH1N1200ç, AH3, AH275Y, Bo Parainfluenzae 1, 2, 3, 4o VRS A, Bo Bordetella pertussiso Chlamydophila pneumoniaeo Legionella pneumophilao Mycoplasma pneumoniae

• Panel Hémoc Gram + (25 espèces/genres et 6 gènes de R)• Panel Hémoc Gram – (20 espèces/genres et 3 gènes de R)• A venir : Panel gastro-intestinal, génotypage VHC

ePlexGenMarkDx®

Emmanuelle Varon - 2016

Avni et al. J Clin Microbiol 54:401–411Emmanuelle Varon - 2016

PCR : additional diagnosis of 18% to 30% vs UAD

Difficultés du diagnostic BM• Faux négatif

o Extraction+++• Répartition inhomogène des bactéries dans le prélèvement• Micro-organismes difficile à lyser• Séparer l’ADN eucaryote +++ (SeptiTest®, Looxster®)• Présence d’inhibiteurs de la Taq (SANG++)

o Seuil de détection (3 à 1000 UFC/ml selon l’espèce et la méthode)o Sang : charge bactérienne faible

• Faux positif et problèmes d’interprétationo Contaminationso bactériémie chez un porteur saino Manque de spécificité : PCR pneumocoque (lytA - gène de l’autolysine A,

ou ply - gène de la pneumolysine) sont présents aussi chez S. mitis, S. oralis et S. pseudo-pneumoniae) qui constituent une part importante du microbioterhino-pharyngé.

o Persistance de l’ADN bactérien (streptocoques, bartonelles, …)• Non adapté pour les prélèvements pluri-microbiens• ADN ne reflète pas des bactéries vivantes Validation

clinique ++++ Carvalho et al. J Clin Microbiol 2007Ecker et al. Expert Rev. Mol. Diagn. 2010

Blaschke et al. Clinical Infectious Diseases 2011Emmanuelle Varon - 2016

Perspectives

• Spectrométrie de masse MALDI-TOFo Progression du nombre d’espèces identifiables

• Développement des bases de données (Bruker-Biotyper, bioMérieuxShimadzu-AnagnosTec, Andromas)

• Mise au point d’autres protocoles d’analyseo Pneumocoques et S. mitis / S. oralis ; E. coli et Shigellao A partir des prélèvements

o Détection de facteurs de virulence : PVL, TSST…o Détection de gènes de résistance

• SCCmec, BLSE, carbapénémases…o Analyse d’autres molécules (polysaccharides, acides gras, …)

• Typage, séquençage (MLST-like par MALDI-RE, PCR-ESI…)

• Séquenceurs de nouvelle génération (très haut débit) “de paillasse”

o Identifier les cibles d’intérêt pour le diagnostic d’un grand nombred’espèces

Emmanuelle Varon - 2016

• PCR sur sang (bactéries, Candida, mecA, vanA/B, KPC) comparéeà PCR sur hémoculture

• Analyse des amplicons par ESI-TOF

Emmanuelle Varon - 2016

• Sequençage haut débit Ion Torrent (Life Technologies)• Cible = ADNr 16S, V1-V2

Emmanuelle Varon - 2016

• A température ambiante, en temps réel• Rapide ++ : en moins de 30 minutes• Peu sensible aux inhibiteurs présents dans le sang• Sensibilité (4 vs 5.1GE pour PCR)• Gène-cible Leader peptidase A (LepA) spécifique

de S. pneumoniae

Nouvelle technique d’amplification (RPA)

Clancy et al. BMC Infectious Diseases (2015) 15:481Emmanuelle Varon - 2016

BM…Il reste quelques défis

• Meilleure spécificité des cibles• Séparation des espèces dans les prélèvements pluri-

microbiens• Quantification

o pathogène vrai : Nono commensal : Oui, mais quel seuil différencie infection de colonisation?

• La biologie moléculaire ne se conçoit pas sans concertation microbio-clinique de la réalisation du prélèvement à l’interprétation des résultats.

Emmanuelle Varon - 2016

Mais surtout n’oubliez pas …la culture

reste essentielle !

Emmanuelle Varon - 2016