mÉtodos microbiolÓgicos em indÚstria
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MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS EM INDÚSTRIA
DE PRODUTOS ESTÉREIS E NÃO ESTÉREIS.
Alessandra Cristo
Agosto 2021
CONCEITO
“O CONTROLE DE QUALIDADE É A PARTE DE BOAS PRÁTICAS DE FABRICAÇÃO
REFERENTE A AMOSTRAGEM, ESPECIFICAÇÕES, ENSAIOS, PROCEDIMENTOS DE
ORGANIZAÇÃO, DOCUMENTAÇÃO E PROCEDIMENTO DE LIBERAÇÃO QUE ASSEGURE
QUE OS ENSAIOS NECESSÁRIOS E RELEVANTES SEJAM EXECUTADOS E QUE OS
MATERIAIS NÃO SEJAM LIBERADOS PARA USO, NEM OS PRODUTOS LIBERADOS PARA
VENDA OU FORNECIMENTO ATÉ QUE A QUALIDADE DOS MESMOS SEJA JULGADA
SATISFATÓRIA.”
LEGISLAÇÕES
• Orgão Regulador: ANVISA/ Visa Local
• RDC Nº 301, DE 21 DE AGOSTO DE 2019
• RDC 79, de 11 de Abril 2003 – Dispõe que na ausência de monografiaoficial/métodos gerais inscrito na Farmacopéia Brasileira poderá seradotada a última edição das seguintes compêndios internacionais:Farmacopéia Alemã, Farmacopéia America (USP), FarmacopéiaBritânica, Farmacopéia Européia, Farmacopéia Francesa,Farmacopéia Japonesa e Farmacopeía Mexicana.
LEGISLAÇÕES
• RDC 169, de 21 de Agosto de 2006 – Incluiu a FarmacopéiaPortuguesa.
• RE 166, de 24 de Julho de 2017 – Validação de Métodos Analíticos (Não inclui métodos Microbiológicos).
GUIAS
• <61> USP Microbiological Examination Of Non-sterile Products: Microbial Enumeration Tests.• < 62> USP Microbiological Examination of Non-sterile Products: Tests for Specified.
Microorganisms.• <71> Sterility Test• <81> Antibiotics - Microbial Assays• <85> Bacterial Endotoxin Test• <1072> Disinfectants anda Antiseptics• <1227> Validation of Microbial Recovery from Pharmacopeial Articles• <1111> USP Microbiological Quality of Non-sterile Pharmaceutical Products• <1112> Apllication of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical Products
GUIAS
• <1116> Microbiological Controle and Monitoring of Aseptic Processing Environments.• <1115> USP Bioburden Control of Nonsterile Drug Substances and Products.• <1231>USP Water for pharmaceutical purposes.• <1223>USP Validation of Alternative Microbial Methods. • <1229.3> USP Sterilization of Compendial Articles - Monitoring of Bioburden • Relatório Técnico nº70 Fundamentos de Limpeza e Programas de Desinfecção para
instalações produtivas assépticas.
PRÉ-REQUESITOS
• Meios de cultura adquiridos de fornecedores qualificados.
• Meios previamente preparados e aprovados no Teste de Promoção de Crescimento e Esterilidade.
• Cepas adquiridas de fornecedores qualificados.
• Cepas utilizadas até quinta passagem.
• Controle de reconstituição e repique de cepas.
• Água de boa Qualidade para preparo dos meios de cultura.
TESTES PRECONIZADOS PARA PRODUTOS
NÃO ESTÉREIS E ESTÉREIS
ANÁLISE DE ÁGUA
TIPOS DE ÁGUA
• Água Potável: água que atenda o padrão de potabilidade que é um conjunto de valores permitidos como parametron da qulaidade da água para o consumohumano, o que não oferece riscos a saúde humama.
• Água Purificada: É a água potável que passou por algum tipo de tratamento para retirar os possíveis contaminantes e atender aos requisites de pureza requeridosestabelecidos. Geralmente preparade por destilação, troca ionica, osmose reversa, termocompressão ou outro processo adequado. Deve estar livre de qualquer substância dissolvidas. Geralmente é utilizada na preparação de medicamentos que não requeiram água estéril e nem apirogênica, destinada aouso não parenteral.
TIPOS DE ÁGUA
• Água Para Injetáveis: É o insumo utilizado na preparação de medicamentosparenteral, como veículo ou na dissoução ou diluição de substâncias ou de preparações. Outros exemplos de fabricações farmacêuticas são a fabricação de princípios ativos de uso parenteral, para lavagem final de equipamentos, tubulações e recipientes usados em preparações parenterais, e na limpeza de certos equipamentos.
• Água Ultrapurificada (Milli-Q): É a água que passou por tratamento adicional para retirar os possíveis contaminantes e atender os requisitos de pureza estabelecido.
AMOSTRAGEM
• A amostragem é uma etapa importante na avaliação da qualidade da água, uma vez que a amostra retirada para análise deve refletir com precisão o desempenho do sistema de produção e distribuição e a qualidade da água utilizada. Uma amostragem inadequada pode levar a uma avaliação equivocada, gerando intervenções desnecessárias no sistema de purificação, ou comprometendo a veracidade do estado da qualidade da água por meio de um resultado impreciso. Considerando as particularidades de cada sistema, as amostras de água devem ser retiradas desde o local de sua geração até os pontos de uso, visto que os resultados obtidos na geração podem não refletir a qualidade da água nos pontos de uso. A coleta de amostras nos pontos de uso deve ser realizada utilizando práticas idênticas àquelas empregadas rotineiramente na utilização da água naquele ponto, mimetizando a operação do sistema (purga da válvula, utilização de mangueiras, sanitização do ponto, etc).
CUIDADOS AMOSTRAGEM
• As amostras devem ser coletadas em recipientes de vidro borossilicato estéreis ou bolsas plásticas estéreis apropriadas para o uso microbiológico. O volume da amostra deve ser suficiente para realizar todas as análises necessárias. A quantidade de amostra adicionada nos recipientes deve permitir a homogeneização antes da realização dos ensaios, sendo sugerido um espaço de pelo menos 2,5 cm acima da superfície da água (headspace).
• Agentes desinfetantes, como cloro ou outros compostos halogenados, quando presentes nas amostras de água, devem ser neutralizados antes da realização dos testes, para garantir uma recuperação adequada dos micro-organismos possivelmente presentes. Um agente neutralizante comumente usado é a solução de tiossulfato de sódio (0,1 mL de uma solução a 3% neutraliza acima de 5 mg/L de cloro residual em uma amostra de 120 mL).
FREQUÊNCIA DE COLETA
• Validação1 fase: 14 dias, 2 fase: 14 dias,3 fase: 12 meses.
• Após fase 3 → Análise Risco determinando os pontos a serem coletados e sua frequência.
ESPECIFICAÇÃO ÁGUA
• ÁGUA POTÁVEL – TESTES PRECONIZADOS
CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS : No máx 500 UFC/mL
PESQUISA DE COLIFORME FECAIS E ESCHERICHIA COLI – AUSÊNCIA 100ML
ESPECIFICAÇÃO ÁGUA
• ÁGUA PURIFICADA – TESTES PRECONIZADOS
CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS : No máx 100 UFC/mL
PESQUISA DE PSEUDOMONAS AERUGIONSA - AUSÊNCIA 20OML
PESQUISA DE COLIFORME FECAIS E ESCHERICHIA COLI – AUSÊNCIA 100ML
ESPECIFICAÇÃO ÁGUA
• ÁGUA ULTRA- PURIFICADA – TESTES PRECONIZADOS
CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS : No máx 10 UFC/mL
PESQUISA DE PSEUDOMONAS AERUGIONSA - AUSÊNCIA 20OML
PESQUISA DE COLIFORME FECAIS E ESCHERICHIA COLI – AUSÊNCIA 100ML
ESPECIFICAÇÃO ÁGUA
• ÁGUA PARA INJETÁVEIS – TESTES PRECONIZADOS
CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS : No máx 10 UFC/100mL
PESQUISA DE PSEUDOMONAS AERUGIONSA: AUSÊNCIA 200ML
PESQUISA DE COLIFORME FECAIS E ESCHERICHIA COLI: – AUSÊNCIA 100ML
ENDOTOXINA BACTERIANA: 0,25EU/ML
METODOLOGIA
Método por profundidade em placa: adicionar 1 mL da amostra em placa de Petri e verter 15 mL a 20 mL do meio de cultura mantido de 45 °C a 50 °C, conforme Tabela 1. Realizar o teste pelo menos em duplicata.
Método de filtração em membrana: utilizar equipamento de filtração que possibilite a transferência da membrana para os meios de cultura. Utilizar membrana estéril com 47 mm de diâmetro e porosidade de 0,45 µm, lavando-se a membrana, após a filtração da amostra, com três porções de 20 mL a 30 mL de água purificada estéril. O volume a ser filtrado poderá variar de acordo co
Fonte: FB 6ª edição, pg.454
Fonte: FB 6ª edição, pg.454
Pesquisa de Coliformes Totais e E. coli:
• NPM
• Método de filtração em membrana: utilizar equipamento de filtração que possibilite a
transferência da membrana para os meios de cultura. Utilizar membrana estéril com 47 mm
de diâmetro e porosidade de 0,45 µm, lavando-se a membrana, após a filtração da amostra,
com três porções de 20 mL a 30 mL de água purificada estéril. O volume a ser filtrado
poderá variar de acordo com a amostra obedecendo a um volume máximo que forneça de
20 UFC a 200 UFC por membrana. Para pesquisa de coliformes, a membrana deve ser
incubada em meio específico (por exemplo, MacConkey, endo Farmacopeia Brasileira, 6ª
edição 456 C, eosina azul de metileno, etc), às temperaturas preconizadas para as
pesquisas de coliformes totais e fecais por 24 horas.
Fonte: FB 6ª edição, pg.454
Pesquisa de Coliformes Totais e E. coli:
• Método cromogênico: O teste baseia-se na adição de 100 mL de amostra aos substratos e
incubação de 35 ºC a 37 ºC por 24 horas. A atividade dos coliformes totais sobre o substrato
ONPG produz uma coloração amarela, indicando a sua presença. A presença da E. coli
pode ser confirmada por fluorescência sob a luz UV, devido sua atuação sobre o substrato
MUG.
Fonte: FB 6ª edição, pg.454
Pesquisa de Pseudomonas aeruginosa:
A pesquisa de Pseudomonas aeruginosa na água para uso farmacêutico pode ser realizada pelo
método de filtração por membrana. Para todos os tipos de água para uso farmacêutico, P.
aeruginosa deve estar ausente.
PROCEDIMENTO Método de filtração por membrana: filtrar 200 mL da amostra através de
membrana de filtração estéril. Colocar cada membrana sobre a placa de ágar M-Pa-C de modo que
não fique espaço entre a membrana e a superfície do ágar. Inverter as placas e incubar a (41,5 ±
0,5) °C por 72 horas. Tipicamente, as colônias de P. aeruginosa possuem de 0,8 mm a 2,2 mm de
diâmetro e são aparentemente planas com borda clara e centro de acastanhado a verde escuro.
Contar as colônias típicas, de preferência a partir do filtro contendo de 20 a 80 colônias. Confirmar
a presença de P. aeruginosa por meio de testes bioquímicos adequados. Podem ser utilizados
outros métodos e meios de cultura, desde que devidamente validados
Limite de Alerta e Ação
❑ Limite de Alerta e Limite de Ação devem ser estabelecidos.
❑ Limite de Alerta não requer necessáriamente uma ação, serve para observar que algo
está saindo fora da tendência.
❑ Limite de Ação requer uma intervenção e ação de imediato para impedir que a
contaminação chegue na especificação.
Monitoramento Ambiental
❑ Áreas limpas
❑ Áreas não estéreis
Objetivo: Avaliar o perfil microbiológico da área, considerando
essencialmente a susceptibilidade de contaminação dos medicamentos nela
fabricados.
O QUE MONITORAR?
❑ Partículas viáveis
✓ Ar passivo
✓ Ar ativo
❑ Placa de Contato
✓ Superfície, chão, parede, bancada, cortina do fluxo.
❑ Swabs
✓ equipamentos.
❑ Luvas e Uniformes.
COMPARAÇÃO DOS DIFERENTES SISTEMAS DE CLASSIFICAÇÃO
FREQUÊNCIA DE AMOSTRAGEM
Fonte: USP 43 <1116>
• ANÁLISE DE RISCO
PARA DEFINIÇÃO
PERIODICIDADE E
FREQUENCIA.
ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO - ATIVO
ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO - PASSIVA
ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO - SEDIMENTAÇÃO
ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO SWAB
Fonte: USP 43 <1116>
ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO LUVAS
ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO UNIFORMES
4 32
1
1 – visor do óculos
2 – antebraço direito
3 – antebraço esquerdo
4 – Corpo – Nivel de bancada
ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO UNIFORMES
4 32
1
1 – visor do óculos
2 – antebraço direito
3 – antebraço esquerdo
4 – Corpo – Nivel de bancada
ANÁLISE DE RISCO – MONITORAMENTO AMBIENTAL
ANÁLISE DE RISCO – MONITORAMENTO AMBIENTAL
MAPA DE MONITORAMENTO AMBIENTAL
LIMITE MICROBIANO EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS
O limite microbiano de medicamentos e insumos pode se constituir em
ausência absoluta de formas viáveis (estéreis) ou presença em
grandezas definidas, restritas ou não a determinadas cepas
microbianas para produtos não estéreis.
LIMITE MICROBIANO EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS
FONTE DE CONTAMINAÇÕES
✓ Matérias primas de origem natural podem conter
cargas elevadas.
✓ Instalações inadequadas,
✓ Equipamento com limpeza inadequada;
✓ Processo não validado;
✓ Particularidades de pontos críticos e procedimentos
de limpeza ineficaz.
LIMITE MICROBIANO EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS
AMOSTRAGEM
• 03 amostras Início processo
• 04 amostras meio processo
• 03 amostras fim processo
LIMITE MICROBIANO EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS
PREPARO DA AMOSTRA
Alguns produtos necessitam de adição de inativantes
especícicos durante o preparo da amostra:
Exemplos:
• Amoxicilina – Penicinilase
• Hidróxido de Alumínio – 0.5% Tiossulfato de Sódio
• Agente espessantes ou que causam entumecencia
(plantago ovata) diluição do teste 3:97mL Caldo TAT
LIMITE MICROBIANO EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS
LIMITE MICROBIANO EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS
LIMITE MICROBIANO EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS
LIMITE MICROBIANO – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
LIMITE MICROBIANO – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
LIMITE MICROBIANO – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
ALMOÇO
PESQUISA DE PATÓGENOS
Através de meios seletivos/Provas Bioquímicas:
• Pseudomonas aeruginosa
• Staphylococcus aureus
• Escherichia coli
• Salmonella sp.
• Candida albicans
• Bactéria Gram-negativa bile-tolerante
• Clostridium
VALIDAÇÃO
PESQUISA DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA
PESQUISA DE S. AUREUS
PESQUISA DE SALMONELLA
PESQUISA DE E. COLI
PESQUISA DE CANDIDA
PESQUISA DE BG- TOLERANTES A BILE
COLORAÇÃO DE GRAM
• Montagem úmida com água, podendo ser usado
corante como azul de metileno
• Usar magnificação 400x, observar, e só depois
passar para 1000x (óleo de imersão)
• Medida real de tamanho
• Fungos: KOH (10%)
• Coloração de Gram, se for bactéria
• Cotton Blue (Azul de Algodão) se for fungo
• Outras colorações diferenciais, se necessário
COLORAÇÃO DE GRAM
Cristal
VioletaLugol Álcool 3X
Lavar Lavar Lavar
COLORAÇÃO DE GRAM – DIFERENÇAS DA PAREDE CELULAR
Gram Positivas Gram Negativas
IDENTIFICAÇÃO POR PROVA BIOQUÍMICA
Gram Positivas Gram Negativas
IDENTIFICAÇÃO POR PROVA BIOQUÍMICA
ATIVIDADE DE ÁGUA
Enquanto o teor de umidade simplesmente define a quantidade de água nos insumos e produtos, a
atividade de água, em termos práticos, é a água do insumo ou produto que vai reagir com microrganismos
(e também participar de outras reações, como as enzimáticas). Quanto mais elevada for a atividade da
água, mais rápido os microrganismos (como bactérias, leveduras e bolores) serão capazes de crescer;
logo a importância da Aw está na sua relação com a conservação do insumo e produto.
Primeiramente, preciso citar as três formas de apresentação da água nos alimentos propostas por Labuza
(1970): Água livre (disponível ou não ligada); Água adsorvida (hidratada); Água ligada.
ATIVIDADE DE ÁGUA
O crescimento e a atividade metabólica dos microrganismos precisam de água em forma disponível.
A medida mais comumente empregada para expressar a estabilidade de um produto é a
determinação do nível de água em sua forma livre, que em alimentos, denomina-se Índice de
Atividade de Água, Aw.
Valores de atividade de água entre 0 e 0,20 indicam que a água está fortemente ligada, enquanto
valores de atividade de água na faixa de 0,70 a 1,00 indicam que a maioria da água encontra-se
livre, sendo esta passível de ser utilizada em reações químicas, enzimáticas e para o
desenvolvimento de microrganismos.
O comportamento microbiano frente à Aw quanto à disponibilidade de água livre é extremamente
variável, sendo as bactérias mais exigentes, em relação aos fungos e as leveduras.
Os alimentos de baixa atividade de água (< 0,60) são microbiologicamente estáveis.
TESTE DE ESTERILIDADE
✓ Aplicado a produtos estéreis.
TESTE DE ESTERILIDADE - AMOSTRAGEM
TESTE DE ESTERILIDADE - AMOSTRAGEM
Tamanho do lote / volume do frasco / número
de frasco.
Ex. lote > 500un / < 100ml / = 20un
MÉTODO DE ANÁLISE - ESTERILIDADE
❑Inoculação Direta
❑ Inoculação Indireta (filtração em membrana)
MÉTODO DE ANÁLISE - ESTERILIDADE
Meios de Cultura :
• Caldo Tioglicolato com rezarsurina,
• Caldo Casoy ( TSB)
• Fluído A, D ou K
PESQUISA MEIO TEMPERATURA
BACTÉRIAS CALDO TIOGLICOLATO 30 – 35
FUNGOS E LEVEDURAS CALDO CASEÍNA SOJA 20-25
14 DIAS DE
INCUBAÇÃO
SISTEMA ABERTO – INOCULAÇÃO DIRETA
Inocula-se a MP ou produto diretamente aos meios
de cultura.
5 a 7 dias realiza-se a transferencia de 100uL para
outros tubo contendo os meios utilizados.
PESQUISA MEIO TEMPERATURA
BACTÉRIAS CALDO TIOGLICOLATO 30 – 35
FUNGOS E LEVEDURAS CALDO CASEÍNA SOJA 20-25
14 DIAS DE
INCUBAÇÃO
SISTEMA ABERTO – FILTRAÇÃO POR MEMBRANA
Ex: 10 unidades de 10mL para realização do teste. Faça um pool e filtre metade
Fitrar com 3 porções de 100mL Fluido validado ( A, D ou K) .
Inocula no Meio TIO.
Repete a mesma operação para o TSB.
PESQUISA MEIO TEMPERATURA
BACTÉRIAS CALDO TIOGLICOLATO 30 – 35
FUNGOS E LEVEDURAS CALDO CASEÍNA SOJA 20-25
14 DIAS DE
INCUBAÇÃO
Membrana 0.45u estéril
SISTEMA FECHADO - STERITEST
Ex: 10 unidades de 10mL para realização do teste. Faça um pool e filtre
metade
Fitrar com 3 porções de 100mL Fluido validado ( A, D ou K) .
Inocula no Meio TIO.
Repete a mesma operação para o TSB.
PESQUISA MEIO TEMPERATURA
BACTÉRIAS CALDO TIOGLICOLATO 30 – 35
FUNGOS E LEVEDURAS CALDO CASEÍNA SOJA 20-25
14 DIAS DE
INCUBAÇÃO
Canister
TESTE INICIAL
Não há
crescimento
Gram e
ID
Mocs ≠ dos
MA das áreas
Falhas no
M.A das
áreas
Mocs = ao
MA da áreas
de fabricação
Reteste
AprovadoReprovado
Há
crescimento
Gram e
ID
TESTE DE ENDOTOXINA
✓ Métodos disponíveis IN VITRO
• Ponto Final de Gelificação
• Ensaio Colorimétrico
• Ensaio Turbidimétrico
✓ Métodos disponíveis IN VIVO
• Coelhos
FONTES DE PIROGÊNIO
Bactérias Gram-positivas
Fungos
Vírus
Fármacos
Bactérias Gram-negativas - LPS
MORFOLOGIA MICROBIANA
PIROGÊNIO
Pirogênio exógeno atua no centro termorregulador do hipotálamo
Leucócitos fagocitários liberam pirogênio endógeno
Aumento da temperatura corpórea (febre) Choque pirogênico
(morte)
PONTO FINAL DE GELEIFICAÇÃO (GEL CLOT)
Ponto Final de Gelificação
Mais simples e mais usado, baseia-se na formação de gel em presença de
endotoxina.
Volumes de 0,1mL de Lisado e 0,1mL da diluição da amostra são transferidos para o tubo teste, e
incubado a 37C ± 1,0C durante 60 minutos.
PONTO FINAL DE GELEIFICAÇÃO – MECANISMO DE AÇÃO
Proenzima Enzima
ativada
Coagulogênio Coagulina
Formação
de Gel
Endotoxina
PONTO FINAL DE GELEIFICAÇÃO
Teste de Sensibilidade do LAL
Realizar a cada lote novo.
Realizar em quadruplicata.
Cinco concentrações
Lambda (٨ concentração do LAL) variar 2 ٨ a ¼ ٨.
Ex. ٨ = 0,125EU/mL
0,50 0,25 0,125 0,06 0,03
A sensibilidade do LAL deve estar na metade ou 2
vezes lambda.
PONTO FINAL DE GELEIFICAÇÃO – CONDIÇÃO DO TESTE
Amostra
Amostra +
Endotoxina
Endotoxina
Diluente
(Água)
Banho
Maria
37ºC
60min
+ Presença
de Gel
-Ausência
de Gel
MÁXIMA DILUIÇÃO VÁLIDA
MDV = Limite X Concentração
Sensibilidade LAL
Exemplo:
Limite = 0,5 EU/mg
Concentração = 2,0 mg/mL
Sensibilidade = 0,125 EU/mL
MDV = 0,5 X 2,0 = 8X
0,125
REALIZAÇÃO DO TESTE
Quantidade de Réplicas Soluções
Controle Negativo
(Água)
2
Controle Positivo
(Água + Endotoxina 2 lambda)
2
Água + Amostra 2
Água + Amostra + Endotoxna 2
Lambda.
2
REALIZAÇÃO DO TESTE – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Soluções Réplica 1 Réplica 2
Controle Negativo
(Água)
_ _
Controle Positivo
(Água + Endotoxina 2
lambda)
+ +
Água + Amostra _ _
Água + Amostra +
Endotoxna 2 Lambda.
+ +
Resultado: Negativo
REALIZAÇÃO DO TESTE – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Soluções Réplica 1 Réplica 2
Controle Negativo
(Água)
_ _
Controle Positivo
(Água + Endotoxina 2
lambda)
+ +
Água + Amostra + +
Água + Amostra +
Endotoxna 2 Lambda.
+ +
Resultado: Positivo
REALIZAÇÃO DO TESTE – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Soluções Réplica 1 Réplica 2
Controle Negativo
(Água)
Falha Falha
Controle Positivo
(Água + Endotoxina 2
lambda)
Falha Falha
Água + Amostra + +
Água + Amostra +
Endotoxna 2 Lambda.
+ +
Resultados Inválidos
Reteste
REALIZAÇÃO DO TESTE – FATORES DE INFLUÊNCIA
❑ pH 6,0 e 8,0 (regentes tamponados)
❑ Temperatura37 ± 1ºC
❑ Tempo 60 ± 2ºC 2 minutos
❑ Substâncias interferentesCálcio, Magnésio, β-glucanos
REALIZAÇÃO DO TESTE – FATORES DE INTERFERÊNCIAS
❑ Inibição Falso negativo
✓ Diluição
✓ Ajuste de pH
✓ Aquecimento
❑ Exacerbação Falso positivo
✓ Diluição
✓ Eliminar Ca++ / Mg++
✓ Aquecimento
VALIDAÇÃO DO TESTE
❑ Confirmação da sensibilidade do LAL
❑ Qualificação do analista
❑ Confirmação da Não-Interferência do Produto
ENSAIO COLORIMÉTRICO
Teste quantitativo de endotoxina, semelhante ao método turbidimétrico, é baseado na
observação de que concentrações crescentes de endotoxina irão
precipitar proporcionalmente a proteína do reagente L.A.L, formando o coagulogênio, que
será quantificado pelo método colorimétrico.
Alíquotas iguais da amostra e do lisado são misturados e incubados por 1 hora e então
centrifugados 1375 x g por 10 minutos. O sobrenadante é então removido do precipitado
por aspiração a vácuo.
Utiliza-se um espectrofotómetro com leitura a 660nm, para quantificar os resultados frente
a uma curva padrão.
ENSAIO COLORIMÉTRICO
ENSAIO COLORIMÉTRICO
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
CV = < 25%
CV entre as amostras = <25%
SPIKE de recuperação = Entre 50% A 200%
Tempo de reação.
ENSAIO TURBIDIMÉTRICO
Superior a técnica colorimétrica, o mesmo se baseia na medição da turbidez da amostra.
ENSAIO TURBIDIMÉTRICO – MECANISMO DA REAÇÃO
ENSAIO TURBIDIMÉTRICO – PREPARO
Preparar curva padrão de endotoxina
Preparar amostras (diluição adequada)
Incubar em leitora/incubadora de microplaca (ELISA) a 37 ºC com 100 leituras em
intervalos de 60 segundos
Determinar tempo de reação para atingir variação de 30 mOD a 340 nm Turbidez Tempo
(min) TURBIDIMÉTRICO KINECT
ENSAIO TURBIDIMÉTRICO
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
CV Amostra = <20%
CV Controle Positivo = <10%
Coeficiente de correlação = >0,98
% Recuperação Spike = 50 a 200%
TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO
O teste´´ in vivo´´ envolve medir o aumento de temperatura retal de coelhos após a injeção
intravenosa do produto em teste.
É usado para produtostolerados por essas cobaias em doses inferiores a 10ml/kg por
período máximo de 10 minutos.
O procedimento descrito na Farmacopéia Brasileira recomenda o uso de coelhos de ambos
os sexos , adultos e sadios.
Os animais devem ser mantidos em gaiolas individuais em sala de temperatura climatizada
(20±2C) e livre de pertubações que os possam excitar.
Obtido resultado negativo no teste de pirogênio, pode-se usar o mesmo animal após 48h.
Quando o teste for positivo, não se usam os mesmos animais por duas semanas.
TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO
✓ Elevação de temperatura de coelhos após administração intravenosa
da solução teste, provocada pela presença de pirogênio
✓ Limitações: Alta variabilidade, falso positivo, fármacos antipiréticos,
tóxicos e outros
✓ Efeito bifásico de febre:
✓ Pirogênio exôgeno: 1 hora
✓ Pirogênio endôgeno: 3 horas
TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO
❑ Pré-teste: verificar temperatura dos coelhos (variação < 1ºC)
❑ Administração intravenosa da amostra pré aquecida a 37±2ºC
❑ Registrar temperatura a cada 30 minutos por 3 horas
TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO - INTERPRETAÇÃO
❑ 1º etapa:
3 coelhos
Nenhum de temperatura ≥ 0,5ºC.
❑ 2ª etapa:
5 coelhos (8 total)
Não mais que 3 temperatura ≥ 0,5ºC
Soma temperatura ≤ 3,3ºC
COMPARATIVOS
Método Vantagens Desvantagens
Gel-Clot • Faciliade de
execução
• Não necessita
equipamento
• Baixo custo (em
relação aos
métodos
turbimétrico e
cromogênico)
• Ensaio semi-
quantitavo
• Baixa sensibilidade
(em relação aos
métodos
turbidimétrico e
cromogênico)
COMPARATIVOS
Método Vantagens Desvantagens
Colorimétrico • Ensaio quantitative
• Alta sensibilidade
(em relação ao
método gel clot)
• Interferência em
amostra colorids
• Alto custo de
reagentes
comparado ao
método gel clot
COMPARATIVOS
Método Vantagens Desvantagens
Turbidimétrico • Ensaio quantitative
• Alta sensibilidade
(em relação ao
método gel clot)
• Interferência em
amostra colorids
• Alto custo de
reagentes
comparado ao
método gel clot
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
É a quantificação da substância ativa frente a um padrão biológico de referência.
O ensaio microbiológico para determinação da potência dos antibióticos é indicado para
substâncias ou preparações , em que o seu teor não pode ser definido por métodos físico-
químicos.
“A atividade (potência) dos antibióticos pode ser demonstrada sob condições específicas
através de seu efeito sobre o crescimento de microrganismo-padrão sensível.”
Ensaios: Turbidimétricos e Difusão em Ágar
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Dois fenômenos ocorrem simultaneamente:
1. Difusão do antibiótico
2. Crescimento microbiano Resultando na zona de inibição de crescimento
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – DOSE RESPOSTA
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – ESQUEMA DO TESTE
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
FATORES DE INFLUÊNCIA: QUANTIDADE DO INÓCULO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
FATORES DE INFLUÊNCIA: COMPOSIÇÃO E PH
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
FATORES DE INFLUÊNCIA: MICROORGANISMO E INÓCULO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
FATORES DE INFLUÊNCIA: MEIO DE CULTURA,
MICROORGANISMO E INÓCULO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
FATORES DE INFLUÊNCIA: ESPESSURA DO ÁGAR
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
FATORES DE INFLUÊNCIA: DISPOSITIVO DAS APLICAÇÕES DAS SOLUÇÕES
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
FATORES DE INFLUÊNCIA: TEMPO E TEMPERATURA
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 2X2
Simétrico ou balançeado
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 2X2
Simétrico ou balançeado
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 2X2
Simétrico ou balançeado
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 2X2
Simétrico ou balançeado
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 3X3
Simétrico ou balançeado
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 3X3
Simétrico ou balançeado
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 3X3
Simétrico ou balançeado
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 5X1
Na USP utiliza o delineamento 5X1, em que as concentrações do padrão devem
aumentar em progressão geométrica e a mediana servir como de
referência(interpolação em curva padrão).
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 5X1
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 5X1
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 5X1
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 5X1
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO 5X1
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
TURBIDIMÉTRICO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
COMPARATIVO DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
Objetivo Assegurar, a eficácia de conservantes antimicrobianos
adicionados aos produtos farmacêuticos.
Conservantes antimicrobianos são substâncias adicionadas em
formas farmacêuticas não estéreis com a finalidade de protegê-las de
quaisquer crescimentos microbianos.
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
Para as formas farmacêuticas estéreis, acondicionadas em
embalagens de doses múltiplas, os conservantes antimicrobianos são
adicionados para inibir o crescimento de microrganismos
contaminantes durante o uso repetido das doses individuais.
A quantidade de conservante utilizada em uma formulação deverá ser
a mínima necessária para a proteção do produto sem prejudicar o
paciente ou consumidor.
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
Conservante deve ter largo espectro de atividade, em larga faixa de
pH ,durante a meia vida do produto,ser efetiva sobre cepas
específicas ATCC, ser compatível com componentes da fórmula,sem
interferir com a cor,sabor ou fragrância do produto ou da embalagem
primária,ser atóxico e não irritante e ser de custo aceitável.
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
Pequenas Quantidades de Conservante = crescimento
Alterações produtos ( propriedades organolépticas,viscosidade)
tornando-o inadequado ao uso;
Grandes Quantidade de Conservante =
efeitos tóxicos, como irritação de pele,levando
custo do produto que geralmente é repassado ao consumidor.
Insatisfação do Consumidor
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
A eficácia antimicrobiana, seja ela inerente ao produto ou devida à
adição de conservantes , precisa ser demonstrada para produtos
tópicos múltipla-dose; produtos orais; oftálmicos; otológicos; nasais;
fluidos de diálise; irrigação, etc.
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
Utilização de cepas padrão em concentrações conhecidas(105 e
à 106 UFC/g ou ml.
Teste realizado com bactérias , fungos e leveduras.
Testes são realizados 0h ,7dias, 14dias, 21dias e 28dias.
Microrganismos utilizados
• Candida albicans ATCC 10231
• Aspergillus niger ATCC 16404
• Escherichia coli ATCC 8739
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
• Staphylococcus aureus ATCC 6538
• In house
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
Critérios de Aceitação
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
Critérios de Aceitação
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
Critérios de Aceitação
EFICÁCIA DE CONSERVANTES
Critérios de Aceitação
DESINFETANTES, SANITIZANTES E ESPORICIDAS
Sanitizantes, desinfectantes e esporicidas são agentes químicos que reduzem,
eliminam ou destroem microorganismos.
Ambientes de alta carga microbiana incluem hospitais, processadores de alimentos,
laboratórios clínicos, instituições, consumidor, entre outros.
Testes para utilização desses mesmos agentes químicos em operações de fábrica
com BPF também são requeridos antes de sua utilização.
DESINFETANTES, SANITIZANTES E ESPORICIDAS
✓ Álcool
✓ Composto contendo bromo/Iodo
✓ Aldeídos
✓ Compostos de Quaternário de Amônio
✓ Fenólico
✓ Peróxido de Hidrogênio
✓ Cloro e Hipoclorito
Composição
DESINFETANTES, SANITIZANTES E ESPORICIDAS
✓ Ácido Peracético / Peróxido de Hidrogênio
✓ Β-Propiolactona
✓ Òxido de Etileno
✓ Ozônio
✓ Dioxido de Cloro
Composição
CLASSIFICAÇÃO DOS SANITIZANTES
Fonte: <1072> USP43-NF38 - 7608
ASPECTO REGULATÓRIO
IN 35/2019 – Boas Práticas de Fabricação Complementares a Medicamentos
Estéreis.
ASPECTO REGULATORIO
Annex 1 do PIC/S
4.37 The disinfection process should be validate. Validation studies should demonstrate
the suitability and effectiveness of disinfectants in the specific manner in wich they are
used and should support the in-use expiry periods of prepared solutions.
O processo de desinfecção deve ser validado Os estudos de validação devem
demonstrar a adequação e eficácia dos desinfetantes na forma específica em que são
usados e devem apoiar os prazos de validade em uso das soluções preparadas.
FARMACOPÉIAS E GUIAS
✓ <1072> Disinfectants And Antiseptics
✓ Relatório Técnico nº70 – PDA Fudamentos de Limpeza e Programa de Desinfecção
para instalações produtivas assépticas.
MÉTODOS
✓ Relatório Técnico nº70 – PDA Fudamentos de Limpeza e Programa de Desinfecção
para instalações produtivas assépticas.
✓ AOAC Internacional
✓ ASTM (American Society for Testing and Materials.
TESTE DE EFICÁCIA DE SANITIZANTES
TESTE DE EFICÁCIA DE SANITIZANTES
SELEÇÃO DOS AGENTES DESINFETANTES
Escolha do sanitizante
Composto por vários processos: Validação do sistema desinfetante, Validação do
Procedimento de Limpeza in vitro, Validação do Procedimento de Limpeza in situ.
• Biocarga – Qual a biocarga média (histórico), sabendo a classificação da área eu sei
qual o microorganismo eu pretendo encontra.
• Quais são o microorganismos indesejáveis
• Superfície Verificar a compatibilidade entre o desinfetante e o material que compõe a
superfície que ele vai ser aplicado.
SELEÇÃO DOS AGENTES DESINFETANTES
Escolha do sanitizante
✓ Tempo de Contato (tempo de contato é compatível com o processo de produção?)
decisão multidisciplinar.
✓ Presença de Matéria Orgânica (avaliar se o resíduo ataca a eficácia do meu
desinfetante)
✓ Preparo (pronto para uso? Preparado in loco? Quais materiais serão utilizados?
Frascos âmbar?
✓ Aspecto regulatório – Regulamentado pela Anvisa?
✓ Segurança – Quais são o riscos envolvidos
✓ Vida útil – Qual o tempo de vida útil após o preparo?
✓ Residuos – Resíduos é compatível ao processo? Métodos de Remoção?
Compatibilidade do Blend? Agua?
SELEÇÃO DOS AGENTES DESINFETANTES
Escolha do sanitizante
✓ Método de Aplicação (MOP? Borrifar?)
✓ . Água
FATORES QUE INTERFEREM
✓ Temperatura
✓ pH
✓ Concentração
✓ Tempo de Contato
✓ Superfície
✓ Qualidade da água (dureza)
✓ Presença de matéria orgânica
TESTE DE EFICÁCIA DE SANITIZANTES
Um nível mais elevado de inóculo deve ser utilizado e não deve
exceder 105.
. Cepas 06 a 10 microorganismos incluindo os microorganismos in
house.
TESTE DE EFICÁCIA DE SANITIZANTES
Fonte: <1072> USP43-NF38 - 7608
TESTE DE EFICÁCIA DE SANITIZANTES
O que avaliar?
Tempo de contato (Time Kill)
Avaliação da Estabilidade
RD = log (N0) – log (NT)RD é a redução
NO é a contagem inicial obtida no controle do inóculo
em UFC/mL
NT é a contagem obtida no tempo de contato T com a
amostra em UFC/mL
PASSO A PASSO
1. Sobre uma placa de petri colocar a superfície teste e adicionar 100uL do microorganism na
concentração prevista no protocolo.
2. Espalhar e secar o inóculo.
3. Adicionar 5mL do desinfetante desafio sobre a superficie a ser testada (molde)
4. Com auxílio de um cronômetro deixar em contato de acordo com os tempos previstos no
protocolo.
5. Adicionar 20ml do caldo neutralizante sobre a superficie teste e agitar suavemente
6. Transferir a superfície teste para o conjunto de filtração, dispensar o neutralizante que
estava na placa e completer o caldo até 200mL.
7. Aguardar 1 minute, realizar a filtração e exaguar a placa com 3 porções de 200ml de
diluente de enxague.
8. Ao final da filtração, retirar o molde e colocar a membrana sobre o meio de cultura
específico para bactérias e bolores e incubar conforme métodos especifícios previsto no
protocolo.
FALHAS
1. Relação de desinfetante e microorganismo inadequado
2. Uso de métodos inadequados
3. Falta de planejamento
4. Tempo de contato insuficiente
5. Neutralização inadequada
6. Toxicidade do neutralizador
7. Baixa Viabilidade da suspensão do inóculo
8. Erros no prepare da suspensão de esporos fungicos e bacterianos
9. Superfícieis porosas
10. Moldes não passiveis de esterilização ao calor umido
11. Letalidade após secagem
12. Definição de metas de redução logarítimas altas
13. Placas incontáveis
14. Método de recuperação não validado
TESTE DE EFICÁCIA DE SANITIZANTES
Cálculo:
RD = log (N0) – log (NT)RD é a redução
NO é a contagem inicial obtida no controle do inóculo em UFC/mL
NT é a contagem obtida no tempo de contato T com a amostra
em UFC/mL
TESTE DE EFICÁCIA DE SANITIZANTES
Critérios de aceitação:
A taxa de recuperação deve ser suficiente para demonstrar o log de redução de
eficácia dos agentes saneantes, de não menos que 3 log de redução para
microorganismos na forma não esporulada e não menos que 2 logs para
microorganismos na forma esporulada.
✓ Testes de Controle ( Neutralizante, Diluente, Fertilidade e Esterilidade dos meios
de cultura) aprovados.
Alessandra Cristo,
alessandraapmoraes@hotmail.com,
(62) 99121-1361
OBRIGADO!
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