métodos de transformação genética

Métodos -diretos- causam danos -indiretos – não causam danos

Eletroporação de protoplastos:

É um método utilizado para introduzir macromoléculas em células vegetais.

Protoplastos são células vegetais desprovidas de paredes celulares e, teoricamente, podem ser isoladas de qualquer tecido vegetal.

Em condições bem estabelecidas de cultura de tecidos, os protoplastos reconstituem suas paredes, dividem-se, formam colônias, calos e regeneram plantas.

A eletroporação consiste na indução de poros reversíveis em membranas celulares, resultando em fluxo de íons e moléculas através da membrana deformada.

Por meio da eletroporação de protoplastos diferentes genes foram incorporados ao genoma de diversas plantas (transformação estável), conferindo-lhes novas características

PEG

Policátions,como o polietilenoglicol (PEG) pode ser usado com agente químicos que permitem a passagem passiva do DNA para dentro da célula vegetal.

No contato do protoplastos com os policátions, a permeabilidade da membrana é aumentada pela interação das cargas positivas dos policátions com as cargas negativas do Dna e da membrana,facilitando a penetração daquele.

Os policátions também protegem o DNA exógeno contra a ação das nucleases da célula vegetal.

A maior limitação do uso desta técnica consiste na obrigatoriedade do uso de protoplastos.

Bombeamento de partículas

A biobalística utiliza microprojéteis em alta velocidade para introduzir ácidos nucléicos e outras moléculas em células e tecidos in vivo

Introduzir o DNA na célula, rompendo a barreira da parede celular e da membrana plasmática, sem o uso de vetores biológicos;

Microprojéteis de ouro ou tungstênio, cobertos com moléculas de DNA, são acelerados a alta velocidade, o que possibilita sua penetração em células intactas;

Foram baseados na geração de micropartículas de uma onda de choque com energia sufíciente para deslocar uma membrana carreadora contendo as micropartículas cobertas com DNA;

Arroz, algodão, feijão, soja, milho, trigo,cevada, aveia .

Agrobacterium

Bactéria existente no solo, foi o primeiro vetor uti l izado na transformação genética de plantas.

No meio natural esta bactéria provoca a formação de tumores. Estes tumores mantêm a capacidade de crescerem mesmo depois de a bactéria ser el iminada, capacidade resultante da transferência à célula vegetal de um fragmento de DNA localizado numa molécula circular (plasmídio), independente do seu cromossoma

Penetração da bactéria no tecido vegetal através de uma lesão sofrida;

As bactérias são atraídas pelas moléculas-sinal;(compostos fenólicos, açúcares eaminoácidos);

As moléculas-sinal vão também ativar genes – plasmídeo Ti; Proteínas codificadas pelos genes vir vão promover a transferência -

plasmídio Ti da bactéria para a célula vegetal; Denominada T-DNA; Duas seqüências repetidas de 25 pb; No núcleo da célula, o T-DNA é integrado, de forma estável, no

genoma vegetal; No genoma vegetal, - oncogenes, são transcritos, codificando

enzimas - na via de biossíntese de hormônios vegetais (citocininas e auxinas);

células transformadas proliferam desordenada, levando à formação de um tumor, - galha-da-coroa.

A hibridização in situ é uma técnica baseada na detecção de pequenos segmentos de DNA ou RNA a par tir de "sondas" específ icas. 

As sondas são seqüências de nucleotídeos complementares desenvolvidas a partir de segmentos conhecidos do DNA ou RNA que se deseja identificar. 

Para permitir a visualização da reação entre as moléculas de DNA ou RNA em estudo e as sondas, estas podem ser associadas a moléculas radioativas, fluorescentes ou biotiniladas (esta última de forma semelhante à técnica de imuno-histoquímica).