hplc – cromatografia líquida de alta eficiência pronta

HPLC – CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

DQI - Química Analítica Instrumental II

LAVRAS 2013

Alexandre Alves de CastroMaisa Carla Ragozoni Pereira

Introdução

Nas indústrias químicas,

farmacêuticas, alimentícias,

refinarias, petroquímicas,

laboratórios de análises

clínicas, ambiental e forense;

Frequentemente é necessário

separar, isolar, purificar,

identificar e quantificar os

componentes de misturas

muitas vezes bastante

complexas.

Introdução

Definição de cromatografia:

Conjunto de técnicas de separação cujo

princípio depende da distribuição diferenciada

de um dos componentes de uma mistura entre

duas fases, uma considerada estacionária, e a

outra, móvel;

A natureza química e física dos componentes da

mistura definem o grau de afinidade entre as

duas fases, acontecendo o fenomeno de

migração diferencial.

Introdução

HPLC

Do ingles HPLC- High Performance Liquid

Chromatography. É também conhecida como:

Cromatografia Líquida de Alta Performance, de

Alta Pressão ou de Alto Desempenho;

É uma técnica ultra-microanalise podendo,

dependendo da substância e do detector

empregado, quantificar massas inferiores a 10-18

g.

Descrição Geral da HPLC

A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE);

Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna;

Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.

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Descrição Geral da HPLC

Descrição Geral da HPLC

Descrição Geral da HPLC

Descrição Geral da HPLC

Descrição Geral da HPLC

Descrição Geral da HPLC

Descrição Geral da HPLC

Descrição Geral da HPLC

Descrição Geral da HPLC

Descrição Geral da HPLC

Conceitos Fundamentais da HPLC

Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas frações com diferentes composições;

É obtida por meios físicos embora reações químicas possam ser envolvidas no processo;

Os métodos físico-químicos de separação são baseados na utilização de alguma propriedade física das substâncias a serem separadas.

Conceitos Fundamentais da HPLC

Importância da cromatografia: Velocidade; Poder de resolução; Manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9

– 10-15g); Simplicidade da técnica.

Objetivo: Separar individualmente os diversos constituintes de

uma mistura de substâncias seja para identificação, quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins.

Instrumentação em HPLC

Fase Móvel

A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba, injetor e coluna;

A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel;

A fase móvel deve ser degaseificada;

As técnicas de degaseificação são: refluxo com resistência de aquecimento; vácuo (trompa d’água); purga com hélio; uso de membrana semipermeável.

Fase Estácionária

Basicamente são dois tipo de FE: Pelicular:Consiste de leito de polímero ou vidro não-

poroso,esférico, com diâmetros típicos da ordem

de 30 a 40mm, recoberto com uma camada fina e

porosa de: Sílica; Alumina; Resina de poliestireno-divinil-benzeno; Resina catadora de íons.

Fase Estácionaria

Partícula Porosa: Consiste em micropartículas porosas com

diametros de 3 a 10 mm. As partículas são constítuidas dos mesmos materias do recobrimento pelicular;

Quanto MENOR for a partícula, MAIOR será a eficiência na separação.

Partículas menores reduzem a distancia de contato do soluto com as FE e FM, facilitando o equilíbrio, e consequentemente melhorando a eficiência da coluna.

Fase Estácionaria

De acordo com as fases móvel e estacionária pode-se classificar o processo basicamente como:

Cromatografia em fase normal: a fase estacionária utilizada é polar e a fase móvel é apolar, em relação a eluição, os solutos mais apolares são eluídos primeiramente, enquanto que os polares são retidos pela fase estácionaria e são eluídos depois;

Cromatografia em fase reversa (FR): a fase estacionária é apolar e a fase móvel polar, portanto os compostos polares são eluídos primeiro e os mais apolares eluídos posteriormente.

Bomba

Principais características da

bomba: Leva a fase móvel desde o

reservatório até a coluna; Deve operar a pressões de até

500 atm com a mesma precisão e exatidão de operações a pressão quase ambiente;

Devem ser constituídas de material inerte;

Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes comuns;

As vazões normalmente empregadas vão de 0,005 até no máximo 4 ou 5ml/min.

Bombeamento por Gradiente

Alteração da composição da fase móvel, sem alteração da vazão total;

O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou a alta pressão;

Bombeamento por gradiente baixa pressão:

Bombeamento por Gradiente

Bombeamento por gradiente alta pressão:

Injetor

Uso de válvulas especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20µl;

A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta;

A injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de injeção.

Colunas Cromatográficas

Na HPLC podem ser usados três tipos de colunas:

Colunas Cromatográficas

Coluna de saturação: É colocada entre a bomba e o

injetor sendo usada para condicionar a fase estácionaria;

Empregada com finalidade de saturar a FM com o líquido da FE.

Colunas Cromatográficas

Coluna de guarda: É colocada entre o injetor e a

coluna analítica, esta possui de 2 a 5 cm;

É utilizada para prevenir impurezas e compostos fortemente retidos;

Satura rapidamente; Aumenta o tempo de vida útil

da coluna analítica; O custo das diversas trocas

dessas coluna ainda é menor do que uma nova coluna analítica.

Colunas Cromatográficas

Coluna de separação: Responsável pela separação dos componentes da

amostra. Podem ser separadas em colunas analíticas e colunas preparativas.

Colunas Cromatográficas

Coluna preparativa: Cromatografia de filtração em gel- separação,

isolamento e purificação de proteínas.

Coluna analítica: Permitem a separação de pequenas quantidades

do material a ser analisado; São constituí das de um tubo de algum material

inerte. O aço inoxidável é o material mais frequentemente utlizado;

Colunas Cromatográficas

Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente, geralmente sílica ou seus derivados;

Tem diâmetro interno uniforme, capaz de resistir às pressões em que será usada;

São normalmente retas, pois apresentam perda na eficiência quando são dobradas.

A coluna deve ser guardada em solvente orgânico ou FM.

Detector

Dispositivos que examinam continuamente o material elúido, gerando sinal quando da passagem de substâncias;

Um detector ideal deve possuir as seguintes características:

Alta sensibilidade; Estabilidade; Reprodutibilidade; Resposta linear; Resposta rápida aos analíticos; Não contribuir para o alargamento do pico; Confiabilidade

Detector

Falicidade do manuseio; Não destrutivo; Seletividade.

Tipos de detectores:

Os principais detectores utilizados em HPLC são: Índice de refração; Espectrofotometira UV-Visível; Fluorescência; Eletroquímico; Espectrometria de massa LC/MS.

Aquisição de dados

Atualmente utilizam-se softwares que permitem: Processar os dados de cromatograma;

Armazenar e registrar;

Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba,amostrador automático, temperatura da coluna;

Realizar cálculos para “System Suitability Test” (SST).

Vantagens e Desvantagens

Vantagens: Não necessita que a amostra seja volátil

( requisito da CG); Tempo reduzido da análise; Alta resolução; Boa detectabilidade e bons resultados quali e

quantitativos.

Desvantagens: Alto custo do equipamento e manutenção; Não existe um detector universal com boa

detectabilidade e baixo custo: Índice de refração: baixa detectabilidade(10 -6 g), pouco

estável.

Espectrômetro de massas: ~ US$ 150.000

Aplicabilidade

Aplicabilidade

Aplicabilidade

Dicas do que não fazer em HPLC Lavar um sistema com tampão usando orgânico

puro: precitiação; Injetar amostras que podem precipitar a fase

móvel: testar miscibilidade; Usar HCl, H2SO4 CCl3 em sistema de aço inox:

corrosão do sistema; Usar fita Teflon para vedar as conexões: sem

efeito e pode causa entupimento; Deixar o sistema parado com a fase móvel

contendo tampão ou acidos/bases fortes: cristalização= danificação dos selos da bomba, injetor, entupimento do detector.

Referências

HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis – George Lunn – Norman Schmulf – Wiley Interscience – 1997 (1632 pag.) – ISBN 0471181765.

HPLC Methods for Recently Approved Pharmaceuticals – George Lunn – Wiley 2005 (717 pag.) – ISBN 9780471669418.

HPLC for Pharmaceutical Scientists – Yuri Kazakevich – Rosario Lobrutto –Wiley Jan 2007(1104 pag.) – ISBN 9780471681625.

HPLC Made to Measure – Stravos Kromidas – Wiley – 2006 –ISBN 352731377X.

Validation Chromatographic Methods – A Practical Guide – David M. Bliesner Wiley 2006 – (304 pag.) – ISBN 9780471741473.

HPLC Practical and Industrial Applications – Joel Swadesh. Modern HPLC for practicing scientists – Michael W.Dong – Wiley Interscience –

2006. HPLC – A practical user’s guide – Marvin C. McMaster – John Wiley & Sons –

2007. Fundamentos da Cromatografia a líquido de alto desempenho – REMOLO

CIOLA-, ed. Edgard Blucher, 1998, 1ª Ed. The Reporter, Optimizing HPLC Separations

http://www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco_Home/Technical_Library/Literature.htl

Pharmaceutical Technology, ed. Brasileira, vol. 2, número 3, junho 1998, Validação de métodos cromatográficos, pág. 12.

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