hidrÓlisis del almidon exito
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7/27/2019 HIDRLISIS DEL ALMIDON EXITO
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METABOLISMO MICROBIANO
(Pruebas Bioqumicas)
INTRODUCCIN
Los estudios sobre las actividades bioqumicas de los microorganismos, en las
que se basan todas sus dems actividades, hubieron de esperar el nacimiento
de la bioqumica, en la ltima mitad del siglo XIX. No obstante, a partir de
entonces, el inters sobre las actividades bioqumicas de los microorganismos
ha crecido a un ritmo impresionante y hoy se reconoce a la bioqumica
microbiana como un sujeto de amplio estudio.Lo que el bioqumico a la larga se propone cuando estudia las actividades de
los microorganismos es la explicacin en trminos moleculares de los procesos
vitales de estos organismos. Paulatinamente se han acumulado datos sobre el
comportamiento bioqumico de los microorganismos. Los primeros
microbilogos no podan hacer otra cosa que estudiar estas poblaciones mixtas
de microorganismos. Despus de los trabajos de LORD JOSEPH LISTER Y
ROBERT KOCH, se hizo posible el estudio de los grmenes en cultivo puro,pero aunque esto simplific notablemente la tarea de observarlos y
clasificarlos, tambin tuvo como consecuencia el estudiarlos en condiciones
muy diferentes de las que reinan en los ambientes naturales.
Los primeros experimentos sobre las actividades bioqumicas de los
microorganismos estaban relacionados principalmente con la capacidad de los
grmenes en crecimiento, de cambiar la composicin qumica de su medio
ambiente realizando la separacin de algunos de los componentes y la
excrecin de otros. Desde la dcada pasad, los microbilogos se han
interesado cada vez ms por los aspectos fisiolgicos de la actividad
microbiana, se obtuvieron xitos espectaculares por los zimlogos al disear
los sistemas metablicos para la obtencin de fermentos tiles industrialmente;
en la actualidad con la manipulacin gentica se estn obteniendo productos
de origen animal y vegetal en grandes cantidades mediante fermentacin
bacteriana a escala industrial.
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OBJETIVOS
Mediante esta prctica el alumno lograra:
Relacionar la actividad metablica de los M.O con los sustratos, los
cambios producidos en los medios de cultivo y la aparicin de diferentes
metablicos en los mismos.
Interpretar adecuadamente pruebas especficas y relacionarlas con las
caractersticas metablicas de diversos M.O
Aplicar los conocimientos adquiridos para la caracterizacin de M.O
problemas
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HIDRLISIS DEL ALMIDN:
FUNDAMENTO:
La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio delmismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan
mediante hidrlisis a monosacridos. La mayora de los pasos de la
degradacin de almidn a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas
distintas, si bien hay otras ms que se necesitan para completar el proceso.
Las tres primeras enzimas son una -amilasa, -amilasa y almidn fosforilasa.
Al parecer solo la -amilasa puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo
que cuando participan la -amilasa y la almidn fosforilasa, es probable queacten sobre los primeros productos liberados por la -amilasa. La -amilasa
ataca de manera aleatoria enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y
amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y
liberando productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no
ramificadas, el ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un disacrido
que contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede
atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos de ramificacin de la
amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa cuando aun quedan
dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas -amilasas son
activadas por Ca+, lo cual es una de las razones por las que el calcio es un
elemento esencial.
OBJETIVO: Buscar La Presencia De La Enzima Am ilasa.
MATERIAL:
Lpiz graso
mechero
Asa y porta asa
Gradilla
Una caja petri con agar almidn
Cultivos puros de 24 horas de desarrollo.
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PREPARACIN DEL AGAR ALMIDON. AL 1%
Ingredientes por litro.
Extracto de carne...........................3 g Almidn Soluble, Difco.................10 g
Agar..............................................12 g
pH final: 7.5 0.2 a 25 C.
1. Suspender 25 g en 1 litro de agua
destilada o desmineralizada.
2. Calentar a ebullicin para disolver
completamente.
3. Esterilizar en autoclave por 15
minutos a 15 libras de presin (121 C).
4. Distribuir en la forma deseada.
METODOLOGIA DE SIEMBRA:
1. Con un lpiz graso o con un marcador, dividir la parte externa de la caja
en cuatro sectores.
2. Identificar los sectores 1 y 2 con el nombre de los microorganismos, el
sector 3 con el problema y el 4 con el control.
3. En condiciones de asepsia, tomar una
asada del cultivo e inocular el sector 1
sembrado por estra recta empezando por el
borde de la caja.
4. Repetir el procedimiento, inoculando los
sectores 2 y 3 con los microorganismos
adecuados.
5. El sector 4 se deja sin sembrar y se utiliza como control de esterilidad
del medio, as como testigo.
6. Invertir las cajas e incubar a 37 C durante 48 horas.
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7. Despus de la incubacin, cubrir la
superficie de la caja con la solucin de lugol.
8. Consultar la gua de observacin y
anotar los resultados obtenidos en la tabla
correspondiente.
RESULTADOS:
LECTURA
En la metodologa dice que Una prueba positiva se revela aadiendo solucin
de lugol, por la aparicin de zonas incoloras alrededor de las colonias; si la
prueba es negativa el medio se tie totalmente de azul-prpura.. Esto fueron
los resultados de las sepas a estudiar.
CEPAS RESULTADOS
5.- Staphylococcusaereus
NEGATIVO
6.-Enterobacteria sp NEGATIVO3.-Proteus sp NEGATIVO8.-problema NEGATIVO
NO FUE CONSUMIDO EL ALMIDN.
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HIDRLISIS DE LA CASENA
FUNDAMENTO:
El hidrolizado cido de casena es una base nutritiva obtenida mediante unahidrlisis no especfica con cido clorhdrico, la cual transcurre hasta convertir
la casena en componentes de una simplicidad qumica relativa. El cido
clorhdrico acta sobre las uniones peptdicas y degrada la protena y
polipptidos a cadenas cortas y aminocidos. Este hidrolizado se caracteriza
por presentar un elevado contenido de nitrgeno amnico y un bajo contenido
de aminocidos sulfurados.1-3
OBJETIVO: buscar la presencia de la enzima caseinasa.
MATERIAL:
Lpiz graso
mechero
Asa y porta asa
Gradilla Una caja petri con agar casena.
Cultivos puros de 24 horas de desarrollo.
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PREPARACIN DEL AGAR CASENA:
FRMULA (EN GRAMOS POR
LITRO)
INSTRUCCIONES
Agar nutritivo a doble
concentracin
Tomar 125ml de agar nutritivo a
doble concentracin y mezclarlos
con a125 ml de agua destilada por
13 minutos
Tomar 125ml de leche y mezclarla
con la solucin anterior por 10
minutos
Esterilizar preparado en la
autoclave.
Vaciar en los tubos
correspondientes
.
Leche descremada y
deslactosada
125ml
Agua destilada 125ml
TECNICA DE SIMBRA
METODOLOGIA DE SIEMBRA:
1. Repetir el procedimiento
adecuado en los incisos 1 al 6 del
ejercicio anterior.
2. Despus de la incubacin
consultar la gua de observacin y
registrar los resultados en la tabla
correspondiente.
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RESULTADOS
LECTURA
CEPAS RESULTADOS5.- Staphylococcusaereus
POSITIVO
6.-Enterobacteria sp NEGATIVO3.-Proteus sp NEGATIVO8.-problema POSITIVO
EN LAS CEPAS 5 Y 6 EL
RESLUTADO FUE POSITIVO, SI
SE ENCONTRO LA ENZIMA
CASEINASA
HIDRLISIS DE LA GELATINA
La gelatina es una protena que se mantiene en un estado de gel mientras la
temperatura sea menor de 25C, cuando la temperatura aumenta la gelatina
se inocula; es decir que pasa de estado liquido permaneciendo en este
mientras la temperatura se mantenga alrededor de los 25C.
La mayora de los polmeros son demasiados grandes para ser transportados
dentro de la clula. Las bacterias excretan enzimas extrace1u1ares que se
hidro1izan unos polmeros transportando al interior de la clula en monmeros
que les servir para crecer.
La produccin de proteasa es elevada por incorporacin de una protena
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(gelatina) en un medio slido en placa. La placa se inunda en un medio cido
que precipita la protena no hidroliza.
OBJETIVO: Buscar La Presencia De La Enzima Gelatinasa
MATERIAL:
Lpiz graso
Mechero
Asa y porta asa
Gradilla
4 tubos de ensayo de 5ml de gelatina.
Cultivos puros de enterobacterias aerogenes Staphilococcus aureus y
una cepa problema.
PREPARACIN DEL MEDIO GELATINA NUTRITIVA.
FRMULA (EN GRAMOS POR
LITRO)
INSTRUCCIONES
Extracto de carne 3 Rehidratar 128 g del medio en unlitro de agua destilada.
Reposar 10 a 15 minutos.
Calentar agitando frecuentemente
hasta el punto de ebullicin durante 1
minuto para disolverlo por completo.
Distribuir en tubos de ensayo.
Esterilizar en autoclave a 121C (15lbs de presin) durante 15 minutos.
Enfriar en posicin vertical.
Conservar en refrigeracin de 2 a
8C.
Gelatina 120
Peptona de Gelatina 5
pH final: 6 + 0.2
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TCNICA DE SIEMBRA
I. 1.- colocar los tubos con gelatina nutritiva en el hielo para mantenerlo
a una temperatura baja y evitar la licuefaccin del medio.
II. 2.- identificar cada
tubo con el nombre de cada uno
de los microorganismos, el 4 tubosirve para control.
III. 3.- en condiciones de
asepsia. Incubar cada uno de los
tres tubos con el microorganismo
correspondiente, sembrando por
picadura con el asa recta.
IV. 4.-Incubaratemperatura ambiente de 2 a 7 das.
V. 5.- despus de la
incubacin, colocar los tubos en hielo,
teniendo cuidado de no agitarlos;
esperar a que el contenido del tubo
control se solidifique. Sacar los otrostres tubos y observar los resultados.
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RESULTADO
Lectura:
Una prueba es positiva si se identifican las caractersticas del cono de
licuefaccin producido por las diferentes bacterias, y al comparar la hidrlisis,
algunas bacterias hacen que el medios solidifique y otras hacen que se
hidrolicen (presencia de gelatinaza).
CEPAS RESULTADOS
5.- Staphylococcus aereus NEGATIVO6.-Enterobacteria sp NEGATIVO3.-Proteus sp NEGATIVO
8.-problema NEGATIVO
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FERMENTACIN DE AZUCARES
FUNDAMENTO:
Se entiende por fermentacin a reacciones de mantenimiento que norequieren la participacin de una cadena de transporte de electrones, aunque
en ciertos casos stas pueden jugar papeles auxiliares. En el caso de
azcares se trata de procesos de xido-reduccin capaces de regenerar NAD
y que comnmente tienen como productos finales alcoholes (etanol,
isopropanol, n-butanol, etc.), cidos (actico, frmico, lctico, etc.)
acompaados o no por la formacin de gases.
Adems de su inters bioqumico, la capacidad para fermentar diferentes
azcares es una propiedad utilizada muy frecuentemente en taxonoma. En
nuestro caso utilizaremos un procedimiento clsico para ensayar la
capacidad de fermentacin de tres azcares: Glucosa, Sacarosa y Lactosa.
La produccin de cidos se observar por el viraje a amarillo del Prpura de
Bromocresol. La produccin de gas por su acumulacin en las Campanas
Durham, de donde habr desplazado parte del lquido inicialmente includo.
Ambas determinaciones se efectuarn a las 24 y 48 horas de incubacin
para as tener una idea de la rapidez de su produccin. Asmismo, se har
una cuantificacin en funcin de la extensin del viraje del indicador y de la
cantidad de gas producida.
OBJETIVO: Observacin De La Descarboxilacion De Los Azucares
MATERIAL
Lpiz graso
Mechero, asa y porta asa y gradilla
16 tubos de 13X100 con tubos Durham conteniendo caldo rojo de fenol
mas un carbohidrato (4 con lactosa, 4 con maltosa, 4 con glucosa y 4
con sacarosa).
Cultivos puros.
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PREPARACIN DE MEDIOS PARA LA PRUEBA DE CARBOHIDRATOS
CALDO ROJO DE FENOL
1. Prehidratar 15 g del medio de cultivo en un litro de agua destilada.2. Agregar carbohidratos si se desea.
CLCULOS
CALDO ROJO DE FENOL AZCAR
15 g-------------------1000ml 100%-----------------300g
X---------------------300ml 1%----------------------X
X=4.5 g x=3g
METODO
I. 1.- colocar los tubos con gelatina nutritiva en el hielo para mantenerlo a
una temperatura baja y evitar la licuefaccin del medio.
II. 2.- identificar cada tubo
con el nombre de cada uno de los
microorganismos, el 4 tubo sirve
para control.
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III. 3.- en condiciones de asepsia.
Incubar cada uno de los tres tubos
con el microorganismo
correspondiente, sembrando por
picadura con el asa recta.
IV. 4.-Incubara temperatura
ambi
ente
de 2
a 7 das.
V. 5.- despus de la incubacin, colocar
los tubos en hielo, teniendo cuidado de
no agitarlos; esperar a que el contenido
del tubo control se solidifique. Sacar los
otros tres tubos y observar los
resultados.
LACTOSA 1%
1. Pesar 4.5 g de caldo rojo de fenol
2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para
disolver el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al
matraz.
3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y
vaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campanadebe de llenarse de medio.
GLUCOSA 1%
1. Pesar 4.5 g de caldo rojo de fenol
2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para
disolver el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al
matraz.
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3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y
vaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana
debe de llenarse de medio.
SACAROSA 1%
1. Pesar 4.5 g de caldo rojo de fenol
2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para disolver
el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al matraz.
3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y vaciar
10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana debe de
llenarse de medio.
MANITOL 1%
1. Pesar 4.5 g de caldo rojo de fenol
2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para
disolver el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al
matraz.
3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida yvaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana
debe de llenarse de medio.
RESULTADOS
CEPAS:
5.- Staphylococcus aereus 6.-Enterobacteria sp 3.-Proteus sp 8.-problema
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La metodologa indica que la prueba positiva da un cambio de coloracin
De rojo amarillo.
Azucares Cepa 8 Cepa 3 Cepa 6 Cepa 5Glucosa Positivo negativo positivo Dudosa
Sacarosa Positiva negativa positiva Negativa
Manitol Positivo negativo positivo Negativo
Lactosa positivo negativo positivo Negativo
PRUEBA DE CATALASA
FUNDAMENTO:
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra
en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen
citocromo. El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido
de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser
ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la
produccin de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2).
OBJETIVO: buscar la presencia de la enzima catalasa.
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MATERIAL
1 caja de petri con agar nutritivo
Agua oxigenada al 3.0%
1 Mechero
Asa de siembra
Cultivos de 24 horas de los microorganismos indicados por el
profesor.
PREPARACIN DE LAS PLACAS DEL MEDIO AGAR NUTRITIVO
Peptona de Gelatina
5.0
Mtodo:
Extracto de Carne 3.0 Suspender 23 g del medio en un litro de
agua purificada. Calentar con agitacin
suave hasta su completa
Agar Bacteriolgico
15.0
Disolucin y hervir durante un minuto.
Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras
de presin) durante 15
pH 6.8 0.2 Minutos. Dejar enfriar a una temperatura
entre 45-50C y vaciar en placas de Petri
estriles.
METODOLOGA DE SIEMBRA:
1. Con un lpiz graso o con un
marcador, dividir la parte externa de la caja
en cuatro sectores2. Identificar los sectores 1 y 2 con el
nombre de los microorganismos, el sector 3
con el problema y el 4 es el control.
3. Sembrar con estra recta inoculado
un microorganismo en cada sector
4. Invertir las cajas he incubar a 37 C durante 24 horas
5. Agregar unas gotas de perxido de hidrogeno sobre el desarrollomicrobiano.
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6. Consultar la gua de observacin y tratar de interpretar la reaccin que
se produce
7. Registrar los datos en la tabla correspondiente.
RESULTADOS:
La metodologa es buscar la presencia de la enzima catalasa el perxido de
hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser
ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la
produccin de la enzima catalasa (h2o2 -> h2o + o2).
LECTURA
CEPAS RESULTADOS5.- Staphylococcusaereus
POSITIVO
6.-Enterobacteria sp POSITIVO3.-Proteus sp POSITIVO
8.-problema POSITIVO
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PRUEBA UREASA
FUNDAMENTO:
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dosmolculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad
enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre
todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o
positivo retardado.
Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio
se complementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser
degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima
ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar el color del
indicador de amarillo a rosa mexicano, ponindose as de manifiesto la
actividad ureasa.
Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el
tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio
poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en lasprimeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundiiy Klebsiella pneumoniae
tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin.
OBJETIVO: Determinacin de la enzima ureasa
MATERIAL:
4 tubos de 12 x 75 con 3 ml de agar urea Cultivos puros de 24 horas.
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PREPARACIN DE AGAR UREA.
Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad
uresica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como
Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.En el medio de cultivo, la
triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de
microorganismos.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el
indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima
ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el
medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, lafermentacin de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del
metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como
especies de Enterobacterias o Klebsiella.
FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) INSTRUCCIONES
Triptena 1.0 Suspender 24 g de polvo en 950
ml de agua destilada.
Dejar reposar 2 minutos.
Esterilizar en autoclave a 121C
durante 15 minutos.
Enfriar a 50C y agregar 50 ml
de una solucin de urea al 40%previamente esterilizada por
filtracin o cloroformo.
Fraccionar en tubos de hemlisis
y solidificar en pico de flauta con
fondo profundo.
Glucosa 1.0
Cloruro de sodio 5.0
Fosfato monopotsico 2.0
Rojo de fenol 0.012
Agar 15.0
pH final: 6.8 0.2
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UTILIZACIN DEL CITRATO
FUNDAMENTO:
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citratocomo nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente
de nitrgeno en su metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio.
Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes
gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobactery algunas especies de
Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhiy Salmonella
paratyphison incapaces de crecer con esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene
citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno
respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias
capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio y liberarn
iones amonio lo que, junto con la eliminacin del citrato (cido), generar una
fuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del
indicador de pH, de verde a azul.
OBJETIVO:Determinacin De La Util izacin De Citrato Com o nicaFuente De Carbono
MATERIAL:
Mechero, asa y porta asa
Gradilla
4 tubos de 16 x 150 conteniendo el medio citrato de Simmons
(inclinado).
Cultivos puros de 24 horas de desarrollo de los microorganismos
indicados en ejercicios anteriores.
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PREPARACIN DEL MEDIO CITRATO DE SIMMONS
Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la
capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa. En el
medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el
citrato de sodio es la nica fuente de carbono.
Ambos componentes son necesarios para el
desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato
forman un sistema buffer, el magnesio es
cofactor enzimtico.
El cloruro de sodio mantiene el balanceosmtico, y el azul de bromotimol es el indicador
de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El
medio de cultivo es diferencial en base a que los
microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono,
usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente
produccin de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras
de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El
desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato.
Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos
orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos
y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de
la produccin de citrato permeasa.
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FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) INSTRUCCIONES
Citrato de sodio 2.0 Suspender 24,2 g del medio
deshidratado por litro de agua
destilada.
Dejar reposar 5 minutos y
mezclar calentando a ebullicin
durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en
autoclave a 121C durante 15
minutos. Enfriar en posicin
inclinada.
Cloruro de sodio 5.0
Fosfato dipotsico 1.0
Fosfato monoamnico 1.0
Sulfato de magnesio 0.2
Azul de bromotimol 0.08
Agar 15.0
pH final: 6.9 0.2
METODOLOGA DE SIEMBRA:
1. Identificar los tubos con el
nombre de los microorganismos
a inocular.
2. Inocular por picadura y
estra el medio
3. Incubar a 35 C de 24 a
48 horas.
4. Despus de la incubacin,
observar si hubo desarrollo, consultar la gua de observacin y anotar
sus datos en la tabla correspondiente.
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RESULTADOS:
En la metodologa dice que una coloracin de color verde cambia a azul en elmedio nos indica una prueba positiva. Esto fueron los resultados
CEPAS RESULTADOS5.- Staphylococcusaereus
NEGATIVO
6.-Enterobacteria sp NEGATIVO3.-Proteus sp NEGATIVO8.-problema NEGATIVO
NEGATIVO
OBSERVACIN DE CIDO SULFRICO
FUNDAMENTO
La protelisis de la protena produce a.a. individuales; ciertas bacterias
heterotrficas pueden liberar enzimticamente el azufre de los diversos a.a.
azufrados, produciendo H2S gaseoso peptona, cistena, cistina, metionina y
tiosulfato son fuentes de azufre, pero las especies utilizan diferentes
compuestos o a.a. azufrados para producir H2S. Las enzimas responsables de
esta actividad son la cistena, desulfhidrasa y la tiosulfato reductasa.
OBJETIVO: identificacin de cistena, desulfhidrasa y la tiosulfato reductasa.
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7/27/2019 HIDRLISIS DEL ALMIDON EXITO
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MATERIAL:
4 tubos de 12 x 75 con agar hierro de Kligler.
Cultivos puros de 24 horas de desarrollo
PREPARACION DEL MEDIO KLIGLER:
Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa
de alimentos para la diferenciacin de enterobacterias, en
base a la fermentacin de glucosa y lactosa, y a la produccin
de cido sulfhdrico.
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la
triptena, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo
bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono
fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario
para la produccin de cido sulfhdrico, el citrato de hierro y
amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el cido
sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el
indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agar esel agente solidificante.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por
medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego
con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.
FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) INSTRUCCIONES
Peptona de carne 13.0 Suspender 54.8 g del polvo por
litro de agua destilada.
Mezclar bien y calentar con
agitacin frecuente, hervir 1 o 2
Cloruro de sodio 5.0
Lactosa 10.0
Tripteina 10.0
Glucosa 1.0
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Citrato de hierro y amonio 0.5 minutos hasta disolucin total.
Llenar hasta la tercera parte de
los tubos de ensayo.
Esterilizar a 121C por 15minutos. Enfriar en pico de flauta
profundo.
Tiosulfato de sodio 0.3
Rojo de fenol 0.025
Agar 15.0
pH final: 7.3 0.2
METODOLOGA DE SIEMBRA (PICADURA Y ESTRIA):
1. Identificar los tubos con la cepa
correspondiente
2. Inocular tres tubos, cada uno
con el microorganismo marcado
3. Incubar los tubos 35 C durante
24 horas
4. Despus de la incubacin, efectuar las observaciones correspondientes
y consultar la gua de observacin.
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RESULTADOS:
KLIGLER
Lecturas Cepa 5 Cepa 3 Cepa 6 Cepa 8
pH negativo negativo positivo Positivo
H2S Negativo positivo negativo Negativo
Lactosa positivo positivo positivo positivo
Glucosa positivo positivo positivo Positivo
Gas positivo negativo negativo positivo
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PRUEBA DEL INDOL:
FUNDAMENTO
La prueba del indol es una prueba bioqumica realizada en especiesbacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del
aminocido triptfano. Esta divisin molecular es lograda por una serie de
enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con
frecuencia triptofanasa.
Se genera el indol por una desaminacin reductiva del triptfano via la
molcula intermediaria cido indolpirvico. Las triptofanasas catalizan la
reaccin de desaminacin, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de
la molcula de triptfano. Los productos finales de la reaccin son el indol,
cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Como coenzima de la reaccin se
requiere al fosfato de piridoxal.
MATERIAL:
4 tubos por alumno de 12 x 75 con medio MIO o SIM.
Cultivo puros de 24 horas de desarrollo
PREPARACION DE MEDIOS MIO Y SIM:
MEDIO MIO:
El Medio MIO es utilizado para la diferenciacin de enterobacterias en
base a su movilidad, capacidad para descarboxilar la lisina y la produccin de
indol. Este medio tambin es conocido como Medio para Movilidad, Indol yOrnitina.
http://es.wikipedia.org/wiki/Bioqu%C3%ADmicahttp://es.wikipedia.org/wiki/Especiehttp://es.wikipedia.org/wiki/Bacteriahttp://es.wikipedia.org/wiki/Organismohttp://es.wikipedia.org/wiki/Indolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cidohttp://es.wikipedia.org/wiki/Tript%C3%B3fanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttp://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Desaminaci%C3%B3n&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Aminohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_pir%C3%BAvicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Amon%C3%ADacohttp://es.wikipedia.org/wiki/Energ%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/wiki/Coenzimahttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Fosfato_de_piridoxal&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Fosfato_de_piridoxal&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Coenzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/Energ%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/wiki/Amon%C3%ADacohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_pir%C3%BAvicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Aminohttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Desaminaci%C3%B3n&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttp://es.wikipedia.org/wiki/Tript%C3%B3fanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cidohttp://es.wikipedia.org/wiki/Indolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Organismohttp://es.wikipedia.org/wiki/Bacteriahttp://es.wikipedia.org/wiki/Especiehttp://es.wikipedia.org/wiki/Bioqu%C3%ADmica -
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Edered y Clark as como Oberhofer y Hajkowsky desarrollaron el Medio
MIO para poder observar las reacciones de movilidad, produccin de indol y
descarboxilacin de la lisina simultneamente. Estas reacciones son
determinantes para la identificacin de enterobacterias.
En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y
nitrgeno. El extracto de levadura provee las vitaminas y cofactores requeridos
para el desarrollo. La dextrosa proporciona la fuente de energa. El agar es
adicionado para demostrar la movilidad. El prpura de bromocresol acta como
indicador de cambios de pH facilitando la deteccin de la descarboxilacin de la
lisina.
PREPARACION DEL MEDIO MIO:
Suspender 31 g del medio en un litro de agua purificada.
Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y
hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y
esterilizar en autoclave a
121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar
enfriar en posicin vertical.
MEDIO SIM:
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de
indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo.
Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Peptona de Gelatina 10.0 L-Ornitina 5.0
Peptona de Casena 10.0 Dextrosa 1.0Extracto de Levadura 3.0 Prpura de
Bromocresol 2.0
Agar Bacteriolgico 2.0pH 6.5 0.2
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El triptfano es un aminocido
constituyente de muchas peptonas, y
particularmente de la triptena, que puede ser
oxidado por algunas bacterias para formar indol.
En el proceso interviene un conjunto de enzimas
llamadas triptofanasa. El indol producido se
combina con el aldehdo del reactivo de Kovacs
o de Erlich, para originar un compuesto de color
rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en
este medio, por la turbidez que producen
alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras
de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro
de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH
mayor a 7.2.
PREPARACION DEL MEDIO SIM
FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) INSTRUCCIONES
Triptena 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro
de agua destilada. Mezclar hasta
disolver; calentar agitando y hervir
durante un minuto.
Distribuir unos 4 ml en tubos de
hemlisis y esterilizar en autoclave
a 121C durante 15 minutos.
Solidificar en posicin vertical.
Peptona 6.1
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Agar 3.5
pH final: 7.3 0.2
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METODOLOGIA DE SIEMBRA (AMBOS MEDIOS POR PICADURA):
1. Identificar los tubos con la cepa correspondiente
2. Inocular tres tubos, cada uno con el microorganismo marcado
3. Incubar los tubos 35 C durante 24 horas.
4. Despus de incubacin, efectuar las observaciones correspondientes y
consultar gua de observacin.
RESULTADOS:
MEDIO SIM
LECTURA CEPA 5 CEPA 6 CEPA 3 CEPA 8
MOVILIDAD Negativo negativo positivo Negativo
INDOL negativo negativo negativo Negativo
H2S negativo negativo positivo negativo
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MEDIO MIO SE LE AGREGA REACTIVO DE ERLICH PARA PRUEBA DE
INDOL.
LECTURA CEPA 5VO CEPA 6 CEPA 3 CEPA 8
MOVILIDAD NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO
INDOL NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
ORNITINA NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO
PRUEBA LCD (MEDIO LIA):
FUNDAMENTO:
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente
Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la
produccin de cido sulfhdrico.
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura
aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el
hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado
para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y
deaminasa.
El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los
indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de
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bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a
5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza
el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de lalisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesaria que la glucosa sea
previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al
amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al
consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento delmedio debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,
desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de
hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
MATERIAL:
4 tubos con agar LIA
Cultivos puros de 24 horas de desarrollo.
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PREPARACIN DEL AGAR LIA
FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) INSTRUCCIONES
Peptona de gelatina 5.0 Suspender 35 g del medio
deshidratado en un litro de agua
destilada. Dejar embeber unos 15
minutos.
Calentar cuidadosamente,agitando con frecuencia y hervir
durante un minuto hasta la
disolucin completa.
Distribuir y esterilizar a 121C
durante 15 minutos. Enfriar en
pico de flauta dejando un fondo
vertical apto para la puncin.
Extracto de levadura 3.0
Glucosa 1.0
Lisina 10.0
Citrato de hierro y amonio 0.5
Tiosulfato de sodio 0.04
Prpura de bromocresol 0.02
Agar 15.0
pH final: 6.7 0.2
METODOLOGIA DE LA SIEMBRA
(PICADURA Y ESTRIA):
1. Identificar los tubos con la
cepa correspondiente.
2. Inocular tres tubos, cada uno
con el microorganismo marcado.
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3. Incubar los tubos a 35 C durante 24 horas.
4. Despus de la incubacin, efectuar las observaciones correspondientes
y consultar la gua de observacin.
RESULTADOS:
LECTURA CEPA 5 CEPA 6 CEPA 3 CEPA 8
LDA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
LDL DUDOSA NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
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PRUEBA ODC:
FUNDAMENTO:
El Medio MIO es utilizado para la diferenciacin de enterobacterias en
base a su movilidad, capacidad para descarboxilar la lisina y la produccin de
indol. Este medio tambin es conocido como Medio para Movilidad, Indol y
Ornitina.
MATERIAL:
4 tubos de 12 x 75 con medio MIO.
Cultivos puros de 24 horas de desarrollo
NOTA:La preparacin del medio MIO se vio previamente.
METODOLOGIA DE LA SIEMBRA (PICADURA):
1. Identificar los tubos con la
sepa correspondiente.
2. Inocular tres tubos, cada
uno con el microorganismo
marcado.
3. Incubar los tubos a 35 C
durante 24 horas.
4. Despus de la incubacin,
efectuar las observaciones correspondientes y consultar la gua de
observacin.
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RESULTADOS:
LECTURA CEPA 5VO CEPA 6 CEPA 3 CEPA 8
MOVILIDAD NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO
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CUADRO REFERENCIAL:
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