genética geral ii prof. dr. ricardo lehtonen r. de souza depto de genética – ufpr...
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Genética Geral II
Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza
Depto de Genética – UFPR
lehtonen@ufpr.br
www.ufpr.br/~lehtonen
PCRReação em Cadeia da Polimerase
Inventada em 1983 por Kary Mullis é uma das técnicas mais comuns utilizadas em
laboratórios de pesquisas médicas e biológicas
Aplicações: seqüenciamento de genes diagnóstico de doenças hereditárias testes de paternidade e na medicina forense diagnóstico de doenças infecciosas
PCR
Reação de PCR: DNA dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) iniciadores (também chamados de primers) DNA polimerase solução tampão
PCR
Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos
Desnaturação
Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura.
As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários minutos.
Hibridação
A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante alguns segundos.
Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde
Extensão
Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos.
A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores
PCR
animação
PCR – desenho dos iniciadores
Comprimento: em torno de 20 bases GC: ideal em torno de 50% Software para desenhar iniciadores: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-
blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
PCR – desenho dos iniciadores
PCR-RFLP
Enzima de restrição:– mutação cria sítio de restrição– mutação elimina sítio de restrição
Transforma uma diferença de nt, que não detectada em uma eletroforese, em uma diferença de tamanho
Fragmentos com tamanhos diferentes migram diferente na eletroforese
PCR-RFLP
PCR-RFLP
ALA 539 540 541 545 546 Seqüência normal....5'..GAA GCA GAA TGG.....GCA GG...3' Iniciador (3') GT CGT ACC.....CGT CC Produto da PCR 5'..GAA GCA GCA TGG..............3' Fnu4HI ou BsoFI ____________85 pb__________'________21 pb_________
PCR-RFLP
85pb 106pbUU UK KK
PCR-RFLP
Vantagem: rapidez
Desvantagem: algumas enzimas tem digestão parcial
PCR-SSCA (ou SSCP)Análise de Conformação de Fita Simples
Descrita originalmente por ORITA e cols. (1989). DNA é amplificado por PCR Depois é desnaturado por calor Gel de poliacrilamida não desnaturante As fitas simples adquirem conformações tridimensionais e
correm em posições diferentes no gel. Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação
e, conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento (IWAHANA e cols., 1992).
PCR-SSCA
Padronização da técnica vários fatores Relação bisacrilamida x acrilamida Concentração de acrilamida Tampão do gel pH Tempo de corrida Temperatura de polimerização Temperatura da corrida
PCR-SSCA
PCR-SSCA
Seqüenciamento didesoxi
Método de Sanger Síntese de DNA na presença de
nucleotídeos didesoxi, os quais não tem o grupo 3’-hidroxila.
Eles podem ser incorporados na cadeia, mas terminam a síntese
Seqüenciamento
animação
PCR em tempo real
É uma técnica para a detecção e medida de produtos gerados durante cada ciclo da PCR
A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumentará na proporção direta da quantidade de produto da PCR.
Em tempo real é possível saber a quantidade de produto em um ponto no qual a reação ainda está na fase exponencial
Por este motivo, essa técnica permite a quantificação, o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese.
PCR em tempo real
PCR em tempo real
SYBR Green é um fluoróforo em suspensão, intercalante de DNA
dupla fita, que emite uma fluorescência verde com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador.
Durante a PCR, as moléculas do SYBR Green vão se ligando ao DNA recém sintetizado
Um aumento da fluorescência é observado em tempo real, o que possibilita o monitoramento contínuo da reação
PCR em tempo real
SYBRSYBR GreenGreen
PCR em tempo real
Taqman
PCR em tempo real
PCR em tempo real
Aplicações Quantificação Detecção de carga viral Determinação do número de cópias de um
gene Análise da expressão gênica
PCR em tempo real
Exemplo de aplicação: Investigação de amplificação ou deleção dos
genes BCHE e ACHE em tecido mamário tumoral com relação ao tecido normal.
PCR em tempo real
Quantificação relativa
TumorCHE / Tumor18S
Q = ───────────────────────
SangueCHE / Sangue18S
PCR em tempo real
Sem Informação20,93%
Inalterado9,30%
Amplificado18,60%
Deletado51,16%
Gene BCHE
Genotipagem com Taqman
Homozigoto para o alelo marcado com FAM
Heterozigoto
Homozigoto para o alelo marcado com VIC
Genotipagem
FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs2863381
População1 Grupo n2 TT TC CC HW T CGuarani (GRC) Ameríndio 58 0,431 0,414 0,155 >0,250 0,6379 0,3621
Kaingang (KRC) Ameríndio 58 0,793 0,190 0,017 >0,500 0,8898 0,1102
Japão (JPT) Asiático 85 0,294 0,494 0,212 >0,950 0,5410 0,4590
China (HCB) Asiático 81 0,272 0,506 0,222 >0,750 0,5250 0,4750
Europa (CEU) Euro-americano 111 0,441 0,477 0,081 >0,250 0,6800 0,3200
Nigéria (YRI) Africano 112 0,955 0,045 0,000 >0,750 0,9780 0,0220
Características da Amostra Detalhes dos Genótipos Frequência Alélica
Fonte: Alves, 2009
FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs3495
População1 Grupo n2 GG GA AA HW G AGuarani (GRC) Ameríndio 57 0,000 0,035 0,965 >0,750 0,0175 0,9825
Kaingang (KRC) Ameríndio 58 0,000 0,069 0,931 >0,750 0,0345 0,9655
Europa (EUR) Euro-americano 24 0,042 0,375 0,583 1,000 0,2290 0,7710
China (CHN) Asio-americano 24 0,000 0,458 0,542 0,150 0,2290 0,7710
Afro-brasileiros (AFBII) Afro-brasileiro 218 0,170 0,427 0,404 >0,100 0,3830 0,6170
África (AFR) Afro-americano 22 0,364 0,591 0,045 0,150 0,6590 0,3410
Características da Amostra Detalhes dos Genótipos Frequência Alélica
Fonte: Alves, 2009
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