gastrulaÇÃo neurulaÇÃo dobramento do corpo … · um gene candidato a indutor endógeno deve...

GASTRULAÇÃO

NEURULAÇÃO

DOBRAMENTO DO

CORPO

FECHAMENTO DO TUBO

ENDODÉRMICO

EXPANSÃO DO ÂMNION

GASTRULAÇÃO

NEURULAÇÃO

DOBRAMENTO DO

CORPO

FECHAMENTO DO TUBO

ENDODÉRMICO

EXPANSÃO DO ÂMNION

GASTRULAÇÃO

NEURULAÇÃO

DOBRAMENTO DO

CORPO

FECHAMENTO DO TUBO

ENDODÉRMICO

EXPANSÃO DO ÂMNION

NEURULAÇÃO

DOBRAMENTO DO

CORPO

A formação do tubo neural se dá pela elevação das DOBRAS

NEURAIS e a perda da conexão do tubo com o ectoderma de

revestimento

A NEURULAÇÂO forma o tubo neural.

Glibert 8a Ed

Embrião de galinha

Embrião de Xenopus laevis

Embrião de Xenopus laevis

Embrião de camudongo

O fechamento do Tubo Neural ocorre de forma desigual ao

longo do eixo embrionário

Fenda Neural

Dobra Neural Ponto de

dobradiça Placa Neural

NORMAL Sem constrição apical

A constrição apical é essencial para o fechamento

do tubo neural

Embrião de Xenopus laevis

A EXTENSÃO CONVERGENTE está presente no

dobramento do MHP

Fengzhu Xiong, Megason Lab Harvard University

1. Indução da formação

da PLACA NEURAL

pelo Mesoderma (Mudança na forma celular,

expressão de marcadores

gênicos)

2. Associação da Placa

Neural com a

Notocorda subjacente;

constrição apical nas

células da borda da

Placa Neural

3. Dobramento da Placa

Neural

1. A convergência do

Tubo Neural é uma

combinação de

fatores: Pressão

lateral e constrição

nos pontos de

dobradiça e extensão

convergente

2. Fusão do Tubo Neural

na porção dorsal

concomitante com a

Migração da Crista

Neural

O QUE INDUZ A

FORMAÇÃO DO

SISTEMA NERVOSO?

Prêmio Nobel em 1935

Resultados:

1. Gerou dois eixos embrionários=

DUPLICAÇÃO AXIAL

2. O segundo embrião é composto

de células doadoras E

aceptoras.

Conclusão:

O Lábio dorsal do blastóporo

tem capacidade INDUTIVA

O ORGANIZADOR

Propriedades do

Organizador:

1. Inicia Gastrulação

2. Participa do

Mesoderma Dorsal

3. Induz formação de

tecido Nervoso a

partir do

Ectoderma

A origem das células do

blastóporo dorsal

(Organizador)

Ovo recém-fertilizado Gástrula

A fertilização em anfíbios é seguida pela ROTAÇÃO

CORTICAL, que forma o CRESCENTE CINZA

Crescente cinza

O Organizador da blástula deriva do crescente cinza

(estágio 1 blastômero)

Porque neste

experimento a

situação (A) gerou

dois embriões?

a) Porque dividiu o ovo

pela metade

b) Foi um resultado

aleatório

c) Porque dividiu o

crescente cinza.

d) Porque dividiu o

Organizador.

Spemann, 1938

Porque neste

experimento a

situação (A) gerou

dois embriões?

a) Porque dividiu o ovo

pela metade

b) Foi um resultado

aleatório

c) Porque dividiu o

crescente cinza.

d) Porque dividiu o

Organizador.

Spemann, 1938

Propriedades do

Organizador:

1. Inicia Gastrulação

2. Participa do

Mesoderma Dorsal

3. Induz formação de

tecido Nervoso a

partir do

Ectoderma

No experimento de Spemman, que tipo de

molécula deve ser a responsável pela

indução do novo eixo embrionário?

a)Fator de transcrição (proteína nuclear)

b)Receptor de membrana

c)Ligante de membrana

d)Proteína extracelular secretada

No experimento de Spemman, que tipo de

molécula deve ser a responsável pela

indução do novo eixo embrionário?

a)Fator de transcrição (proteína nuclear)

b)Receptor de membrana

c)Ligante de membrana

d)Proteína extracelular secretada

1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?

2. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?

Spemann, 1938

Pergunta: O ovo recém-

fertilizado tem sua

potencialidade distribuída

simetricamente?

1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?

Sem Crescente cinza não há região dorsal

ENTÃO, qual o elemento ativo no crescente cinza?

2. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?

Recém-

fertilizado

Rotação

cortical

Meso-

blástula

Gástrula

Transcrição

zigótica Crescente

Cinza

Organizador

1. Expressão na região dorsal

2. Capaz de causar duplicação axial

3. Ser de origem materna

Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a

seguintes propriedades:

Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a

seguintes propriedades:

1. Expressão na região dorsal

2. Capaz de causar duplicação axial

3. Capaz de compensar pelo efeito do UV

4. Ser de origem materna

•A TRANSCRIÇÃO no

embrião de Xenopus só

ocorre NA BLÁSTULA

•Os fatores indutivos do

Organizador estão

presentes ANTES da

blástula

Heasman, J. Development 124, 4179-4191 (1997)

Membros da Família Wnt

Obs.: Wnt=Wingless +int

Via de sinalização Wnt

controle Injetados com XDsh

O Dsh, assim como o Wnt, causa duplicação axial

Sokol et al.,Development 121:1637-1647 (1995)

1. Expressão na região dorsal

2. Capaz de causar duplicação axial

3. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a

seguintes propriedades:

Candidato: Wnt/Dsh

Dors

al

Ventr

al

O Dsh normalmente se encontra concentrado na

região dorsal de blástulas

Western Blot

para Dsh

1. Expressão na região dorsal

2. Capaz de causar duplicação axial

3. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a

seguintes propriedades:

Candidato: Wnt/Dsh

Dors

al

Ventr

al

O Dsh normalmente se encontra concentrado na

região dorsal de blástulas

Western Blot

para Dsh

Antes da

Transcrição

zigótica

1. Expressão na região dorsal

2. Capaz de causar duplicação axial

3. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a

seguintes propriedades:

Candidato: Wnt/Dsh

O embrião de Xenopus expressa beta-catenina desde cedo

ve

ntr

al

dors

al

1. Expressão na região dorsal

2. Capaz de causar duplicação axial

3. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve

ter a seguintes propriedades:

Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina)

Schohl and Fagotto Development 129, 37-52 (2002)

Localização da beta-catenina na blástula de Xenopus

ventral dorsal

1. Expressão na região dorsal

2. Capaz de causar duplicação axial

3. Ser de origem materna

Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve

ter a seguintes propriedades:

Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina)

VISUALIZAÇÃO DA ROTAÇÃO CORTICAL

Ponto de entrada do esperma

Development 1992 Mar;114(3):699-709.

Organization and regulation of cortical microtubules during the first

cell cycle of Xenopus eggs. Schroeder MM, Gard DL

O áster do esperma organiza a polimerização dos

microtúbulos que resultam na rotação cortical

Slide 37 da Profa Nathalie:

A rotação cortical desloca

elementos citoplasmáticos

especificamente para o

crescente cinza

1. Fertilização

2. Polimerização polarizada

dos microtúbulos pelo

aster espermático

3. Rotação cortical

4. Concentração de Dsh na

região vegetal-dorsal

5. Inibição de GSK-3 na

região vegetal-dorsal

6. Atividade da beta-

catenina na região

vegetal-dorsal

Região

Ventral

Região

Dorsal

1. O que é que há entre o crescente cinza e a região

dorsal?

Acúmulo de beta catenina nuclear.

2. O que é que há entre o crescente cinza e a

gastrulação?

No experimento acima, ocorreu uma duplicação na blástula aceptor a e

uma duplicação do início da gastrulação.

O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente

cinza de um embrião antes da primeira divisão celular?

a)Nada, porque o embrião se regenera.

b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo

Organizador

c)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao

Organizador

d)Ausência de gastrulação porque faltariam células.

Spemann, 1938

Pergunta: O ovo recém-

fertilizado tem sua

potencialidade distribuída

simetricamente? Este pedaço é só

endoderma!

Crescente cinza

A região DORSAL da blástula deriva do crescente cinza

(estágio 1 blastômero)

No experimento acima, ocorreu uma duplicação do na blástula

aceptoar e uma duplicação do início da gastrulação.

O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente

cinza de um embrião antes da primeira divisão celular?

a)Nada, porque o embrião se regenera.

b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo

Organizador

c)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao

Organizador

d)Ausência de gastrulação porque faltariam células.

1. O que é que há entre o crescente cinza e a região

dorsal?

Acúmulo de beta catenina nuclear.

2. O que é que há entre o crescente cinza e a

gastrulação?

Sem Crescente Cinza não há Organizador e não há

gastrulação.

1. Mas beta-catenina é uma

proteína nuclear, e o efeito do

Organizador depende de uma

proteína secretada…

Recém-

fertilizado

Rotação

cortical

Meso-

blástula

Gástrula

Crescente

Cinza

Organizador

Recém-

fertilizado

Rotação

cortical

Meso-

blástula

Gástrula

Crescente

Cinza

Organizador

?

Recém-

fertilizado

Rotação

cortical

Meso-

blástula

Gástrula

Dsh no pólo

vegetal

Dsh no

crescente

cinza

Transcrição

zigótica

Organizador

Neural

Recém-

fertilizado

Rotação

cortical

Meso-

blástula

Gástrula

Dsh no pólo

vegetal

Dsh no

crescente

cinza

Transcrição

zigótica

Organizador

2. Transcrição zigótica do

que?

COMO É FORMADO O

ORGANIZADOR?

Propriedades do

Organizador:

1. Inicia Gastrulação

2. Participa do

Mesoderma Dorsal

3. Induz formação de

tecido Nervoso a

partir do

Ectoderma

O Organizador de Spemann fica no MESODERMA DORSAL

Organizador de Spemann

Crescente cinza

Após a gastrulação, as células do Organizador irão formar a

notocorda

QUAL É A RELAÇÃO

ENTRE

O CRESCENTE CINZA,

BETA-CATENINA E

O MESODERMA

DORSAL???!!

Como é formado o MESODERMA?

Nieuwkoop, anos 70

O pólo vegetal SECRETA elementos que induzem o

mesoderma mesmo antes da transcrição zigótica.

?

Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o

Mesoderma

Um fator candidato a indutor

endógeno do MESODERMA deve ter

a seguintes propriedades:

1. Capaz de induzir MESODERMA

2. Expresso no pólo vegetal

3. Ser de origem materna

Um fator candidato a indutor endógeno do

MESODERMA deve ter a seguintes propriedades:

Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do pólo vegetal

que induzem o Mesoderma

Mas, VegT é uma proteína nuclear.....

VegT

Como é formado o MESODERMA DORSAL?

Dale and Slack, 1987

Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal

(amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal

(variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em

induzir genes dorsais no ectoderma (em azul)

a) Não há diferença entre

o poder de indução de

1 a 4 porque todos

induziram genes

dorsais

b) Os blastõmeros 1 e 4

têm um índice maior

porque estão nas

pontas

c) O blastômero 1 teve

um índice mais alto

porque é maior

d) O blastômero 1 teve

índice mais alto porque

tem o citoplasma do

crescente cinza

Dale and Slack, 1987

Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal

(amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal

(variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em

induzir genes dorsais no ectoderma (em azul)

a) Não há diferença entre

o poder de indução de

1 a 4 porque todos

induziram genes

dorsais

b) Os blastõmeros 1 e 4

têm um índice maior

porque estão nas

pontas

c) O blastômero 1 teve

um índice mais alto

porque é maior

d) O blastômero 1 teve

índice mais alto porque

tem o citoplasma do

crescente cinza

Dale and Slack, 1987

Blastômero dorsal do pólo vegetal é capaz de induzir

mesoderma DORSAL no ectoderma

NASCE O CENTRO DE NIEUWKOOP!

Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o

Mesoderma Dorsal/Organizador

Dale and Slack, 1987

Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal

produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente?

a) Fator de transcrição

(proteína nuclear)

b) Receptor de membrana

c) Ligante de membrana

d) Proteína extracelular

secretada

Dale and Slack, 1987

Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal

produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente?

a) Fator de transcrição

(proteína nuclear)

b) Receptor de membrana

c) Ligante de membrana

d) Proteína extracelular

secretada

Hipótese: Existem fatores SECREATDOS do pólo vegetal

DORSAL que induzem o Mesoderma DORSAL

VegT Que elemento materno está na região

dorsal ?

QUAL É A RELAÇÃO

ENTRE

O CRESCENTE CINZA,

BETA-CATENINA E

O MESODERMA

DORSAL???!!

(VegT)

O Centro de Nieuwkoop é formado pela sobreposição de

VegT e Beta-catenina

b-catenina

VegT e outros

TGF-betas

Mesoderma

Dorsal

Mesoderma

Ventral

Mas VegT e beta-catenina são fatores de transcrição!!!

E são maternais (= antes da transcrição zigótica!)

E agora????!!!!

b-catenina

VegT e outros

TGF-betas

Mesoderma

Dorsal (Org)

Mesoderma

Ventral

?

?

Nieuwkoop

O que é secretado pelo Centro de Nieuwkoop para formar o

Organizador?

b-catenina

VegT

Mesoderma

Dorsal (Org)

Mesoderma

Ventral

?

?

Nieuwkoop

A presença SIMULTÂNEA dos fatores de transcrição beta-

catenina e VegT inicia a transcrição zigótica de genes que

codificam proteínas secretadas

Genes do

Organizador

?

VegT Beta-Catenina

Nieuwkoop

Organizador

1. Ativado por VegT

2. Ativado por beta-cat

3. Induz Organizador

4. ZIGÓTICO!!

Genes do

Organizador

Xnr-1/

Nodal

VegT Beta-Catenina Nieuwkoop

Organizador

1. Zigótico

2. Ativado por VegT

3. Ativado por beta-cat

4. Induz Organizador

O centro de Nieuwkooop no pólo vegetal, secreta Nodal, que

induz a formação do Organizador no mesoderma

Xnrs são expressos zigóticamente

Transc. Zigótica

1. Zigótico

2. Ativado por VegT

3. Ativado por beta-cat

4. Induz Organizador

Recém-

fertilizado

Rotação

cortical

Meso-

blástula

Gástrula

Dsh no pólo

vegetal

Dsh no

crescente

cinza

Transcrição

zigótica

Organizador

Nodal (produzido

pelo C.

Nieuwkoop)

Neural

VegT no pólo

vegetal

Propriedades do

Organizador:

1. Inicia Gastrulação

2. Participa do

Mesoderma Dorsal

3. Induz formação de

tecido Nervoso a

partir do

Ectoderma por

proteínas

secretadas

Recém-

fertilizado

Rotação

cortical

Meso-

blástula

Gástrula

Dsh no pólo

vegetal

Dsh no

crescente

cinza

Transcrição

zigótica

Organizador

Nodal

Neural

VegT no pólo

vegetal

?

O que é que o lábio do

blastóporo dorsal secreta

que pode induzir

diferenciação neural no

ectoderma?

VIA DE SINALIZAÇÂO DE BMP

Existem proteínas extracelulares que são inibidores de BMP e atuam evitando a

ligação de BMP com o seu Receptor

O lábio do blastóporo dorsal produz inibidores de BMP como

Chordin, Noggin e Follistatin.

NOGGIN CHORDIN

Development October 15, 2003 vol. 130 no. 20 4975-4988

Superexpressão de inibidores de BMP induzem um segundo eixo

neural.

O que é que o lábio do

blastóporo dorsal secreta

que pode induzir

diferenciação neural no

ectoderma?

Inibidores de BMP

SE inibição do BMP induz destino neural

BM

P

Epidermal

Neural

BM

P

Epidermal

Neural

ENTÃO BMP induz destino epidermal

Como provar que BMP4 comanda a decisão de

epiderme e placa neural a partir do ectoderma?

a) Aumentar a quantidade de BMP4.

Espera-se que tenha mais tecido

epitelial.

b) Reduzir a quantidade de inibidor de

BMP4.Espera-se que tenha mais

tecido neural

c) Reduzir o número de receptores de

BMP4. Espera-se que tenha mais

tecido neural

d) Aumentar o número de receptores

de BMP4. Espera-se que tenha mais

tecido neural

Como provar que BMP4 comanda a decisão de

epiderme e placa neural a partir do ectoderma?

a) Aumentar a quantidade de BMP4.

Espera-se que tenha mais tecido

epitelial.

b) Reduzir a quantidade de inibidor de

BMP4.Espera-se que tenha mais

tecido neural

c) Reduzir o número de receptores de

BMP4. Espera-se que tenha mais

tecido neural

d) Aumentar o número de receptores

de BMP4. Espera-se que tenha mais

tecido neural

mRNA para receptor

dominante negativo

de BMP (pg)

Normal

Duplicação

0 88% 0

20 52% 27%

200 7% 76%

Suzuki et al. 1994 Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Oct 25;91(22):10255-9.

Remoção da via de sinalização de BMP>> neural

O potencial de cada célula é indefinido

A posição de cada célula em relação a

fonte de morfógeno

é interpretada em programas de

diferenciação distintos

Gradiente morfogenético

Fator Morfogenético:

Tem efeitos diferentes em

doses-diferentes

Ou seja:

Gera um gradiente de

resposta a partir da origem

do fator

BMC Developmental Biology 2007 7:22

Epitélio Neural

BMP4

O ectoderma exposto a altos níveis de BMP = Epitélio

Epitélio Neural

BMP4

O ectoderma exposto a baixos níveis de BMP = Neural

BM

P

Epidermal

Neural

SE BMP induz epidermal

Epidermal

Neural

ENTÂO ausência de sinal deve favorecer a

diferenciação neural

Epidermal

Neural

ENTÃO ausência de qualquer sinal favorece NEURAL

Modelo de diferenciação neural por default

Redução da densidade de células tronco aumenta a expressão

de genes neuraisof neural markers. Evidence for the “default neural state”

Tropepe, V. et al., 2001. Neuron, 30(1), pp.65–78.

Ne

ura

l m

ark

ers

P

luriip

ote

ncy

Lim et al., Neuron, Vol. 28, 713–726, December, 2000

Gobeske et al., PLoS One Vol 4 e7506 October 2009

Recém-

fertilizado

Rotação

cortical

Meso-

blástula

Gástrula

Dsh no pólo

vegetal

Dsh no

crescente

cinza

Transcrição

zigótica

Organizador

Nodal

Neural

VegT no pólo

vegetal

Inibidor

de BMP

=

O nò de Hensen de embrião de aves, é similar ao Organizador, porque é onde

se inicia a gastrulação

Wolpert, Biologia do Desenvolvimento

O nò de Hensen de embrião de aves tem propriedades indutoras

similares ao Organizador

Que genes devem estar

expressos no nó de Hensen?

a) Beta-catenina

b) Inibidores de BMP

c) Dsh

d) BMP

O padrão de expressão de BMP e seus inibidores são

complementares na gástrula e nêurula

Streit et al., Development (1998)

Reese et al., Dev. Bio (2004)

Mod from Gitton et al., Development (2011)

Neural

Epidermal

BM

P4

Ch

ord

in

GÁSTRULA NÊURULA

Inibição de beta-catenina

beta-catenina normal

Os micrômeros precisam da atividade de beta-

catenina para formar células mesênquimais primárias

Inibição de beta-catenina beta-catenina normal

Os micrômeros precisam da atividade de beta-

catenina para induzir um segundo eixo dorso-ventral