estudo da velocidade da reação enzimática bem como os fatores que a influença - quantidade de...
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• Estudo da velocidade da reação enzimática bem como osfatores que a influença
- Quantidade de produto formado por unidade de tempo
-Quantidade de substrato transformado por unidade de tempo
Pode ser medido por:
ou
Cinética enzimática
V = - S/ t = P/ t
2[S][S]
3[S]4[S]5[S]
tempo
[pro
duto
]
Cinética enzimática
[S]
Velo
cida
de
da re
ação
• Atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da reação catalisada
V0 varia com a concentração de substrato
V0 sobe linearmente a medida que se aumenta a concentração de substrato, e então começa a se nivelar e se aproximar e um ponto máximo onde a velocidade não aumenta mesmo em concentrações maiores de substrato.
Velocidade da reação é proporcional a S
Substrato satura todasas moléculas de enzima
Cinética enzimática com único substrato
E + ES E + PK1
K -1
K2
K -2
S
Hipótese: segunda reação é a étapa limitante
Após curto tempo - estabilidade dinâmica com relação a [E]
e [ES] é alcançado
Cinética enzimática com único substrato
E + S ES E + PK1
K -1
K2
V0 – Velocidade Inicial
Estado estacionário – [ES] constante
Então Formação de [ES] = Degradação de [ES]
Vo = K2 [ES] [Et]=[E] + [ES]
V de Formação de ES = K1 [E] [S] V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]
Já que Formação de [ES] = Degradação de [ES]
K1 ([Et]-[ES]) [S] = K –1[ES] + K2 [ES] K1[S][Et] - K1[S][ES] = (K –1+ K2) [ES]
[ES] = [Et] [S]
[S] + (K –1+ K2) / k1)
Km
[ES] = [Et] [S] Se, V0 = k2 [ES]
Km + [S]
Então: V0 = k2 [Et] [S]
Km +[S]
Em V máxima [Et] = [ES]
Então V max = k2 [Et]
Sendo assim Vo = Vmax [S]
Km +[S]
Quando V = Vmax 2
Km= [S]
Vmax = 2
Vmax . [S]
Km +[S]
2 . [S] - [S] Km =
Uma propriedade importante:
Propriedades importantes de Km:• É numericamente igual a [S] É numericamente igual a [S] na qual a velocidade da reação na qual a velocidade da reação é metade da Vmax.é metade da Vmax.• Característico de cada Característico de cada enzima.enzima.• Reflete a afinidade da enzima Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato.pelo seu substrato.
Km = [S]
2 . [S]Km +[S] =
Gráfico Linewevear-Burk
• A VELOCIDADE DA REAÇÃO É PROPORCIONAL À CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA
• FACILITA A DETERMINAÇAO DA CONCENTRACAO DE UMA ENZIMA
• DOSAGENS (transaminases, LDH, amilase, fosfatase alcalina)
v0
[E]
Ex: ATP + Glicose ADP + Glicose 6- Phexocinase
Reações em que há 2 substratos envolvem a transferência de átomos ou grupos funcionais de um substrato para o outro:
Sequencial (formação do complexo ternário)
Pingue-pongue ou duplo deslocamento
Reações enzimáticas com mais de um substrato
Inibidores A atividade das enzimas pode ser diminuida ou parada por várias substâncias chamadas de inibidores. Tem inibidores naturais fazendo parte dos constituintes da célula e outros estranhos ao organismo que podem provocar alterações do metabolismo celular. Aqueles encontrados nas células são fundamentais para a fiosiologia. Esses inibidores permitem ás células um controle preciso da velocidade de algumas reações chaves permetindo uma resposta integrada à mudanca das condições fisiológicas.
Inhibição específica de certas enzimas permita as aplicações farmacológicas ex: sulfonamidos (sulfadoxina, ...)Usados para combater as infecções bacterianas
Pneumonia a pneumocystis (Pneumocystis jirovici, P. carinii) IO em pacientes HIV + Infecção do tracto urinárioShigelose (Desinteria)Algumas infecções por protozoários (Plasmodium falciparum)Sulfonamidos são inibidores competitivos da dihidropteroato sintetase (dhps) enzima importante envolvida no metabolismo dos folatos de muitos organismos menos o homem.Os folatos nos serem humanos são fornecidos pela dieta.Toxicidade seletiva para bactérias.
Largo campo de aplicaçacão para o combate de insetosEx: enzimas digestivas de insetos como as -amilases catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas a-1,4 do amido, glicogênio e outros carboidratos. Essas enzimas são muito importantes para os insetos, especialmente para aqueles que se desenvolvem em grãos ricos em amido. (No feijao foram identificados 4 desses inhibidores)Desenvolvimento de plantas mais resistentes ao ataque das pragas contribuindo para a redução do uso de inseticidas químicos.
InibidoresImportância:
• Agentes farmacêuticos• Ferramentas no estudo de mecanismo de funcionamento das enzimas• Ferramenta nos estudos das vias metabólicas
Inibidores
Reversíveis
Irreversíveis Inib. Competitiva (freqüente)
Inib. Acompetitiva (quando o inibidor liga-se ao complexo ES , mas não a enzima livre)
Inib. Mista
Inib. Não-competitiva (caso particular de inib. Mista)
Inibidores Irreversíveis
Inibidor irreversível
1-Reagentes específicos para grupo (R) 2- Análogos de substrato 3- inibidor suicida
1
2
Inibição Reversível
= inib. acompetitiva
Semelhança estrutural entre S e I
Não há semelhança estrutural entre S e I
Não há semelhança estrutural entre S e I
Inibição não-Competitiva •Inibidor não tem semelhança estrutural com o substrato•NÃO se liga no sítio ativo da enzima•Aumento da [substrato] não diminui a inibição •Km da enzima NÃO se altera •A VMAX DIMINUI na presença do inibidor
Inibidor competitivo • Estrutura semelhante à do substrato • Liga-se ao Sítio Ativo da Enzima• Aumento da [substrato] diminui a inibição • A Vmax NÃO se altera•Km da enzima AUMENTANa presença do inibidor
0 1 2 3 4 5 6 70
5
10
15
Sem inibidor
Com inibidor
Substrato (mM)
V 0(m
ol.L
-1.m
in-1
)Substrato (mM) V0 (sem inibidor)
mmol.L-1.min-1 V0 (com inibidor)
mmol.L-1.min-1 0.2 5 3 0.4 7.5 5 0.8 10.0 7.5 1.0 10.7 8.3 2.0 12.5 10.7 4.0 13.6 12.5 6.0 13.5 13.5
Exemplo: Succinato desidrogenase
Inibição competitiva
Inibição competitiva Inibição não-competitiva
O inibidor se liga somente no complexo ES em sítio próprio.
Inibição acompetitiva
Analgésicos... inibidores de Prostaglandinas
Ligação covalenteInibidor irreversível (suicída) - Aspirina
Interações sem ligação covalente Inibidor competitivo e reversível – Ponstan
Regulação de perfusão renalAgregação plaquetáriaProtetora de mucosa gástrica
Inflamação
•Inibidor irreversível Ligação covalente Ácido acetil salicílico
•Inibidor competitivo e reversívelInterações sem ligação covalenteÁcido mefenâmico
Sítio Ativo da Ciclooxigenase
Inibidor competitivo e reversível da COX-1/2 Interação iônica
Dipirona sódica
Inibidor competitivo e reversível da COX-2
Meloxicam
Inibidores Competitivos de proteases do vírus HIV
Gag e Gag Pol são clivados pela protease do vírus HIV em 9 pontos específicos para produzir proteínas funcionais. O precursor Gag vai originar proteínas estruturais e o precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa, integrase e proteases.
Amprenavir
Processing of the env protein is carried out by a host cell enzyme, whereas the gag and gag-pol proteins are processed only by the viral aspartic protease (HIV-PR).
* Inibidores de proteases
Protease produz partículas virais infecciosas
Ciclo de Replicação do Vírus HIV
Inibidores Competitivos de proteases do vírus HIV
Gag e Gag Pol são clivados pela protease do vírus HIV em 9 pontos específicos para produzir proteínas funcionais. O precursor Gag vai originar proteínas estruturais e o precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa, integrase e proteases.
Amprenavir
Processing of the env protein is carried out by a host cell enzyme, whereas the gag and gag-pol proteins are processed only by the viral aspartic protease (HIV-PR).
Regulação da atividade enzimática das enzimas alostéricas
• Enz. alostéricas analogia com protéina alostérica (ex: Hb)
• Moduladores alostéricos (≠ de inibidores não-competitivos ou mistos!!)
• Mudanças conformacionais entre forma ativa e inativa e parámetros cinéticos diferentes (≠ do Michaelis-Menten)
• Dois tipos: enzimas homotrópicas (reguladas pelo substrato) e heterotrópicas
Hiperbole Sigmoide
Enzimas alostéricas... O que é isso?
Sistema multienzimático sequencial
Enzimas alostéricas... O que é isso?
Ex: Aspartato Transcarbamilase (AtCase) -síntese de pirimidinas
Aspartato + carbamil-fosfato N-carbamil aspartato
AtCase
Citidina trifosfato
Uridina trifosfato
-Reguladas por moduladores alostéricos => envolvendo ou não o sítio ativo-Várias subunidades - Inibição por retroalimentação
Um modulador alostérico pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.
Michaellis-Menten
Enzimas Alostéricas
Enzima Homotrópica
Efeito moduladores
Efeito moduladores
Exemplos de enzimas regulatórias Fosfofrutokinase –1 (PFK-1):
ALOSTERIA MODIFICAÇÃO COVALENTE
ALOSTERIA
Glicogênio Fosforilase
Modificação covalente reversível
Ativação Proteolítica
Fatores que afetam a velocidade enzimática
pH
Temperatura
Concentração de substratos
Concentração de cofatores
Presença de Inibidores e/ou ativadores
Modificações químicas: fosforilações, adenilações, etc
Concentração de enzima
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