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Disciplina: Bioquímica ClínicaCurso: Análises Clínicas

3º. MóduloDocente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini

Fundamentos da Espectrofotometria

“Uma maneira boa de cutucar moléculas, é

com radiação eletromagnética (luz)”

A espectrofotometria faz parte da classe dos métodos A espectrofotometria faz parte da classe dos métodos

analíticos que baseiam-se na interação da matéria com a

energia radianteLuz

incidente

Luz

emergente

Luz absorvida

Perdas:

- reflexões

- dispersão

-absorção

•Boa sensibilidade

•Baixo custo de

análise

•Fácil operação

•Equipamentos

robustos

Fundamentos da Espectrofotometria

(a) (b)

Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma: (a) esquema e (b) fotografia.

Arco-Íris: exemplo de difração de luz produzida na natureza.

Fundamentos da Espectrofotometria

• Porque ocorre o fenômeno da absorção?• Moléculas que apresentam elétrons que podem ser

promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia.

Cores de RadiaçãoRegião do Visível

Teoria da Espectrofotometria

• Lei de Lambert-Beer

– Quando uma radiação monocromática passa através de uma solução, uma parte da energia é absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é transmitida.

Teoria da Espectrofotometria

• Lei de Lambert-Beer

– Grandezas:

1- Transmitância

2- Absorbância

Teoria da Espectrofotometria

• Lei de Lambert-Beer– Grandezas:

1- Transmitância:

quantidade de energia radiante transmitida pela solução.A transmitância é dada pela relação entra a intensidade daradiação transmitida (I) e a intensidade da radiaçãoA transmitância é dada pela relação entra a intensidade daradiação transmitida (I) e a intensidade da radiaçãoincidente (Io), ou seja, T = I/Io.Seu valor varia de zero a 1 (ou 0 a 100%)T=O � toda a luz incidente é absorvida (I=O)T=1 � toda a luz incidente é transmitida (I=Io).

2- Absorbância

Teoria da Espectrofotometria

• Lei de Lambert-Beer– Grandezas:

1- Transmitância:

2- Absorbância

quantidade de energia radiante absorvida pela solução. quantidade de energia radiante absorvida pela solução. A absorbância ou densidade óptica (DO) é diretamente proporcional à concentração da amostra. Para se determinar a concentração de uma determinada solução, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade (ou Fator de Calibração), o qual é obtido através da relação entre a concentração e a absorbância de uma solução padrão de concentração exatamente conhecida.

Teoria da Espectrofotometria

• Lei de Lambert-Beer• 2- Absorbância

Uma vez conhecido o Fator de Proporcionalidade, fica fácil se descobrir a concentração da solução teste. Basta realizar a seguinte equação:

Praticando:

1-Determine o Fator de Proporcionalidade de uma amostra, sabendo:

[padrão] = 12,4 g/dL

abs. padrão = 0,52abs. padrão = 0,52

Praticando:

2-Sabendo que o Fator de Proporcionalidade de uma amostra é 22,4. Qual o valor da [padrão] se a abs. padrão for de 0,33?

Lei de Lambert-BeerA espectroscopia de absorção molecular está baseada

na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), que

estão relacionadas através das equações:

T= I/Io (%T = 100x T)A = log (1/T) = log (I/Io)

Io I

A=0 � T= 1 � 100% TransmissãoA=0,9 � T=0,1 � 10 % transmissão

90% Absorção

Io

Lei de Lambert-Beer

A absorbância é muito importante porque ela é diretamente proporcional à

concentração de espécies absorventes de luz na amostra.

Partes Essenciais de um Espectrofotômetro

• Fontes de radiação;

• Monocromador;

• Compartimento de amostra;amostra;

• Detector.

Fontes de RadiaçãoFonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de comprimento de onda.

•Lâmpada de tungstênio: utilizada para região UV próximo e visível•Lâmpada de deutério: utilizada para a região do UV

Sistema Óptico

• Filtros de vidro: transmitem faixa ampla de comprimento de onda;•Prismas: transmitem •Prismas: transmitem pequena faixa de onda;•Redes de difração: transmitem pequena faixa de comprimento de onda.

Cubetas de Medida

DetectoresUtilizados para receber a energia radiante transmitida através da solução e transformá-la em energia elétrica.

Espectrofotômetros

Feixe Simples

Feixe Duplo

Espectrofotômetros com duplo feixe

Espectrofotômetros com duplo feixe

Análises Quantitativas

Análises Quantitativas

Análises Quantitativas

Análise Qualitativa2,4

2

,6 2

,8 3,0

3

,2

Lo

g ε

A ou B

C

D

C5H11

OH

C5H11

R

OH OH

R

OH(A) (B)

240 250 260 270 280 290 300

Comprimento de onda (nm)

2,0

2,2

2,4

2

,6 2

,8 3,0

3

,2

Lo

g

A ou B

C5H11

OH OHOH

C5H11

OH

OH

OHOH

(A) (B)

(C) (D)

Espectro de absorção do canabidiol comparado com outros fenóis.