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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Desenvolvimento de um biossensor para detecção e
identificação do vírus da dengue em fluídos biológicos
Tese de Doutorado Orientando: Fernando Sérgio Rodrigues Ribeiro Teles
Orientador: José Luiz de Lima-Filho
Co-orientador: Duarte Miguel França dos Prazeres (IST / UTL, Lisboa-Portugal)
Recife, 2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Desenvolvimento de um biossensor para detecção e
identificação do vírus da dengue em fluídos biológicos
Tese de Doutorado
Orientando: Fernando Sérgio Rodrigues Ribeiro Teles
Orientador: José Luiz de Lima-Filho
Co-orientador: Duarte Miguel França dos Prazeres (IST / UTL, Lisboa-Portugal)
Recife, 2006
FERNANDO SÉRGIO RODRIGUES RIBEIRO TELES
Desenvolvimento de um biossensor para detecção e
identificação do vírus da dengue em fluídos biológicos
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas (área de concentração de Biotecnologia).
Orientando: Fernando Sérgio Rodrigues Ribeiro Teles
Orientador: José Luiz de Lima-Filho
Co-orientador: Duarte Miguel França dos Prazeres (IST / UTL, Lisboa-Portugal)
SUMÁRIO Agradecimentos ------------------------------------------------------------- i Resumo ------------------------------------------------------------------------ ii Abstract ------------------------------------------------------------------------ iii Abreviaturas ----------------------------------------------------------------- iv Lista de figuras -------------------------------------------------------------- v 1. Introdução ----------------------------------------------------------------- 1 1.1 Dengue ----------------------------------------------------------------- 1 1.2 Biossensores ----------------------------------------------------------- 7 1.2.1 Conceito -------------------------------------------------------- 7 1.2.2 Caracterização ------------------------------------------------- 11 1.3 Imobilização de biomoléculas em superfícies --------------------- 15 1.4 Transdutores ----------------------------------------------------------- 17 1.4.1 Transdutores piezelétricos ------------------------------------ 18 1.4.2 Transdutores óticos -------------------------------------------- 20 1.4.3 Transdutores eletroquímicos ---------------------------------- 23 1.5 Áreas de aplicação dos biossensores ------------------------------- 35 1.5.1 Monitoramento e controle de bioprocessos ---------------- 36 1.5.2 Monitoramento ambiental / Guerra química e biológica - 38 1.5.3 Agricultura e veterinária -------------------------------------- 39 1.5.4 Diagnóstico clínico -------------------------------------------- 39 1.6 Biossensores de DNA ------------------------------------------------ 42 1.6.1 Biossensores de DNA com transdução ótica -------------- 46 1.6.2 Biossensores de DNA com transdução piezelétrica ------ 52 1.6.3 Biossensores de DNA com transdução eletroquímica ---- 55 1.6.4 Novos biossensores de DNA --------------------------------- 68 2. Objetivos ------------------------------------------------------------------- 82 2.2 Objetivo geral --------------------------------------------------- 82 2.3 Objetivos específicos ------------------------------------------- 82 3. Publicações ---------------------------------------------------------------- 83 3.1 “Trends in dengue diagnosis” ---------------------------------- 83 3.2 “Electrochemical detection of a dengue-related
oligonucleotide sequence using ferrocenium as a hybridization indicator” --------------------------------------
84
4. Conclusões ----------------------------------------------------------------- 85 5. Bibliografia ---------------------------------------------------------------- 87 6. Anexos ---------------------------------------------------------------------- 106
i
AGRADECIMENTOS
São devidos agradecimentos às seguintes entidades:
• José Luiz, por me ter aceito como seu orientando de doutorado no LIKA,
e Miguel Prazeres, por me ter aceito como seu co-orientando;
• Coordenação do Doutorado em Ciências Biológicas, por me ter aceito
como aluno de doutorado do CCB / UFPE;
• Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT, do Ministério da Ciência,
Tecnologia e Ensino Superior de Portugal, por me ter concedido a Bolsa
de Doutorado que permitiu a minha vinda e manutenção no Brasil;
• Professores Madalena Areias e Marcelo Navarro, do DQF / UFPE, pela
ajuda inestimável que me deram, não apenas pelo suporte material
indispensável que me concederam para a realização do trabalho
experimental, como também pelas sugestões profícuas;
• Aos colegas do laboratório, principalmente à Rosa Dutra (professora na
UPE), à Neide Shinohara e à Rosângela Frade pelo convívio quotidiano
agradável e pelas sugestões e colaborações informais. Agradeço
especialmente ao Jorge Brito pela atenção e orientação desinteressadas
que me dispensou na iniciação do meu trabalho de laboratório.
• A todas as pessoas que, mais ou menos diretamente, contribuíram para a
finalização bem-sucedida deste trabalho.
ii
RESUMO
A dengue, uma doença emergente, é atualmente a mais importante arbovirose
humana, manifestando-se na forma de quatro sorotipos relacionados antigenicamente
(DENV 1-4). É endêmica e / ou epidêmica em todas as regiões tropicais e subtropicais,
e uma ameaça potencial para regiões mais temperadas. Dos 100 milhões de casos
anuais, 450000 correspondem à forma mais grave, hemorrágica, com alta letalidade.
Devido à inespecificidade dos sintomas iniciais e à inexistência de vacinas e drogas
eficientes e devidamente testadas, o diagnóstico precoce é a principal estratégia de
sobrevivência à dengue hemorrágica. As técnicas laboratoriais de diagnóstico clínico
convencional, contudo, apresentam limitações significativas. Com a tecnologia de
biossensores produzem-se dispositivos simples, rápidos, baratos, sensíveis, específicos e
miniaturados para diagnóstico descentralizado. Neste trabalho, desenvolveu-se um
biossensor eletroquímico de DNA para detectar, por voltametria cíclica, um
oligonucleotídeo sintético relacionado com o genoma do vírus da dengue, hibridizando-
o especificamente com a sua seqüência complementar, imobilizada num eletrodo de
carbono vítreo modificado com quitosana. O ferroceno foi usado como indicador
eletroativo de hibridização por se ligar ao ssDNA e ao dsDNA com diferentes
afinidades e, assim, gerar picos de corrente distintos. Este biossensor conseguiu
discriminar significativamente o dsDNA do ssDNA, na gama de detecção de mg/ml
(submicromolar). A maior afinidade relativa do ferroceno por dsDNA foi confirmada
pela obtenção de maior constante de decaimento voltamétrico (kd) e menor período de
meia-vida (t1/2) em relação ao ensaio com ssDNA. A identificação específica do
sorotipo deverá requerer somente substituição da seqüência conservada (genérica) por
seqüências específicas de cada sorotipo.
Palavras-chave: diagnóstico de dengue; biossensor de DNA; detecção eletroquímica;
indicador de hibridização; eletrodo de carbono vítreo; imobilização de quitosana.
iii
ABSTRACT
Dengue, an emerging disease, is nowadays the most important human
arboviruses, appearing in the form of four antigenically-related serotypes (DENV 1-4).
It is endemic and / or epidemic in all tropical and subtropical regions, and a potential
threat to more temperate regions. From the 100 million annual cases, 450000
correspond to the more serious, haemorrhagic form, with high lethality. Due to the non-
specificity of early symptoms and to the inexistence of efficient and properly tested
vaccines and drugs, early diagnosis is the main strategy of survival to haemorrhagic
dengue. Conventional laboratory techniques of clinical diagnosis, however, exhibit
significant limitations. With biosensor technology, simple, rapid, cheap, sensitive,
specific and miniaturised devices for decentralised diagnosis are produced. In this work,
an electrochemical DNA biosensor was developed to detect, through cyclic
voltammetry, a synthetic oligonucleotide related with dengue virus genome, to hybridise
with its complimentary sequence, immobilised in a chitosan-modified glassy carbon
electrode. Ferrocene was used as an electroactive hybridisation indicator for its ability
to bind ssDNA and dsDNA with different affinities, thus generating distinct current
peaks. This biosensor was able to significantly discriminate dsDNA from ssDNA, in the
detection range of mg/ml (submicromolar). The higher relative affinity of ferrocene to
dsDNA was confirmed by the obtention of a higher voltammetric decay rate constant
(kd) and a lower half-life period (t1/2), compared to the ssDNA assay. The identification
of the specific serotype will only require substitution of the conserved (generic)
sequence by its serotype-specific counterparts.
Keywords: dengue diagnosis; DNA biosensor; electrochemical detection; hybridisation
indicator; glassy carbon electrode; chitosan immobilisation.
iv
ABREVIATURAS
AdSV Adsorptive Stripping Voltammetry --------------------- Voltametria de Redissolução Adsorptiva
AdTSV Adsorptive Transfer Stripping Voltammetry ----------- Voltametria de Redissolução Adsortiva após Transferência
AFM Atomic Force Microscopy -------------------------------- Microscopia de Força Atômica
AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrome -------------- Síndrome da Imuno Deficiência Adquirida
BAW Bulk Acoustic Wave -------------------------------------- Onda Acústica Interna
BIA(core) Biospecific Interaction Analysis ------------------------- Análise de Interação Bioespecífica
BLM Bilayer Lipid Membrane ---------------------------------- Membrana Lipídica de Bicamada
BOD Biochemical Oxygen Demand --------------------------- Demanda Bioquímica de Oxigênio
cDNA Complimentary DNA ------------------------------------- DNA Complementar
DNA Deoxyribonucleic Acid ----------------------------------- Ácido Desoxirribonucléico
dG Deoxyguanosine ------------------------------------------- Desoxiguanosina
dsDNA Double-Stranded DNA ------------------------------------ DNA de Cadeia Dupla
dU Deoxyuridine ----------------------------------------------- Desoxiuridina
ENFET Enzyme-Based Field Effect Transistor ----------------- Transistor de Efeito de Campo Baseado em Enzima
FIA Flow Injection Analysis ----------------------------------- Análise de Injeção de Fluxo
HIV Human Immunodeficiency Virus ------------------------ Vírus da Imunodeficiência Humana
IgG Immunoglobulin G ---------------------------------------- Imunoglobulina G
ISFET Ion-Selective Field Effect Transistor -------------------- Transistor de Efeito de Campo Seletivo a Íons
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry -- União Internacional de Química Pura e Aplicada
kb Kilobase ----------------------------------------------------- Quilobase
Mr Relative Molecular Mass --------------------------------- Massa Molecular Relativa
μTAS μ (Micro) Total Analytical System ---------------------- μ (Micro) Sistema Analítico Total
MWNT Multi-Wall Carbon Nanotube ---------------------------- Nanotubo de Carbono em Multicamada
NADH Nicotinamide Adenine Dinucleotide (H-) -------------- Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (-H-)
NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification --------- Amplificação Baseada na Sequência de Ácido Nucléico
PCB Polychlorinated Biphenyl --------------------------------- Bifenil Policlorinado
PCR Polymerase Chain Reaction ------------------------------ Reação em Cadeia da Polimerase
PNA Peptide Nucleic Acid -------------------------------------- Ácido Nucléico Peptídico
QCM Quartz Crystal Microbalance ----------------------------- Microbalança de Cristal de Quartzo
RNA Ribonucleic Acid ------------------------------------------ Ácido Ribonucléico
RT-PCR Reverse Transcription-PCR ------------------------------ Trancrição Reversa-PCR
SAM Self-Assembled Monolayer ------------------------------ Monocamada Auto-Organizada
SAW Surface Acoustic Wave ----------------------------------- Onda Acústica de Superfície
SCE Saturated Calomel Electrode ----------------------------- Eletrodo de Calomelanos Saturados
SPR Surface Plasmon Resonance ----------------------------- Ressonância de Plasma em Superfície
SSB Single Strand DNA-Binding Protein -------------------- Proteína de Ligação ao ssDNA
ssDNA Single-Stranded DNA ------------------------------------- DNA de Cadeia Simples
STM Scanning Tunnelling Microscopy ----------------------- Microscopia de Tunelamento
SWNT Single-Wall Carbon Nanotube --------------------------- Manotubo de Carbono em Monocamada
TCNQ Tetracyanoquinodimethane ------------------------------- Tetracianoquinodimetano
TSM Thickness-Shear-Mode ----------------------------------- Modo de Cisalhamento em Espessura
UV Ultra-Violet ------------------------------------------------- Ultra-Violeta
v
LISTA DE FIGURAS Figura 1 – O mosquito Aedes aegypti, principal vetor da dengue (retirado de
www.canalciencia.ibict.br).
Figura 2 - Seqüência dos últimos 400 nucleotídeos correspondentes à seqüência não-codificante
3’ do genoma do vírus da dengue (sorotipos 1-4). As áreas escuras representam seqüências
homólogas entre os sorotipos (retirado de Houng et al., 2001).
Figura 3 - Estrutura do vírus da dengue (retirado de www.prefeitura.sp.gov.br).
Figura 4 - Relação entre temperatura corporal, viremia e quantidade de IgM anti-dengue num
quadro clínico típico de dengue (retirado de www.cdc.gov).
Figura 5 - Distribuição da dengue no mundo (retirado de www.anvisa.gov.br).
Figura 6 - Número de casos de dengue notificados nas várias regiões do Brasil, em 2004/2005
(retirado de www.cienciaviva.org.br).
Figura 7 - Principais etapas operacionais num biossensor: a) biocatálise; b) transdução; c)
amplificação; d) processamento; e) exibição visual (retirado de www.pharmacon.us).
Figura 8 - Cristal de quartzo e respectivo suporte (retirado de www.tms.org).
Figura 9 - Funcionamento de um aparelho de SPR (retirado de www.fz-juelich.de).
Figura 10 - Estrutura do ferroceno (retirado de de.wikipedia.org).
Figura 11 - Perfis eletroquímicos típicos de voltametria cíclica. Em cima: potencial aplicado ao
longo do tempo. Em baixo: corrente de resposta em função do potencial aplicado (retirado de
www.sg0.chem.upenn.edu).
Figura 12 - Esquema da dupla-camada elétrica. (A) Na ausência de eletrólito, a queda de
potencial entre os dois eletrodos é linear. (B) Quando um eletrólito é adicionado, forma-se uma
bicamada junto à superfície de cada eletrodo; deste modo, a queda de potencial acontece
principalmente junto às bicamadas, assim minimizando a queda de potencial no seio da solução,
vi
Vs (Vs = corrente que atravessa a solução, i × resistência da solução, Rs) (adaptado de Diamond,
1998).
Figura 13– Variações do potencial aplicado e da corrente de resposta ao longo do tempo em
voltametria de pulso (adaptado de Diamond, 1998).
Figura 14 – Decaimento temporal das correntes total (itotal) e de carga da dupla-camada (idc) em
voltametria de pulso (adaptado de Diamond, 1998).
Figura 15 - Perfil de potencial aplicado ao longo do tempo em voltametria de pulso diferencial
(retirado de www.epsilon-web.net).
Figura 16 - Esquema de célula eletroquímica (retirado de chemistry.binghamton.edu).
Figura 17 - Esquema de um eletrodo de Ag/AgCl (retirado de www.ktf-split.hr).
Figura 18- Princípio de funcionamento de um detector FIA. Depois de a amostra e o reagente
se misturarem e reagirem, os produtos resultantes são detectados oticamente ou
eletroquimicamente ao serem eluídos por um capilar (retirado de www.llnl.gov).
Figura 19 – Lado esquerdo: vários formatos de biossensores comerciais para determinação de
glucose. Lado direito: como eram exclusivamente realizados os diagnósticos clínicos antes do
surgimento dos biossensores – num laboratório (retirado de www.chemsoc.org).
Figura 20 - Esquema genérico de um biossensor de DNA. A hibridização de uma cadeia-alvo
com uma cadeia-sonda imobilizada numa superfície transdutora gera um sinal elétrico
específico que é depois medido (retirado de www.nature.com).
Figura 21 - Biossensor em formato microfluídico (μTAS) para detecção de hibridização de
DNA (retirado de www.aist.go.jp).
Figura 22 - Mecanismo de transferência eletrônica em biossensores baseados em polímeros
condutores (retirado de Gerard et al., 2002).
Figura 23 - Esquema de uma SAM de alcanotióis (cadeias em V) numa superfície de ouro.
Esferas escuras: átomos de ouro. Esferas claras: átomos de enxofre (retirado de Freire et al.,
2003).
vii
Figura 24 - Processo de detecção de hibridização usando dendrímeros de ácidos nucléicos
imobilizados (retirado de Wang & Jiang, 1998).
Figura 25 - Estruturas químicas de um PNA e de um DNA homólogos (retirado de www.dkfz-
heidelberg.de).
Figura 26 - Etapas de manufatura de um eletrodo de pasta de carbono (retirado de
www.epsilon-web.net)
Figura 27 - Princípio de detecção eletroquímica de hibridização de DNA em eletrodos de
carbono. (A) A sonda de DNA é adsorvida na superfície do eletrodo por aplicação de um
potencial positivo. (B) Hibridização da sonda com o alvo complementar. (C1) Transdução
usando o sinal de eletrooxidação dos resíduos de guanina. (C2) Transdução usando o sinal de
eletrorredução de um indicador redox pré-concentrado na superfície do eletrodo (retirado de
Pividori et al., 2000).
Figura 28 - Estrutura da quitosana (retirado de www.ualberta.ca).
Figura 29 - Ligação do ferroceno (em cima, à direita) a um sulco maior do dsDNA (retirado de
rincewind.usask.ca).
Figura 30 - Esquema da técnica de AdTSV para detecção de DNA. Através da aplicação de um
potencial elétrico, o ssDNA é acumulado na superfície do elétrodo, e este lavado com água e
solução do eletrólito. Finalmente, o elétrodo modificado com ssDNA é transferido para uma
célula voltamétrica convencional, onde é feita a medição (retirado de
www.biologicalprocedures.com).
Figura 31 - Princípio de funcionamento de um biossensor multianalito para identificação
específica dos sorotipos do vírus da dengue. É usada uma sonda-repórter genérica, ligada a um
lipossomo encapsulando moléculas de um corante, e 5 sondas de captura – uma relativa a uma
região conservada do genoma viral e as outras específicas para os 4 sorotipos. Quando um RNA
viral específico está presente, forma uma ‘sanduíche’ com as duas sondas (repórter e de
captura), sendo o número de lipossomos capturados na região de detecção proporcional à
quantidade de RNA viral presente (retirado de Zaytseva et al., 2004).
viii
Figura 32 - Esquema em ‘sanduíche’ de biossensor para detecção genérica do genoma do vírus
da dengue e identificação específica do sorotipo (retirado de Baeumner et al., 2004b).
Figura 33 - Esquema de um biochip de DNA. Os diferentes alvos de DNA, obtidos de
fragmentos habitualmente clonados em plasmídeos e depois amplificados, são imobilizados no
chip. As sondas de RNA ou cDNA, obtidas de células em diferentes condições de crescimento,
são marcadas com um fluoróforo. Após hibridização das sondas com os alvos, um laser faz a
leitura do mesmo, sendo gravadas e registradas as localizações específicas, no chip, onde a
hibridização ocorreu. Finalmente, os dados são analisados (retirado de
www.kbrin.louisville.edu).
Figura 34 - Detecção de hibridização de DNA num nanoporo de α-hemolisina. (a) Visão
transversal do nanoporo heptamérico de α-hemolisina ligado a um ssDNA. O sinal ⊕ indica um
potencial positivo aplicado no lado trans da membrana, para o qual é impulsionado o ssDNA
(carregado negativamente) a partir do lado cis. (b) ‘Assinatura’ de corrente típica de um duplex
de DNA totalmente complementar formado entre o ssDNA imobilizado (oligo-1) e uma cadeia
recém-chegada (oligo-2G); B representa os eventos individuais de ligação específica entre o
oligo-1 e o oligo-2G, e T os eventos de translocação do oligo-2G que não se ligou ao oligo-1. (c)
‘Assinatura’ de corrente relativa à ligação parcialmente complementar entre o oligo-1
imobilizado e o oligo-2C recém-chegado. Neste caso, apenas se observam eventos T (retirado de
Niemeyer, 2002).
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 DENGUE
A dengue é atualmente a mais importante arbovirose humana e uma das grandes
doenças emergentes contemporâneas, sendo propagadas a humanos por fêmeas
infectadas dos mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus (figura 1).
Figura 1 – O mosquito Aedes aegypti, principal vetor da dengue
(retirado de www.canalciencia.ibict.br).
O vírus da dengue pertence ao gênero Flavivirus e à família Flaviviridae,
podendo apresentar-se na forma de quatro sorotipos (DENV 1-4) relacionados
antigenicamente. Apesar da grande variabilidade genética entre eles, a região não-
codificante 3’ é relativamente conservada entre eles, como mostra a figura 2.
2
Figura 2 - Seqüência dos últimos 400 nucleotídeos correspondentes à seqüência não-
codificante 3’ do genoma do vírus da dengue (sorotipos 1-4). As áreas escuras
representam seqüências homólogas entre os sorotipos (retirado de Houng et al., 2001).
O seu genoma é um ssRNA de 11 kbs e Mr = 4000 que contém seqüências para
codificação de proteínas estruturais e não-estruturais, incluindo uma glicoproteína-E,
responsável pelo reconhecimento e ligação específica às células hospedeiras. Estas
proteínas estão integradas numa bicamada lipídica que envolve a nucleocápside viral
(Teles et al., 2005), como se pode observar na figura 3.
Figura 3 - Estrutura do vírus da dengue (retirado de www.prefeitura.sp.gov.br).
3
Os primeiros sintomas da dengue, após um período de incubação de até duas
semanas, são bastante inespecíficos, confundindo-se com os da malária, leptospirose,
influenza, febre amarela e várias encefalites. Entre eles, incluem-se febre alta, dores
musculares e articulares, cefaléia, náuseas, vômitos, fraqueza e erupções cutâneas – é a
febre de dengue clássica. Principalmente em casos de pacientes jovens ou reinfectados
com um novo sorotipo, a patologia pode evoluir para febre hemorrágica de dengue,
caracterizada por febre muito alta, hepatomegalia, colapso circulatório e manifestações
hemorrágicas. Este quadro clínico é uma situação emergencial e, se não for tratado
prontamente, pode degenerar em síndrome de choque da dengue, que tem alta taxa de
letalidade (Teles et al., 2005). O período de duração da febre, de 2-7 dias, corresponde a
extensa disseminação da infecção e à produção de anticorpos de IgM e IgG anti-dengue
(Castleberry & Mahon, 2003). Este período febril correlaciona-se com maior viremia e
antecede o aparecimento, no sangue, de anticorpos IgM anti-dengue (figura 4).
Figura 4 - Relação entre temperatura corporal, viremia e quantidade de IgM anti-
dengue num quadro clínico típico de dengue (retirado de www.cdc.gov).
Em indivíduos com infecção primária e em não-imunizados com uma vacina
flaviviral, a resposta imunológica consiste na produção massiva de anticorpos IgM
específicos, atingindo um pico de concentração sanguínea aproximadamente 2 semanas
após o início dos sintomas, e retornando a níveis indetectáveis por ELISA ao fim de 2-3
meses (Nogueira et al., 1992; World Health Organization, 1997). A evolução temporal
4
do perfil de IgG é semelhante, embora os seus níveis sanguíneos sejam sempre bastante
inferiores aos de IgM. A situação é inversa durante uma infecção secundária, na qual o
pico de IgG supera o de IgM. Numa infecção secundária ou em indivíduos já
imunizados com uma vacina flaviviral, os níveis de IgM são muito menores do que
numa infecção primária, podendo mesmo ser praticamente nulos (Rossi et al., 1998;
World Health Organization, 1997). Mesmo vários meses após a infecção secundária,
ainda é possível detectar o sorotipo infectante, embora os anticorpos da infecção
primária possam participar em reações cruzadas e, assim, impedir um diagnóstico
correto desse sorotipo (Putnak et al., 2003). A inespecificidade dos sintomas,
principalmente no estágio inicial da doença, compromete significativamente o êxito de
muitos métodos para o seu diagnóstico precoce, pelo que a reprodutibilidade de
resultados de diagnóstico entre laboratórios diferentes é freqüentemente preferida à
exatidão dos mesmos.
A dengue afeta mais de 100 países em regiões tropicais e subtropicais do
planeta, sendo também uma ameaça potencial para regiões mais temperadas
(Castleberry & Mahon, 2003; Gascon et al., 1998; Rodriguez-Tan & Weir, 1998; World
Health Organization, 1997), como se constata da figura 5.
Figura 5 - Distribuição da dengue no mundo (retirado de www.anvisa.gov.br).
5
A sua incidência anual atinge 100 milhões de casos, dos quais 450000
correspondem à forma hemorrágica, mais grave; estima-se que cerca de metade da
população mundial esteja em risco (Monath, 1994; Rigau-Perez et al., 1998). Fatores
como o aumento drástico das viagens aéreas, a pressão humana sobre os ecossistemas
tropicais, o colapso de programas de controle de pragas, o grande aumento populacional
nas regiões tropicais e a deterioração das condições medico-sanitárias nessas regiões
têm intensificado o contato humano com o vírus da dengue e, assim, a expansão da
doença (Guzman & Kouri, 1996; Lupi & Tyring, 2003). Depois do grande surto
epidêmico que afetou Cuba em 1981 (World Health Organization, 1997), o caso mais
dramático da história da dengue na América, grandes surtos ocorreram noutras regiões
do continente americano, na Ásia e em ilhas do Pacífico (Halstead, 2002). Foi no
sudeste asiático que se notificaram, pela primeira vez, as formas mais graves da doença
- nas décadas de 1950 e 1960 -, as quais aumentaram abruptamente no continente
americano nas últimas décadas. Aqui se incluem surtos epidêmicos, por exemplo, no
Brasil, Venezuela, Colômbia e Guiana Francesa (Gubler & Trent, 1994). A doença
tornou-se endêmica no Brasil, correspondendo à circulação dos sorotipos 1 e 2.
Recentemente, porém, também o sorotipo 3 foi introduzido no país, manifestando-se no
surto epidêmico mais severo registrado no Brasil até agora (Miagostovich et al., 2006;
Nogueira et al., 2005). A figura 6 indica o número total de casos notificados de dengue
nas várias regiões do Brasil entre 2004 e 2005.
Figura 6 - Número de casos de dengue notificados nas várias regiões do Brasil, em
2004/2005 (retirado de www.cienciaviva.org.br).
6
Ao nível individual, a prevenção da dengue faz-se geralmente recorrendo a
repelentes de insetos e a mosquiteiros (Kuno et al., 1990); ao nível populacional, o
controle químico (através de inseticidas) e o controle biológico (através, por exemplo,
de bactérias) de populações de mosquitos têm sido as principais formas de prevenção da
doença (Priest, 1992). Por outro lado, o tratamento é meramente sintomático e paliativo,
habitualmente com recurso a analgésicos, no caso da febre de dengue, e a administração
de soro, no caso da variante hemorrágica. Na ausência de drogas eficazes e específicas e
de uma vacina multivalente (isto é, ativa contra os quatro sorotipos), o diagnóstico
precoce assume importância primordial no combate à dengue, especialmente à forma
hemorrágica. No entanto, os métodos convencionais de laboratório para diagnóstico
clínico da dengue apresentam limitações significativas. A detecção do vírus por
isolamento em cultura (seguido geralmente de imunofluorescência com anticorpos
monoclonais), apesar de ser o método mais direto e conclusivo (Yamada et al., 2002),
requer equipamento sofisticado e mão-de-obra qualificada, além de ser pouco útil em
diagnóstico precoce, visto que são necessários vários dias para isolar e classificar o
vírus (Guzman & Kouri, 1996; Teles et al., 2005). Esta limitação é extensiva aos
métodos sorológicos para detecção de anticorpos anti-dengue específicos. Apesar da sua
maior simplicidade, a sorologia, em infecções primárias, só permite detectar o nível de
anticorpos sanguíneos 4-5 dias após a infecção (Teles et al., 2005). Normalmente,
considera-se que o resultado de um diagnóstico sorológico é positivo para um
determinado sorotipo quando se registra, para o anticorpo específico, um aumento do
seu nível basal em quatro vezes, ou mais. Em infecções secundárias, podem ainda
ocorrer reações cruzadas do anticorpo para a infecção atual com o anticorpo da infecção
anterior, ou até de outra flavivirose, resultando em resultados errôneos (Schwartz et al.,
2000; Soler, 1998). A detecção de antígenos específicos da partícula viral por
imunofluorescência (com anticorpos monoclonais) é geralmente ineficiente devido à
reprodução lenta do vírus da dengue em cultura, que resulta numa concentração viral
demasiado baixa para poder ser detectada (Guzman & Kouri, 1996). A RT-PCR
(utilizada para sintetizar cDNA a partir do RNA viral e, depois, amplificar o primeiro
através de uma polimerase) e técnicas derivadas, embora sejam mais simples, rápidas,
sensíveis e específicas do que a hibridização convencional de ácidos nucléicos, exigem
manipulação meticulosa e são sujeitas a fácil contaminação da amostra biológica
(Sarkar & Sommer, 1990). Um método ‘ideal’ de diagnóstico da dengue deverá poder
7
suprimir as limitações dos métodos convencionais atuais. Algumas inovações
tecnológicas têm sido desenvolvidas no sentido de utilização in situ (diagnóstico
descentralizado), mas as técnicas atualmente conhecidas e disponíveis continuam a não
preencher os requisitos necessários para o diagnóstico bem-sucedido de doenças
infecciosas nos países tropicais e subdesenvolvidos: simplicidade, baixo custo, rapidez e
precisão (Kuno et al., 1998). Para um diagnóstico eficiente da dengue, antevê-se a
necessidade de desenvolver técnicas e / ou dispositivos capazes de, não só detectar o
vírus, mas também discriminar, num único ensaio multianalito, os quatro sorotipos
(Mehrvar & Abdi, 2004); a elevada variabilidade genética entre os sorotipos,
especialmente quando isolados de regiões geográficas distintas, tem dificultado e
atrasado o desenvolvimento e produção de tais dispositivos (Tadeu et al., 1987). Novos
sistemas bioanalíticos, potencialmente miniaturáveis e portáteis para detecção in situ de
agentes patogênicos têm sido recentemente desenvolvidos, produzidos e
comercializados. Os formatos mais recentes destes dispositivos consistem em módulos
integrados nos quais um elemento de reconhecimento biológico, um transdutor físico e
um detector se encontram compactados numa única unidade funcional. Estes sistemas
caracterizam-se, em geral, por possuírem elevada seletividade, sensibilidade, rapidez e
linearidade do sinal de resposta, além de poderem ser operados por pessoal não
qualificado, inclusive pelo próprio paciente, fora de grandes e especializadas
instituições clínicas (Cabral et al., 2003; Teles et al., 2005). A partir do momento em
que se desenvolva suficientemente a tecnologia que permita a sua produção com custos
mais competitivos, eles deverão constituir, no futuro próximo, uma nova abordagem ao
diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas, com vantagens acrescidas sobre os
menos versáteis e complexos sistemas atuais de diagnóstico clínico (Griffiths & Hall,
1993; Teles et al., 2005).
1.2 BIOSSENSORES
1.2.1 Conceito
O conceito de biossensor é, hoje em dia, utilizado correntemente no meio
científico, embora nem sempre de forma inequívoca. Porém, todos os biossensores
possuem a capacidade de reconhecer moléculas biológicas específicas, o que os tem
8
tornado tão divulgados e aplicados, por exemplo, em diagnósticos clínicos e controle
ambiental. Admitindo que mecanismos ou princípios biológicos são comumente
utilizados para o reconhecimento molecular de substâncias, pode afirmar-se que os
biossensores constituem um subgrupo dos sensores químicos, embora muito mais
seletivos do que os últimos (Cammann et al., 1991). Segundo uma primeira definição da
IUPAC, aqui traduzida da língua inglesa, “sensores químicos analíticos são transdutores
miniaturados que respondem seletivamente e reversivelmente a compostos químicos ou
íons e geram sinais elétricos que dependem da concentração”. De acordo com esta
definição estrita, tubos e tiras (fitas)-teste (test-strips) para testes de diagnóstico devem
ser considerados dosímetros e não verdadeiros sensores, visto que, através deles, não é
possível detectar oscilações de concentração do analito. Além disso, estes instrumentos
carecem de um sinal contínuo e proporcional à concentração. É também consensual na
IUPAC que grandes instrumentos analíticos acoplados a uma sonda externa ou a um
sistema de FIA não devem ser considerados como sensores. Idealmente, um sensor
químico deverá ser mais barato e versátil do que os tradicionais aparelhos analíticos
mais complexos. Adicionalmente, a definição da IUPAC não considera outras formas
importantes de transdução do sinal biológico – piezelétrica, acústica, ótica, etc. -, ainda
que o sinal do transdutor seja sempre convertido, no final, num sinal elétrico (Cammann
et al., 1991; Spichiger-Keller, 1998). Por estes motivos, foi proposta recentemente pela
IUPAC uma definição mais abrangente: “Um sensor químico é um aparelho que
transforma informação química, desde a concentração de um componente específico na
amostra até à análise da composição total, num sinal analiticamente útil”. Uma outra
discussão conceptual clássica refere-se à distinção entre sensor químico e transdutor
físico. Segundo alguns autores, um transdutor físico é um aparelho que monitora a
variação de uma propriedade física particular no ambiente em seu redor através de um
sinal eletrônico. Nesta categoria incluem-se, por exemplo, os aparelhos para medição de
temperatura (termômetros, termístores, etc.), cristais piezelétricos para medição de
pressão e medidores de densidade luminosa (fotodiodos, fotomultiplicadores, etc.). Um
sensor químico, por outro lado, pode conter um transdutor físico ou um eletrodo de
referência, mas as suas características de reconhecimento são geralmente determinadas
por outros elementos seletivos presentes no componente sensorial, tais como um filme
ou uma membrana seletiva. A composição e a forma deste elemento seletivo são
cruciais no desempenho do sensor, pois deles depende não só a seletividade, como
também a sensibilidade, estabilidade e tempo de resposta do sensor. De acordo com
9
estes pressupostos, um sensor químico pode definir-se como “um aparelho que fornece,
ao utilizador, informação sobre o seu ambiente; ele consiste num transdutor físico e
numa camada quimicamente seletiva” (Diamond, 1998), numa tentativa de salientar
tanto a natureza da amostra em teste como a do processo de reconhecimento. Esta é
também a problemática essencial na distinção entre um sensor químico e um biossensor.
Atualmente, a definição mais comum de biossensor enfatiza a natureza da espécie
envolvida no reconhecimento seletivo em detrimento da natureza da espécie sob
medição; assim sendo, um biossensor é qualquer aparelho de medida que incorpore uma
espécie biológica como parte essencial do processo de reconhecimento. Esta definição
permite incluir, na categoria de biossensor, muitos aparelhos analíticos atualmente em
desenvolvimento para aplicações não biológicas, e excluir as designadas biosondas, isto
é, todos os sensores ou transdutores que, embora detectem espécies de natureza
biológica ou espécies importantes em sistemas biológicos (exs.: eletrodos seletivos para
íons presentes em fluidos orgânicos), não possuem um componente biológico para o
reconhecimento (Diamond, 1998).
Para efeitos práticos, define-se aqui um biossensor como um aparelho analítico
compacto que converte uma resposta biológica, resultante de uma reação bioquímica
específica entre um elemento biológico imobilizado na superfície do sensor (por ligação
covalente ou não covalente) e o elemento biológico a detectar, num sinal elétrico
mensurável que é comparado com um sinal-padrão (referência) produzido por um
sistema similar, mas sem o biomaterial ativo; a diferença dos dois sinais é então
amplificada, processada, exibida visualmente e gravada (Walker & Gingold, 1993), tal
como esquematizado na figura 7.
Figura 7 - Principais etapas operacionais num biossensor: a) biocatálise (conversão de
substrato, S, em produto, P); b) transdução; c) amplificação; d) processamento; e)
exibição visual (retirado de www.pharmacon.us).
10
Os biossensores diferem dos equipamentos analíticos-padrão pelo seu propósito
muito específico de determinar uma única substância ou grupo de substâncias, pela sua
evolução tendencial no sentido da miniaturação e pelo fato de o resultado final ser uma
informação definitiva, isto é, que não carece de processamento adicional (Moses &
Cape, 1999). Um biossensor incorpora um elemento biológico de reconhecimento,
catalítico ou não (exs.: enzima, anticorpo, ácido nucléico, célula), associado a um
transdutor físico-químico, donde resulta um sinal elétrico discreto ou contínuo,
geralmente proporcional à concentração do analito específico (ou grupo de analitos) a
ser detectado. A especificidade dos biossensores de enzimas, por exemplo, é baseada na
grande especificidade da ação enzimática. O transdutor, por outro lado, deve responder
na escala de concentração desejada e num intervalo de tempo suficientemente rápido, de
até alguns minutos, e deve compensar internamente desvios na resposta causados por
fatores externos, como a temperatura (Sethi, 1994). A combinação física bem sucedida
do transdutor com o elemento biológico é conseguida por engenharia de superfícies, a
qual cria um `ambiente molecular` semelhante àquele em que o bioelemento opera em
condições fisiológicas (Sigrist & Gao, 1999). Os transdutores dos biossensores são
normalmente muito eficientes, ao contrário do desempenho modesto da maioria dos
componentes de reconhecimento molecular, devido ao seu curto tempo de vida ou à
complexidade do processo de geração do sinal (Spichiger-Keller, 1998). A conexão das
biomoléculas com os transdutores exige a retenção das propriedades físicas do material
transdutor em presença da biomolécula; além disso, a transdução do sinal deve manter-
se funcional no meio onde a biomolécula expressa a sua função biológica (Sigrist &
Gao, 1999). Além dos elementos de detecção e de transdução, os biossensores possuem
freqüentemente um dispositivo eletrônico a jusante do transdutor (por exemplo, um
conversor analógico-digital) para minimizar interferências eletromagnéticas externas ou
para fazer convergir simultaneamente sinais de vários sensores na mesma unidade de
processamento de dados (Camman et al., 1991).
Os primeiros biossensores começaram sendo fabricados há cerca de 40 anos e
consistiam em enzimas imobilizados em conjunção com um eletrodo de oxigênio ou de
pH; a reação era seguida pelo monitoramento do consumo de um substrato ou da
formação de um produto. De grande relevância eram os eletrodos de glicose oxidase e
de uréase para medição dos teores de, respectivamente, glicose e uréia. Após o início da
pesquisa e produção de biossensores com proteínas imobilizadas na sua superfície,
11
iniciou-se a sua miniaturação por imobilização em suportes de silício (litografia). A
investigação e fabricação de sensores planares em silício têm visado a produção de
aparelhos idênticos, com características reprodutíveis, de baixo custo e em larga escala
(Diamond, 1998). Uma das principais metas desta indústria é a fabricação de eletrodos à
base de tintas condutoras e pastas de carbono aplicadas por técnicas de impressão
screen-printing (Cabral et al., 2003). Com base na produção industrial em larga escala
de chips (circuitos integrados) de silício, têm-se intensificado a pesquisa e a produção
de biochips (também designados por arrays) (Dittrich et al., 2006) que, essencialmente,
diferem dos chips convencionais por possuírem biomoléculas manipuladas em vez de
condutores e isoladores inorgânicos e polímeros orgânicos, de modo a diminuir-se o
tamanho do chip. As proteínas, por exemplo, situam-se na escala nanométrica, centenas
de vezes menores do que a escala habitual dos materiais litográficos. Porém, existe um
limite mínimo de tamanho, definido pelas dimensões da biomolécula – ainda que, na
prática, o tamanho mínimo possível de um biossensor seja superior em várias ordens de
grandeza (Griffiths & Hall, 1993) -, para que a pastilha de silício funcione como um
circuito eletrônico. Sendo assim, as pesquisas subseqüentes têm incidido sobre a taxa de
transferência eletrônica entre moléculas com o fim de aumentar a velocidade de
propagação de informação. Relativamente aos chips microeletrônicos convencionais, os
biochips requerem controle da transferência de massa, ou seja, o acesso de analitos e
reagentes à superfície de biorreconhecimento do chip (Ruf et al., 2006). Biochips de
segunda geração deverão ser parte de futuros sistemas analíticos integrados e totalmente
automatizados em sistemas de fluxo para medições em tempo real (Bean, 2001).
1.2.2 Caracterização
Ainda que um biossensor ideal não exista realmente, uma vez que todos eles se
desviam mais ou menos da idealidade, é possível definir algumas características gerais
de idealidade, embora elas dependam grandemente da aplicação desejada. Uma das
características de um biossensor `ideal` é possuir elevada seletividade, conferida pelo
biomaterial ativo que lhe está associado; isto significa uma grande capacidade de
discriminar analitos diferentes, embora estes possam ser estruturalmente e
funcionalmente semelhantes. Possuir elevada seletividade significa afirmar que, embora
possam estar presentes em solução substâncias interferentes, a sua contribuição para o
12
sinal global é mínima (Spichiger-Keller, 1998). A seletividade de um biossensor pode
ser incrementada tanto por aumento da exclusividade de ligação entre o receptor
biológico e o transdutor, de modo a reduzir interferências indesejáveis, como pelo
desenvolvimento de novos receptores biológicos com diferentes e maiores afinidades. A
concepção de novos receptores baseados em biomoléculas, assim como uma maior
compreensão das interações moleculares que ocorrem na interface receptor / transdutor,
têm sido possibilitados por avanços nas técnicas computacionais de modelação (Turner,
1996). O bom desempenho de um biossensor requer, ao nível da superfície de
reconhecimento, alta concentração da biomolécula, baixa interação não específica e
estabilidade da camada biológica (Sigrist & Gao, 1999). O incremento da seletividade e
das capacidades de reconhecimento do biossensor depende fortemente do conhecimento
fundamental da relação estrutura / função dos biomateriais (Willner & Willner, 2001).
Em teoria, um biossensor é capaz de detectar um tipo particular de molécula em
solução, mesmo quando outras substâncias estão presentes em concentrações
significativamente superiores (Walker & Gingold, 1993). A seletividade dos
biossensores pode ainda ser aumentada por inclusão das etapas de purificação e de
modificações químicas no processo analítico, equiparando-se assim aos métodos e
aparelhos convencionais de análise. Deste modo, obtêm-se dispositivos miniaturados
portáteis e funcionalmente equivalentes a laboratórios químicos completos, passíveis de
serem utilizados in situ (Regnier et al., 1999). Estão atualmente em desenvolvimento
sistemas microfluídicos que integram, num único dispositivo miniaturado (de tipo
μTAS), todas as etapas básicas de um processo de análise química, com as vantagens de
baixo consumo de reagentes, pequeno volume necessário de amostra e produção de
arrays de biossensores para análise simultânea de múltiplos analitos (Regnier et al.,
1999; Sethi, 1994; Sigrist & Gao, 1999; Willner & Willner, 2001). As várias operações
analíticas integradas num biossensor miniaturado permitirão obter rápidos resultados
quando acopladas a análise computacional em tempo real (Sethi, 1994). Em geral, a
análise de misturas de substâncias por meio de um biossensor não requer prévia
separação dos seus componentes antes da detecção, embora micro-separações
cromatográficas ou eletroforéticas possam ser necessárias para analisar certas misturas
complexas (Regnier et al., 1999; Sethi, 1994). A miniaturação é também adequada para
medições in vivo, visto que é menos susceptível de interferir indesejavelmente na
estrutura e função dos organismos vivos. A viabilidade de monitoramento in vivo
prolongado, todavia, poderá estar limitada pela necessidade de esterilização e
13
manipulação asséptica do biossensor, pela toxicidade dos seus componentes e por
dificuldade de calibração, parcialmente relacionada com a biocompatibilidade entre o
aparelho e o material biológico. A especificidade é outra característica que um
biossensor ‘ideal’ deve possuir; é também uma medida da capacidade discriminatória de
um biossensor e caracteriza a capacidade única de uma biomolécula para gerar um sinal
ou mudança de sinal por interação com um substrato ou produto específico (Spichiger-
Keller, 1998).
A sensibilidade, que determina o limite de detecção do biossensor, deve também
ser maximizada. Apesar de, muitas vezes, a seletividade (ou a especificidade) e a
sensibilidade serem muito semelhantes às do biocatalizador livre, o biossensor
geralmente é preferido quando outras vantagens estão presentes, tais como grande
rapidez de resposta, elevada estabilidade e tempo de vida, capacidade de reutilização e
baixo custo. Em algumas aplicações – por exemplo, em tecnologia ambiental -, alta
seletividade e sensibilidade não são os principais requisitos, mas sim capacidade de
detectar classes de compostos químicos e concentrações-limite; a variedade de
substâncias poluentes em águas subterrâneas, por exemplo, tem tornado ineficientes os
biossensores para detecção de um único analito e, por isso, é urgente o aparecimento de
biossensores de mais largo espectro (Moses & Cape, 1999; Spichiger-Keller, 1998).
Genericamente, um biossensor deve ter um baixo tempo de resposta, o que possibilita a
sua aplicação em monitoramento e em detecção em tempo real. Adicionalmente, deve
possuir elevada estabilidade, tanto operacional como de armazenamento, o que depende
significativamente do método de imobilização físico ou químico escolhido para o
bioelemento (Cabral et al., 2003; Mulchandani & Bassi, 1995). Em particular, o
desenvolvimento dos biossensores enzimáticos, principalmente baseados em
oxidorredutases (peroxidases, oxidases e desidrogenases), tem sido limitado pela
instabilidade de muitas enzimas à temperatura ambiente de trabalho, mas a utilização de
enzimas estáveis a altas temperaturas, obtidas de microorganismos termofílicos, tem
solucionado parcialmente o problema (Luong et al., 1988). Ainda mais comuns são a
refrigeração e secagem no gelo, que possibilitam aumentar quase indefinidamente a
estabilidade das enzimas imobilizadas (Cammann et al., 1991). Os biossensores
baseados em organismos vivos intactos oferecem geralmente maior estabilidade do
elemento biológico do que os biossensores enzimáticos, porque dispensam as etapas de
extração e purificação das enzimas, causadoras de perda da sua atividade (Cammann et
al., 1991; Walker & Gingold, 1993). Além disso, outras substâncias necessárias para a
14
reação enzimática, tais como cofatores, não têm que ser adicionados, pois já estão
presentes nas células vivas, o que torna as células microbianas mais baratas. Elas são
também menos sujeitas a inibição e a variações de pH e de temperatura do que as
enzimas isoladas (Walker & Gingold, 1993). A potencial reutilização é uma vantagem
adicional, uma vez que as células podem ser continuamente realimentadas durante o seu
tempo de vida (Diamond, 1998). Estes biossensores têm, contudo, as desvantagens de
baixa seletividade, longos tempos de resposta causados pela alta resistência difusional
das membranas celular e subcelulares e maior tendência para libertação do bioelemento
(Diamond, 1998; Higgins et al., 1987; Moses & Cape, 1999; Walker & Gingold, 1993).
Uma abordagem mais recente no sentido de obter sensibilidades mais altas é a dos
biossensores baseados em receptores individuais ou estruturas receptoras de organismos
vivos imobilizados sobre o transdutor. Contrariamente aos biossensores enzimáticos,
que se baseiam em bioatividade, os biossensores baseados em receptores operam por
reconhecimento específico de um ligante pelo seu receptor (Diamond, 1998). Além de
maior sensibilidade, os biossensores baseados em receptores têm, relativamente aos
enzimáticos, a vantagem de menores tempos de resposta. As principais desvantagens
são o isolamento das moléculas receptoras e a sua instabilidade após a imobilização,
incluindo labilidade à temperatura ambiente (Cammann et al., 1991; Diamond, 1998).
Um biossensor deve ainda, se possível, ser passível de reutilização múltipla, o que,
além de diminuir o gasto de reagentes e conseqüentemente o custo de cada ensaio,
geralmente assegura maior reprodutibilidade dos resultados, ainda que biossensores
descartáveis, produzidos com base na tecnologia de microtransdutores eletrônicos,
permitam solucionar o problema típico da baixa estabilidade dos biossensores
(Cammann et al., 1991; Walker & Gingold, 1993). A experiência adquirida com
avaliação de qualidade em química clínica, relacionada com os diferentes níveis de
conhecimento entre os técnicos de saúde, sugere que resultados precisos, idênticos e
reprodutíveis entre diferentes laboratórios possam ser mais úteis do que resultados
exatos (Spichiger-Keller, 1998). Por outro lado, elevada estabilidade e capacidade de
reutilização permitem minimizar os custos de fabrico dos biossensores, particularmente
dos enzimáticos (Cabral et al., 2003). A dificuldade de reutilização tem sido um
problema recorrente em imunossensores, pois a elevada afinidade da ligação antígeno-
anticorpo não permite a sua separação após o evento de reconhecimento. Uma técnica
referida para o desenvolvimento de imunossensores reversíveis e reutilizáveis emprega,
sobre um transdutor eletroquímico ou piezelétrico (ver a secção 2), uma camada
15
antigênica de reconhecimento que, por fotoisomerização, muda de um estado com
propriedades antigênicas para outro estado sem essas propriedades, permitindo o
desligamento do anticorpo e a regeneração do antígeno ativo (Willner & Willner, 2001).
1.3 IMOBILIZAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM SUPERFÍCIES
O processo de imobilização de biomoléculas em superfícies é fundamental para
a construção e especificidade dos biossensores. O desempenho de um biossensor
depende criticamente do modo e da eficiência da ligação do elemento biológico à sua
superfície (Sethi, 1994). A escolha do método de imobilização mais apropriado depende
fundamentalmente do bioelemento a ser imobilizado, da natureza da superfície sólida à
qual o bioelemento deve aderir e do mecanismo de transdução. Independentemente do
método de imobilização escolhido, devem ser tidos em conta alguns requisitos
fundamentais, entre os quais a necessidade de retenção da atividade, especificidade e
estabilidade da biomolécula após a imobilização, mesmo depois da reutilização e
armazenamento. São também exigidas simplicidade e elevada reprodutibilidade do
método de imobilização, visando inclusive a produção do biossensor em larga-escala.
Adicionalmente, devem ser minimizadas as ligações não-específicas e evitadas
condições-ambiente extremas (de pH, temperatura, etc.), embora biomoléculas mais
estáveis possam ser produzidas por modificação química ou genética e por organismos
extremófilos (Diamond, 1998). As ligações não-específicas, por outro lado, podem ser
minimizadas bloqueando a superfície do sensor, funcionalizada com a biomolécula, com
uma proteína, como a caseína ou a albumina de soro bovino, antes da ligação do analito
(Janshoff et al., 2000).
Uma das principais formas de imobilização utilizadas na construção de
biossensores é a ligação covalente, segundo a qual certos grupos químicos da
biomolécula a ser imobilizada, não essenciais para a sua atividade biológica, se ligam a
suportes ativados quimicamente. A ativação ocorre freqüentemente por silanização,
podendo os grupos funcionais assim introduzidos serem ligados à biomolécula
diretamente ou, indiretamente, através de um reagente que se ligue por ligações
cruzadas (por exemplo, o glutaraldeído). Os suportes podem ser polímeros, tanto
naturais como sintéticos, ou substâncias inorgânicas, como vidro, metais e cerâmicas.
Através de uma ligação covalente obtêm-se superfícies estáveis e resistentes a grandes
16
variações de pH, temperatura e força iônica, mas com significativa desnaturação e perda
de bioatividade devido à grande rigidez da ligação (Diamond, 1998; Moses & Cape,
1999).
A oclusão é outra estratégia de imobilização de biomoléculas, geralmente em
membranas ou matrizes de géis como a sílica-gel e a poliacrilamida. Estas substâncias
polimerizam por reações cruzadas, sendo assim capturada a biomolécula a imobilizar.
Este método oferece a vantagem de se poder controlar o grau de porosidade; os poros
devem permitir a difusão de substratos e produtos mas, simultaneamente, impedir a
perda da biomolécula, geralmente de elevada massa molecular (Sethi, 1994). Os géis de
poliacrilamida proporcionam elevada retenção da atividade enzimática. Em alternativa,
a polimerização pode ser induzida pelo próprio biossensor, ocorrendo junto à superfície
do eletrodo à medida que a biomolécula vai sendo ocluída, o que permite controlar a
espessura e a porosidade do filme. Outra forma de oclusão é através da formação do
filme por absorção da biomolécula a partir da solução; o filme assim formado é bastante
fino e uniforme (Moses & Cape, 1999).
A imobilização por adsorção física é simples e suave, mas pouco reprodutível e
confiável devido à facilidade de a biomolécula se libertar do sensor durante o
armazenamento em longo prazo, visto que as ligações geralmente são fracas e pouco
estáveis, o que depende muito de mudanças no pH, temperatura e força iônica. A fácil
desorção também é freqüente quando um excesso de biomoléculas forma múltiplas
camadas instáveis na superfície do sensor. A adsorção física tem sido utilizada sobre
suportes de alumina, argila, vidro e resinas de troca iônica. A adsorção química, mais
forte do que a física, ocorre freqüentemente com substâncias orgânicas hidrofóbicas
mais afins para o ambiente igualmente hidrofóbico da superfície de um eletrodo do que
para o ambiente hidrofílico hostil do seio de uma solução aquosa (Bard, 1983). A
adsorção não-específica, predominantemente causada por interações hidrofóbicas, pode
ser reduzida pela adição de detergentes (Uttenthaler et al., 1998).
A imobilização de biomoléculas pode ainda efetuar-se por interações biológicas
altamente específicas e fortes, tais como as conferidas por agentes bifuncionais
indutores de reações químicas intermoleculares cruzadas com suportes sólidos (exs.:
avidina / biotina), ou ligações como DNA-DNA, DNA-RNA, anticorpo-antígeno e
enzima-substrato.
As biomoléculas também podem ser imobilizadas em camadas de polímeros, por
simples imersão do eletrodo em solução do polímero, seguida de evaporação do
17
solvente (revestimento por imersão). As camadas poliméricas também se podem formar
por aplicação de um potencial elétrico sobre moléculas poliméricas pré-existentes
(eletrodeposição) ou sobre monômeros que, sob esse estímulo, são induzidos a
polimerizar junto à própria superfície do elétrodo (eletropolimerização), uma técnica
vantajosa por ocorrer à temperatura ambiente e por permitir um controle rigoroso da
espessura do filme polimérico imobilizado, variando apenas o potencial ou a corrente ao
longo do tempo (Gerard et al., 2002). Por outro lado, os próprios polímeros utilizados
podem ser eletroativos e participar em reações redox, ou podem ser eletrólitos que,
devido aos seus grupos iônicos, podem atrair substâncias ionizadas da solução,
imobilizando-as por atração eletrostática. As camadas de polímeros não eletroativas
também podem ser usadas para produzir eletrodos seletivos a determinada(s) espécie(s)
química(s), permitindo que apenas ela(s) chegue(m) à superfície do eletrodo (Bard,
1983). Neste caso, a sua espessura não deve ser muito grande, para permitir uma
eficiente transferência eletrônica. A exclusão seletiva de interferentes em elétrodos
seletivos baseia-se geralmente em propriedades moleculares como a carga, tamanho,
forma e polaridade. Atualmente, os eletrodos revestidos com polímeros são altamente
atrativos para o desenvolvimento de novos sensores mais específicos, não apenas por a
variedade de polímeros disponíveis permitir uma correspondente multiplicidade de
processos eletroquímicos, mas também pela possibilidade de construir sensores
tridimensionais (Diamond, 1998).
1.4 TRANSDUTORES
O transdutor é o aparelho eletrônico que, ligado a jusante do suporte de
imobilização de um biossensor, converte uma variação fisico-química provocada pela
reação biológica ou bioquímica, relacionada com um determinado tipo particular de
energia, num sinal que é comunicado ao detector.
Existem três tipos principais de transdutores com potencialidades para
aplicações comerciais: os eletroquímicos, os piezelétricos e os óticos. Cada tipo de
transdutor define, com o mesmo nome, o tipo particular de biossensor a que está
associado.
18
1.4.1 Transdutores piezelétricos
Alguns cristais, como o quartzo, podem polarizar-se por possuírem cargas
positivas e negativas que se separam quando ele é sujeito a um estresse mecânico,
estabelecendo-se um campo elétrico que provoca a vibração do cristal com uma
freqüência oscilatória fixa, a qual depende da composição, da espessura e do ângulo de
corte do cristal; este é o efeito piezelétrico. O princípio de funcionamento dos
biossensores piezelétricos baseia-se no fato de a freqüência de ressonância de um cristal
piezelétrico normalmente diminuir quando o analito se liga especificamente à molécula
imobilizada na superfície do cristal, provocando uma deformação mecânica (Sethi,
1994). Através da técnica de QCM, é possível medir pequenas diferenças de massa (na
ordem de ng/cm2) entre diferentes analitos (Walker & Gingold, 1993). A detecção
baseia-se na propagação de ondas acústicas no interior do cristal (BAW), em oposição
ao princípio de propagação de ondas acústicas ao longo da superfície (SAW), neste
último caso quando a oscilação do cristal se situa em freqüências muito altas,
geralmente entre 50 MHz e alguns GHz (Diamond, 1998; Janshoff et al., 2000). Nestes
sistemas, as interações moleculares são detectadas por registro de mudanças na
velocidade das ondas acústicas, predominantemente causadas por variações de massa ou
de viscosidade após ligação do analito (Sigrist & Gao, 1999). Apesar de os sistemas
BAW serem, em geral, menos sensíveis do que os sistemas SAW, são mais
habitualmente utilizados devido à sua robustez e à disponibilidade da eletrônica
(Janshoff et al., 2000). Em QCM (também designada por BAW ou TSM, atendendo ao
mecanismo de propagação das ondas acústicas), é utilizado um instrumento de medida
constituído basicamente por dois conjuntos de eletrodos metálicos, depositados sobre
ambas as superfícies circulares de um cristal de quartzo, na forma de um filme muito
fino, e conectados a dois contatos elétricos presos a um suporte de cerâmica (figura 8).
19
Figura 8 - Cristal de quartzo e respectivo suporte (retirado de www.tms.org).
A aplicação de um estímulo elétrico a um dos conjuntos de eletrodos gera uma
onda acústica que é recebida pelo outro conjunto de eletrodos no outro lado do cristal, a
alguns milímetros de distância, e convertida novamente num sinal elétrico. As variações
de freqüência são medidas em relação a um cristal de referência, tratado de modo
semelhante ao primeiro, mas sem o analito ligado. Um circuito oscilador excita o cristal
e mantém a oscilação (freqüência) característica – assim compensando as perdas de
energia -, sendo feita a medição da freqüência através de um contador de freqüência
(Silva, 2004). O modelo matemático mais conhecido para a relação massa / freqüência
num transdutor piezelétrico, em meio gasoso, baseia-se na equação de Sauerbrey
(Sauerbrey, 1959):
Δf = - 2.3 × 106 f02 Δm / a (equação 1).
Esta equação (em que f0 é a freqüência de ressonância do cristal, Δm é a massa do
material depositado na sua superfície e a é a área do cristal) prevê o aumento da
freqüência de ressonância do cristal com o aumento da massa da molécula que a ele se
liga. Todavia, numerosas interferências podem ocorrer num biossensor piezelétrico –
resultante de utilizar o transdutor piezelétrico em meio líquido -, nomeadamente por
efeito da viscosidade, densidade, temperatura e condutividade específica da solução sob
medida (Diamond, 1998; Walker & Gingold, 1993). Estes biossensores sofrem
principalmente de baixa sensibilidade e de ligações não específicas (Mulchandani &
Bassi, 1995). A manutenção da sensibilidade, da reprodutibilidade e da correlação
20
descrita pela equação de Sauerbrey exige meticulosas lavagens e secagens ao ar antes
do uso (Cammann et al., 1991). A equação de Sauerbrey não é válida com filmes
espessos e líquidos viscosos, uma séria limitação em muitas aplicações biológicas. Em
líquidos, de um modo geral, a freqüência de ressonância do cristal de quartzo em
solução é influenciada, por exemplo, pela força iônica e constante dielétrica do eletrólito
e pela rugosidade e hidrofilicidade da superfície; concretamente, superficies muito
rugosas e hidrofílicas facilitam a deposição de moléculas de líquido em pequenas
cavidades, contribuindo para a massa total detectada pelo transdutor (Janshoff et al.,
2000). A utilização de QCM em meios líquidos padece de alguns problemas,
nomeadamente a instabilidade da oscilação do cristal e os efeitos da viscosidade e
densidade do líquido (Damos et al., 2004). Isto acontece porque o movimento de
cisalhamento do cristal gera um fluxo plano-laminar no líquido próximo à interface,
causando uma diminuição da freqüência de oscilação do cristal de acordo com a
seguinte equação (Kanazawa & Gordon, 1985):
Af = - f0 3/2 (ρl ηl / π ρc μc) 1/2 (equação 2).
Nesta equação, ρl e ηl são, respectivamente, a densidade e a viscosidade do líquido, ρc é
densidade do cristal e μc é o módulo de cisalhamento do cristal – o quociente entre a
tensão de cisalhamento (força / área) aplicada ao cristal e a deformação específica nele
gerada. Ainda que esta equação não o preveja, outros fatores – incluindo a estrutura da
interface sólido / líquido, temperatura, caráter hidrofóbico / hidrofílico da superfície do
cristal, uniformidade do filme sobre o cristal e extensão da área do cristal em contato
com a solução influenciam a aplicação de QCM em fase líquida (Damos et al., 2004).
A QCM não parece apropriada para miniaturação, por necessitar de uma área reacional
relativamente grande; todavia, fornece dados importantes e fidedignos a nível cinético e
termodinâmico (Janshoff et al., 2000).
1.4.2 Transdutores óticos
Os biossensores óticos baseiam-se na alteração de propriedades óticas de
algumas substâncias em resposta à reação bioquímica para detecção do analito. Nestes
21
biossensores, um estímulo luminoso incide sobre a camada biológica imobilizada na
ponta, por exemplo, de uma fibra ótica, sendo depois monitorada uma propriedade ótica,
como a absorvância, fluorescência, atividade ótica ou luminescência (Walker &
Gingold, 1993). Depois de a luz incidir na amostra biológica, as moléculas da amostra
absorvem-na em determinados comprimentos de onda, dependendo do número e tipo de
moléculas presente; em seguida, é medido o espectro de luz dispersa ou que atravessa a
amostra, e comparado com um sinal de calibração, de modo a determinar a
concentração de analito. A intensidade do sinal obtido é freqüentemente proporcional à
quantidade de material biológico presente (Sethi, 1994). Muitas técnicas óticas detectam
o índice de refração (n) e a espessura do filme (d) ou, em alternativa, a espessura ótica
efetiva (nd) (Janshoff et al., 2000). Devido à baixa atenuação proporcionada pelas fibras
óticas, é possível a detecção de sinais remotos não elétricos em ambientes perigosos ou
sensíveis, in situ e in vivo (Diamond, 1998; Walker & Gingold, 1993). A natureza não
elétrica dos sistemas óticos confere-lhes importantes vantagens quando aplicados a
biossensores para aplicações médicas, industriais e militares. Os biossensores óticos
podem ainda responder a mais de um analito usando reagentes que absorvam ou emitam
a diferentes comprimentos de onda, ainda que os reagentes opticamente ativos que
utilizam sejam freqüentemente instáveis (Luong et al., 1988). Este tipo de biossensor
explora atualmente a alta qualidade de vários componentes óticos (exs.: fibras óticas,
lasers, detectores e conectores) empregues em tecnologia de comunicações (Diamond,
1998).
Vários biossensores óticos utilizam métodos de variação colorimétrica, de entre
os quais se destacam as tiras-teste utilizadas em numerosas aplicações comerciais; elas
consistem em tiras de papel ou de outro material absorvente impregnado com enzimas e
outros reagentes. A cor produzida é depois comparada com uma escala de cor pré-
existente, ou medida através de um medidor portátil de refletância. Uma das aplicações
mais conhecidas e utilizadas das tiras-teste é na determinação de glicose no sangue e
urina (Cabral et al., 2003; Walker & Gingold, 1993). Os biossensores óticos, contudo,
apresentam tipicamente problemas de interferência da luz ambiente, longos tempos de
resposta, libertação do reagente sob uso contínuo, baixa estabilidade da matriz de
imobilização e alto custo de manufatura e de reagentes, além da inerente complexidade
(Griffiths & Hall, 1993; Sethi, 1994).
22
Certos transdutores óticos têm suscitado ultimamente maior interesse científico e
comercial, geralmente os baseados no efeito de detecção de campo evanescente, em
especial a variante de SPR (figura 9).
Figura 9 - Funcionamento de um aparelho de SPR (retirado de www.fz-juelich.de).
Os biossensores baseados neste efeito são sensíveis a um parâmetro que
correlaciona a massa do analito com o índice de refração da luz que atravessa a fibra
(Diamond, 1998; Sigrist & Gao, 1999). Como a camada biológica de reconhecimento
tem freqüentemente uma massa bastante elevada, a ocorrência de um sinal por variação
de massa exige que o analito também tenha uma massa elevada, pelo que uma alta
sensibilidade está normalmente restrita a analitos tais como anticorpos, vírus e bactérias.
Novos sistemas baseados neste princípio permitem já detectar biomoléculas na gama de
picomolar (Sigrist & Gao, 1999).
A aplicação destes transdutores em biossensores tem ganhado relevância devido
às vantagens proporcionadas pelo desenvolvimento e miniaturação dos transdutores
optoeletrônicos e das fibras óticas, que são caracteristicamente flexíveis, pequenas,
descartáveis e baratas (Sethi, 1994). Como a luz para análise permanece confinada e é
totalmente conduzida no interior da fibra ótica, evita-se assim a necessidade de
equipamento ótico adicional, tornando mais facilmente exeqüível a miniaturação e a
fabricação de aparelhos óticos integrados, nos quais não só o elemento de
reconhecimento, mas também, por exemplo, a fonte luminosa, o detector e um array de
sensores estão espacialmente confinados num chip (Diamond, 1998; Spichiger-Keller,
1998). Em geral, as técnicas óticas são mais sensíveis do que a QCM, à qual são
freqüentemente comparadas, inclusive por requererem um sensor com menor área
superficial (Janshoff et al., 2000).
23
1.4.3 Transdutores eletroquímicos
Nos biossensores eletroquímicos, geralmente a variação de alguma grandeza
elétrica é correlacionada com a concentração de analito na amostra biológica. É deste
tipo a maioria dos transdutores usados em biossensores comerciais, o que está
certamente relacionado com as elevadas sensibilidade e seletividade e com a inerência
de equipamentos de medição mais simples do que os utilizados em outros tipos de
transdução, nomeadamente piezelétrica e ótica (Dutra, 1999). Baseiam-se na ocorrência
de processos redox durante a reação biológica ou bioquímica que define o evento
analítico na superfície do biossensor. A imersão de um eletrodo – a unidade transdutora
básica de um sensor eletroquímico – numa solução eletrolítica resulta na troca de
elétrons entre ele e o analito. O potencial da solução (E) é dado pela equação de Nernst
(Diamond, 1998),
E = E0 + [ R T ln ([Ox] / [Red]) / n F ] (equação 3),
sendo E0 o potencial formal do par redox, R a constante dos gases (8.314 J mol-1 K-1), T
a temperatura absoluta, n o número (constante) de elétrons transferidos na reação redox
elementar, F a constante de Faraday (96487 C mol-1) e [Ox] e [Red] as molaridades das
espécies oxidada e reduzida (respectivamente) do par redox. Na indústria farmacêutica,
em particular, os biossensores eletroquímicos têm sido empregues em vários estágios sa
pesquisa e produção de drogas, apesar da ainda insuficiente seletividade obtida e da
necessidade de pré-isolar a droga antes da sua quantificação. A seletividade, pelo menos
em parte, pode ser melhorada por escolha adequada do potencial a impor e por
utilização de membranas seletivas na superfície do eletrodo (Kauffmann & Viré, 1993).
A resposta de um biossensor eletroquímico é controlada cineticamente quando a
concentração da biomolécula é muito baixa, o que constitui uma limitação analítica na
medida em que as respostas máximas correspondem freqüentemente a concentrações
muito baixas. Quando o controle é difusional, não depende de pequenas variações na
concentração de enzima, mas é uma função da concentração do analito. Nestes
biossensores, além de parâmetros como o pH, temperatura e concentração de analito,
importa considerar parâmetros relativos à construção do eletrodo para o sinal de
resposta; neles incluem-se a concentração da biomolécula imobilizada, a espessura do
filme biológico e a membrana semipermeável que eventualmente envolva a biomolécula
24
imobilizada (Cabral et al., 2003; Diamond, 1998). A detecção eletroquímica é
geralmente adequada para imunoensaios de injeção de fluxo (Gübitz & Shellum, 1993).
Os principais tipos de transdutores eletroquímicos são os condutimétricos, os
potenciométricos e os amperométricos.
Num transdutor condutimétrico, é medida a variação de condutividade elétrica
que ocorre em muitos processos biológicos, provocada pela variação nas concentrações
de espécies iônicas em solução (Walker & Gingold, 1993). A condutividade é medida
por aplicação de uma corrente alternada entre dois eletrodos de metais nobres imersos
em solução, e fundamenta-se no fato de algumas reações enzimáticas gerarem produtos
eletricamente carregados a partir de substratos neutros (Griffiths & Hall, 1993). A
grande desvantagem da técnica é a falta de especificidade, pois a resistência da solução
é determinada pela migração de todos os íons presentes (Sethi, 1994). Na prática, a
condutividade de fundo das soluções biológicas, normalmente elevada e bastante
variável ao longo do tempo, torna a técnica muitas vezes demasiado insensível e
inviável para aplicações analíticas (Moses & Cape, 1999). O princípio de operação
envolve a aplicação de um campo elétrico ao longo de um par de microeletrodos
rodeados por uma solução eletrolítica contendo a enzima e as espécies a detectar. A
fabricação de um biossensor microeletrônico deste tipo requer as operações
normalmente envolvidas na produção de transistores e, adicionalmente, uma etapa de
deposição e imobilização da enzima, sendo o aparelho encapsulado numa resina ou num
filme polimérico. Um exemplo clássico de biossensor condutimétrico é aplicado à
determinação de uréia, também adaptado para detecção de multianalitos. Potenciais
aplicações deste biossensor são, por exemplo, em análise sanguínea in vitro, cirurgia
renal e monitoramento de diálises (Sethi, 1994; Walker & Gingold, 1993).
Os transdutores potenciométricos envolvem processos capacitivos, funcionando
segundo o princípio de acumulação de uma elevada densidade de carga junto à
superfície do eletrodo de trabalho, daí resultando uma elevada diferença de potencial em
relação ao eletrodo de referência, que é mantido a um potencial constante, com uma
corrente faradaica nula e uma corrente capacitiva constante. Basicamente, é medida a
diferença de potencial enquanto se fixa o valor da corrente. Nestas condições, a técnica
é não-destrutiva, pois não há consumo de analito (Griffiths & Hall, 1993). Num eletrodo
enzimático, a reação da enzima com o analito gera uma mudança no potencial devida à
acumulação ou depleção de íons (Mulchandani & Bassi, 1995). A diferença de potencial
gerada é proporcional ao logaritmo da atividade do íon-analito (Diamond, 1998;
25
Griffiths & Sethi, 1994; Hall, 1993; Luong et al., 1988). As variações na concentração
iônica que ocorrem em solução são medidas utilizando eletrodos seletivos a íons. Como,
em muitas reações bioquímicas, o íon hidrogênio é consumido ou gerado, um simples
eletrodo de pH pode ser usado para a sua medição potenciométrica (Walker & Gingold,
1993). O limite de detecção da técnica varia entre 10-6 M e 10-9 M (Spichiger-Keller,
1998). Os biossensores potenciométricos miniaturados são dispositivos de baixo custo e
produzidos em massa, baseados nos transistores ISFET, designando-se por transistores
ENFET; geralmente possuem uma membrana biocatalítica formada por uma fina
camada de um gel com a enzima imobilizada sobre a membrana seletiva para a espécie
sob medição. O efeito de substâncias interferentes pode ser significativo a ponto de
suprimir completamente a resposta do eletrodo (Diamond, 1998). O eletrodo de
referência é um ISFET idêntico, mas sem a membrana biocatalítica. Este tipo de
biossensor padece caracteristicamente de alguns problemas de sensibilidade,
estabilidade e tempo de resposta, além de forte dependência da capacidade
tamponizante da amostra. Porém, é apropriado para miniaturação e fabricação de um
array para multianálise de analitos diferentes. Alguns dos principais exemplos de
aplicação estão na determinação de uréia, penicilina, glicose, creatinina e acetilcolina
(Mulchandani & Bassi, 1995; Sethi, 1994).
Os transdutores amperométricos operam por aplicação de um potencial
constante entre os eletrodos de trabalho e de referência, sendo medida a corrente em
estado-estacionário resultante da reação redox do analito. O resultado é o decaimento da
corrente (i) ao longo do tempo (t), de acordo com a equação de Cottrell (Maloy, 1983),
i = n F A D1/2 C / (π t)1/2 (equação 4),
em que A é a área do eletrodo, D é o coeficiente de difusão característico do analito e C
é a sua concentração. Enquanto a potenciometria descreve o sistema eletroquímico no
equilíbrio (isto é, na ausência de corrente), a amperometria desloca esse equilíbrio e
relaciona o número de elétrons transferidos ao longo da interface eletrodo / solução com
a concentração do analito (Diamond, 1998). A partir da conhecida relação entre corrente
e carga elétricas,
Q = ∫ i dt (equação 5),
26
na qual Q representa a carga elétrica fluindo durante o intervalo de tempo elementar dt e
i a corrente variável resultante, e da 1ª Lei de Faraday,
Q = n F N (equação 6),
em que N é a quantidade de substância reduzida ou oxidada, deduz-se imediatamente
que
dN / dt = i / (n F) (equação 7)
e, portanto, que a corrente medida é proporcional ao consumo de analito ao longo do
tempo. Por outras palavras, a potenciometria mede a energia eletrônica e a
amperometria mede a velocidade da reação redox (Faulkner, 1983). A reação redox, no
biossensor, é mediada por uma determinada enzima redox imobilizada, e dela resultam
as espécies eletroativas detectáveis pelo método. As desidrogenases e as
oxidorredutases são enzimas particularmente usadas em biossensores amperométricos
porque a sua atividade catalítica está relacionada com transferência de elétrons. A
corrente gerada pelo potencial aplicado resulta de transferência eletrônica entre o
eletrodo de trabalho e a solução eletrolítica, e é diretamente proporcional à concentração
das espécies eletroativas, numa gama de detecção de 10-7 a 10-8 M (Sethi, 1994; Silva,
2004). Apesar disso, nem sempre a seletividade dada por um potencial constante
aplicado é suficiente para distinguir as diferentes espécies eletroativas presentes em
solução, pois outras espécies presentes podem sofrer reações redox ao mesmo potencial
que o analito. Alguns biossensores amperométricos comerciais têm solucionado este
problema recorrendo a membranas seletivas para eliminar espécies interferentes ou, em
alternativa, a mediadores de transferência eletrônica que, além de serem
eletroquimicamente reversíveis, diminuem o potencial de trabalho para minimizar a
ocorrência de reações redox indesejadas (Cammann, 1991; Diamond, 1998;
Mulchandani & Bassi, 1995). Derivados do ferroceno (figura 10) e das quinonas – de
que são exemplos o TCNQ e o ácido antraquinonamonossulfônico (Wong & Gooding,
2006) - são compostos muito usados para esse fim, embora os eletrodos que os contêm
tenham geralmente tempos de vida curtos e, conseqüentemente, não sejam adequados
para monitoramento contínuo de bioprocessos em longo prazo (Mulchandani & Bassi,
1995).
27
Figura 10 - Estrutura do ferroceno (retirado de de.wikipedia.org).
Num processo oxidativo, estes compostos bombeiam elétrons dos centros ativos
das enzimas para os eletrodos. Alguns sais orgânicos, no entanto, atuam transportando
elétrons no sentido inverso, ou seja, dos eletrodos para as enzimas. O efeito da
utilização de todos estes compostos é diminuir a distância para transferência de elétrons
e, assim, facilitar a comunicação entre os centros redox da biomolécula imobilizada e o
eletrodo (Willner & Willner, 2001). Uma nova geração de biossensores amperométricos
utiliza a transferência direta de elétrons entre a camada de reconhecimento e a superfície
do eletrodo através do correto posicionamento estereoquímico da biomolécula,
geralmente conseguido por adsorção direta da mesma na superfície do eletrodo. Deste
modo é possível superar as limitações impostas pelas grandes distâncias e conseqüente
baixa velocidade de transferência eletrônica entre as duas superfícies (Cabral et al.,
2003; Diamond, 1998).
De entre as principais técnicas amperométricas, destaca-se, pela sua larga
utilização e possibilidade de análise qualitativa, a voltametria cíclica, que consiste na
aplicação de uma rampa linear de potencial sucessivamente crescente e decrescente (ou
vice-versa). A voltametria, em geral, difere da coulometria pelo fato de, na segunda,
praticamente todo o analito ser convertido noutro estado redox (Skoog et al., 1998). Em
voltametria cíclica, o potencial de um eletrodo de trabalho - ou, mais rigorosamente, a
diferença entre o potencial variável de um eletrodo de trabalho e o potencial constante
de um eletrodo de referência (ver definições adiante) - é variado linearmente ao longo
do tempo e a corrente resultante é registrada, até que a oxidação ou a redução do analito
ocorra; após esse evento, a direção da varredura de potencial é invertida. O
aparecimento de bandas no voltamograma corresponde à ocorrência de reações redox
em gamas de potencial definidas (figura 11).
28
Figura 11 - Perfis eletroquímicos típicos de voltametria cíclica. Em cima: potencial
aplicado ao longo do tempo. Em baixo: corrente de resposta em função do potencial
aplicado (retirado de www.sg0.chem.upenn.edu).
Atendendo à proporcionalidade entre potencial (V) e tempo (t) e à equação 7,
vem
∫ i dE = n F N / k (equação 8),
com dE representando a variação elementar do potencial e k a constante de
proporcionalidade entre t e V. Isto significa, em suma, que as áreas integradas das
bandas redox resultantes são proporcionais à quantidade total da(s) substância(s)
eletroativa(s) entretanto gerada(s) ou consumida(s) na superfície do eletrodo. A
voltametria cíclica é particularmente útil, por exemplo, em detectar irreversibilidade
eletroquímica (caracterizada por uma grande diferença entre os potenciais dos picos de
oxidação e redução), assim como casos em que o produto da reação no eletrodo se perde
por via de uma reação química. Neste último caso, o pico de corrente da curva de
retorno (correspondente, por exemplo, à banda de redução) deverá ter menor
intensidade do que o pico homólogo da curva dianteira (correspondente, no mesmo
caso, à banda de oxidação) (Evans et al., 1983). A sensibilidade da técnica, contudo,
pode ser significativamente limitada pelo fenômeno de carga da dupla-camada,
29
resultante da presença e movimentação de íons do eletrólito junto à superfície dos
eletrodos (figura 12).
Figura 12 - Esquema da dupla-camada elétrica. (A) Na ausência de eletrólito, a queda
de potencial entre os dois eletrodos é linear. (B) Quando um eletrólito é adicionado,
forma-se uma bicamada junto à superfície de cada eletrodo; deste modo, a queda de
potencial acontece principalmente junto às bicamadas, assim minimizando a queda de
potencial no seio da solução, Vs (Vs = corrente que atravessa a solução, i × resistência da
solução, Rs) (adaptado de Diamond, 1998).
Como consequência, é gerada uma corrente adicional no circuito, de natureza
capacitiva, devida à variação gradual do potencial do eletrodo de trabalho. Esta corrente
interfere com a corrente total medida, adicionando-se à corrente faradaica que se
pretende medir; esta, por sua vez, está diretamente relacionada com a mudança do
estado de oxidação da(s) espécie(s) química(s) sob medição, ou seja, com a velocidade
da reação eletroquímica (que, por sua vez, depende da taxa de transferência das
substâncias eletroativas do seio da solução para o eletrodo, isto é, da transferência de
massa, e da taxa de transferência de elétrons entre o eletrodo e essas substâncias, isto é,
da transferência de carga) (Diamond, 1998; Maloy, 1983). A corrente de carga da dupla-
camada contribui mais significativamente para a corrente total nos primeiros instantes
após aplicação de um potencial porque decai mais depressa do que a última. Este fato
tem sido aproveitado em eletroanálise para, em instantes mais tardios, minimizar as
0V
1V 1V
0V
Eletrodo
Eletrodo
Eletrodo
Eletrodo
V
x
Solução Solução
(A) (B)
iRS
30
correntes capacitivas e, desse modo, atingir menores limites de detecção, através de
técnicas eletroquímicas de pulso. Em voltametria de pulso, após manutenção do
potencial num certo valor, este é instantaneamente aumentado (pulso de potencial) e
novamente mantido; ao fim de algum tempo, é medida a corrente (figura 13).
Figura 13 – Variações do potencial aplicado e da corrente de resposta ao longo do
tempo em voltametria de pulso (adaptado de Diamond, 1998).
Se este período de tempo entre a aplicação do pulso e a medição da corrente for
suficientemente longo para que a reação eletroquímica ocorra, a intensa corrente
capacitiva gerada pelo pulso decai para valores desprezíveis. Deste modo, praticamente
toda a corrente medida é faradaica e, portanto, correlacionada com a concentração do
analito (figura 14).
Corrente
Potencial
E0
0 •
Medição da corrente
E1
Tempo
31
Figura 14 – Decaimento temporal das correntes total (itotal) e de carga da dupla-camada
(idc) em voltametria de pulso (adaptado de Diamond, 1998).
No entanto, a maximização da sensibilidade (isto é, da razão corrente /
concentração de analito) exige que esse tempo não seja excessivamente longo, pois a
corrente medida também decai (embora mais lentamente do que a corrente capacitiva).
Deste modo, a elevada sensibilidade conseguida com voltametria de pulso requer a
escolha de um tempo de medição ótimo, nem muito curto, nem muito longo,
tipicamente na gama de dezenas a milhares de segundos (Osteryoung, 1983). Algumas
configurações mais comuns de voltametria de pulso incluem pulso diferencial (figura
15), pulso normal, em degrau e de onda quadrática (Diamond, 1998; Skoog et al.,
1998).
Tempo
Corrente
itotal
Idc
•
Medição da corrente
32
Figura 15 - Perfil de potencial aplicado ao longo do tempo em voltametria de pulso
diferencial (retirado de www.epsilon-web.net).
O equipamento para uma análise voltamétrica é composto basicamente por uma
célula eletroquímica e por um potenciostato. A célula eletroquímica (figura 16) é um
recipiente que contém a solução de eletrólito a analisar e é adaptado para a imersão de
três eletrodos: o eletrodo de trabalho, geralmente sólido, que mede o potencial das
espécies eletroativas em solução; o eletrodo de referência, geralmente de prata / cloreto
de prata (Ag/AgCl) (figura 17) ou SCE (Hg2Cl2/Hg), que deve possuir um potencial
estável com o tempo, temperatura e passagem de pequenas correntes, e em relação ao
qual é medido o potencial do eletrodo de trabalho; e o eletrodo auxiliar, que
normalmente consiste num condutor inerte (platina ou grafite), para completar o
circuito.
Figura 16 - Esquema de célula eletroquímica (retirado de chemistry.binghamton.edu).
33
Figura 17 - Esquema de um eletrodo de Ag/AgCl (retirado de www.ktf-split.hr).
Na solução eletrolítica (que também contém um eletrólito de suporte para a
tornar mais condutiva), a corrente flui entre os eletrodos de trabalho e auxiliar. O
potenciostato é um aparelho eletrônico que controla o potencial aplicado ao eletrodo de
trabalho e permite medir a corrente que o atravessa (Silva, 2004). Em eletrodos de fitas
(tiras), as correntes muito baixas que são geradas, por gerarem quedas ôhmicas muito
baixas, não distorcem o perfil voltamétrico medido, o que permite simplificar o
esquema de detecção, acoplando o eletrodo de referência ao auxiliar. Esta configuração
possibilita que os dois eletrodos utilizados – o de referência / auxiliar e o de trabalho –
possam ser dispostos muito proximamente e, deste modo, reduzir significativamente o
volume necessário de amostra (Turner et al., 1987). Este é também o caso dos
ultramicroeletrodos, de dimensões inferiores a, aproximadamente, 20 μm (Skoog et al.,
1998). A necessidade de utilizar um sensor de referência é comum às várias técnicas
eletroquímicas atrás descritas, o que limita a sua aplicabilidade in vivo, devido à típica
baixa estabilidade em longo prazo de eletrodos de referência; neste contexto particular,
a utilização de biossensores óticos é mais vantajosa, pois o seu sinal de comparação é
gerado com a mesma fonte de luz usada para a amostra (Spichiger-Keller, 1998).
Ainda que a maioria dos biossensores comerciais sejam eletrodos enzimáticos
amperométricos, o seu sucesso em áreas que exigem monitoramento contínuo tem sido
limitado pelo fato de o sinal depender fortemente da transferência de massa das espécies
eletroativas para a superfície do eletrodo, o que pode provocar saturação da superfície e
perda de sensibilidade (Griffiths & Hall, 1993). Não obstante, a sensibilidade inerente
às técnicas de potencial controlado, associada à tendência para o modo portátil e à
34
facilidade de fabricação de ultramicroeletrodos para medições em espaços exíguos,
torna os biossensores amperométricos muito promissores, por exemplo, para aplicações
biomédicas (Wang, 1999). O processo de polimerização oxidativa por via eletroquímica
(eletropolimerização; ver definição adiante) da molécula pirrólica contribuiu
grandemente para o desenvolvimento de biossensores amperométricos miniaturados
porque, durante a sua ocorrência, biocatalizadores e mediadores adicionados à mistura
de polimerização podem ficar retidos numa membrana junto à superfície do eletrodo,
em condições não desnaturantes, o que favorece a microfabricação de chips. No futuro,
as técnicas eletroquímicas e, em especial, as amperométricas, deverão beneficiar não só
da miniaturação da célula eletroquímica integrada num chip, mas também da fabricação
de potenciostatos integrados (Diamond, 1998). Ao contrário dos biossensores
potenciométricos, cuja sensibilidade e seletividade só podem ser aumentadas por
manipulação da camada que contém o bioelemento sensorial, os biossensores
amperométricos miniaturados podem ter a seletividade aumentada por escolha
apropriada do potencial do eletrodo de trabalho, e a sua sensibilidade também
aumentada por maximização das correntes faradaicas e minimização das correntes de
carga, aproveitando a minimização da capacitância proporcionada pelos microeletrodos
(Diamond, 1998; Sethi, 1994). No entanto, os biossensores amperométricos têm a
desvantagem de eventual formação de depósitos da molécula sob medição junto à
superfície do eletrodo, visto que uma parte do analito se consome durante a medição, o
que gera uma atenuação indesejada do sinal (Cammann, 1991). A tecnologia de filmes
finos permite fabricar eletrodos e microeletrodos de carbono, reconhecidos pela sua
elevada estabilidade e conseqüente eficiência em monitoramento de processos contínuos
(Sigrist & Gao, 1999). Devido às desvantagens inerentes ao clássico eletrodo de gota de
mercúrio e aos avanços alcançados em poderosas técnicas espectroscópicas, como a
espectroscopia de absorção atômica, a amperometria entrou em declínio e só
recentemente ressurgiu com o desenvolvimento de técnicas de medição de pulso e de
eletrodos modificados quimicamente (Diamond, 1998). Exemplos típicos deste tipo de
biossensor podem ser encontrados em vários aparelhos para medição de glicose e de
hipoxantina (Walker & Gingold, 1993).
35
1.5 ÁREAS DE APLICAÇÃO DOS BIOSSENSORES
Os biossensores são hoje usados correntemente em várias áreas científicas,
embora continue a haver uma discrepância muito significativa entre o elevado número
de artigos científicos publicados sobre o tema e a modesta quantidade de aplicações
comerciais. Para esse limitado sucesso comercial do mercado de biossensores contribui
certamente o baixo nível de cooperação interdisciplinar entre as várias áreas científicas
implicadas na tecnologia de fabricação de biossensores, nomeadamente a Bioquímica,
Microeletrônica, Engenharia de Superfícies e de Polímeros, Robótica e Automação, etc.
(Cammann et al., 1991). Paralelamente, a baixa estabilidade típica do bioelemento
imobilizado pode também dificultar o sucesso comercial dos biossensores, o que pode
ser ultrapassado com recurso ao armazenamento do biossensor sob refrigeração ou à
imobilização do bioelemento recorrendo a incorporação em membranas ou géis (Sethi,
1994). O sucesso da tecnologia de biossensores depende parcialmente da incorporação
de biomoléculas no método de fabricação dos mesmos, que é essencialmente o de um
aparelho microeletrônico. Em termos gerais, o comportamento das biomoléculas ligadas
a superfícies sólidas é ainda largamente incompreendido, embora as recentes técnicas de
AFM e STM já permitam obter imagens de biomoléculas adsorvidas em superfícies, em
escala de resolução próxima da atômica. Estas técnicas também se têm mostrado úteis,
em indústria microeletrônica, no controle da qualidade dos filmes de microeletrodos
depositados sobre os substratos imobilizados através, por exemplo, da técnica de
impressão por jacto de tinta (inkjet printing) (Diamond, 1998). Quando os biossensores
são reutilizados, o biomaterial pode desligar-se gradualmente ao longo das sucessivas
utilizações, comprometendo a integridade do sensor. Um outro problema é a freqüente
falta de uniformidade e de pureza aceitável da biomolécula purificada de algum
organismo vivo, responsável pela geração de resultados pouco reprodutíveis. O
desenvolvimento de biossensores está também freqüentemente limitado pela sua falta de
seletividade pois, apesar de a especificidade da reação bioquímica ser, por definição,
muito alta, interferências externas podem influenciar o sinal ao nível do transdutor.
Continuam por identificar setores de mercado que compensem os volumosos
investimentos feitos nas áreas de investigação, produção e comercialização de
biossensores, não tanto pela falta de conhecimentos dos mecanismos moleculares
implicados nos processos bioquímicos de reconhecimento, mas principalmente pela
ainda inexistência de uma tecnologia que permita a microfabricação dos mesmos a
36
preços competitivos e pela falta de um claro benefício de utilização por parte dos
usuários (Griffiths & Hall, 1993). O controle da futura expansão da tecnologia de
biossensores dependerá certamente de um equilíbrio entre, por um lado, as vantagens da
tecnologia e as oportunidades de mercado e, por outro, os obstáculos técnicos e
financeiros. Uma grande parte dos biossensores para várias aplicações é produzida
como alternativa às tiras-teste individuais, baratas e descartáveis, em vez de competir
com os complexos instrumentos analíticos de laboratório (Moses & Cape, 1999). Na
ausência, em curto prazo, de vastos mercados para os biossensores, as empresas que os
produzem deverão fabricá-los essencialmente para uso próprio e / ou para
comercialização em pequenos mas numerosos mercados afins. Genericamente, o
desenvolvimento futuro dos biossensores deverá passar pelo monitoramento contínuo e
imediato (on-line) de resultados e por monitoramento em regime de estreita
proximidade dos utilizadores (Griffiths & Hall, 1993). Vários setores de mercado já
utilizam biossensores rotineiramente, de entre os quais se destacam os que se seguem.
1.5.1 Monitoramento e controle de bioprocessos
As fermentações industriais, incluindo as alimentícias e farmacêuticas, exigem
monitoramento constante dos níveis de substrato, produto e biomassa microbiana, mas
os tradicionais métodos off-line são dispendiosos, demorados e sujeitos a contaminações
(Luong et al., 1988). O monitoramento on-line tem sido aplicado mais sistematicamente
em controle de fermentações, mas a inserção do biossensor dentro do biorreator (in situ)
cria alguns problemas, nomeadamente a dificuldade de calibração, de esterilização e a
baixa estabilidade do bioelemento (Keay & Wang, 1997; Moses & Cape, 1999;
Mulchandani & Bassi, 1995). A recalibração dos biossensores in situ não é possível
durante o processo, uma grande desvantagem devido à labilidade de muitos
componentes biológicos dos biossensores (que resulta na sua gradual inativação durante
todo o processo de monitoramento) e às variações na resposta do sensor em função das
variações na composição do meio de cultura. Esta sensibilidade às condições dos
bioprocessos é o motivo de os biossensores serem ainda usados preferencialmente ex
situ como detectores em sistemas FIA (Schügerl et al., 1996), cujo princípio de
funcionamento está indicado na figura 18.
37
Figura 18 - Princípio de funcionamento de um detector FIA. Depois de a amostra e o
reagente se misturarem e reagirem, os produtos resultantes são detectados oticamente ou
eletroquimicamente ao serem eluídos por um capilar (retirado de www.llnl.gov).
Processos de esterilização podem manter um biorreator livre de
microorganismos indesejados, mas também são susceptíveis de degradar as
biomoléculas lábeis do biossensor. Por conseqüência, muitas aplicações utilizam os
biossensores como aparelhos de fluxo off-line. Segundo este conceito, um pequeno
caudal de meio fermentativo flui continuamente do biorreator através de um tubo de
análise (detector) contendo um biossensor não esterilizado. O sinal do sistema – a altura
do pico – é proporcional à concentração da espécie sob medição, sendo a calibração
efetuada ao mudar a solução-teste que flui pelo tubo por uma solução de calibração; este
é o princípio da análise por FIA (Moses & Cape, 1999; Twork & Yacynych, 1990).
Grandes vantagens do FIA em análise on-line são a sua capacidade para autocalibração
automática e para miniaturação e a compatibilidade com uma interface para análise
computacional. O sistema FIA permite ainda obter um baixo tempo de resposta e
utilização do sinal-controle por retroação, além de exigir somente pequenas quantidades
de amostra para análise e de reagentes, com implicações vantajosas nos custos
operacionais (Keay & Wang, 1997; Mulchandani & Bassi 1995; Ružička, 1992; Twork
& Yacynych, 1990). Em contrapartida, podem surgir problemas derivados de rejeição
do analito por contínua obstrução e mudança de tamanho dos poros da membrana,
contaminação microbiana da membrana, necessidade de diluição da amostra,
aparecimento de bolhas de oxigênio na solução e necessidade de recalibrações
contínuas. Apesar de o sistema FIA ser a técnica mais usada para integrar biossensores
com biorreatores, a sua aceitação é mais consensual para culturas de células de
38
mamíferos e plantas do que para fermentações microbianas, estas últimas mais rápidas e
exigindo a recente tecnologia de arrays de sensores para detecção simultânea de vários
analitos (Mulchandani & Bassi, 1995). Mais recentemente, técnicas de análise de
injeção seqüencial, derivadas do sistema FIA, oferecem vantagens adicionais em
monitoramento de bioprocessos (Cladera et al., 1995). Por outro lado, a análise on-line
apresenta vantagens em monitoramentos freqüentes de culturas, nomeadamente menor
necessidade de mão-de-obra do que em análise off-line e a conseqüente diminuição de
custos (Pol et al., 1996). A tecnologia de biossensores possibilita a realização de
medições contínuas, rigorosas e em tempo real, de substratos e metabólitos não-voláteis,
o que permite aplicar ações corretivas quando necessário, otimizar processos
fermentativos e minimizar o consumo de reagentes dispendiosos (Cammann, 1991;
Mulchandani, 1995). Isto é especialmente importante em fermentações industriais com
culturas de células bacterianas e eucarióticas dispendiosas e delicadas, de modo a
minimizar os custos de produção. Na indústria alimentícia, em particular, a produção de
alimentos e o controle da sua qualidade exigem geralmente o conhecimento da sua
composição química, estado de conservação e contaminação microbiana (Luong et al.,
1988). Exemplos importantes de aplicação de biossensores nesta área incluem a
determinação de glicose em vinho e refrigerantes e a determinação de hipoxantina no
peixe, como medida do seu estado de conservação (Cammann et al., 1991).
1.5.2 Monitoramento ambiental / Guerra química e biológica
Uma grande parte da investigação e desenvolvimento de métodos sensíveis de
detecção e controle de níveis de poluentes na área ambiental tem-se efetuado
recentemente por pressão de legislações restritivas (Moses & Cape, 1999). Estas áreas
caracterizam-se pela necessidade comum de determinação de poluentes no ar, solo, água
e efluentes, tais como pesticidas, herbicidas, fertilizantes, PCBs, dioxinas, metais
pesados e vários microorganismos, incluindo agentes patogênicos potencialmente
aplicáveis em situações de terrorismo e guerra biológica e química (Cammann et al.,
1991; Luong et al., 1988; Sethi, 1994). Aplicações vantajosas de biossensores de
microorganismos inteiros são esperadas em monitoramento ambiental da água, de que é
exemplo a medição de BOD (Diamond, 1998; Moses & Cape, 1999). A detecção de
bactérias em solução, por exemplo, é baseada geralmente na ligação específica de um
39
anticorpo imobilizado na superfície do sensor a um antígeno da superfície da célula
bacteriana (Janshoff et al., 2000). Devido à complexidade da interacção de células com
anticorpos e à sua correlação com o sinal medido, tem-se modelado a adesão de células
em superfícies usando vesículas lipídicas dopadas com receptores, para interagir com
ligantes imobilizados (Yun et al., 1998). Os biossensores para detecção e
monitoramento de agentes biológicos e químicos perigosos começam sendo
freqüentemente utilizados para medições em tempo real (Cabral et al., 2003). A vasta
utilização do sistema FIA para uso em monitoramento ambiental deve-se à sua
capacidade para analisar muitas amostras e à facilidade de adaptação a diferentes tipos
de analisadores, havendo a tendência para o desenvolvimento de sistemas FIA portáteis
e automatizados para análises on-line, especialmente da qualidade da água (Keay &
Wang, 1997).
1.5.3 Agricultura e veterinária
A expansão da tecnologia de biossensores nesta área dependerá de avanços
primordiais na área de cuidados de saúde humanos. Atualmente, existe já um grande
mercado potencial nesta área, especialmente no diagnóstico de várias afecções em
animais, com previsível utilização de novos métodos de diagnóstico por pessoas não
especializadas (Sethi, 1994).
1.5.4 Diagnóstico clínico
O mercado de análises e diagnósticos clínicos é atualmente o maior alvo de
investigação e produção de biossensores, representando mais de 50% do mercado
mundial (Cabral et al., 2003; Walker & Gingold, 1993). Além da sua já conhecida
utilização em análises clínicas à urina e ao sangue para medição in vivo e in vitro de
vários analitos (H+, oxigênio, sódio, uréia, etc.), algumas das maiores aplicações futuras
são esperadas no diagnóstico do câncer, doenças genéticas, doenças infecciosas e de
determinadas substâncias em situações de emergência clínica, como a glicose, lactato,
creatinina, uréia e várias enzimas de importância clínica (Luong et al., 1988).
40
Em geral, os equipamentos analíticos de laboratórios centrais já permitem
realizar muitos diagnósticos e análises clínicas rápidas, precisas, confiáveis e de fácil
utilização por pessoal especializado. A estes requisitos, os biossensores permitem, em
teoria, acrescentar algumas vantagens, tais como: baixo custo; desnecessidade genérica
de tratamento prévio das amostras biológicas; possibilidade de operação fora dos
centros de diagnóstico, por pessoal não especializado, e, até, no âmbito domiciliar, pelo
próprio paciente; e capacidade de monitoramento contínuo do nível de várias
substâncias de interesse clínico (Luong et al., 1988). É de esperar que seja nos cuidados
de saúde intensivos e pontuais, ao nível individual, que os biossensores sejam utilizados
de forma mais generalizada (Wang, 1999). A miniaturação tendencial dos biossensores
também abre caminho ao diagnóstico descentralizado, com enorme diminuição do
intervalo de tempo entre a coleta da amostra e a decisão terapêutica para somente alguns
minutos, em contraste com a escala de tempo de horas em química clínica tradicional.
Contrariamente ao que acontece em controle de bioprocessos, em que geralmente a
resposta resulta de variações da concentração de analito, o propósito fundamental em
diagnósticos clínicos é determinar se essa concentração está acima ou abaixo de um
valor pré-fixado (Walker & Gingold, 1993).
Até agora, a tecnologia de biossensores em diagnóstico clínico não tem tido
ainda a difusão comercial que as suas potencialidades e vantagens prometem, em parte
porque existe uma forte corrente de opinião contra a realização de medições químicas
em muitos consultórios médicos por pessoal não treinado, e a favor dos aparelhos
analíticos multifuncionais existentes em grandes laboratórios clínicos (Regnier et al.,
1999). Além disso, de entre a vasta gama de patologias humanas, só a medição de
glicemia para controle da diabetes reúne as duas principais condições que garantem um
grande e imediato sucesso comercial: a existência de um imenso mercado-alvo e a
necessidade de vários monitoramentos constantes e diários. Alguns métodos correntes
para medição de glicemia baseiam-se em variações colorimétricas, uma enorme
desvantagem para muitos diabéticos que, tradicionalmente, têm sérios problemas de
visão. Em conseqüência, biossensores baseados noutros métodos são urgentemente
necessários no mercado (Moses & Cape, 1999). Ainda que seja um aspecto
freqüentemente subestimado, a predominância de métodos invasivos de coleta de
amostra biológica – geralmente sangue – não tem constituído uma vantagem em relação
aos convencionais e bem estabelecidos métodos laboratoriais de análise e diagnóstico. O
desenvolvimento e a aplicação de biossensores para medição de metabólitos em fluídos
41
biológicos que não requeiram métodos invasivos de coleta, tais como saliva ou suor,
facilitam uma coleta mais freqüente da amostra e com menos traumas físicos para o
paciente; isto é especialmente importante em pacientes que necessitem de coletas
diárias, como é o caso dos diabéticos, e / ou com problemas na coleta de sangue, como
os hemofílicos e os recém-nascidos (Guilbault & Palleschi, 1995).
Os biossensores para análises e diagnósticos clínicos podem ser pequenos
aparelhos portáteis na forma de, por exemplo, uma caneta ou um cartão de crédito com
um painel para exibição dos resultados em formato digital (figura 19).
Figura 19 – Lado esquerdo: vários formatos de biossensores comerciais para
determinação de glucose. Lado direito: como eram exclusivamente realizados os
diagnósticos clínicos antes do surgimento dos biossensores – num laboratório
(retirado de www.chemsoc.org).
Para utilização em laboratórios clínicos, os biossensores são tipicamente
maiores, e a realização de análises com sangue não diluído, além de ser mais rápida,
permite evitar erros de pipetagem e diluição, assim como efetuar medições mais
próximas da situação que ocorre in vivo do que quando se analisa soro ou plasma
(Moses & Cape, 1999). A utilização de biossensores pelos próprios pacientes é ainda
controversa entre os técnicos de saúde em patologias e situações graves de saúde, de
que são exemplos o câncer, viroses e a medição de analitos como o colesterol, mas já é
comumente aceite, por exemplo, em testes domiciliares para gravidez, alcoolismo e
pequenas alergias (Griffiths & Hall, 1993; Walker & Gingold, 1993). Vários temas de
química clínica constituem oportunidades promissoras para a tecnologia de
biossensores, nomeadamente o monitoramento de drogas terapêuticas, a determinação
rápida da glicemia, os testes de susceptibilidade a antibióticos, a identificação de
42
leucócitos em doentes com câncer, AIDS e hepatites, os testes virais, etc. (Sethi, 1994).
A formulação e reforço do cumprimento de recentes legislações impondo rigorosos
padrões de controle de qualidade em análises clínicas (à semelhança do que acontece
em vigilância ambiental) deverá dificultar, futuramente, a introdução de novos
biossensores baratos no mercado, embora possa consolidar e ampliar a utilização de
biossensores já estabelecidos e mais competitivos (Walker & Gingold, 1993). Também
a aplicação do sistema FIA em química clínica não tem sido bem sucedida, devido ao
fato de as análises clínicas geralmente exigirem a realização de várias determinações
diferentes em cada amostra (Keay & Wang, 1997).
1.6 BIOSSENSORES DE DNA
Os métodos convencionais para análise de seqüências genômicas específicas
incluem seqüenciamento direto de ácidos nucléicos ou hibridização, sendo esta mais
rotineiramente usada em laboratórios de diagnóstico devido à sua maior simplicidade
(Pividori et al., 2000). Tal como acontece in vivo, a hibridização de ácidos nucléicos na
superfície de um transdutor (suporte sólido) é tanto mais forte e específica quanto maior
for o grau de complementaridade entre as bases das duas cadeias que se ligam. A
especificidade e a estabilidade dessa ligação são máximas quando as duas cadeias são
perfeitamente complementares. Os mecanismos moleculares da hibridização sobre
suportes sólidos, porém, ainda são relativamente desconhecidos e dificilmente
previsíveis, devido à carência de métodos para o seu monitoramento contínuo e à
dificuldade de estimar a exata concentração de ácido nucléico imobilizado. Mesmo
assim, geralmente assume-se que as etapas importantes que ocorrem na interface sólido
/ líquido são a difusão da solução para a superfície do sensor e, nesta, difusão
bidimensional, adsorção e desorção (Chan et al., 1997). Alguns estudos teóricos,
incluindo análise fractal, têm tentado estimar parâmetros relativos, por exemplo, à
cinética de hibridização (Sadana & Vo-Dinh, 1998). Ainda que se assuma a semelhança
dos processos de hibridização em solução e em suporte sólido, a velocidade de
hibridização no segundo caso é normalmente várias dezenas de vezes inferior, para
condições e sequências de DNA idênticas (Gao et al., 2006). A menor eficiência da
hibridização em suporte sólido deve-se, em grande parte, à indisponibilidade para
hibridizar de vários grupos da cadeia imobilizada, por estarem envolvidos nesse
43
processo de ligação à superfície do transdutor. A velocidade de hibridização também
diminui com o aumento do grau da estrutura secundária de uma ou das duas cadeias,
tanto em fase líquida como em solução. Além disso, o mecanismo de hibridização entre
cadeias de DNA com extensas estruturas secundárias é mais complexo do que o descrito
pelo modelo tradicional dos dois-estados (Gao et al., 2006). Tal como acontece em
solução, a hibridização interfacial em fase sólida requer otimização das condições
ambientais, tais como a força iônica e a temperatura (Wang, 2000). A obtenção de altas
sensibilidade e seletividade requer maximização da eficiência de hibridização e
minimização da adsorção não específica (Wang, 2002). O grupo de Wang, trabalhando
com eletrodos de discos de carbono (Wang et al., 1997a), avançou algo mais na redução
da adsorção não específica em hibridização de ácidos nucléicos, ao revestir os eletrodos
com uma membrana semipermeável a oligonucleotídeos e capaz de, in situ, os
selecionar e separar de acordo com o seu tamanho, o que é especialmente relevante em
amostras biológicas contendo grandes fragmentos de ácidos nucléicos celulares de
tamanhos muito diversos. A hibridização de DNA ocorre geralmente entre uma
seqüência conhecida (sonda) e uma seqüência desconhecida (alvo), podendo também
ocorrer hibridização do tipo DNA-RNA ou RNA-RNA (Junhui et al., 1997). As sondas
de DNA podem ser produzidas por um método químico, adicionando monômeros
nucleotídicos a uma cadeia crescente imobilizada num suporte sólido, ou por métodos
de biologia molecular. Neste caso, uma abordagem possível é isolar um determinado
mRNA de células que o produzam em abundância e, depois, produzir a sonda de DNA a
partir dele por transcrição reversa; outra opção é inferir a seqüência de DNA pretendida
a partir da seqüência de aminoácidos da proteína expressa por esse DNA, embora a
validade desta estratégia esteja limitada pela degenerescência do código genético
(Diamond, 1998). A hibridização de ácidos nucléicos em formatos tradicionais, como a
eletroforese em gel e em membrana (southern), é geralmente muito lenta e laboriosa
(Wang, 2002). A hibridização é também o evento de reconhecimento biomolecular
inerente à maior parte dos biossensores de DNA (genossensores) mas, neste caso,
ocorre diretamente sobre a superfície de um transdutor (Vercoutere & Akeson, 2002). O
princípio de detecção está representado na figura 20.
44
Figura 20 - Esquema genérico de um biossensor de DNA. A hibridização de uma
cadeia-alvo com uma cadeia-sonda imobilizada numa superfície transdutora gera um
sinal elétrico específico que é depois medido (retirado de www.nature.com).
Deste modo, o próprio DNA (mais especificamente, a cadeia imobilizada), na
função de receptor, é uma parte do próprio biossensor. Ao contrário de enzimas e
anticorpos, os ácidos nucléicos formam camadas de reconhecimento biológico
facilmente sintetizáveis em laboratório, altamente estáveis e reutilizáveis após ruptura, a
alta temperatura, da ligação entre as duas cadeias de DNA ligadas (Wang, 2000). Neste
sentido, oligonucleotídeos sintéticos curtos são freqüentemente preferidos como os
bioelementos ativos em genossensores, pelo fato de, neles, não ocorrerem as típicas
mudanças conformacionais complexas que diminuem a velocidade, eficiência e
seletividade da hibridização em polinucleotídeos ou DNA genômico. O diagnóstico de
doenças infecciosas com biossensores de DNA possibilita detectar estirpes diferentes de
um determinado microorganismo patogênico por escolha apropriada de sondas de DNA
específicas para cada estirpe; em alternativa, também permite detectar o patôgeno com
uma única sonda de DNA independentemente da sua estirpe pois, de acordo com a
biologia evolutiva, se considera que todas as estirpes de uma mesma espécie possuem
regiões genômicas com seqüências comuns. Os biossensores de DNA para diagnóstico
são, neste aspecto, comparativamente vantajosos em relação aos biossensores de
anticorpos (imunossensores), limitados na distinção de diferentes estirpes da mesma
espécie patogênica. Particularmente em relação a infecções virais, uma vantagem
adicional dos genossensores é a possibilidade de diagnóstico precoce através de simples
identificação dos genes virais com sondas de DNA, atendendo a que os imunossensores
requerem alguns dias desde o início da infecção para que os anticorpos específicos
45
sejam produzidos e possam ser detectados (Diamond, 1998). Um dos propósitos do
desenvolvimento e produção de biossensores é detectar DNA autonomamente e com
alta sensibilidade mas, por enquanto, a presença de ácidos nucléicos em concentrações
muito baixas nos fluídos biológicos exige geralmente prévia amplificação por PCR até
níveis detectáveis pelo biossensor (Junhui et al., 1997). Esta etapa, todavia, pode ser
incorporada em modernos sistemas microfluídicos de análise (também designados
microssistemas de análise total, μTAS, ou sistemas lab-on-a-chip) (Dittrich et al.,
2006) que, adicionalmente, possibilitam que o evento de hibridização ocorra em fase
líquida em vez de numa superfície sólida, em condições similares às do microambiente
in vivo (figura 21). Apesar disso, continua a ser um objetivo primordial dos chips de
DNA a eliminação da etapa e da necessidade da PCR, embora tal ainda não tenha sido
conseguido na generalidade dos dispositivos disponíveis comercialmente (Kerman et
al., 2004a).
Figura 21 - Biossensor em formato microfluídico para detecção de hibridização de
DNA (retirado de www.aist.go.jp).
A detecção do evento de hibridização de duas cadeias de DNA freqüentemente
faz-se por associação da cadeia-alvo a um indicador ou marcador de hibridização,
embora outras alterações no sistema possam também ser medidas (Wang, 2000). Foi
demonstrado (Steel et al., 1999) que a interação de cátions moleculares com ácidos
nucléicos, atuando como indicadores de hibridização por via de atração eletrostática,
não é afetada pela imobilização dos últimos em superfícies sólidas. Como a constante de
46
ligação das duas cadeias é alta, o limite de detecção do marcador é geralmente o fator
limitante da velocidade de hibridização. O marcador não se deve ligar ao alvo em locais
envolvidos nas ligações de hidrogênio para não obstruir a ligação à sonda e não deve
diminuir a temperatura de fusão (Tm) de modo a não alterar as características da
hibridização. Na prática, porém, muitos marcadores têm grupos que se ligam a cadeias
simples de DNA por ligações de hidrogênio, mas em percentagem suficientemente
baixa para não alterar a estabilidade da hibridização (Diamond, 1998). A marcação de
sondas de DNA iniciou-se com marcadores radioativos. Devido ao imenso risco
biológico associado, novos tipos de marcação de DNA para utilização em biossensores
têm sido entretanto desenvolvidos.
Abaixo é feita uma revisão de literatura relevante existente sobre biossensores de
DNA baseados na hibridização de ácidos nucléicos.
1.6.1 Biossensores de DNA com transdução ótica
Muitos biossensores óticos de DNA utilizam uma fibra ótica para transmitir o
sinal emitido por um marcador fluorescente. Em geral, uma sonda de DNA em cadeia
simples é colocada na extremidade da fibra e, após hibridização com a cadeia
complementar, são medidas alterações na fluorescência resultantes da associação
seletiva do DNA de cadeia dupla a um marcador fluorescente. O grupo de Piunno
(Piunno et al., 1994; Piunno et al., 1995) utilizou brometo de etídeo, que se intercala
fortemente entre as bases de DNA de cadeia dupla e nos sulcos maiores da dupla hélice,
como indicador de fluorescência; a intensidade de fluorescência, medida pela reflexão
interna total na fibra ótica revestida pela sonda de DNA, é diretamente proporcional à
quantidade de brometo de etídeo intercalado no DNA. O biossensor manteve-se ativo
mesmo após armazenamento prolongado e lavagens agressivas. Com outros indicadores
fluorescentes (ex.: PicoGreen), obtiveram-se limites de detecção muito baixos, na
ordem de femtomolar. A sensibilidade conseguida com brometo de etídeo, contudo, não
é muito alta em comparação com a obtida por PCR ou em ensaios convencionais de
hibridização de ácidos nucléicos, além de o seu potencial cancerígeno ser muito
elevado. Estes fatos têm motivado a procura de substitutos do brometo de etídeo (Junhui
et al., 1997). Fergusson e colaboradores (Fergusson et al., 1996) desenvolveram um
biossensor de fibra ótica em array para detecção simultânea de múltiplas seqüências de
47
DNA por meio de oligonucleotídeos complementares ligados a um marcador
fluorescente, registrando o aumento da fluorescência após a hibridização. Outra forma
de detectar a hibridização de DNA por fluorimetria baseia-se na utilização de grampos
de DNA - oligonucleotídeos de cadeia simples em forma de grampo de cabelo, com as
extremidades próximas uma da outra e formando uma alça no meio (stem-and-loop);
uma das extremidades é marcada com um fluoróforo e a outra com um extintor de
fluorescência (quencher). Quando as duas extremidades se linearizam e portanto se
afastam após hibridização com uma cadeia complementar, o sistema passa a emitir
fluorescência (Fang et al., 1999). Com estas sondas de grampos de DNA conseguem-se
elevadas especificidade e sensibilidade, sendo possível distinguir diferenças de um
único nucleotídeo entre duas cadeias-alvo diferentes, na gama de picomolar (Liu et al.,
2000). Num outro trabalho (Steemers et al., 2000), microesferas revestidas com uma
sonda de DNA ligam-se individualmente a pontas de um feixe de fibras óticas
(microarray ótico) e são depois identificadas usando combinações de marcadores
fluorescentes. Biossensores semelhantes conseguem atingir limites de detecção na
ordem de zeptomolar. Segundo um outro tipo de transdução ótica, usando um espelho
de ressonância de ondas evanescentes (Watts et al., 1995), sondas de DNA biotiniladas
foram imobilizadas na superfície de um transdutor por meio de estreptavidina, e a
hibridização da seqüência complementar monitorada em tempo real; a detecção baseou-
se na variação de uma propriedade ótica – índice de refração interfacial (e
conseqüentemente do ângulo de ressonância) – após a hibridização. Esta técnica
também permitiu detectar uma concentração de oligonucleotídeo na ordem de
nanomolar (Junhui et al., 1997). Biossensores deste tipo também têm sido utilizados
com o objetivo de detectar mutações genéticas humanas (Feriotto et al., 2001) e
produtos de PCR de organismos modificados geneticamente, na ordem de nanomolar
(Feriotto et al., 2002; Mariotti et al., 2002).
De entre os sistemas comercialmente disponíveis baseados na técnica de SPR, o
mais usado é o biossensor BIAcore, da Pharmacia Biosensor AB, para análise de
eventos biológicos em tempo real e em fluxo contínuo (Diamond, 1998). Este modelo
foi aplicado em detecção de DNA (Wood, 1993) por imobilização de uma sonda
biotinilada num chip previamente revestido com avidina. Num sistema de fluxo
contínuo sobre o chip (superfície do biossensor), inicialmente a sonda foi imobilizada
por complexação avidina-biotina e, depois, o alvo foi hibridizado. Além da alta
especificidade, este sistema permite que a hibridização ocorra em menos de 10 minutos
48
à temperatura ambiente (Diamond, 1998; Junhui et al., 1997). A técnica de SPR serviu
ainda de base para a otimização, em tempo real, de um sensor de DNA imobilizado
numa superfície de ouro previamente funcionalizada com polipirrol (Guedon et al.,
2000). Neste trabalho, visando a fabricação futura de chips de DNA, detectaram-se
simultaneamente vários eventos de hibridização através da técnica de electrospotting,
dispensando o uso de reagentes tiolados e de várias etapas para imobilização.
Recentemente, polímeros condutores têm sido cada vez mais usados para aplicação em
biossensores, por possuírem propriedades eletrônicas vantajosas, incluindo alta
afinidade eletrônica (figura 22).
Figura 22 - Mecanismo de transferência eletrônica em biossensores baseados em
polímeros condutores (retirado de Gerard et al., 2002).
Algumas técnicas, incluindo espectroscopia de fotocorrente e QCM, foram
usadas para seguir, em tempo real, os processos de adsorção e hibridização de DNA
sobre eletrodos modificados com polipirrol (Lassalle et al., 2001a). O polímero de
polipirrol foi também utilizado na construção de um biossensor de DNA adaptável à
imobilização de diferentes biomoléculas (Dupont-Filliard et al., 2001). Com base na
grande afinidade da ligação avidina / biotina, monômeros pirrólicos biotinilados foram
eletropolimerizados na superfície de uma QCM. Após ligação da avidina, um
oligonucleotídeo biotinilado liga-se a esta (que tem capacidade de se ligar
simultaneamente a quatro moléculas de biotina), ficando assim imobilizado. Finalmente,
a cadeia-alvo hibridiza com a anterior e, ligada na outra extremidade a um marcador
fluorescente, é detectada por fluorescência. A versatilidade desta técnica e a capacidade
de reutilização do sensor ficam demonstradas após lavagem, a qual regenera a superfície
sem alterar a matriz polimérica do polipirrol imobilizado. Bidan e colaboradores (Bidan
et al., 2000) usaram um processo de eletrocopolimerização para imobilizar nucleotídeos
49
em superfícies transdutoras. Por esta técnica, uma mistura de pirrol com um
oligonucleotídeo covalentemente ligado a um pirrol é electrooxidada, resultando em
imobilização irreversível das unidades oligonucleotídicas num copolímero polipirrólico.
O processo foi aplicado, juntamente com QCM, à detecção do vírus da hepatite C em
amostras sanguíneas, e à preparação de camadas polipirrólicas funcionalizadas com
biotina, usando microeletrodos de ouro em série (array) num chip de silício. O uso de
suportes poliméricos em genossensores, em virtude da sua versatilidade físico-química,
visa superar as tradicionais limitações de detecção de DNA em superfícies metálicas e
de vidro, nomeadamente, no caso do vidro, a baixa densidade superficial dos grupos
funcionais silânicos, que limita a concentração superficial de oligonucleotídeos
imobilizados. Outra vantagem é o seu baixo custo comparativamente ao vidro ou ao
ouro. A imobilização de oligonucleotídeos deve maximizar a sensibilidade, a
capacidade de imobilização (relacionada com a densidade de ligações), a estabilidade da
ligação ao suporte e a acessibilidade das moléculas interatuantes, assim como minimizar
ligações não específicas (Preininger & Chiarelli, 2001). Neste âmbito, superfícies
hidrofílicas são particularmente favoráveis à hibridização de ácidos nucléicos, pois
facilitam a exposição das bases hibridizantes (Chan et al., 1998; Chen et al., 2002).
Apesar disso, como mostra um trabalho (Delair et al., 1999) sobre imobilização de
DNA em superfícies de látex hidrofóbico (poliestireno) e hidrofílico (poli(N-
isopropilacrilamida)), o aumento da força iônica do meio reduz a adsorção de DNA à
superfície hidrofílica mais drasticamente do que à superfície hidrofóbica. Estudos de
imobilização de albumina humana carregada negativamente em superfícies de látex
aniônico demonstraram, porém, que é possível ligar as duas superfícies criando uma
barreira de potencial positivo entre elas, formada pelos cátions do eletrólito salino
(Gingeras et al., 1987). No entanto, como mostram estudos de imobilização covalente
de oligonucleotídeos modificados com grupos dissulfito em superfícies de vidro
modificadas com mercaptosilano, altamente hidrofóbico, a hidrofobicidade do filme
silânico confina num pequeno volume as alíquotas de solução aquosa do
oligonucleotídeo depositadas sobre ele, por via da tensão superficial, e assim previne a
eventual mistura e contaminação cruzada numa hipotética configuração de microarray
(Rogers et al., 1999). As características de ligação também podem variar
consideravelmente dependendo do grupo funcional; como exemplo, a imobilização de
DNA sobre grupos -COOH, apesar do alto rendimento de reação, é geralmente preterida
em relação à imobilização sobre grupos –NH2 porque a repulsão eletrostática negativa
50
com as moléculas de DNA gera uma baixa concentração destas junto à superfície do
eletrodo (Ivanova et al., 2004). Em geral, têm sido utilizados, em genossensores,
polímeros condutores catiônicos cuja resposta eletroquímica (corrente) diminui após a
hibridização do DNA, presumivelmente devido ao impedimento da troca aniônica ou à
reorganização do polímero (Cha et al., 2003). No entanto, Reisberg e colaboradores
relataram (Reisberg et al., 2005) a detecção de oligonucleotídeos, por voltametria de
pulso diferencial com um eletrodo de carbono vítreo, usando um polímero sintético com
um grupo quinona, trocador de cátions; a possibilidade de imobilização de DNA
(carregado negativamente) neste polímero aniônico foi atribuída à formação, em torno
das sondas de DNA, de um ‘escudo’ eletricamente positivo de cátions da solução. Com
este sensor, obteve-se um aumento da resposta após a hibridização, com óbvia
possibilidade de aumento da sensibilidade de detecção usando polímeros condutores. A
introdução de grupos amina tem sido, no entanto, a estratégia mais usada para
funcionalizar superfícies sólidas com biomoléculas. Esta abordagem pode ser usada
para imobilizar oligonucleotídeos covalentemente em superfícies de silício, uma
alternativa à imobilização direta sobre silício oxidado que, sendo quimicamente
semelhante ao vidro, apresenta iguais desvantagens, principalmente heterogeneidade e
irreprodutibilidade da superfície formada (Strother et al., 2000). Noutro dos muitos
trabalhos existentes sobre ligação de DNA a grupos –NH2, a imobilização de
oligonucleotídeos foi feita usando microesferas de nylon como suporte sólido,
revestidas com polietilenimina (Ness et al., 1991). Alguns trabalhos documentam o uso
concomitante de vários polímeros segundo diferentes estratégias de imobilização,
nomeadamente um gel polimérico composto por polivinil-álcool com ligação cruzada a
cloreto de polialilamina (Preininger & Chiarelli, 2001) e um complexo oligonucleotídeo
/ poli(L-lisina) em superfícies sólidas modificadas com derivados de poliestireno
(Ivanova et al., 2004). Todos estes trabalhos argumentam a obtenção de maiores
eficiências de imobilização e de hibridização dos ácidos nucléicos quando se usam
matrizes poliméricas para adsorver ou ligar covalentemente cadeias de DNA. A
adsorção é muitas vezes preferida à ligação covalente como via de imobilização de
DNA porque as superfícies de determinados transdutores podem conter grupos capazes
de reagir e fragmentar o DNA quando se ligam a ele, alterando a sua estrutura original
(Sukhorukov et al., 1996). A funcionalização de superfícies de transdutores físicos com
moléculas orgânicas contendo grupos funcionais específicos pode ser também
implementada pela técnica de SAM, que resulta basicamente de imergir a superfície do
51
transdutor numa solução diluída (~ 1 mM) de uma substância anfipática a adsorver, à
temperatura ambiente, durante um período de tempo relativamente curto. Este
procedimento gera espontaneamente superfícies muito finas, com quantidades muito
baixas da molécula adsorvida, formando uma única camada altamente ordenada e
compacta, semelhante ao micro-ambiente de uma célula viva. A monocamada adsorve
fortemente à superfície sólida e é termodinamicamente muito estável. A grande
flexibilidade para várias aplicações deve-se à possibilidade de controlar tanto a
funcionalidade (grau de hidrofilicidade) como o comprimento da cadeia (isto é, a
distância), do que depende o desempenho do biossensor, independentemente da
estratégia de imobilização ou do processo de transdução (Chaki & Vijayamohanan,
2002). O caso certamente mais estudado e descrito é de SAMs de alcanotióis
covalentemente ligados a superfícies de ouro (figura 23).
Figura 23 - Esquema de uma SAM de alcanotióis (cadeias em V) numa superfície de
ouro. Esferas escuras: átomos de ouro. Esferas claras: átomos de enxofre (retirado de
Freire et al., 2003).
Aminoalcanotióis bifuncionais permitem ligar, à superfície sólida, moléculas
lineares de DNA. A sensibilidade aumenta quando a cadeia-sonda é imobilizada
perpendicularmente à superfície (Hianik et al., 2001). Chrisey e colaboradores (Chrisey
et al., 1996) imobilizaram oligômeros de DNA modificados com grupos tiólicos numa
das suas extremidades em superfícies previamente tratadas com uma monocamada de
aminosilano. Por outro lado, Zhao e colaboradores (Zhao et al., 1999), através de
medições eletroquímicas e de espectrometria de raios-X, relataram maior eficiência de
imobilização de DNA de cadeia dupla em eletrodos de ouro modificados com SAMs
52
contendo grupos terminais hidroxila do que SAMs com grupos terminais amina ou
carboxila. O grande interesse das técnicas de ondas evanescentes para aplicação em
biossensores advém da desnecessidade de marcação da cadeia-alvo, da rapidez da
reação de hibridização (em poucos minutos) e possibilidade de reutilização da sonda
imobilizada acima de 100 vezes. Uma desvantagem significativa é a sua relativa baixa
sensibilidade, requerendo nanogramas ou até microgramas de DNA em 100 μl de
solução (Vercoutere & Akeson, 2002). A detecção ótica pode ser efetuada por outros
processos de marcação do DNA além da fluorescência. Nanopartículas de ouro
funcionalizadas, por exemplo, têm mostrado maior estabilidade e sinal menos
susceptível a perturbações externas do que a detecção por marcadores de fluorescência
(Fritzsche, 2001). Foi relatado o aumento de sensibilidade da detecção de DNA por
QCM quando se formam filmes de partículas coloidais de ouro sobre eletrodos de ouro
(Lin et al., 2000).
Em geral, os biossensores óticos, especialmente os baseados em fibras óticas,
são adequados para miniaturação, atendendo ao muito pequeno diâmetro das fibras. Ao
transmitirem luz por longas distâncias sem perda de sinal, elas permitem detecção
remota em amostras inacessíveis ou perigosas. A natureza ótica do sinal ainda evita a
interferência dos sinais elétricos e, sendo inofensiva, é recomendável para aplicações in
vivo. Porém, estes sensores apresentam as desvantagens de baixa estabilidade, possível
interferência de luz ambiente e alto custo das fibras óticas de quartzo para transmissão
de luz ultravioleta.
1.6.2 Biossensores de DNA com transdução piezelétrica
Uma seqüência de DNA com algumas centenas de pares de bases normalmente
tem massa molecular suficientemente alta para que o aumento de massa associado à sua
hibridização com uma cadeia complementar possa ser detectado especificamente por um
sensor piezelétrico sobre o qual a primeira cadeia está imobilizada (Junhui et al., 1997).
O grupo de Campbell (Campbell et al., 1993) utilizou o princípio da microbalança de
quartzo para detectar a mudança de massa induzida por hibridização de uma cadeia de
DNA covalentemente imobilizada sobre um cristal piezelétrico modificado com um
polímero. O aumento de massa resultante foi na ordem de 102 Hz relativamente a
cristais-controle aos quais se ligaram alvos não complementares. Noutro trabalho
53
(Lassalle et al., 2001b), a hibridização de DNA sobre uma matriz polipirrólica foi
detectada por QCM e espectroscopia de fotocorrente, com resultados semelhantes. Foi
desenvolvido também um sensor microgravimétrico bastante sensível para diagnóstico
da doença genética de Tay-Sachs (Bardea et al., 1998). Vários estudos (Caruso et al.,
1997; Zhou et al., 2001) relataram aumento da eficiência de hibridização e da
sensibilidade da QCM após imobilização de multicamadas de DNA marcado com
biotina em superfícies de ouro modificadas. A detecção da variação de massa num
cristal piezelétrico foi ainda usada segundo o princípio de SAW para detectar a
hibridização interfacial de DNA em eletrodos de paládio; o incremento na massa foi
correlacionado com as variações da freqüência de ressonância em tempo real (Su &
Thompson, 1995; Su et al., 1993). A mesma técnica foi aplicada no monitoramento da
ligação de drogas anticancerígenas ao DNA, atingindo-se um limite de detecção para as
drogas em torno de 10-7 M (Su et al., 1995). Zhang e colaboradores (Zhang et al., 1998),
usando o princípio de ondas acústicas internas (BAW), construíram um biossensor para
detecção on-line de DNA danificado por luz ultravioleta, baseando-se na diminuição de
massa após fragmentação da molécula induzida pela irradiação. Parâmetros interfaciais
como a viscosidade à superfície, a energia livre e a morfologia podem influenciar a
resposta do sensor (isto é, a freqüência de ressonância), normalmente reduzindo a
sensibilidade (Junhui et al., 1997). Em alguns trabalhos (Okahata et al., 1992; Su &
Thompson, 1995), a variação da freqüência de ressonância foi relacionada com o
processo de hibridização através da variação de viscosidade dependente da concentração
de DNA. Este tipo de biossensores de DNA pode distinguir diferenças num único
nucleotídeo (Furtado & Thompson, 1998). Uma inovação interessante para aumentar a
sensibilidade e a linearidade de biossensores de DNA com detecção por QCM é a
utilização de dendrímeros de ácidos nucléicos - um tipo de estruturas macromoleculares
ramificadas - como sondas para genossensores (figura 24).
54
Figura 24 - Processo de detecção de hibridização usando dendrímeros de ácidos
nucléicos imobilizados (retirado de Wang & Jiang, 1998).
Por possuírem muitas cadeias simples de DNA, estas estruturas esféricas, ao
serem imobilizadas diretamente sobre um transdutor físico, aumentam grandemente a
capacidade de hibridização e, em conseqüência, geram uma resposta significativamente
amplificada (Wang & Jiang, 1998; Wang, 2000). A utilização de PNAs – moléculas
semelhantes a ácidos nucléicos, em que o esqueleto açúcar-fosfato é substituído por
uma estrutura peptídica (figura 25) – como elementos de reconhecimento diretamente
imobilizados na superfície de um transdutor físico trouxe a possibilidade de selecionar
novas condições experimentais e de aumentar, em associação com QCM ou outros tipos
de transdutor, a capacidade discriminatória entre seqüências de DNA diferindo entre si
em apenas um par de bases (Wang et al., 1997b; Wang, 2000).
55
Figura 25 - Estruturas químicas de um PNA e de um DNA homólogos (retirado de
www.dkfz-heidelberg.de).
Num trabalho recente (Le-Floch et al., 2005), foi desenvolvido um esquema de
detecção eletroquímica usando uma sonda de PNA neutra e politiofeno, um polímero
eletroativo catiônico e, portanto, solúvel em água, o que evita as fortes interferências
elétricas causadas pelos habituais polímeros hidrofóbicos em contato permanente com
os elétrodos. Sendo neutra, a sonda de PNA só se liga ao politiofeno quando ocorre a
hibridização com a seqüência-alvo complementar de DNA carregada negativamente,
devido à atração eletrostática entre o politiofeno e o alvo. Além disso, também se
registrou um acréscimo de sensibilidade pelo fato de o sinal de resposta aumentar) em
vez de diminuir) após o evento de hibridização.
1.6.3 Biossensores de DNA com transdução eletroquímica
Em biossensores eletroquímicos de DNA, uma sonda de DNA unifilamentar é
imobilizada numa superfície eletricamente ativa (eletrodo), sendo medidas variações em
parâmetros eletroquímicos (exs.: corrente, potencial, condutividade, capacitância)
decorrentes da hibridização com uma cadeia-alvo. O uso de eletrodos sólidos aumentou
56
significativamente a aplicabilidade dos métodos eletroquímicos para análise de ácidos
nucléicos (La-Scalea et al., 1999). Relativamente a outras formas de transdução, os
biossensores eletroquímicos permitem detecção simples, rápida e barata, além de serem
passíveis de miniaturação e fabricação em massa (Kerman et al., 2004a). A intrínseca
potencialidade de miniaturação, a compatibilidade com técnicas de microfabricação, a
baixa exigência energética e o caráter tendencialmente portátil tornam os biossensores
eletroquímicos especialmente aptos para aplicação em diagnóstico de DNA (Wang et
al., 2000; Wang et al., 2002). Até que a fabricação de biossensores de DNA
descartáveis se torne mais efetiva e barata, a viabilidade dos biossensores atuais
depende grandemente da capacidade de regeneração contínua das suas superfícies para
múltiplas utilizações, com reprodutibilidade na detecção. Para isso, uma grande
inovação veio da utilização de compósitos (pastas) de carbono que, por terem
substituído os antigos eletrodos de mercúrio, incrementaram o desenvolvimento de
novas técnicas voltamétricas e potenciométricas altamente sensíveis para detecção de
DNA, assim como de processos de modificação de eletrodos com DNA e de
biossensores de DNA (Compton, 1999). A rigidez moderada da grafite permite um
polimento fácil e suave (figura 26), além de o DNA poder ser imobilizado por simples
adsorção à superfície, ou até incorporado na pasta.
57
Figura 26 - Etapas de manufatura de um eletrodo de pasta de carbono (retirado de
www.epsilon-web.net).
Os compósitos de carbono também são caracterizados por rápido transporte de
carga e grande área superficial (Diamond, 1998). A agregação das partículas condutoras
de grafite é geralmente conferida por substâncias adesivas por simples mistura manual;
entre estas incluem-se o óleo mineral (Wang et al., 1998a) e resinas epóxi (Pividori et
al, 2003). A utilização destas últimas permite minimizar a adsorção não específica de
DNA à superfície do eletrodo, mesmo sem tratamento com agentes de bloqueio.
Adicionalmente, a alta porosidade dos compósitos de grafite / epóxi e o seu
comportamento funcionalmente semelhante a um array de microeletrodos explicam a
sua elevada sensibilidade, inclusive quando comparada à das clássicas membranas de
nylon, usadas em ensaios genéticos, que atuam como barreiras difusionais para as
espécies eletroativas (Alegret, 1996; Pividori et al., 2003). Dutra e colaboradores (Dutra
et al., 2000), do nosso laboratório, relataram o desenvolvimento de um biossensor
amperométrico para detecção de IgG humana utilizando um eletrodo reutilizável de
58
grafite / epóxi em associação com partículas de prata dispersa e TCNQ como mediador
de transferência eletrônica. Este sistema permitiu reduzir drasticamente o potencial de
trabalho e atingir maior seletividade do que quando simples biocompósitos de grafite /
epóxi são usados. O grupo de Erdem (Erdem et al., 2004) utilizou, mais recentemente,
um novo compósito rígido de carbono como material de transdução para detecção, por
voltametria de pulso diferencial, de hibridização de DNA, com 15 minutos de tempo de
hibridização e 10 mg/ml de DNA-alvo. Os potenciais de oxidação dos resíduos de
guanina e adenina do DNA assim obtidos foram, respectivamente, +0.55 V e +0.85 V,
bastante inferiores aos obtidos em trabalhos anteriores com compósitos de grafite /
epóxi. Este novo compósito permite imobilizar facilmente e rapidamente, por simples
adsorção-úmida, tanto DNA genômico como oligonucleotídeos, uma alternativa
vantajosa em relação aos protocolos habituais para adsorção química ou eletroquímica.
Uma inovação também recente consistiu na utilização de uma grafite expandida como
material de suporte do eletrodo de um biossensor enzimático (Calas-Blanchard et al.,
2003). Esta forma de grafite pode ser facilmente comprimida e agregada sem auxílio de
uma substância adesiva, pelo que apresenta características de condutividade eletrônica e
de área superficial eletroquímica mais favoráveis do que as pastas de carbono. No
entanto, a reprodutibilidade necessita ser melhorada, talvez minimizando e
uniformizando o nível de impurezas entre diferentes lotes de grafite, removendo-as
parcialmente por tratamento eletroquímico. Também os ácidos nucléicos peptídicos (já
mencionados acima) têm incrementado a sensibilidade e a seletividade da detecção
eletroquímica de DNA, além de outras vantagens que incluem alta rapidez e eficiência
de hibridização, baixa dependência da força iônica e maior estabilidade térmica, tanto
em solução como na interface de um sensor (Wang et al., 1996f). A maior
especificidade dos ácidos nucléicos peptídicos em relação aos seus análogos de DNA
permite usar sondas de menor comprimento, vantagem aproveitada pelo grupo de Wang
para detectar potenciometricamente seqüências de 10 a 15 pb em eletrodos de pastas de
carbono (Wang et al., 1996f; Wang et al., 1997c). A imobilização de DNA em eletrodos
modificados com SAMs oferece um possível ganho em sensibilidade e especificidade
em relação a outros métodos de imobilização, pois evita alterações conformacionais
capazes de afetar a atividade do biocomponente ativo imobilizado; desta forma se
assegura maior homogeneidade e reprodutibilidade da superfície do eletrodo. Além
disso, a escala molecular da dimensão da monocamada permite difusão rápida das
espécies eletroativas até à superfície do eletrodo em comparação com a cinética
59
observada em eletrodos modificados com filmes poliméricos finos ou compósitos. As
SAMs também reduzem drasticamente as correntes residuais capacitivas (não
faradaicas), assim como a passivação dos eletrodos, devida à acumulação de substâncias
indesejadas (Freire et al., 2003). Contudo, a aplicabilidade das monocamadas ainda é
limitada devido a problemas de estabilidade das mesmas e à dificuldade da sua
formação. A técnica sonoeletroquímica – combinação de detecção eletroquímica com
irradiação ultrasônica -, além de também reduzir a passivação em eletrodos de carbono,
aumenta drasticamente o transporte de massa, permitindo controlar a extensão da
adsorção de espécies relevantes (Brett & Matysik, 1997; Hagan & Coury, 1994; Zhang
& Coury, 1993).
Um dos métodos tradicionalmente usados para gerar sinais elétricos que
detectem a hibridização de DNA é o emprego de marcadores enzimáticos, tal como
acontece em imunossensores. A enzima, previamente ligada à sonda unifilamentar de
DNA, acopla-se à superfície do eletrodo por via da hibridização específica com a cadeia
complementar e, aí, gera uma alteração eletroquímica diretamente resultante da catálise
de uma reação redox. O grupo de Lumley (Lumley et al., 1996), trabalhando com um
transdutor de fibras de carbono, monitorou o evento de hibridização sobre um condutor
redox polimérico, em conexão com uma cadeia-alvo de DNA marcada com peroxidase
de rábano; foi medida a corrente de eletrorredução do peróxido de hidrogênio por
amperometria, tendo sido detectadas diferenças de um único nucleotídeo. A marcação
de DNA com peroxidase de rábano também foi usada (Patolsky et al., 1999) para seguir
a acumulação, na superfície do eletrodo, do produto fenólico da reação enzimática. A
detecção foi realizada por cronopotenciometria e por impedimetria, atingindo-se limites
de detecção muito baixos após múltiplas amplificações da resposta. Lipossomos
marcados com peroxidase também foram usados para amplificar a resposta ao evento de
hibridização por impedimetria (Alfonta et al., 2001) ou, por técnicas de pulso, para
detectar produtos de PCR (Wojcienchowski et al., 1999) e seqüências relacionadas com
o citomegalovírus humano (Azek et al., 2000). Atualmente, os métodos de detecção de
DNA baseados em marcadores enzimáticos conseguem discriminar diferenças de um
único nucleotídeo entre duas seqüências na gama de picomolar (Patolsky et al., 2001;
Campbell et al., 2002). Uma interessante aplicação da marcação enzimática em
genossensores veio do grupo de Pividori (Pividori et al., 2001), que utilizou peroxidase
para detectar um oligonucleotídeo produtor de β-lactamase em Staphylococcus aureus.
Este genossensor foi adaptado do formato clássico de hibridização por dot-blot, mas
60
com a configuração de um biossensor amperométrico, utilizando um eletrodo de grafite
/ epoxi com uma membrana de nylon. Para a hibridização, utilizaram-se duas sondas
biotiniladas (nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente) em vez de apenas uma, o que,
combinado a prévia amplificação por PCR do oligonucleotídeo extraído de células
bacterianas, permite atingir a sensibilidade necessária (~ 105 – 106 bactérias) à obtenção
de um sinal positivo. Com este procedimento, o tempo habitualmente necessário – 4 a 5
dias – para efetuar o diagnóstico microbiológico pelos testes de susceptibilidade
bacteriana pode ser reduzido para cerca de 36h, incluindo o tempo requerido para a PCR
(Pividori et al., 2001). Geralmente, as enzimas marcadoras são conjugadas com uma
única molécula de DNA (Bakker & Qin, 2006), mas recentemente foi descrita uma
configuração utilizando glucose oxidase conjugada com várias seqüências
oligonucleotídicas, por ligação dos resíduos glicosídicos oxidados da enzima com as
extremidades 5’ de oligonucleotídeos aminados (Dominguez et al., 2004). Deste modo,
vários eventos de hibridização sucessivos resultaram numa grande amplificação do sinal
e, portanto, num grande aumento da sensibilidade da detecção.
As primeiras configurações para detecção de hibridização de DNA utilizavam
substâncias eletroativas como indicadores de hibridização, de acordo com o princípio
descrito nas figuras 27A, B e C2.
Figura 27 - Princípio de detecção eletroquímica de hibridização de DNA em eletrodos
de carbono. (A) A sonda de DNA é adsorvida na superfície do eletrodo por aplicação de
um potencial positivo. (B) Hibridização da sonda com o alvo complementar. (C1)
Transdução usando o sinal de eletrooxidação dos resíduos de guanina. (C2) Transdução
usando o sinal de eletrorredução de um indicador redox pré-concentrado na superfície
do eletrodo (retirado de Pividori et al., 2000).
61
Estas substâncias geralmente ligam-se com muito maior afinidade a uma cadeia
dupla de DNA do que a uma cadeia simples e, conseqüentemente, a sua concentração
junto à superfície de um eletrodo aumenta após a ocorrência de hibridização, assim
como a resposta eletroquímica – o pico da banda correspondente à reação redox. Os
indicadores geralmente interatuam com o esqueleto de açúcar / fosfato de uma cadeia
dupla de DNA por atração eletrostática ou, interagindo hidrofobicamente dentro da
dupla hélice, por ligação aos sulcos maiores ou intercalação entre nucleotídeos
adjacentes. Além da discriminação entre ssDNA e dsDNA, um indicador eletroativo
deve possuir um potencial redox baixo e bem definido (Wang, 2002). Os indicadores
eletroquímicos geralmente mais usados para detecção e quantificação de DNA incluem
o Hoechst 33258, corantes heterocíclicos (exs.: brometo de etídeo e azul de metileno),
drogas anticancerígenas (ex.: daunomicina) e complexos organometálicos,
principalmente de Co, Fe, Os, Pt e Ru. Na maior parte dos casos, estes compostos
ligam-se reversivelmente ao DNA por intercalação, com os seus grupos aromáticos
planares encaixados entre nucleotídeos adjacentes. Uma exceção relevante é o Tris(2,2’-
bipiridil) rutênio(II), que se liga ao DNA por atração eletrostática (Pyle et al., 1989).
Como exemplo, os metalointercaladores redox Co(bpy)33+ (bpy = 2,2’-bipiridina) e
Co(phen)33+ (phen = 1,10-fenantrolina) foram usados (Millan & Mikkelsen, 1993) para
detectar, por voltametria cíclica, um oligonucleotídeo(dT) alongado com resíduos dG,
imobilizado num eletrodo de carbono vítreo por ligação covalente, com N-
hidroxisuccinimida e uma carbodiimida como reagentes de ligação. O mesmo
procedimento foi empregue (Millan et al., 1994) sobre um eletrodo de pasta de carbono
modificado com octadecilamina ou ácido esteárico, cujos grupos funcionais permitiram
a imobilização covalente de um polinucleotídeo alongado com resíduos de dG para
construção de um biossensor para a fibrose cística, usando Co(bpy)33+, Co(phen)3
3+ e
Os(bpy)33+ como indicadores de hibridização. Noutro trabalho (Liu et al., 1996), o
brometo de etídeo foi escolhido para detectar um oligonucleotídeo covalentemente
imobilizado num eletrodo de grafite quimicamente modificado com uma amina
primária. Erdem e colaboradores (Erdem et al., 1999) relataram a detecção específica de
pequenos oligonucleotídeos relacionados com o vírus da hepatite B após adsorção
eletroquímica num eletrodo de pasta de carbono polarizado positivamente (pré-tratado)
para aumentar a afinidade ao DNA aniônico, a mesma estratégia de imobilização usada
anteriormente por Wang e colaboradores (Wang et al., 1996b), trabalhando com
62
eletrodos de carbono em pasta e screen-printed para detectar pequenas seqüências de
DNA relacionadas com o HIV, por cronopotenciometria, usando Co(phen)33+ como
indicador. Alguns trabalhos com eletrodos de ouro incluem adsorção física (Zhao et al.,
1997) e química (Hashimoto et al., 1994b) de DNA e detecção eletroquímica da
hibridização com, respectivamente, Co(bpy)33+ e Hoechst 33258, e imobilização
covalente pela técnica de SAM, seguida de detecção com azul de metileno (Kerman et
al., 2002) e daunomicina (Hashimoto et al., 1994a). Alguns trabalhos interessantes
foram realizados pelo grupo de Xu, para detecção voltamétrica específica de DNA com
eletrodos de grafite (Xu et al., 2000), platina (Xu et al., 2001b) e carbono vítreo (Xu et
al., 2001a). Foi realizada acumulação eletroquímica de DNA num eletrodo pré-tratado,
assim como imobilização sobre um filme de quitosana revestindo o eletrodo. O
polímero natural e catiônico de quitosana (figura 28) forma complexos estáveis com os
grupos fosfato das cadeias polianiônicas de DNA, quer nativas, quer desnaturadas,
resultando numa imobilização altamente estável (Hayatsu et al., 1997). A técnica é
também potencialmente mais simples e barata do que as que usam ligação covalente
(Xu et al., 2001a).
Figura 28 - Estrutura da quitosana (retirado de www.ualberta.ca).
Nos três trabalhos, o grupo de Xu usou ferrocenocarboxaldeído e
aminoferroceno como indicadores de hibridização. Estes compostos, ao contrário dos
intercaladores, ligam-se covalentemente às sondas de DNA. Ju e colaboradores (Ju et
al., 2004), por outro lado, usaram ferroceno (na forma monocatiônica) como indicador
para detectar DNA de levedura com ligação covalente a um eletrodo de ouro
funcionalizado com uma SAM. O ferroceno liga-se aos sulcos maiores do dsDNA
63
imobilizado (figura 29), embora também se possa ligar eletrostaticamente (Ju et al.,
2004).
Figura 29 - Ligação do ferroceno (em cima, à direita) a um sulco maior do dsDNA
(retirado de rincewind.usask.ca).
Na senda da procura de novos indicadores redox que discriminem mais
eficazmente um ssDNA de um dsDNA, foi utilizado (Takenaka et al., 2000)
ferrocenilnaftaleno diimida, um intercalador que se liga mais fortemente a um dsDNA
do que os intercaladores usuais e tem afinidade desprezível para o ssDNA. A
sensibilidade da detecção de DNA por este meio atingiu 10 zmol, diminuindo a
quantidade de sonda imobilizada e protegendo a superfície a descoberto com 2-
mercaptoetanol. A utilização de indicadores de hibridização que não se liguem
covalentemente ao DNA possibilita evitar o custo elevado, a morosidade e a maior
complexidade dos procedimentos de síntese, ligação à sonda de DNA (marcação) e
separação do produto.
Mais recentemente, têm-se desenvolvido esquemas de detecção eletroquímica de
hibridização de DNA sem utilização de indicadores (método direto). Eles baseiam-se
em mudanças na eletroatividade intrínseca do DNA, decorrentes do evento de
hibridização. As suas principais vantagens são a simplificação e maior rapidez dos
procedimentos experimentais, pois assim se eliminam as etapas de adição e associação
do indicador, e se evita o inconveniente da perda de sinal pelo fato de o indicador se
desligar gradualmente do dsDNA imobilizado. A maioria dos protocolos para detecção
64
direta de DNA baseia-se na eletroatividade intrínseca das suas bases, os únicos
componentes que sofrem processos redox em eletrodos de mercúrio e de carbono.
Concretamente, são os resíduos de adenina e guanina que sofrem oxidação em eletrodos
de carbono (figuras 27A, B e C1) e, adicionalmente à citosina, redução em eletrodos de
mercúrio a potenciais muito negativos (Paleček, 1996). Em eletrodos de carbono e em
meio ácido, resíduos livres de guanina e adenina geram picos de oxidação bem
definidos a potenciais em torno de, respectivamente, 0.85 V e 1.15 V (Brabec, 1980;
Compton, 1999), em contraste com a má definição dos picos correspondentes numa
cadeia polinucleotídica (Paleček, 1996). A discriminação entre ssDNA e dsDNA
caracteriza-se por um menor pico de corrente de oxidação do dsDNA relativamente ao
do ssDNA, não só devido a os locais de oxidação do dsDNA estarem protegidos por
participarem nas ligações de hidrogênio da dupla hélice, como também à maior rigidez
estrutural de uma dupla hélice, que se liga com dificuldade aos contornos sinuosos da
superfície de um eletrodo (Compton, 1999; La-Scalea et al., 1999). O pico de oxidação
das bases purínicas também aumenta quando o peso molecular dos ácidos nucléicos
(correlacionado com o seu tamanho) diminui. Em ambos os casos, a maior proximidade
física entre os segmentos electrooxidáveis e a superfície do eletrodo facilita a
transferência de carga entre eles (Brabec, 1981; La-Scalea et al., 1999). Este tipo de
detecção, no entanto, não pode ser usado para detectar cadeias-alvo com resíduos de
guanina, pois o seu sinal eletroquímico interfere com o sinal de referência das guaninas
da cadeia-sonda imobilizada. Esta limitação é geralmente obviada pela utilização de
sondas cujos resíduos de guanina são substituídos por análogos de inosina (que também
emparelham com a citosina), sendo então o sinal de hibridização dado exclusivamente
pelo pico de oxidação das guaninas da cadeia-alvo. Ainda que a inosina tenha uma
banda de oxidação característica, ela é bem separada e distinta a banda de oxidação da
guanina (Wang et al., 1998b). A sensibilidade da detecção do duplex de DNA sem
auxílio de indicadores de hibridização pode ser incrementada pela acumulação de ácido
nucléico na superfície de um eletrodo de mercúrio e por diminuição do volume de
solução a utilizar, de acordo com a técnica de AdSV. Nesta técnica, após a pré-
concentração do analito na superfície do eletrodo por adsorção física – freqüentemente
associada a agitação da solução -, a sua detecção é feita através de técnicas
voltamétricas convencionais, sendo o analito redissolvido na solução a partir da
superfície sólida. Com os métodos de redissolução adsorptiva obtêm-se os limites de
detecção mais baixos de entre todas as técnicas voltamétricas (Skoog et al., 1998). Jelen
65
e colaboradores (Jelen et al., 2002) detectaram quantidades de DNA abaixo de 1 pg em
volumes de 3-5 μl de solução, usando eletrodos de mercúrio e de amálgama de cobre.
Nestas baixas concentrações, todavia, pode ocorrer fusão dos picos de redução dos
resíduos nucleotídicos com as bandas de descarga do eletrólito (Paleček & Postbieglová,
1986). Para resolver este problema, foi desenvolvida a técnica de AdTSV (figura 30),
segundo a qual um eletrodo de carbono ou mercúrio é inicialmente modificado por
imersão numa pequena gota de solução de DNA; após ocorrer adsorção do ssDNA e do
dsDNA – mediante, ou não, a aplicação de um potencial para polarização do eletrodo -,
este é transferido para um volume maior de solução de eletrólito sem DNA, onde é
efetuada a medição voltamétrica (Paleček et al., 1993).
Figura 30 - Esquema da técnica de AdTSV para detecção de DNA. Através da
aplicação de um potencial elétrico, o ssDNA é acumulado na superfície do elétrodo, e
este lavado com água e solução do eletrólito. Finalmente, o elétrodo modificado com
ssDNA é transferido para uma célula voltamétrica convencional, onde é feita a medição
(retirado de www.biologicalprocedures.com).
A utilização de AdTSV permite, sem necessidade de construir nenhuma célula
voltamétrica especial, detectar DNA em amostras com volumes muito pequenos, até 5-
10 μl, comparáveis aos usados em géis de eletroforese. Os sinais de ssDNA e dsDNA
sãs tão distintos como em voltametria convencional usando um eletrodo de mercúrio,
sendo suficientes quantidades de DNA inferiores a 1 ng (Paleček, 1996). A detecção de
baixas concentrações de ácidos nucléicos foi feita on-line, num sistema de
amperometria de fluxo (Wang et al., 1996e). Este método permitiu analisar volumes de
amostra de vários microlitros em sistemas de injeção de fluxo, resultando em limites de
66
detecção na ordem de picogramas. Em conjunção com um detector de pasta de carbono,
esta configuração parece atrativa para monitorar ácidos nucléicos em efluentes
cromatográficos. Uma alternativa à voltametria de redissolução é a potenciometria de
redissolução, que apresenta como vantagem o baixo sinal de fundo dos modernos
aparelhos de corrente constante, em comparação com as altas correntes de fundo dos
aparelhos voltamétricos análogos (Wang et al., 1996a). O grupo de Wang realizou
vários trabalhos respeitantes à detecção de ácidos nucléicos por potenciometria de
redissolução em eletrodos de carbono ativados por pré-tratamento eletroquímico. Nestes
trabalhos incluem-se a detecção cronopotenciométrica em eletrodos de pasta de carbono
(Wang et al., 1996c) e eletrodos microfabricados por screen-printing (Wang et al.,
1996a), ambos relatando a detecção de DNA com alta sensibilidade, na gama de
nanogramas. Também se incluem a detecção de vestígios de RNA na presença de
excesso de dsDNA, com limite de detecção de 10 pg (Wang et al., 1995), e a detecção
de DNA em eletrodos de pasta de carbono aquecidos, resultando num grande aumento
do sinal devido à etapa de acumulação, e possibilitando a utilização de volumes muito
pequenos, uma conseqüência dos movimentos de convecção térmica perto da superfície
do eletrodo (Wang et al., 2000). Parâmetros eletroquímicos relativos à interface eletrodo
/ eletrólito também têm sido objeto de estudo para detectar DNA. Os transdutores
capacitivos baseiam-se na teoria da dupla camada elétrica, segundo a qual a interface de
um transdutor eletroquímico é composta por duas fases condutoras – a superfície do
eletrodo e a solução do eletrólito; quando a interface é modificada por imobilização de
uma sonda de DNA e, depois, de uma cadeia-alvo, a espessura da camada dielétrica
aumenta após deslocamento e substituição das moléculas de água e eletrólito pelas
moléculas de DNA e, portanto, a capacitância diminui. As variações da capacitância
podem então ser monitoradas pela medição da corrente média que flui na célula
eletroquímica durante a descarga do capacitor (dupla camada elétrica). Berney e
colaboradores (Berney et al., 2000) desenvolveram um genossensor com uma sonda
imobilizada num eletrodo de silício por adsorção ou ligação covalente, obtendo um
limite de detecção de 100 pmol sem adição de mediadores para amplificar o sinal.
Noutros trabalhos, foi também documentada a detecção de pequenos oligonucleotídeos
com sondas tioladas e imobilizadas através de SAMs em eletrodos de ouro (Berggren et
al., 1999; Guiducci et al., 2002). O grupo de Cai (Cai et al., 2004) desenvolveu um
método para detecção de hibridização de DNA em eletrodos de silício, usando
espectroscopia de impedância. A detecção fundamenta-se no fato de a desorção de
67
ssDNA ser acompanhada de maiores perdas dielétricas do que a desorção de dsDNA,
devido à maior flexibilidade estrutural do primeiro (Guan et al., 2004). As medições
impedimétricas executam-se com corrente alternada em vez de corrente contínua
(direta) fluindo pela amostra, o que reduz o risco de modificação ou danificação da
biocamada (Cai et al., 2004), embora a aplicabilidade da impedimetria na construção de
biossensores esteja limitada pela sua morosidade (Guan et al., 2004). A aplicação bem
sucedida de biossensores em diagnóstico clínico requer não só a detecção como também
a quantificação de ácidos nucléicos, visto que elevados níveis destas substâncias no
organismo podem prenunciar um estado patológico. A medição da concentração de
ácido nucléico é freqüentemente efetuada pela determinação das concentrações
individuais de guanina e adenina ou pelo seu quociente no DNA. Para isso, foi proposto
(Wang et al., 2002) um método para determinar simultaneamente concentrações
individuais de guanina e adenina com um eletrodo de carbono vítreo após redissolução
adsorptiva de DNA; as duas bases produziram picos de oxidação bem definidos e
limites de detecção em torno de 4 ng/ml. A recente descoberta e utilização de MWNTs
como sensores químicos, combinando propriedades electrónicas únicas e grande área
superficial, foi aproveitada por Wu e colaboradores (Wu et al., 2003) para determinação
eletroquímica direta dos picos de oxidação da guanina e adenina num eletrodo de
carbono vítreo modificado com MWNTs. Devido à elevada capacidade adsorptiva dos
MWNTs, a efetiva acumulação de adenina e guanina aumenta significativamente as
correntes de oxidação das mesmas, permitindo a sua detecção direta (livres ou no DNA)
com alta sensibilidade, rápida resposta, grande simplicidade e reprodutibilidade
excelente. A determinação de bases nucleotídicas na presença de ácido nucléico é,
portanto, possível sem separação prévia das mesmas, em contraste com a habitual
determinação por UV, que deve ser combinada com uma técnica de separação (Paleček,
1996). Num outro trabalho (Kerman et al., 2004b), foi demonstrado que a
funcionalização lateral dos MWNTs em eletrodos de pasta de carbono, em conjugação
com a sua funcionalização nas extremidades, permite obter uma área superficial muito
maior para imobilização de DNA, tendo sido obtido um limite de detecção de 10 pg/ml,
compatível com as exigências de testes genéticos. Nos últimos anos, foi proposta a
determinação de oligonucleotídeos não marcados num eletrodo de grafite pirolítica a
baixos potenciais (Santos-Álvarez et al., 2002), uma vantagem em relação a outros
esquemas para detecção direta de ácidos nucléicos, já que os potenciais a que as bases
normalmente sofrem electrooxidação são demasiado altos e, por isso, fundem-se com as
68
correntes de descarga do eletrólito às baixas concentrações de DNA utilizadas. Neste
trabalho, os picos anódicos voltamétricos resultantes foram atribuídos à oxidação de
NADH (adicionado) pelos produtos de oxidação das unidades adenínicas do
oligonucleotídeo, fortemente adsorvidos na superfície do eletrodo. O procedimento
exibiu sensibilidade acrescida quando foram usados oligonucleotídeos ricos em resíduos
de adenina. Ao contrário dos métodos atrás descritos, o DNA também pode ser
determinado diretamente pela eletrooxidação dos seus resíduos de açúcar em eletrodos
de cobre (Singhal & Kuhr, 1997). O princípio de detecção é baseado no fato de o pico
de oxidação do dsDNA ser maior do que o do ssDNA, devido ao maior número de
resíduos de açúcar acessíveis no lado externo da dupla hélice do que na cadeia simples.
A sensibilidade da detecção é tanto maior quanto maior for o número de resíduos
nucleotídicos e, portanto, quanto maior for o tamanho do oligonucleotídeo. Com este
procedimento, pôde detectar-se DNA na gama de picomolar.
1.6.4 Novos biossensores de DNA
Para o futuro próximo, antevê-se a intensificação do desenvolvimento de
biossensores eletroquímicos, cuja miniaturação é relativamente fácil, e com bom
desempenho. Entre estes, é de esperar um desenvolvimento especial de sistemas de
detecção de DNA sem utilização de marcadores, pois a marcação é uma etapa adicional
no processo de detecção (Bean, 2001). Apesar disso, a utilização de indicadores de
hibridização ainda é provavelmente a melhor opção para detecção eletroquímica de
DNA (Pividori et al., 2000). Neste contexto, formatos em ‘sanduíche’ de nanopartículas
de ouro, DNA e microesferas magnéticas têm sido cada vez mais usados para detecção
altamente sensível de DNA (Merkoçi et al, 2005). A técnica, porém, exige prévia
dissolução química do complexo DNA-nanopartícula para posterior detecção
eletroquímica dos íons Au3+ resultantes e entretanto acumulados, o que, além de
constituir um passo adicional no processo, é feito com solução oxidante de HBr / Br2,
que é altamente tóxica. Além disso, cada nanopartícula de ouro, pelo fato de estar
conjugada a várias cadeias-alvo de DNA, é susceptível de se ligar a diferentes cadeias-
sonda e, portanto, a diferentes microesferas magnéticas, formando uma imensa rede
tridimensional interconectada. Como solução para estes problemas, foi desenvolvido
(Pumera et al., 2005) um método de nanopartículas de ouro em que cada uma se liga a
69
uma única molécula de DNA-alvo; a individualidade dos triconjugados resultantes
assegura maior reprodutibilidade e sensibilidade do que nos formatos tradicionais. A
outra vantagem descrita é a possibilidade de detectar diretamente o conjugado em vez
de o dissolver previamente para detectar somente as partículas de ouro, através de
acumulação das microesferas magnéticas hibridizadas na superfície de um eletrodo
magnético e subseqüente transdução voltamétrica. Entretanto, novas vias para gerar o
sinal de hibridização têm sido testadas. Usando uma técnica de detecção direta, foi
medido o decréscimo da condutividade iônica ao longo de BLMs durante a formação de
um híbrido entre uma sonda de ssDNA contida na BLM e um alvo complementar
(Siontorou et al., 1997); este fenômeno foi atribuído a alterações na permeabilidade
iônica associada a mudanças estruturais na BLM, decorrentes do evento de hibridização.
Aoki e colaboradores (Aoki et al., 2000) desenvolveram um sensor de canais iônicos
para detectar indiretamente a hibridização de DNA com alta especificidade, fazendo uso
da repulsão eletrostática entre ferrocianeto (marcador redox) e uma cadeia-alvo de DNA
negativamente carregada que se liga a uma sonda de ácido nucléico peptídico neutra,
imobilizada num eletrodo de ouro. Uma abordagem semelhante para amplificar o sinal
de hibridização utiliza lipossomos carregados negativamente que, ao se ligarem à sonda
imobilizada, formam uma imensa superfície de carga negativa que repele a cadeia-alvo,
também negativa (Patolsky et al., 2000); o resultante impedimento à transferência
eletrônica interfacial foi medido por espectroscopia de impedância. O grupo de
Baeumner também utilizou amplificação de sinal com lipossomos para detectar DNA
por via ótica. Num dos seus trabalhos (Baeumner et al., 2004b), foi desenvolvido um
biossensor para detecção e identificação do vírus da dengue após amplificação do RNA
viral pela técnica de NASBA, uma variante da PCR para amplificação direta de RNA. O
formato deste sensor inclui uma sonda-repórter de DNA (complementar a uma
seqüência genérica adicionada ao RNA viral durante o passo de amplificação) ligada à
superfície externa de um lipossomo e uma sonda de captura biotinilada e imobilizada
numa membrana de polietersulfona revestida com estreptavidina (a qual possui alta
afinidade de ligação para a biotina). Este sensor permite detectar o vírus genericamente
(isto é, independentemente do sorotipo) ou especificamente, apenas por escolha
apropriada da sonda de captura – complementar a uma seqüência conservada do genoma
viral ou a seqüências específicas para cada um dos quatro sorotipos. O RNA
amplificado e as duas sondas são então misturadas para formar uma ‘sanduíche’ e os
lipossomos marcados com DNA, em número proporcional à quantidade de RNA
70
existente na amostra, são detectados por eletroquimioluminescência com um
refletômetro portátil. Após otimização da sensibilidade e especificidade, o biossensor
foi capaz de detectar o RNA do vírus da dengue em até 15 minutos. Uma ligeira
variação deste sensor foi produzida com a sonda de captura ligada a uma microesfera
magnética e esta, por sua vez, imobilizada num magneto permanente na região de
detecção (Kwakye & Baeumner, 2003). Os lipossomos foram preenchidos com uma
substância corante, do que resultou uma grande amplificação do sinal e da sensibilidade
da detecção por microscopia de fluorescência. Este biossensor foi construído em
formato microfluídico, incluindo, além do módulo de detecção, módulos para extração,
purificação e amplificação de RNA. Com base nestes dois sensores, foi desenvolvido
um biossensor universal (Baeumner et al., 2004a), que engloba imobilização sobre uma
membrana de polietersulfona, uma sonda-repórter universal enriquecida com dG e
detecção ótica usando um lipossomo corado ligado a uma sonda universal rica em dC.
As sondas repórter e de captura podem ser facilmente e rapidamente substituídas para se
tornarem específicas para a seqüência-alvo de ácido nucléico. Após otimização das
condições de hibridização, das concentrações dos componentes e do comprimento da
sonda genérica, foram feitos ensaios com seqüências bacterianas reais, previamente
amplificadas e, com uma simples incubação, a identificação e quantificação não
excederam , no total, 30 minutos. Ao contrário dos biossensores descritos atrás e de
muitos outros atualmente disponíveis, este formato dispensa as etapas habituais de
conversão de um biossensor genérico em específico. Este formato foi posteriormente
aplicado à identificação de um sorotipo específico do vírus da dengue num único ensaio,
após amplificação do RNA viral (Zaytseva et al., 2004), contrariamente aos
biossensores atrás descritos, que requerem quatro análises separadas, isto é, uma para
cada sorotipo. O princípio de funcionamento deste biossensor multianalito está descrito
nas figuras 31 e 32.
71
Figura 31 - Princípio de funcionamento de um biossensor multianalito para
identificação específica dos sorotipos do vírus da dengue. É usada uma sonda-repórter
genérica, ligada a um lipossomo encapsulando moléculas de um corante, e 5 sondas de
captura – uma relativa a uma região conservada do genoma viral e as outras específicas
para os 4 sorotipos. Quando um RNA viral específico está presente, forma uma
‘sanduíche’ com as duas sondas (repórter e de captura), sendo o número de lipossomos
capturados na região de detecção proporcional à quantidade de RNA viral presente
(retirado de Zaytseva et al., 2004).
Figura 32 - Esquema em ‘sanduíche’ de biossensor para detecção genérica do genoma
do vírus da dengue e identificação específica do sorotipo (retirado de Baeumner et al.,
2004b).
A tendência para o futuro é a aplicação das tecnologias de micromecânica e
microfabricação de sistemas na preparação e análise de amostras de ácidos nucléicos
através de kits de diagnóstico e sistemas de fluxo (Pividori et al., 2000). Neste contexto,
deve salientar-se a importância crescente que os formatos para análise microfluídica
vêm adquirindo nos últimos anos (Dittrich et al., 2006). O grupo de Wang produziu um
biossensor eletroquímico para determinação de pequenas seqüências de DNA de
72
Mycobacterium tuberculosis por cronopotenciometria de redissolução adsortiva, usando
Co(phen)33+ como indicador de hibridização (Wang et al., 1997d). Este biossensor, de
tiras de carbono microfabricadas por screen-printing, foi comparado com um sistema
similar de pasta de carbono, conseguindo-se, nos dois casos, curtos tempos de
hibridização (5-15 minutos). A equipa de Wang também detectou a hibridização de
DNA e RNA diretamente, por alterações no pico de oxidação da guanina, usando
potenciometria de redissolução adsorptiva num sensor de filme-espesso screen-printed,
atingindo limites de detecção na ordem de μg/ml (Wang et al., 1996d). O sensor
microfabricado foi incorporado num aparelho portátil operado por uma bateria, tal como
requerido para diagnóstico de DNA in situ. Lamture e a sua equipe (Lamture et al.,
1994) modificaram o processo clássico de detecção com radioisótopos 32P para
desenvolver um sensor que combinasse a química de hibridização de DNA com as
tecnologias de microfabricação eletrônica. Deste modo, sondas oligonucleotídicas foram
covalentemente imobilizadas num filme fino de SiO2 e esta matriz ligada diretamente à
superfície de um aparelho de contagem radioquímica, que detecta o decaimento dos
isótopos 32P das cadeias-alvo de DNA hibridizadas. A detecção de 32P com esta técnica
provou ser cerca de 10 vezes mais rápida do que a atingida com detectores
convencionais de fase gasosa e, pelo menos, 100 vezes mais rápida do que com filme de
raios-X. Também se demonstrou a possibilidade de atingir esta velocidade quando a
matriz oligonucleotídica é ligada a chips descartáveis de SiO2 posteriormente depostos
sobre o aparelho de radiomedição sem prejuízo da especificidade.
Uma das principais linhas de pesquisa em novos sistemas de diagnóstico é a dos
biochips de DNA (figura 33), geralmente associada a técnicas de microfabricação por
screen-printing; elas permitem produzir séries bastante densas de eletrodos de
microbandas revestidos com diferentes sondas para detecção simultânea de diferentes
seqüências-alvo de DNA, com ou sem um indicador redox, impressas no chip por
fotolitografia convencional (Pividori et al., 2000; Wang et al., 1996d).
73
Figura 33 - Esquema de um biochip de DNA. Os diferentes alvos de DNA, obtidos de
fragmentos habitualmente clonados em plasmídeos e depois amplificados, são
imobilizados no chip. As sondas de RNA ou cDNA, obtidas de células em diferentes
condições de crescimento, são marcadas com um fluoróforo. Após hibridização das
sondas com os alvos, um laser faz a leitura do mesmo, sendo gravadas e registradas as
localizações específicas, no chip, onde a hibridização ocorreu. Finalmente, os dados são
analisados (retirado de www.kbrin.louisville.edu).
Usando componentes fotolitográficos convencionais, foi desenvolvida (Park et
al., 2002) uma técnica em ‘sanduíche’ para detecção eletroquímica em fendas de 20 μm
num microeletrodo sobre um chip de silício. Neste sistema, foi usada uma sonda de
DNA para capturar um alvo com uma região complementar a uma segunda sonda de
DNA, esta ligada a uma nanopartícula de ouro. Após 6-15 horas de hibridização, as
nanopartículas ligadas às sondas permaneceram nas fendas, facilitando a formação de
‘pontes’ de prata (entretanto adicionada) condutoras durante um tratamento com
reagentes-padrões formadores de filmes (ex.: hidroquinona). Com este sistema, foi
possível distinguir diferenças de um único nucleotídeo na gama de femtomolar. A
utilização de microeletrodos e de outros componentes convencionais possibilita um fácil
aumento de escala para um formato de array de alta densidade. Apesar de os
microarrays de DNA não poderem ser considerados biossensores – no sentido de
aparelhos de uso simples, de baixo custo e portáteis -, eles atingem alta eficiência de
processamento analítico e utilizam técnicas de microfabricação para imobilização
74
altamente seletiva dos seus componentes de reconhecimento (Baeumner et al., 2004a).
O desenvolvimento de biossensores a partir dos microarrays deverá ser mediado pela
produção de chips descartáveis que permitam obviar as limitações dos microarrays
atuais. Uma das particularidades mais salientes dos arrays de DNA de alta densidade é
a necessidade de endereçamento físico, por técnicas de deposição por microjato, de
volumes na gama de picolitros em localizações discretas e altamente específicas no
chip. Contrariamente à detecção por fluorescência ou por espectroscopia de massa,
muito usadas na detecção de hibridização em microchips de DNA, a transdução
eletroquímica parece ser a solução ideal para progredir no sentido de miniaturar o
aparato instrumental (Wang, 2000). Visando estes dois princípios – endereçamento
específico num chip e detecção eletroquímica -, Fixe e colaboradores (Fixe et al., 2004;
Fixe et al., 2003) apresentaram uma técnica de microarrays de DNA com
endereçamento elétrico. De acordo com esta técnica, a aplicação de um curto pulso de
potencial a um eletrodo resulta num aumento drástico da imobilização covalente
seletiva e da hibridização de DNA numa superfície de filme-fino sobre um suporte de
plástico; esse aumento foi de aproximadamente 109 vezes em relação a um sistema
análogo mas sem o pulso de potencial. O enorme aumento das taxas de imobilização e
hibridização foi atribuído à rápida reorientação espacial do ssDNA adsorvido na
superfície devido à rápida mudança do campo elétrico, o que reduz as barreiras estéreas
e acelera ambas as reações. Outros protocolos semelhantes foram desenvolvidos
anteriormente (Edman et al., 1997), mas com tempos de duração de pulso demasiado
longos (~ 5 minutos), assim desencadeando reações eletroquímicas indesejadas e
passíveis de danificar as moléculas de DNA. No trabalho de Fixe e colegas, foram
usados pulsos inferiores a 1 V durante 4.5 ns, o que é compatível com microfabricação
eletrônica convencional de silício. Isto possibilita o endereçamento eletrônico num
microarray durante a manufatura, de modo a imobilizar covalentemente e seletivamente
um grande número de diferentes moléculas de sonda em locais altamente específicos e
densos. Assim, muitas seqüências-alvo sob estudo podem ser imobilizadas num único
chip manufaturado, em áreas contíguas, cada uma correspondendo a um pixel. Durante
o ensaio experimental, alguns pixels podem ser hibridizados com uma das seqüências-
alvo, sendo a leitura final efetuada apenas depois de a hibridização ter ocorrido em
todas as amostras. Esta técnica deverá permitir reduzir a duração e o custo da produção
de microarrays, assim como aumentar a velocidade de aquisição de dados (Fixe et al.,
2004). Recentemente foi proposto um método para detecção visual, qualitativa e
75
simultânea, num chip de DNA, dos vírus da hepatite B (que, sendo de RNA, teve que
ser sujeito inicialmente a transcrição-reversa para gerar um molde de DNA), hepatite C
e HIV em amostras de sangue infectado (Wen et al., 2004). Os ácidos nucléicos foram
primeiramente amplificados por PCR multiplex para amplificação e detecção simultânea
de várias seqüências genômicas (Chamberlain et al., 1988) e, ao processo, foram
adicionados dUs biotinilados que se ligaram às cadeias em formação. A detecção foi
conseguida por meio de um sistema enzimático, usando fosfatase alcalina ligada a
avidina (fazendo uso da afinidade avidina / biotina). Através da formação de
precipitados púrpuras visualmente discerníveis no chip, utilizou-se o substrato
enzimático (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) e um amplificador de sinal (azul de
nitro-tetrazólio). A originalidade do sistema de amplificação por PCR usado neste
trabalho permitiu solucionar alguns problemas típicos de PCR multiplex,
nomeadamente a maior probabilidade de amplificação não-específica e as menores
eficiência e sensibilidade de amplificação de cada seqüência do que em PCR
convencional, devido a potenciais interações cruzadas e competição entre os diferentes
pares de primers usados para amplificar seqüências diferentes (Brownie et al., 1997;
Polz & Cavanaugh, 1998). A explicação reside no fato de se ter combinado as vantagens
de PCR de primers imobilizados em série (arrayed anchored primer PCR) e de PCR
‘aninhada’ (nested PCR). A PCR de primers imobilizados em série (Westin et al.,
2000) é uma amplificação sobre uma superfície sólida à qual os primers são
imobilizados pela extremidade 5’. O molde de DNA, presente na fase líquida, hibridiza
então com os primers complementares imobilizados e a cadeia nascente é sintetizada
sobre eles por uma DNA polimerase. Como apenas uma hibridização perfeita pode
desencadear a elongação, pois híbridos não complementares não se ligam
eficientemente à superfície sólida, a amplificação não-específica pode ser altamente
diminuída. Por outro lado, a PCR ‘aninhada’ (Albert & Fenyo, 1990) utiliza dois pares
de primers para uma única seqüência: um par externo, que amplifica a seqüência-alvo
tal como em PCR convencional, e um par interno, que se liga ao produto amplificado no
primeiro ciclo e assim gera um segundo produto, de tamanho inferior ao primeiro.
Assim, se uma seqüência errada for amplificada indevidamente no primeiro ciclo, a
probabilidade de ser também amplificada no segundo ciclo é muito baixa. Deste modo,
o número de cópias da seqüência-alvo aumenta exponencialmente sem um aumento
correspondente das ‘falsas amplificações’, resultando no incremento da sensibilidade da
detecção. Esta técnica permitiu detectar cerca de 1 pg de fragmentos de DNA virais no
76
chip (Wen et al., 2004). Em geral, a imobilização de ácidos nucléicos em chips ainda
necessita ser otimizada para maximizar a sensibilidade e a especificidade, minimizar
hibridizações cruzadas e prevenir a baixa eficiência de hibridização devida às estruturas
secundárias do DNA-alvo (Bean, 2001). Embora os biochips de DNA sejam capazes de
detectar um grande número de genes num único ensaio, subsiste a dificuldade de
detecção ao nível celular sem prévia amplificação da(s) seqüência(s) genômicas a
detectar (Wang et al., 2005). No âmbito dos novos biossensores de DNA, deve
salientar-se a importância crescente que os formatos para análise microfluídica vêm
adquirindo nos últimos anos (Dittrich et al., 2006). Estes sistemas permitem evitar as
interferências químicas típicas do confinamento espacial dos elementos de
biorreconhecimento e de transdução, possibilitando, deste modo, que a miniaturação
seja acompanhada de eficiente transferência do sinal e de alta sensibilidade na detecção.
A elevada taxa de transferência de massa assim conseguida resulta da baixa distância
difusional e do elevado quociente superfície / volume (Ruf et al. 2006). Gulliksen e
colaboradores (Gulliksen et al., 2005) desenvolveram um microssistema para detecção
de um marcador cangerígeno (seqüências artificiais de genoma do papiloma virus
humano, susceptível de causar câncer cervical), provavelmente o primeiro relato de
detecção de mRNA amplificado por NASBA em tempo-real num microssistema; a
sensibilidade conseguida foi similar à dos métodos de diagnóstico convencionais, na
ordem de 10-6 μM. O grupo de Wei (Wei et al., 2005) conseguiu reduzir os volumes de
amostra e de reagente para 1 μl e o tempo de hibridização para menos de 10 minutos,
num sistema que integra os conceitos de μTAS e de microarrays; com este sistema
evitaram-se as limitações dos microarrays tradicionais, concretamente a necessidade de
utilizar volumes de reagente e solução relativamente altos, a velocidade difusional
comparativamente baixa das biomoléculas reagentes e o tempo superior a 1 dia
requerido para que a reação de hibridização seja completa; o limite de detecção obtido
foi 19 amol. Num outro trabalho (Smistrup et al., 2005), utilizaram-se dois tipos de
microesferas magnéticas ligadas a diferentes sondas de DNA num microcanal,
utilizando um separador magnético. Neste sistema, as duas microesferas funcionalizadas
conseguiram distinguir diferenças de um único oligonucleotídeo no DNA-alvo. O grupo
de Erickson (Erickson et al., 2005) implementou um método eletrocinético para
discriminar polimorfismos de um único nucleotídeo num sistema μTAS, o que foi
possível pelo controle rigoroso da temperatura na interface do microarray dispensando
o recurso a sensores externos de temperatura, comuns na maioria dos sistemas
77
microfluídicos. A grande vantagem deste sistema é, devido a esse controle apertado da
temperatura e, portanto, da estringência, a eliminação total de hibridização parcial entre
seqüências oligonucleotídicas parcialmente complementares, com óbvio aumento da
seletividade. Um sistema ultrasensível foi desenvolvido (Wang et al., 2005) para
quantificar vestígios de ácidos nucléicos, combinando espectroscopia de fluorescência
confocal, grampos de DNA um reator microfluídico para confinamento molecular num
volume de apenas 1 femtolitro. Este sistema permite detectar fluorescência de uma
única molécula em solução, eliminando assim uma etapa posterior para remoção das
moléculas não ligadas de sonda, com a vantagem adicional de diminuição significativa
do custo dos ensaios de hibridização tradicionais, geralmente muito onerados pelo custo
elevado das sondas. O limite de detecção atingido foi 14 zmol. Recentemente foi
relatado (Liao et al., 2006) um array de sensores microfluídico para detecção específica
de alvos de RNA ribossomal de vários patógenos bacterianos em fluídos humanos.
Depois de extraído das células bacterianas, o RNA foi detectado por
imunofluorescência, através da reação específica da peroxidase de rábano, conjugada a
um anticorpo marcado. O sensor atingiu o limite de detecção de 2600 células
bacterianas em cultura, com um tempo de detecção de 45 minutos. Usando detecção
amperométrica, foi possível obter praticamente 100% de sensibilidade na detecção de
bactérias gram-negativas sem necessidade de purificação nem de amplificação do ácido
nucléico.
Uma área de importância crescente no desenvolvimento de novos sistemas e
procedimentos bioanalíticos é a dos conjugados de DNA – proteína semi-sintéticos, que
podem ser formados tanto por síntese química de ligação covalente como por sistemas
não covalentes de reconhecimento molecular por afinidade, incluindo
complementaridade entre cadeias de DNA. A recente tendência de aumento do custo /
benefício da miniaturação progressiva dos atuais microssistemas produzidos por
fotolitografia tem sido argumentada em favor de uma orientação oposta, isto é, a
montagem de sistemas micromecânicos e estruturas biomiméticas funcionais na gama
de 5-100 nm (Niemeyer, 2001; Niemeyer, 2002). Entre os materiais conhecidos, o DNA
é particularmente atrativo para fabricação de nanossistemas devido a características
singulares que incluem: capacidade de uma cadeia simples com cerca de 20
nucleotídeos de ser especificamente detectada por outra cadeia com o tamanho e a
complexidade de um genoma eucariótico; grande rigidez mecânica de hélices duplas
pequenas, que se comportam como espaçadores rígidos entre dois componentes
78
moleculares eventualmente ligados nas suas extremidades; estabilidade fisico-química
relativamente alta; e susceptibilidade a manipulação e processamento altamente
precisos, ao nível atômico (na gama de ångstrom), por meio de ‘ferramentas’
moleculares naturais extremamente específicas, incluindo ligases, nucleases e outras
enzimas processadoras de DNA (Niemeyer, 2001). Além da utilização já rotineira do
sistema de afinidade avidina / biotina / estreptavidina em sondas de DNA e de ácidos
nucléicos peptídicos, mencionados acima, outros tipos de conjugados DNA–proteína
têm sido pesquisados e aplicados em nanobiotecnologia. Estes conjugados podem
ajudar a resolver alguns problemas básicos e recorrentes dos atuais biossensores, de que
é exemplo a síntese de um conjugado oligonucleotídico com uma lipase fúngica para
gerar uma sonda termoestável aplicável em ensaios de hibridização de DNA e em
biossensores (Kynclova et al., 1995). O grupo de Kerman (Kerman et al., 2005),
trabalhando com eletrodos de carbono screen-printed modificados com SWNTs,
estudou a interação da proteína SSB de Escherichia coli com ssDNA através de
medição dos picos voltamétricos de oxidação da sonda de DNA ligada ao SWNT e da
proteína SSB. Quando a proteína SSB se ligou ao ssDNA – para o qual tem grande
afinidade relativa -, o sinal de oxidação dos resíduos de guanina do mesmo diminuiu,
indicando obstrução provocada pela proteína à transferência de elétrons do ssDNA para
o eletrodo. Paralelamente, aumentaram os sinais relativos à oxidação dos resíduos de
tirosina e triptofano da proteína. Concomitantemente à hibridização da sonda com uma
cadeia complementar, ocorre o desligamento entre o ssDNA e a proteína, aumentando
agora o pico de corrente relativo ao DNA (neste caso, dsDNA) e diminuindo o relativo à
proteína. Mediante a amplificação de sinal gerada pelos SWNTs, atingiu-se um limite
de detecção de 0.15 mg/ml de DNA-alvo. Uma das aplicações mais revolucionárias e
promissoras na área dos conjugados de DNA - proteína é a dos detectores de moléculas
individuais, que visam mimetizar a maquinaria protéica celular, a qual lê e copia uma
molécula de DNA ou RNA de cada vez com extrema precisão, discriminando pares de
bases um-a-um (Vercoutere & Akeson, 2002). Uma abordagem iniciada na
Universidade de Cornell, EUA (Korlach et al., 2002), utiliza uma DNA polimerase
ligada a uma superfície de SiO2. Quando a polimerase incorpora um nucleotídeo
marcado com um fluoróforo numa cadeia nascente de DNA, a síntese pode ser
monitorada em tempo real. Usando quatro tipos diferentes de fluoróforos – um para
cada tipo de nucleotídeo -, deverá ser possível, em princípio, identificar o nucleotídeo
que está a ser incorporado, isolando a luz emitida por cada novo fluoróforo incorporado
79
da luz emitida pelos fluoróforos precedentes; isto pode ser feito por foto-branqueamento
desses fluoróforos precedentes ou ligando cada fluoróforo ao grupo pirofosfato terminal
do nucleotídeo que está a ser lido e que, depois de se formar a ligação covalente com
um novo nucleotídeo, é liberado. Outra abordagem tem sido desenvolvida nas
Universidades da Califórnia e de Harvard, EUA (Voss, 1999), e envolve o conceito de
nanoporo de DNA, que consiste em imobilizar covalentemente uma cadeia simples de
DNA ou oligonucleotídeo no lúmen de um poro nanométrico de α-hemolisina de
Staphyloccocus aureus. Esta estratégia baseia-se em conclusões de trabalhos anteriores
(Henrickson et al., 2000; Kasianowicz et al., 1996), segundo as quais moléculas de
ácidos nucléicos produzem ‘assinaturas’ de correntes iônicas quando atravessam canais
iônicos de α-hemolisina (figura 34).
Figura 34 - Detecção de hibridização de DNA num nanoporo de α-hemolisina. (a)
Visão transversal do nanoporo heptamérico de α-hemolisina ligado a um ssDNA. O
sinal ⊕ indica um potencial positivo aplicado no lado trans da membrana, para o qual é
impulsionado o ssDNA (carregado negativamente) a partir do lado cis. (b) ‘Assinatura’
de corrente típica de um duplex de DNA totalmente complementar formado entre o
ssDNA imobilizado (oligo-1) e uma cadeia recém-chegada (oligo-2G); B representa os
eventos individuais de ligação específica entre o oligo-1 e o oligo-2G, e T os eventos de
translocação do oligo-2G que não se ligou ao oligo-1. (c) ‘Assinatura’ de corrente
relativa à ligação parcialmente complementar entre o oligo-1 imobilizado e o oligo-2C
recém-chegado. Neste caso, apenas se observam eventos T (retirado de Niemeyer,
2002).
80
O conjugado é capaz de detectar, com resolução de uma única base, cadeias-alvo
que passem e eventualmente se liguem à sonda imobilizada, por medição da variação na
corrente iônica que flui pelo nanoporo (Howorka et al., 2001). Porém, o sistema ainda
apresenta algumas deficiências para a seqüenciação de nucleotídeos. Uma delas advém
de cerca de 12 nucleotídeos ocuparem o poro transmembranar e de cada um deles
contribuir para a resistência total observada, o que obscurece o efeito de qualquer
nucleotídeo individual (Meller et al., 2001); a outra deriva de, à temperatura ambiente e
ao potencial de 120 mV, cada nucleotídeo da cadeia atravessar o poro em apenas 2 ms,
um evento demasiado breve e que, por isso, só pode ser resolvido a freqüências bastante
superiores a 10000 kHz. Esta é a freqüência geralmente usada para reduzir o ruído
instrumental e, assim, discriminar diferenças na corrente dependentes da seqüência
nucleotídica. A utilização de freqüências mais altas, porém, pode obscurecer estas
diferenças (Vercoutere & Akeson, 2002). Conseqüentemente, é provável que um
aparelho de seqüenciação de DNA baseado em nanoporos deva, no futuro, incluir uma
enzima que regule a velocidade de translocação do DNA ao longo do poro, diminuindo-
a de microssegundos para milissegundos por nucleotídeo. Seja como for, a resolução de
moléculas individuais com biossensores de nanoporos constitui uma alternativa ao
princípio geral de detecção com microarrays, usando séries extensas de sondas de
DNA. Os nanoporos poderão, assim, representar a próxima geração de biossensores de
DNA (Vercoutere & Akeson, 2002).
O reconhecimento de DNA tem sido considerado lento porque os protocolos
tradicionais de hibridização em filtro demoram cerca de 20 horas (Wolcott, 1992),
embora muitos biossensores atuais já produzam resultados em menos de uma hora. No
entanto, continua por se desenvolver um genossensor verdadeiramente simples, rápido e
de baixo custo para uso rotineiro, o que é especialmente limitativo em aplicações
clínicas (Fortina et al., 2002). Ao se desenvolverem biossensores para aplicações in
vivo, deve tomar-se em consideração o interesse clínico de se monitorar continuamente
um analito particular (Turner et al., 1987). Em muitas aplicações relacionadas com
diagnóstico clínico, os genossensores atuais enfrentam ainda o problema de os ácidos
nucléicos se encontrarem, in vivo, em concentração demasiado baixa para poderem ser
detectados sem prévia amplificação por PCR (Teles et al., 2005). No entanto, atendendo
à elevada estabilidade química do DNA comparativamente a outros elementos de
biorreconhecimento, tais como enzimas e anticorpos, o futuro desenvolvimento de
81
biossensores de DNA, em particular para uso clínico, parece ser altamente promissor
(Junhui et al., 1997).
82
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolvimento de um biossensor para detecção específica de um modelo do
genoma do vírus da dengue e eventual identificação dos quatro sorotipos virais.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Desenvolvimento de um biossensor eletroquímico de DNA para detecção
específica de uma seqüência oligonucleotídica conservada do genoma do vírus
da dengue, através do pico de oxidação do ferroceno, usado como indicador
eletroativo de hibridização, por voltametria cíclica, utilizando um eletrodo de
carbono vítreo modificado com um filme de quitosana.
• Otimização do biossensor relativamente a vários parâmetros referentes ao meio e
ao eletrodo, incluindo o pH, as concentrações de DNA-sonda e DNA-alvo e os
tempos e temperaturas de imobilização e hibridização.
• Aplicação do biossensor otimizado à identificação específica de seqüências
oligonucleotídicas-modelo do genoma de cada um dos quatro sorotipos do vírus
da dengue.
83
3. PUBLICAÇÕES 3.1 “TRENDS IN DENGUE DIAGNOSIS”
Teles, F.R.R.; Prazeres, D.M.F.; Lima-Filho, J.L. 2005. Reviews in Medical
Virology, 15: 287-302.
Rev. Med. Virol. (in press).Published online in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com).
Reviews in Medical Virology DOI: 10.1002/rmv.461
Trends in dengue diagnosisF. R. R. Teles1, D. M. F. Prazeres2 and J. L. Lima-Filho1*1Laboratorio de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof.Moraes Rego, 1235, Campus Universitario, Cidade Universitaria, Recife, PE-CEP: 50670-901, Brazil2Centro de Engenharia Biologica e Quımica, Instituto Superior Tecnico, Av. Rovisco Pais, 1049–001 Lisbon,Portugal
SUMMARY
The conventional diagnosis of dengue virus infections includes the detection of the virus in serum or tissue samples,both by isolation in culture or through detection of specific viral molecules (genome RNA or dengue antigens)and detection of specific anti-dengue antibodies (serology). Isolation of dengue virus provides the most direct andconclusive approach to diagnosis, despite the demand for high-level equipment, technical skills and manpower.However, it is useless in early diagnosis because several days are required to isolate and classify the virus. Serology,despite being simpler, is not able to afford an accurate early diagnosis in primary infections because 4–5 days arerequired for the immune system to produce a sufficient amount of antibodies. Moreover, it leads to misleading resultsin secondary infections owing to cross-reactivity among serotype-specific antibodies and with other flavivirusantibodies. The RT-PCR and other PCR-based techniques are fast, serotype-discriminating, more sensitive andeasier to carry out than conventional nucleic-acid hybridisation, but are handicapped by easy sample contaminationand high technological demands. Recently, advances in bioelectronics have generated commercial kits and newtechniques for detection of dengue antibodies and RNA, based on biosensor technology. Most of them are rapid, easyto operate, reusable, cheap, sensitive and serotype-specific. Nevertheless, their accuracy is still questionable becausemost still lack validation and standardisation. This review summarises and describes the techniques currentlyemployed and anticipated in the near future for diagnosis of dengue disease. Copyright # 2005 John Wiley
& Sons, Ltd.
Received: 20 August 2004; Revised: 17 September 2004; Accepted: 3 December 2004
INTRODUCTIONDengue virus belongs to the Flavivirus genus of theFlaviviridae family and is transmitted to humans byinfected Aedes aegypti or Aedes albopictus mosqui-toes. Dengue viruses include four antigenicallyrelated serotypes (DENV 1–4), all of which causedisease. The diameter of the icosahedral nucleo-capsid is 45 nm. The capsid is surrounded by alipid bilayer with three structural proteins, includ-ing a glycoprotein-E responsible for attachment to
host cells which is recognised by specific antibo-dies. Dengue virus contains a single-strandedRNA (ssRNA) of 11 kb in length, Mr 4000, with asingle ORF flanked by two non-translated regionsat each end, plus seven sequences for the synthesisof non-structural proteins [1–3].After an incubation period of up to 2 weeks,
coinciding with the appearance of dengue virusparticles in the blood, non-specific symptomsarise, including high fever, headache, joint pain,nausea, vomiting, retro-orbital pain, weaknessand a rash known as ‘dengue fever’. If the patientis young or is re-infected by a different dengue ser-otype, the pathology may evolve to ‘dengue hae-morrhagic fever’ (DHF), when blood capillariesbecome too permeable, allowing fluid to escape.Bleeding is probably caused by activated plateletsderived from damaged capillary endothelium [4].This leads to extremely high fever, haemorrhagicmanifestations, hepatomegaly and circulatory fail-ure. If treatment is not administered promptly,hypovolaemic ‘dengue shock syndrome’ (DSS),
RR EE VV II EE WW
Copyright # 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
*Corresponding author: Dr J. L. Lima-Filho, Laboratorio de Imunopa-tologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco,Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Campus Universitario, Cidade Univer-sitaria, Recife, PE-CEP: 50670-901, Brazil.E-mail: Jose_Luiz60@terra.com.br
Abbreviations usedCF, complement fixation; DENV, dengue virus; DHF, dengue hae-morrhagic fever; dsDNA, double-stranded DNA; DSS, dengue shocksyndrome; HI, haemagglutination inhibition; MAC-EIA, monoclonalantibody (IgM) capture—enzyme immunoassay; NASBA, nucleicacid sequence-based amplification; NSI, non-structural protein-1;RIA, radioimmunoassay; RTC, reversible target capture; ssRNA,single-stranded RNA
caused by severe plasma leakage, may appear—which has a high mortality rate. Natural andexperimental infection in humans and primates,respectively, has shown that dengue virus infectsand replicates in vivo within mononuclear phago-cytic cells [2,5]. It is likely that vascular endothe-lium is destroyed both by direct infection and byindirect targeting via mediators released bymacrophages [6].Dengue virus is nowadays the most important
arthropod-spread virus affecting humans existingin more than 100 countries worldwide [7,8]. Thedisease is endemic in most tropical and sub-tropi-cal regions and a potential threat to more tempe-rate countries, even in Europe and USA [9–11].Dengue fever is considered one of the great emer-ging diseases of the near future. It is estimated thataround half of the world population is at risk, withan annual incidence of 100 million cases of denguefever and over 45 0000 cases of DHF [2,12,13]. Thethreat of dengue disease expansion comes fromthe increase in air travel, which has brought tour-ists to endemic areas and also taken new denguevirus strains to susceptible populations. Due tothe spread of both virus and hosts throughoutthe world, dengue has become epidemic, espe-cially in urban areas [12–14]. Tropical habitatshave been subjected to major ecological changesin the past decades, exposing humans to pro-longed contact with dengue virus. Moreover,increasing human populations and the collapseof mosquito control programmes in many coun-tries have led to the spread of dengue virus world-wide [15,16]. In 2001, unprecedented epidemicoutbreaks of dengue disease occurred in the Amer-icas, Asia and Pacific islands [4]. The severe formsof the disease emerged in Southeast Asia in the1950s and 1960s and increased abruptly in theAmericas in the past 20 years. Recent outbreakshave occurred in Brazil, Venezuela, Colombiaand French Guiana [17].At present, neither effective vaccines nor drugs
are available to prevent and treat the diseasecaused by dengue virus. Treatment is merelysymptomatic and, apart from the life-threateninghaemorrhagic and shock pathologies which aretreated by fluid replacement, the treatment of theless severe dengue fever is limited to the use ofanalgesics. Control of vector mosquitoes is cur-rently the most effective measure to prevent thedisease. At the individual level, chemical repel-
lants and mosquito barriers are widely used andrecommended [3]. At the population level, com-mon approaches include chemical control of mos-quito populations and biological control throughthe use of bacteria [18]. A multivalent vaccine, cap-able of stimulating the immune system of an indi-vidual to induce protection against all the fourdengue virus serotypes, is urgently needed. Can-didate laboratory-attenuated strains and plasmidDNA vaccines are still in the early stages of labora-tory testing, production and validation [19–22].Until safe and effective vaccines become available,early diagnosis is the key to survival in the case ofthe more severe forms of dengue disease. None-theless, clinical diagnosis of dengue virus diseaseis often inconclusive since the symptoms areusually non-specific. Specifically in the earlyphase, these symptoms often cannot be distin-guished from those of other infections, such asmalaria, leptospirosis, scrub typhus, measles, yel-low fever, influenza, West Nile, Japanese and StLouis encephalitis. For this reason, a definite con-firmation of the disease requires specific virologi-cal or serological techniques [23]. The dramaticburst of dengue cases in the Americas has raisedthe need for evaluation of diagnostic proceduresamong different laboratories [24]. As an example,the newly introduced DENV-3 serotype in Brazilhas shown the importance of ongoing monitoringof new serotypes and genotypes for surveillancepurposes [25].This article gives an overview of standard and
more recent techniques employed in health-carefacilities and research laboratories for denguevirus diagnosis.
PROFILE OF THE IMMUNE RESPONSEIN THE HOSTIn a typical human dengue infection, about 0.1% ofthe peripheral blood mononuclear cells becomeinfected a few days after the mosquito bite. Theonset of fever, which lasts for 2–7 days, indicatesbroad dissemination of the infection. Anti-dengueneutralising antibodies of IgM and IgG isotypesare produced which do not confer cross-immunityto the other serotypes [8].In individuals never infected before with a flavi-
virus nor immunised with a flaviviral vaccine, theprimary antibody response consists of a massiveproduction of the dominant IgM (Figure 1A).Detectable levels of anti-dengue IgM antibodies
F. R. R. TelesF. R. R. Teles et al.et al.
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by the EIA method (see section below) are presentafter several days of fever, rising quickly until apeak is reached, approximately 2 weeks after theonset of symptoms, and declining to undetectablelevels over 2–3 months [7,26]. Shortly afterwards, alower level of anti-dengue IgG appears. Serologi-cal tests may identify a specific dengue serotypeearly in the disease, since the antibodies producedin that phase are serotype-specific. Months afterinfection, in the convalescent phase, the antibodyspecific for the infecting serotype may be detected[7] but cross-reactive antibodies produced mean-while may mislead determination of the correctserotype. The efficiency of serological diagnosisof dengue infections may be hindered by commoncross-reactive antigenic determinants among thefour serotypes [20].
A secondary antibody response, which corre-sponds to most cases of DHF, occurs in individualspreviously infected or immunised with a flavi-virus. As can be seen in Figure 1B, it is charac-terised by a predominance of IgG, before orsimultaneously with the production of a smalleramount of IgM, whose level reaches a peak atabout 2 weeks after the onset of symptoms. TheIgM levels are much lower (or even absent) in asecondary than in a primary infection, despitesimilarities in the kinetic profile of production[7,27]. Once detected, IgG levels increase rapidly,reaching a maximum about 2 weeks after the onsetof symptoms, and then decrease slowly over 3–6months. These preformed antibodies confer life-long immunity to the specific serotype that caused
the primary infection [28]. Rapidly increasingamounts of neutralising antibodies, during theonset of fever, affect dengue virus recovery fromserum [7]. This immune enhancement phenomen-on probably occurs because antibodies from a pre-vious infection allow the new cross-reactiveserotype a greater access to macrophages, via anti-body-dependent immune enhancement, causingincreased lysis of the infected macrophages, andgreater release of inflammatory mediators. Theenhancing infectivity in dengue disease relies onthe Fc receptor-mediated uptake of immune com-plexes by macrophages [16]. Both in vivo and invitro studies have shown that virus–antibody com-plexes are essential for infection of mononuclearphagocytes by dengue viruses [29]. More infectingviral particles increase the number of infected cells,which is correlated with the more severe forms ofthe disease (DHF/DSS) and involves hyperacti-vation of the complement system [30–32]. In DHF,the combined effects of low-grade persistent infec-tion and weak antibody response lead to chronicimmune-complex formation and eventual deposi-tion of immune complexes in the tissues [30].
CURRENT METHODS FOR SPECIFICDENGUE DIAGNOSIS
SerologyThe infecting dengue serotype is usually deter-mined by measuring a four-fold or greater rise inantibodies to that particular serotype. Serum isusually suitable for testing even after prolongedexposure to a tropical climate because antibodiesare not easily inactivated by harsh treatment ofspecimens. In addition, the techniques are rela-tively simple and some reagents are commerciallyavailable. However, in practice, serological diag-nosis is in general less specific than diagnosis byculture. All too often, the most precise serologicaldiagnosis that many laboratories can provide is‘acute flavivirus infection’ rather than ‘acute den-gue infection’. Specific diagnosis is often only pos-sible in primary infections; in secondary infectionsand in multiple flaviviral infections, the identifica-tion of the specific serotype is frequently impos-sible because of extensive cross-reactivity ofantibodies to flaviviruses, particularly betweendengue viruses [33]. This is a major constraint formost travellers who are prevaccinated againstJapanese encephalitis and yellow fever, in that
Figure 1. Profile of immunoglobulins M (thin line) and G (thick
line) production in the course of dengue virus primary (A) and
secondary (B) infections, a few days after the onset of fever. In
a primary infection, the predominant IgM reaches a peak and
then declines simultaneously with IgG to basal levels. In a sec-
ondary infection, the elicited production of IgG is much more
pronounced than that of IgM. In addition, the time interval dur-
ing which detectable levels of antibodies in the blood are
observed is significantly prolonged for IgG compared with IgM
Trends in dengue diagnosisTrends in dengue diagnosis
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specificity of a serological test is usually lower inprevaccinated individuals [34]. Serum frompatients with autoimmune diseases may showfalse-positive reactions in dengue serologicaldetection tests [35] and polyclonal B-cell activationmay also lead to false-positive results. By specifi-cally detecting anti-dengue IgM responses, amore accurate diagnosis of flavivirus infectionsmay be achieved, although this may not allowdetermination of the specific dengue serotypecausing the infection. Another factor complicatingflavivirus serology is the phenomenon called ‘ori-ginal antigenic sin’, by which B-cells responding toa first flavivirus infection are restimulated tosynthesise antibodies with a greater affinity forthe first than for the current infecting virus inevery subsequent flavivirus infection. A confirma-tory diagnosis requires the use of paired serumsamples, which is more time-consuming [7,23,28].The antigen battery for most of the serological testsshould include the four dengue serotypes, anotherflavivirus, a non-flavivirus (e.g. chikungunya) andan uninfected tissue control antigen [36].The main techniques usually employed in sero-
logical diagnosis of dengue infections are as fol-lows [7].
EIAThe EIA format has been successfully applied foryears to detect and distinguish IgG and IgM anti-bodies to dengue and to other flaviviruses [37,38].The technique is very sensitive and widely usedsince it is readily available as a commercial kit,allowing a large number of determinations simul-taneously and in a short time. This is of mainimportance in laboratories with high volumes oftesting [7,30]. Usually, serum dilutions, platewashers and plate readers are present in mostlaboratories to perform multiple EIA assays [23].In cases where only a single specimen is avail-
able, the test allows diagnosis of recent denguevirus infection even in primary infections. Follow-ing a primary or a secondary infection, this test canmeasure a rise in dengue-specific IgM, even inserum samples collected early in the acute phase(5–7 days after the onset of symptoms). One ofthe main advantages of the test is the ability to dis-tinguish primary from secondary infections basedon the IgM/IgG ratio. In primary infections, theIgM/IgG ratio in acute or convalescent sera usual-ly exceeds 1.5, whereas in secondary infections, the
quantity of IgG antibodies is much higher thanthat of IgM antibodies (Figure 1). By thistechnique, a diagnosis of recent or acute dengueinfection can be made against a set of flaviviral-specific antigens, since anti-flavivirus IgM iscomplex-specific (IgM elicited by a given flavi-virus can be generally differentiated from IgM eli-cited by other flavivirus). This is especiallyadvantageous when undifferentiated symptomsin the early stages of flaviviruses are present.Another advantage of this technique is the possibi-lity of detecting anti-flaviviral IgM in the cere-brospinal fluid which, together with the fact thatIgM usually do not cross the blood–brain barrier,implies replication of dengue virus within the cen-tral nervous system of the host, and not in theblood cells [7].The classical dengue monoclonal antibody
(IgM)—capture EIA (MAC-EIA), recommendedby the World Health Organization for serologicaldiagnosis of dengue infections, is inexpensive,simpler, faster and provides more informationthan other serological tests [38–40]. Nevertheless,wider use is handicapped by the fact that itrequires at least 5 days after infection beforedetectable anti-dengue antibodies can be producedby the immune system of the host [34,41]. Due tothe occurrence of some flavivirus cross-reactivity,results of other serological, virological and epide-miological tests must be considered for a conclu-sive diagnosis [7]. Owing to the persistence ofIgM antibody after a primary infection, false-posi-tive results are frequent even after some months.The test is of great usefulness for clinical surveil-lance in dengue non-endemic regions, where it iscertain that any positive results are recent infec-tions. Despite being slightly less sensitive thanthe HI test (see below) for diagnosis of dengueinfections, the EIA test provides faster results, isless costly and often requires only one blood sam-ple [34,36].New EIA kits for detection of anti-dengue anti-
bodies and antigens have been described[34,35,42–45]. Some of them are less time-consum-ing and technically demanding than MAC-EIA,and claim specific and sensitive detection in bothprimary and secondary infections. Nevertheless,the lack of proper validation and standardisationis still a major problem. The evaluation of thesediagnostic kits requires a multi-institutional study[46,47].
F. R. R. TelesF. R. R. Teles et al.et al.
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HI-testThe haemagglutination-inhibition (HI) test fordengue is simple and more sensitive than electro-phoretic methods, being able to detect less than1 mg/ml of antibodies [30]. Moreover, reagentsmay be prepared locally and the equipmentrequirement is minimal. Some HI antibodies maypersist for long periods, of 50 years or more;thus, the test is suitable for epidemiological stu-dies [36,48]. The test has been successfully appliedin dengue diagnosis for some decades, includingin the form of simple, fast, sensitive and specificserological kits [49,50].
A major drawback of the method is the require-ment for chemical pretreatment to remove non-specific inhibitors of haemagglutination, andfurther absorption with red blood cells to removenon-specific agglutinins. Moreover, the test usual-ly does not discriminate infections caused byclosely related flaviviruses, nor is it serotype-spe-cific, due to cross-reacting dengue antibodies. Itrequires paired sera for optimal use and, if thepaired acute and convalescent sera are collectedless than 7 days apart from each other, the HItest probably will not afford a diagnosis in a pri-mary infection, since there was not enough timefor the HI antibody level to rise. However, someprimary infections may show a response corre-lated with the virus isolated [36]. The response toa primary dengue infection is characterised byslow evolution of the HI antibody. Since the HItest does not differentiate among immunoglobulinisotypes, the detection of a primary antibodyresponse derives from the absence or low level ofdetectable antibody in the acute-phase serum. Incontrast, the evolution of the HI antibody in asecondary antibody response to a dengue infectionis rapid. In this case, since all antibodies arebroadly flavivirus-reactive, a specific and conclu-sive diagnosis requires results from additionaltests [7,16].
CF-testUnlike the IgM or the HI antibodies, which appearwithin 5–7 days, the CF antibody appears later,within 7–14 days after the onset, and persists forshorter periods, a marker of recent infection. Asecondary immune response is characterised by afour-fold rise in the CF antibody when the acuteand convalescent sera are collected within lessthan 2 weeks [7,36].
CF is the least sensitive serological test for den-gue, which explains why it has been replaced byother methods [7]. On the other hand, althoughdelayed compared with other tests, CF is highlysensitive in primary infections [36].
Neutralisation testAfter a primary dengue infection, moderately spe-cific neutralising antibodies are detected in earlyconvalescence. Following a secondary infection,neutralising antibodies are produced, against atleast two and usually all dengue serotypes, andagainst other flaviviruses as well. In many combi-nations of sequential dengue infections, the neu-tralising antibody produced in higher amounts inconvalescent serum is specific to the virus thatcaused the primary dengue infection [7]. In gener-al, the test is not reliable in determining the infect-ing serotype except in primary dengue infections.Since the neutralising test is more sensitive thanthe HI test, neutralising antibodies may bedetected even in the absence of HI antibodies [36].As in the HI test, the neutralisation test has the
potential problems of nonspecific inhibition by ser-um factors other than the specific antibody and therequirement for paired serum samples, thus delay-ing a confirmatory diagnosis [16,23]. Moreover, thetest is expensive, time-consuming and technicallydifficult, thus explaining why it is not routinelyused in many diagnostic laboratories [36]. Unlikethe previous serological methods, the neutralisa-tion test employs live virus, which restricts itsmanipulation to Biosafety Level 3 Laboratories.The neutralisation test measures only neutrali-sation epitopes, which vary between differentflaviviruses. A faster neutralisation test usesmammalian new-born hamster kidney BHK-21cells [51].It seems to be possible to distinguish between
closely related flaviviruses by combining the highspecificity of wild-type viruses with the improvedbiosafety of attenuated viruses. The approachrelies on the use of hybrid chimeric viruses formedfrom an attenuated vaccine strain (e.g. yellowfever) as a backbone virus into which one ormore structural proteins have been replaced bythe corresponding structural proteins of the virusto be tested, e.g. dengue virus [52]. Certain denguevirus strains have also been used as chimeric vec-tors for the testing and production of tetravalentdengue virus vaccines [21,22].
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Dot-blot immunoassayThe immunoblotting technique is relatively newand procedures and reagents continue to evolve.The technique requires virus purification and gelelectrophoresis, which is a major constraint forroutine diagnosis, especially in small laboratories.Moreover, the accuracy of membrane-based tech-niques is strongly dependent on subjective inter-pretation, which is aggravated by nonspecialisedpersonnel operating dengue diagnostic kits. How-ever, similar specificities and sensitivities withthose of more established EIA assays have beenreported [46]. Recently, recombinant purified Bdomains of dengue virus serotypes 1–4 wereapplied in immunoblot strips to detect serotype-specific antibodies in serum samples, stainedaccording to routine procedures by using peroxi-dase-labelled rabbit anti-human serum [53]. Agood correlation between the results of immuno-blot strips and type-specific RT-PCR was observedin primary infections (see below) [54]. Otherimmunoblot kits for dengue diagnosis have beenavailable for several years [3,47,55,56], despitebeing usually unable to detect antibodies to theNS1 protein in primary infections. A recent reportdemonstrated the detection of dengue NS1 antigenin serum or plasma in the absence of anti-dengueIgM antibodies, with some advantages over RT-PCR (see section on PCR-based techniques),namely the possibility of storing the samples at4�C for retrospective testing and the absence ofcontamination due to the higher stability of anti-gens [57].
Virus detection
Isolation in cultureOne of the traditional methods for isolation of den-gue viruses is intracerebral inoculation of newbornmice [58]. However, the lack of a high neurotropicactivity of the virus makes it the least sensitivemethod of isolation [16]. In contrast, inoculationof clinical specimens (serum, plasma and othersterile body fluids) into mosquito cells, larvae oradult mosquitoes is the most sensitive approachfor dengue virus isolation in culture [59]. It is fre-quently followed by specific detection and identi-fication of the virus by immunofluorescence assaysemploying serotype-specific anti-dengue monoclo-nal antibodies (see section on antigen detection).The binding of a specific monoclonal antibody is
revealed with a second, labelled antibody [7,60].The cytopathic effect can also be assayed in mam-malian cells [36]. Unfortunately, some mammaliancell lines have low or no sensitivity for differentdengue virus serotypes and strains may, in turn,require an adaptation period after the inoculationof cell cultures [61]. Mosquito cells are more sensi-tive for the recovery of dengue viruses than mam-malian cells, and are easily grown and stocked atroom temperature. A growing-medium which isstable for at least 2 weeks and simple performanceare further advantages [62–64]. Cells from thegenus Toxorhynchites and Aedes are frequentlyused for inoculation [16,62,65] as in the inoculationof live mosquitoes [64,66]. The advantages of Tox-orhynchites are its large size, thus facilitating inocu-lation and, as with other mosquitoes, a lowercross-contamination of cultures. However, high-sensitivity requires the inoculation of many mos-quitoes, due to the low inoculation volume, andproduction of Toxorhynchites mosquitoes in labora-tory is fastidious, since larvae are carnivorous andrequire co-production of another mosquito speciesas a food source. Adult male mosquitoes of Aedesaegypti and Aedes albopictus species are easier tomaintain but, owing to their smaller size, theyrequire more delicate inoculation techniques.When colonised mosquitoes are not available, theabove mentioned mosquito cell lines can be usedfor inoculation. The sensitivity thus obtained isusually lower than with live mosquitoes, but theutilisation of a larger inoculum volume permitsenough sensitivity for routine virus isolation[7,67]. Furthermore, cell cultures have higher isola-tion rates and do not require special facilities orhigh technical training [16]. Days to weeks arenecessary for successful virus isolation; moreover,the presence of only small amounts of viable virusin the inoculum, the formation of virus–antibodycomplexes and inappropriate handling of samplesmay decrease the efficiency of the technique [28].Owing to the high antibody titre, dengue virus isonly rarely isolated from blood during the acutephase of a secondary infection, thus suggestingthe use of mosquito inoculation or macrophagecell lines as virus recovery systems [29]. Themain disadvantages of dengue virus detection byculture are its inability to provide a successfuldiagnosis in the brief initial period after the onsetof fever, the heat-lability of dengue virus, the highcost of equipping and maintaining laboratories for
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virus culture and the interference caused by largeamounts of antibodies and subsequent immunecomplex formation. Obtaining the specimen earlyin the disease and prompt delivery to the labora-tory greatly affect the performance of virus isola-tion [16].
Antigen detectionDengue viral antigens may be detected in periph-eral blood leukocytes from dengue patients, espe-cially during the febrile phase of illness [7,23]. Ingeneral, visual detection of dengue virus antigensis performed in acetone-fixed leukocytes, snap-fro-zen tissue or in formalin-fixed tissue (to removethe lipids), after partial digestion by proteases toreveal antigens cross-linked by formalin [7]. Viralantigens circulate in the patient’s blood for longerperiods than viral RNA; therefore, detection of vir-al antigens may afford a positive diagnosis insituations where viral RNA is not detectable [57].Monoclonal antibodies may be inefficient for iden-tification of dengue viruses in culture owing to thelow viral replication rate, resulting in low viralconcentration in the tissue [16]. Nonetheless,immunofluorescence tests have become routinelyused in most diagnostic laboratories for denguevirus diagnosis [64,68,69].
Genome detectionThis can be done by nucleic acid hybridisation andPCR-based techniques.
Nucleic acid hybridisation. In situ hybridisationcoupled with electron microscopy has been usedfor ultrastructural studies and diagnosis of dengueRNA detection within mosquito cells [70,71]. Somenucleic acid hybridisation procedures for thedetection of dengue RNA extracted from infectedcell cultures and live mosquitoes using both bioti-nylated and 32P-labelled probes have also beendescribed [72,73]. Radiolabelling has been gradu-ally discarded due to the well-known constraintsof dangerous radioactive materials. The biotinyla-tion method is less sensitive and so not very usefulfor viral identification in clinical samples, unless aprior step of amplification is performed by PCR[16]. This is the main reason why hybridisationhas been replaced by PCR for direct virus detec-tion and identification.
Nevertheless, a novel in situ hybridisation proto-col was developed for detection of dengue RNA in
mosquitoes. The sandwich technique, called rever-sible target capture (RTC) hybridisation, utilisestwo DNA probes: a poly(dA)-tailed capture anda digoxigenin-labelled detector probe. After hybri-disation of both probes to the target dengueRNA, the former probe is captured by oligo (dT)-coated paramagnetic beads and the specific hy-brid is detected through the labelled probe. Thetechnique can be directly applied in the tissue,thus eliminating the steps of extraction and puri-fication of the target genomic material. Goodsensitivity, rapidity and simplicity of operationare claimed [74].
PCR-based techniques. Dengue viral RNA genomemay also be detected in tissue or serum samplesfrom humans or in mosquitoes by reverse-tran-scription–polymerase chain reaction (RT-PCR)amplification technique [7,23,28,75–77]. The detec-tion of dengue virus by this technique is no lesscomplex or expensive than virus culture in mos-quito cells, but is faster, more sensitive and allowsdetection of viral particles in serum containingonly few copies of viral genome or anti-dengueantibodies [77]. The combination of the two re-actions—reverse transcription of the viral RNAgenome to a cDNA copy and subsequent Taq poly-merase-mediated amplification of this cDNA—in a single reaction vessel greatly decreases theassay time and the risk of contamination, whichis traditionally one major handicap in PCR, andfacilitates handling of a large number of speci-mens. The RT-PCR technique is already a verypowerful investigational approach in epidemiolo-gical analysis and evolutionary studies, since thebasic methodology of directly amplifying RNAinto DNA can be used to amplify larger regionsof the genome for rapid sequence analysis [7,28].The technique was useful for detecting and typingdengue viruses in suspected cases, allowing arapid identification of new serotypes in endemicareas [75].The use of dengue-specific oligonucleotide pri-
mers during the cyclic amplification processallows the amplification of only a few dengueRNA molecules among millions of other RNAmolecules. This technique is less time-demandingthan biological amplification through culture (itcan be performed in a few hours) and allows mil-lion-fold enzymatic amplification. It also avoidscontamination from immune complexes, since
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dengue RNA can be purified from proteins in aprior step of specimen preparation. This is espe-cially important in diagnosis during convales-cence, when high titre antibodies usually hamperdengue virus detection. Another advantage ofthe RT-PCR technique is the possibility of directlydetecting not only the presence or absence of thevirus, but also all the four dengue serotypes.This may be achieved by adding four serotype-specific sets of oligonucleotide primers (selectedfrom the published sequence data of the four den-gue virus serotypes [78–80]) to a single reactiontube or, in a two-step strategy, using a universalset of dengue oligonucleotide primers followedby a subsequent classification step with serotype-specific primers [7,28,81]. These serotype-specificprimers are usually designed for targeting sero-type-specific sequences within the regions flankedby the outer, universal primers. The amplifiedsequences of the four serotype-specific primershave different sizes, as revealed by stained agarosegel electrophoresis, of infected culture fluid of iso-lates in dengue patients or in prototype viruses[76]. Prior use of primers homologous to con-served dengue virus RNA sequences assures thatall strains of dengue virus are amplified in thefirst-round amplification reaction. However, thespecificity of the technique is based on the abilityof the type-specific primers to recognise RNAsequences unique to each dengue virus type.According to a previous study [28], no cross-reac-tivity was detected between the type-specific pri-mers and heterologous dengue virus types; onlya single amplified product was obtained in eachtyping reaction. In comparison to hybridisation,another current method for confirmation of theamplification product, the RT-PCR method ismore sensitive and easy to carry out, because itrequires only electrophoresis of the amplified pro-duct, whereas hybridisation requires labelling,purification and standardisation of probes.The current use of the RT-PCR method as a
diagnostic tool, however, is still hindered by themeticulous manipulation required both for opti-mal preparation of specimens and to avoid false-positive results due to contamination [82]. Thestorage of serum samples at �70�C is essentialfor RT-PCR to maintain viral RNA in optimal con-ditions, but this is not feasible in many areaswhere dengue disease is endemic [57]. Whenapplied to dengue diagnosis, it is still necessary
to determine the oligonucleotide primer sequencescapable of detecting all or most dengue genotypesin circulation [7]. Real-time PCR can give informa-tion about the kinetic profile of the amplificationprocess, by monitoring the dynamic change inintracellular dengue virus RNA during the courseof infection [2]. By using a generic fluorogenicprobe highly homologous with all dengue virusserotypes and appropriate sets of serotype-specificprimers, it is possible to detect all the four denguevirus serotypes with high sensitivity and withoutcross-reactivity among the different serotypes.With this procedure, very low detection limits ofthe four dengue serotypes can be achieved [81,83].Many of the reported works claiming detection
of dengue virus based on RT-PCR, and agarosegel for confirmation of the results, use dengue gen-ome coding sequences, namely those responsiblefor the expression of the viral envelope protein-Eand nonstructural proteins NS3 and NS5, as con-served sequences among the four dengue sero-types [28,76,84,85]. However, the sensitivity ofconventional dengue RT-PCR may be low for thesignificant variants that occur, probably becauseof codon degeneracy [81,86]. Recent studies ofnucleotide sequencing of the 3’ non-coding regionof dengue virus strains of the four dengue sero-types isolated in different geographical regions,and subsequent nucleotide sequence alignment,lead to the generation of consensus sequences foreach serotype. The results showed that the 3’ non-coding region contains probably the most con-served sequence in the four serotypes; it is a sec-ondary structure presumably involved in viralreplication, transcription and virulence [87–89].For this reason, these unique dengue 3’ non-cod-ing sequences may be useful as serotype-specificmarkers to detect, differentiate and quantify thedifferent serotypes with high sensitivity and speci-ficity [81,90]. The use of consensus primers toamplify all four dengue virus serotypes, togetherwith four serotype-specific primers, in a single-step PCR, allows discrimination of the four den-gue serotypes after separation of the PCR frag-ments by agarose gel electrophoresis. Since themethod is able to identify dengue virus serotypesby demonstrating defined sequence homologies inthe genomic RNA, it is of special epidemiologicalsignificance to provide information on the distri-bution of dengue serotypes and strains in endemicareas [91,92].
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While the development of real-time TaqMan RT-PCR provides some improvements over conven-tional RT-PCR, it does not avoid the somewhattime-consuming two-step amplification, composedof a reverse-transcription step and an expensive sec-ond thermal cycling step. This two-step strategyenhances sensitivity, but is also responsible forincreased false-positive results due to cross-contam-ination with the PCR products [93]. RT-PCR hasbeen applied for a few years in serum, tissues andmosquitoes for dengue virus detection, but numer-ous protocols under use still lack standardisation andvalidation for routine diagnostic purposes [14,16].
Recently, a NASBA format for detection of den-gue viral RNA in acute viraemic serum was devel-oped. The system was used for amplification ofRNA from all the four dengue virus serotypeswith a set of universal primers and subsequentidentification of the amplified products by sero-type-specific capture probes. The detection of theamplified product was performed by electroche-miluminescence through a probe-hybridisationmethod (Figure 2), and the results comparedwith those obtained with standard mosquito C6/36 cell culture assay with immunofluorescentdetection. By using known culture positive andnegative serum or plasma samples, the NASBAtechnique exhibited excellent sensitivity and speci-ficity, around 100% [93].
NEW HIGHLIGHTS IN DENGUE DIAGNOSISAn ‘ideal’ dengue diagnostic technique shouldovercome the main limitations of the existing tech-niques. Despite the fact that some technologicalimprovements have met the needs for applicationin the field, the available techniques often fail toaccomplish four basic requirements for a success-ful diagnosis in tropical sub-developed countries:simplicity, economy, rapidity and accuracy [46].Biosensors, new bioanalytical systems potentiallyamenable to miniaturisation, have been producedas portable devices for detection of several patho-genic agents. They consist of integrated moduleswhere the biochemical components, the transducer(e.g. electrochemical, piezoelectric, acoustic oroptic) and the detector are packaged in a singleunit. Biosensors are usually designed to be highlyselective, sensitive, fast and, in general, response-proportional [94].
An optical membrane-based DNA/RNA hybri-disation biosensor using liposome amplification
Figure 2. NASBA technique for amplification of viral RNA
has the following steps: (1) a single RNA chain is used as a tem-
plate at 41�C by an avian reverse-transcriptase with DNA poly-
merase activity; (2) primer A hybridises to the RNA chain; (3) a
single DNA chain is formed through elongation of the primer
by the polymerase; (4) the RNA moiety of the DNA-RNA hybrid
is degraded by a RNAase H; (5) primer B hybridises to the newly
synthesised DNA chain; (6) a second DNA chain is formed by the
polymerase through elongation of the primer B, using the first
DNA chain as a template; and (7) the bacteriophage T7 RNA
polymerase, with a promoter sequence codified in the double
stranded DNA-coupled primer A, synthesises new viral RNA
single-stranded molecules by using the double-stranded DNA
as a template. These newly formed RNA molecules, in turn, serve
as templates for a new round of amplification of the target
sequence. Since they are synthesised as antisense molecules to
the targeted sequence, the second round of amplification must
begin with hybridisation of primer B, rather than primer A, to
the RNA template. Detection and identification of dengue viral
RNA can be achieved by using, respectively, a conserved and four
serotype-specific capture probes, as well as a common detector
probe as a primer A-bound label suitable for electrochemilumi-
nescence detection
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was recently used for detection of generic andserotype-specific synthetic dengue genomicsequences. After isothermal amplification of theviral RNA by the transcription-based amplificationmethod, a biotinylated DNA capture probe wasimmobilised on a streptavidin-coated polyether-sulfone membrane and a DNA reporter probewas coupled to the outer surface of a liposome[41]. DNA-coupled liposomes were then mixedwith the amplified dengue virus RNA and themixture added to the membrane. In this way, asandwich was formed between the two probesand the target RNA. Upon passing the capturezone of the membrane strip, the number of repor-ter probe-tagged liposomes was proportional tothe amount of RNA present in the sample, withthe detection being carried out by electrochemilu-minescence with a portable reflectometer. In con-trast, no signal was detected with a nonspecificRNA molecule. The reporter probe was composedof the liposome and an attached DNA oligonucleo-tide sequence that hybridised to a genericsequence added to the dengue RNA during theamplification step. This generic reporter probewas used in the construction of both a genericand four dengue serotype-discriminating biosen-sors. In the generic biosensor, a conserved captureprobe complementary to a conserved region with-in the dengue RNA genome was also used. Tobuild the serotype-specific biosensors, a trickychange was the use of four serotype-specific cap-ture probes, one of them for each of the four bio-sensors. After optimisation with respect tosensitivity and specificity, the biosensors showeda very high correlation with a complex and expen-sive electrochemiluminescence laboratory-baseddetection standard system, by analysis of sevenpositive samples and three negative control sam-ples. Despite the fact that the laboratory-based sys-tem has a much larger dynamic range than thebiosensor, the latter allows a clear distinctionbetween different RNA concentrations andbetween positive and negative samples. After ana-lysis of 11 clinical samples, only dengue serotype-3exhibited some cross-reactivity. After genomicamplification, the biosensor was able to detectthe synthetic dengue virus RNA within 15 minutes[41]. By suitable optimisation of the stringenthybridisation conditions, the assay was able todetermine specific DNA sequences at femtomolarconcentrations [95].
A slight variation of this biosensor was devel-oped for detection of a synthetic dengue RNAsequence, consisting of a biotinylated genericsequence-bound capture probe attached to a strep-tavidin-coated magnetic bead. When the targetRNA was present, the reporter and capture probeshybridised to it, forming a liposome–RNA–beadcomplex that became immobilised on a permanentmagnet in the capture zone of the device. The finalquantification was performed by fluorescencemicroscopy. These liposomes entrap hundreds orthousands of marker dye molecules, thus providingenhanced signal amplification and sensitivity forlow nucleic acid concentrations, much higher thanin single fluorophore detection [96–98]. Accordingto previous studies with membrane strip-based bio-sensors, it should be possible to apply this opticalbiosensor for real dengue RNA detection in thesame hybridisation conditions and with a similarsensitivity, around 100-fold higher (in the picomo-lar range) than with the former polyethersulfonemembrane biosensor [97,98]. This biosensor wasbuilt in a microfluidic format suitable for mass pro-duction of miniaturised devices at the micrometerscale. In addition to the detection module, the sys-tem also includes modules for RNA extraction, pur-ification and PCR-based amplification. Obviousadvantages of this miniaturised molecular assayinclude the need for lower quantities of reagentsand power consumption, increased rates of diffu-sion and mass transport, and a very high through-put. This fully automated, whole-integrated systemis also faster and cheaper than more technologicallydemanding laboratory-based methods for molecu-lar diagnosis [98,99]. It is expected that furtherresearch may produce a truly portable, easy-to-use microfluidic biosensor in which fluorescentdetection can be replaced by electrochemical detec-tion in a multi-analyte, dengue serotype-specificbiosensor [98].Based on the two biosensors previously
described, an improved universal liposome-basedDNA biosensor was developed. It uses a universaldye-entrapping liposome and a universal poly-ethersulfone membrane with immobilised strepta-vidin (see Figure 3). The detection is performed bya portable reflectometer. In relation to the previousmicrofluidic device, a membrane instead of a mag-net was used in biosensor fabrication due tothe high speed, simplicity and nanomolar range-sensitivity of the assay. A set of experiments with
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synthetic target DNA bacterial sequences was per-formed in order to optimise the universal biosen-sor assay and to determine its detection range.The biosensor assay was optimised in relation tohybridisation conditions, concentrations of thecomponents and length of the generic probe.Data thus obtained were used in assays with realDNA sequences isolated and amplified from bac-terial species. Lower limits of detection may beachieved after prior amplification by PCR or NAS-BA. The results showed good agreement withthose achieved with previously reported specificbiosensors [41,97]. When the sequences of thereporter and capture probes are easily and rapidlychanged to be specific for the dengue RNA targetsequence, the biosensor gives a highly specificand sensitive response (detection limit in thefemtomolar range). Furthermore, using only astraightforward incubation, the overall identifica-tion and quantification periods do not last morethan 30 minutes. Unlike other biosensors currentlyavailable, the present format dispenses with theusual steps for conversion from a generic to a spe-cific biosensor. In general, they require expensiveor complex and lengthy procedures in order todetect a new target sequence, namely the finding
of new probe sequences and further labelling.The present biosensor is a good alternative to theslower blot assays [96].From a certain perspective, RNA and DNA bio-
sensors for viral detection seem to be less promis-ing than antibody biosensors (immunosensors).This is because, in vivo, viral nucleic acids arepackaged inside the viral envelope and thus theirconcentration may be too low for a successfuldiagnosis without prior amplification by PCR,unlike the much more abundant and stable viralproteins. Moreover, salt-dependent electrostaticeffects greatly influence the stability, structure,reactivity and binding of nucleic acids in solutionor at an interface [100]. The buffer compositionstrongly influences detection of dengue virus RNAin the former membrane-based biosensor. Sincethe components of the buffer solution may favourhybridisation under appropriate conditions, theirconcentrations were varied for optimisation ofthe microfluidic biosensor [98]. In a recent report,an immunochip for detection of dengue viral anti-gens was fabricated [101]. This biosensor employstwo specific monoclonal antibodies for the glyco-protein-E and NS1 protein, respectively, immobi-lised in a piezoelectric transducer. Multi-antibody
Figure 3. Scheme for a universal biosensor. (1) At 41�C, an incubation of the following mixture takes place: a universal liposome carrying
a dC-rich probe, a reporter probe with a dG-rich terminal and a target-specific sequence, the target sequence (e.g. dengue viral genome)
and a biotinylated capture probe. After the incubation, a polyethersulfone membrane with immobilised streptavidin is added to the
mixture. (2) After a few minutes, a specific detection of the target sequence is performed, with its concentration being proportional to
the amount of bound liposomes in the detection zone
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coating allows the capture of several different anti-gens, thus enhancing the detection signal. The sen-sitivity obtained was 100-fold greater than with theconventional sandwichEIAassay, enabling thedetec-tion of a very low viral antigen concentration (of0.05 mg/ml) in the specimen, and consequentlyaffords an earlier diagnosis when compared withother current methods, especially in the viraemicphase. The immunosensor is also characterised bylow technical demands, easy result interpretationand short response time (30–60min) [101].At present, biosensors for dengue diagnosis are
still in the early stages of development and evalua-tion, which is not surprising given the fact that thefour dengue serotypes are among the most diffi-cult to cultivate and propagate in the laboratory[24]. One reason for this is certainly the high varia-bility between the different serotypes, especiallywhen isolated in various geographical regions[40]. It is believed that an efficient biosensor fordengue diagnosis should be a multi-analyte devicefor detection of the four serotypes [102].Wider utilisation of biosensor technology for
dengue diagnosis in clinical facilities suffers basi-cally from the same constraints faced by otherinfectious pathologies. The majority of the com-mercially available biosensors make use of electro-chemical transduction, which is more suitable formicrofabrication and miniaturisation [103]. Thesebiosensors, however, have problems of interfer-ence from electrochemically active substancesand troublesome electron-transfer pathwaysbetween the redox enzyme and the electrode sur-face. In general, the behaviour of the active biomo-lecules when adsorbed on a surface is highlyunpredictable; together with troublesome interac-tion of matrix compounds, this may complicatedetermination of selectivity, sensitivity, detectionlimit and response time of the biosensor [102].Additionally, mass production of biosensors witha reproducible output requires large amounts ofthe purified biomolecule from a biological sourcewith a reasonable degree of purity, except in thecase of the highly specific monoclonal antibodies.Moreover, certain biological components of thebiosensor may be released over time, thus contam-inating the biological sample. Today’s biosensorsalso have poor stability and difficult sterilisation,thus explaining the increasing interest and invest-ments in single-use disposable devices, by usingcheap integrated chip technology [100,104]. The
modest stability of biomolecules for biosensingunder working conditions, e.g. room temperature,usually limits the good performance of the biosen-sor up to some months [104]. Nonetheless, storageunder refrigeration and immobilisation of the bio-logical sensing element in membranes or gels maybe employed to overcome these obstacles. Othersetbacks in biosensor research and developmentinclude low selectivity due to non-specific interfer-ing signals at the level of the transducer elementand the high costs required to implement thenew technology. In the future, a new generationof biosensors must overcome the usual poor flex-ibility and discriminating power of current biosen-sors by suitable inclusion of purification andchemical modification steps in the analyticaldevice, namely in a microfluidic format [103].Research about the effects of interfering substanceshas been performed in pure synthetic samples, likemodel-DNA sequences, rather than in complexreal samples while prior knowledge of the selec-tive molecular recognition processes is needed[104]. Constraints about the interpretation ofresults by non-clinical laboratory staff and mainte-nance of historical patient records must also beconsidered in biosensor-based diagnosis. How-ever, the still limited availability of biosensors inthe market may be due mainly to a lack in theappropriate technology for their manufacture at acompetitive cost rather than a lack of fundamentalknowledge [100]. Future advances in biosensortechnology will require integration of analyticalchemistry, surface chemistry, materials engineer-ing, biological sciences, microelectronics, micro-fabrication and automation before these devicescan become more widely accepted by the clinicalcommunity as valuable diagnostic tools for diag-nosis of dengue and other infectious diseases.
ACKNOWLEDGEMENTSThe authors acknowledge the Fundacao para aCiencia e Tecnologia (FCT), Portugal, for supportfor this work in the form of a PhD grant (ref.:SFRH/BD/6186/2001) to Fernando Teles, Finan-ciadora de Estudos e Projetos (FINEP), Brazil.
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Copyright # 2005 John Wiley & Sons, Ltd. Rev. Med. Virol. (in press).
84
3.2 “ELECTROCHEMICAL DETECTION OF A DENGUE-RELATED
OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCE USING FERROCENIUM AS A
HYBRIDIZATION INDICATOR”
Teles, F.R.R.; Prazeres, D.M.F.; Lima-Filho, J.L. Analytica Chimica Acta
(submetido).
1
ELECTROCHEMICAL DETECTION OF A DENGUE -RELATED
OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCE USING FERROCENIUM AS A
HYBRIDIZATION INDICATOR
F.R.R. Teles1, D.M.F. Prazeres2 and J.L. Lima-Filho1*
1 Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE), Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Campus Universitário, Cidade
Universitária, Recife, PE – CEP: 50670-901, Brazil.
2 Centro de Engenharia Biológica e Química, Instituto Superior Técnico, Av. Rovisco
Pais, 1049-001, Lisbon, Portugal.
* Corresponding author: Dr. J.L. Lima-Filho, Laboratório de Imunopatologia Keizo-
Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Av. Prof. Moraes Rego,
1235, Campus Universitário, Cidade Universitária, Recife, PE – CEP: 50670-901,
Brazil.
E-mail: Jose_Luiz60@terra.com.br
Abstract
A simple method for electrochemical detection, after nucleic-acid hybridization,
of a synthetic 20-bp oligonucleotide target sequence related with dengue virus genome
was developed. A complimentary DNA probe sequence was stably immobilized onto a
glassy carbon electrode previously modified with chitosan oligomer via strong
electrostatic interactions. Electrochemical detection of hybridization between probe and
target strains was performed by cyclic voltammetry, using ferrocene (in the form of
ferrocenium ion, Fc+) as a hybridization indicator. Ferrocene binds DNA with different
intensities whether single or a double strands are present, thus originating distinct
voltammetric peak currents. After hybridization of the complimentary chain, the peak
2
current response of ferrocene oxidation increased around 26%. A higher voltammetric
decay rate constant (kd) and a lower half-life period (t1/2) for the interaction of ferrocene
with double-stranded DNA (dsDNA) compared to those with single-stranded DNA
(ssDNA) also confirmed the two different strengths of interaction with the two types of
DNA. Thus, by combining the simplicity of DNA immobilization onto a chitosan film
and suitable voltammetric detection of hybridization concomitant with ferrocene
attachment to DNA, good results were obtained towards discrimination between ssDNA
and dsDNA.
Keywords: modified glassy carbon electrode; DNA electrochemical biosensor; DNA
immobilization; hybridization indicator; chitosan; dengue diagnosis
1. Introduction
Biosensors have found many applications in both research and industry, namely
in the fields of agriculture, pharmaceutics, environment, food, forensics and clinical
diagnosis, for the detection of specific biomolecules of interest. Concerning clinical
diagnosis, many reports have been published in recent years on the detection and
quantification of nucleic-acids in biological samples in order to identify inherited and
infectious diseases of bacterial or viral origin. The assays described often make use of
the peculiar ability of DNA or oligonucleotide complimentary chains to hybridize, not
only in vivo, but also in vitro. This allows discrimination between ssDNA and dsDNA,
as well as, by the reversible nature of the process, the development of reusable
biosensors. In most cases, the use of a previously labeled nucleic-acid probe is required.
The most traditional labeling method – enzymatic labeling with 32P or 125I radioisotopes
-, despite its high sensitivity, has been progressively discarded due to the potential
dangers of radioactivity. New labeling procedures, including avidin/biotin [1],
digoxigenin [2], fluorescent dye [3] and a chemiluminescent agent [4], have replaced
the radioactive method but, in general, they are complex and time-consuming.
Furthermore, these techniques have been mainly applied to the classical southern
transfer and dot-blot formats [5]. The PCR method was a major advancement for easy,
specific and sensitive detection of infectious pathogens, despite its greater efficiency for
3
qualitative rather than quantitative DNA detection [6]. More recently, DNA biosensors
with optical [7,8], piezoelectric [9,10,11], acoustic [12,13] and electrochemical
transduction have been developed for sequence-specific DNA detection. Among them,
electrochemical biosensors have gained particular interest for commercial purposes
because they are rapid, sensitive, cheap and amenable for in-the-field detection. In
parallel with the detection technique, surface-immobilization methods have become
increasingly important for the design of electrochemical DNA biosensors, despite the
related problems of optimal immobilization of DNA and screening of highly sensitive
indicators of DNA hybridization onto electrode surfaces [14,15].
The direct method [16,17,18] of DNA electrochemical detection consists in
detecting the redox activity of the nitrogenated bases of DNA, especially adenine and
guanine. Yet, since DNA as a whole is highly redox-inactive, an electrochemical
hybridization indicator is usually needed (indirect method); it may bind DNA through
physical intercalation between base pairs or through electrostatic interaction, in well-
defined binding sites [19]. The effect is an accumulation of the indicator in the DNA
layer near the surface of the electrode. The degree of the accumulation is usually
different if a single or a double-chain is attached, which correlates with different
voltammetric peak currents [20]. The electrochemical indicators more widely used for
DNA detection and quantification are Hoechst 33258, heterocyclic dyes (ethidium
bromide, methylene blue, anthracyclines, phenotiazines and acridine derivatives),
anticancer drugs (e.g., daunomycin) and organomettalic complexes (mainly from Co,
Fe, Os, Pt and Ru). In general, these compounds bind DNA reversibly through
intercalation, with its planar, aromatic groups stacked between base pairs. One
exception is Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium(II), which binds electrostatically to the
negatively-charged sugar phosphate backbone of DNA [21].
Cyclic voltammetry has been used to detect dT-oligonucleotides enzymatically
elongated with dG residues by covalent attachment to a glassy carbon electrode through
N-hydroxysuccinimide and a water-soluble carbodiimide as coupling reagents, using the
metallointercalators Co(bpy)33+ and Co(phen)3
3+ (bpy = 2,2’-bipyridine; phen = 1,10-
phenanthroline) as electrochemical indicators [19]. Short, synthetic oligonucleotides are
ideal chemical recognition elements since they provide highly sequence-selective
hybridization, which is not hindered by the complex conformational changes that occur
in the long-size polynucleotides or genomic DNA. The same group used a similar
immobilization procedure onto a carbon paste electrode added with octadecylamine or
4
stearic acid, which provided functional groups for the covalent attachment of a dT-
polynucleotide elongated with dG residues, to build a biosensor for cystic fibrosis by
using Co(bpy)33+, Co(phen)3
3+ and Os(bpy)33+ as hybridization indicators [20]. In
another work, ethidium bromide was used as the electroactive intercalator to detect an
oligonucleotide covalently immobilized in a graphite electrode chemically modified
with a primary amino group [22]. Erdem et al. [23] reported the detection of short
oligonucleotides related to the hepatitis B virus after electrochemical adsorption on a
pretreated carbon paste electrode, the same immobilization strategy previously used by
Wang et al. [24], working with carbon paste and strip electrodes, to detect short DNA
sequences related to HIV by chronopotentiometry, using Co(phen)33+ as the indicator.
Some works with gold electrodes include physical [15] and chemical [6] adsorption of
DNA with electrochemical detection of hybridization with, respectively, Co(bpy)33+ and
Hoechst 33258, and covalent immobilization through molecular self-assembly (SAM),
followed by DNA detection with methylene blue [25] and daunomycin [5]. Interesting
works were carried out by Xu’s team towards sequence-specific voltammetric detection
of PCR-derived DNA with graphite [26], platinum [14] and glassy carbon [27]
electrodes. They promoted electrochemical accumulation of DNA onto a previously
polarized (pretreated) electrode, as well as DNA immobilization over a chitosan film-
modified electrode. The natural cationic chitosan polymer forms stable complexes with
the polyanionic phosphodiester backbones of either native or denatured DNA [28], thus
providing a very stable immobilization. Moreover, the technique is potentially simpler
and less costly than covalent DNA immobilization’s approaches [27]. In all the three
works, Xu’s group used ferrocenecarboxaldehyde and aminoferrocene as hybridization
indicators. These compounds, unlike the intercalators, covalently label the DNA probes.
In another approach, Ju et al. [29] used ferrocenium ion as a groove-binder to detect
yeast DNA covalently attached to a gold electrode through SAM. In this way, Fc+ was
able to interact with the major grooves of immobilized dsDNA by π-electron
conjugation, due to its planar, aromatic groups. Fc+ may also interact with immobilized
DNA by electrostatic binding [29]. The use of a non-covalent DNA hybridization
indicator (intercalator, electrostatic binder or groove-binder) avoids the costly and
labor-intensive procedures to synthesize the derivatives, label them to the DNA chain
and separate the product.
Dengue fever is one of the most threatning emerging diseases of the near future.
It is a mosquito-borne disease of viral origin and affects more than 100 countries, being
5
endemic and epidemic in most tropical and subtropical countries and also a potential
threat to temperate regions worldwide [30,31]. Its annual incidence reaches 100 million
cases, from which more than 2% correspond to its more severe and acute form, dengue
hemorrhagic fever [32,33]. Until an effective vaccine becomes available, diagnosis has
a major importance, especially in the early, non-specific symptom’s phase [34]. Since,
however, the conventional virological and serological tests are usually lengthy, a
reliable biosensor for viral detection and quantification, combining simplicity, economy,
rapidity and accuracy [35], is urgently needed. Some biosensors for detection of short
dengue-related DNA sequences were already assayed, but the methodologies employed
are somewhat tedious, namely due to the use of biotin-labeled DNA probes and DNA-
tagged liposomes [36,37].
The present paper proposes a simple method to specifically detect a 20-bp
oligonucleotide from the most conserved dengue genomic sequence, the 3’-noncoding
region [38], thus envisaging detection of all the four antigenically-related dengue virus
serotypes (DENV1-4). One major novelty of this work is the simplicity of DNA
immobilization onto a chitosan-modified glassy carbon electrode, combined to a
straightforward detection of the hybridization event through the oxidation peak current
of the ferrocenium ion indicator by cyclic voltammetry. In accordance to Ju et al. [29],
but contrarily to other works (including those mentioned above), we readily included
the indicator into the voltammetric solution itself, thus avoiding the previous binding
step. Promising results were obtained concerning discrimination between ssDNA and
dsDNA.
2. Experimental
2.1 Apparatus
Cyclic voltammetry measurements were performed in a MQPG-01 potentiostat
(Microquímica Indústria e Comércio, Brazil) coupled to a PC. Experiments were carried
out in an electrochemical cell composed by a 0.5 ml acrylic vessel and three artisan, lab-
made electrodes: a working glassy carbon electrode (tightly packed into a glass body)
with 3.0 mm of diameter and an electrical contact provided by a copper wire, an
Ag/AgCl (with 3M NaCl) reference electrode with 4.0 mm of diameter, also with a
6
copper wire contact, and a platinum wire as the counter electrode (diameter of 0.5 mm).
An USC750 ultrasonic bath (UltraSonic Cleaner, Brazil) and a thermostated bath
(BioEng, Brazil) were also used.
2.2 Reagents
The synthetic dengue-related oligonucleotide sequence 5’-GGT TAG AGG
AGA CCC CTC CC-3’ (target) and its complimentary counterpart, 5’-GGG AGG GGT
CTC CTC TAA CC-3’ (probe), were purchased as a lyophilized powder from
Invitrogen. Sodium hydroxide was purchased from Merck, ferrocenium
hexafluorophosphate (FcPF6) was obtained from Aldrich, sodium chloride was acquired
from Anidrol (Brazil) and EDTA was purchased from Grupo Química (Brazil).
Chitosan and SDS were obtained from Sigma. Hydrochloric acid, hydroxymethyl
aminomethane (Tris), icy acetic acid and sodium citrate were acquired from Vetec
(Brazil). Monobasic sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) and dibasic sodium phosphate
(Na2HPO4.7H2O), both used to prepare the phosphate buffer, were supplied by,
respectively, CAQ - Casa da Química (Brazil) and Vetec. All reagents were of
analytical grade. All solutions were prepared with deionized (milli-Q) and sterilized
water. Alumina suspension with particle size of 0.5 μm and a polishing cloth were
obtained from Fortel Indústria e Comércio (Brazil).
2.3. Methods
Electrode preparation
The surface of the glassy carbon electrode was polished with the alumina
suspension using a polishing cloth to a mirror finish. The electrode surface was then
cleaned in an ultrasonic bath for 15 minutes and washed with deionized water. The
electrode was finally sterilized under UV-light for 1h. This procedure was repeated after
each voltammetric experiment. Other materials, including glassware, containers, pipette
tips and the electrochemical vessel, were heat-sterilized prior to use.
7
Probe immobilization
The electrode surface was uniformly coated with 2 μl of 1% chitosan solution in
1% acetic acid and air-dried, after which it was immersed in 50 μl of 0.1M NaOH (to
stabilize the chitosan film [27]) and again air-dried. The electrode surface was then
immersed in a 3.1 mg mL-1 of DNA-probe solution in 0.01 M TE buffer (10 mM Tris-
HCl + 1 mM EDTA) pH=8.0 for 2h. After rinsing with 1 ml of 0.1 M phosphate buffer
pH=7.0 with 0.1% SDS, to remove unbound DNA, the electrode surface was immersed
in the TE buffer until further use.
Hybridization
The DNA-probe modified electrode was immersed in 2×SSC hybridization
buffer (0.3 M NaCl + 0.03 M sodium citrate, pH=7.0) containing 2.6 mg mL-1 of target
sequence. The set was incubated at 42ºC in a water-bath for 1h so that hybridization
could occur. The electrode was finally washed with 1 ml of 0.4 M NaOH with 0.1%
SDS to remove adsorbed (unhybridized) DNA-target [26]. Control experiments of DNA
hybridization (immobilization assays) were performed like the ‘true-hybridization’
assays, but with target-free 2×SSC hybridization buffer.
Indicator binding and electrochemical detection
Cyclic voltammetry assays, simultaneously with indicator-binding, were carried
out at 25ºC by immersing the DNA-modified electrode in 0.01 M TE buffer pH=8.0
with 0.4 mM FcPF6, at 50 mV s-1, in the scan range from -0.1 V to 0.5 V.
3. Results and discussion
The principle of DNA electrochemical detection underlying this work relies on
the fact that ferrocene is an electroactive DNA-binder, exhibiting greater affinity for
8
dsDNA than for ssDNA due to its tight binding to the major grooves of the DNA
double-chain. Since the different affinities to ssDNA and dsDNA provide different local
Fc+ concentrations near the electrode, the presence of a single or a double DNA-chain
correlates with distinctive voltammetric redox peak currents. According to the literature
[14,27], a chitosan support film improves the efficiency of DNA immobilization onto
glassy carbon electrode surfaces by electrostatic interaction between the polycationic
chitosan oligomer and the polyanionic DNA backbone (Fig. 1).
In this work, the immobilization and the hybridization event were distinguished
through the voltammetric peak of Fc+ oxidation. In order to do so, we carried out cyclic
voltammetry on a dsDNA-modified, a ssDNA-modified and a bare glassy carbon
electrode at 50 mV s-1, between -0.1 V and 0.5 V. As can be seen in Fig. 2,
immobilization of the DNA probe yielded an oxidation peak current around 3.1 μA at
394 mV, probably due to the ferrocene directly adsorbed onto the ssDNA-modified
electrode. The nearby hybridization curve shows a 26% higher peak of 4.2 μA at 396
mV, which implies an increased affinity of ferrocene to dsDNA when compared to
ssDNA. The reason for this is a higher Fc+ concentration available for oxidation near
the electrode surface when dsDNA is attached instead of ssDNA. The figure also shows
an oxidation band of ferrocene in the bare electrode; despite being non-negligible, this
band is lower when compared with the two bands of the DNA-modified electrode. The
higher inclination of the bare electrode voltammetric curve also indicates a higher
hindrance of the electronic transport in the bare electrode, which is somewhat
overwhelmed when the electrode is modified with ssDNA or dsDNA.
In order to assess the different interaction strengths of ferrocene with ssDNA
and dsDNA, the model of first-order reaction kinetics was used to determine a
voltammetric decay rate constant (kd), in agreement with the relation Ip = (constant) .
exp(-kd.t), where t is the voltammetric decay period and Ip is the oxidation peak current
at time t. This was performed by recording the Ip values of consecutive scans in both the
hybridization and the immobilization assays and plotting their logarithms against t (Fig.
3). The half-life period (t1/2) for both the immobilization and the hybridization assays
was also determined from these data. For the ssDNA-modified electrode, we roughly
estimated kd = 1.9.10-3 s-1 and t1/2 = 353 s and, for the dsDNA-modified electrode, kd =
4.2.10-3 s-1 and t1/2 = 150 s. According to the previous statements, the greater affinity of
ferrocene to dsDNA than to ssDNA may be inferred from the higher voltammetric
oxidation peak obtained, at nearly the same potential, in the former case. On the other
9
hand, kd corresponds to the dissociation rate constant of ferrocene from the DNA
molecule to the bulk solution. Its value is predictably higher with dsDNA than with
ssDNA – as confirmed by the experimental results – since, according to theory, the
decay of the ferrocene oxidation peak would not occur in the ssDNA-modified electrode
if there was no ssDNA-bound ferrocene, which is not the case, as seen in Fig. 2. The t1/2
depletion observed when passing from the ssDNA-modified electrode to the dsDNA-
modified one is also explained by the existence of only a few ssDNA-bound ferrocene
ions. According to theoretical predictions, t1/2 for the ssDNA-modified electrode should
be nearly infinite.
4. Conclusions
This paper describes a very simple method to detect a specific short 20-bp
dengue-related oligonucleotide sequence by cyclic voltammetry with a glassy carbon
electrode, simultaneously with the use of Fc+ as a hybridization indicator, and chitosan
oligomer as a binding layer for improved efficiency of DNA immobilization. In order to
detect all the four antigenically-related dengue virus serotypes (DENV1-4), the
oligonucleotide sequence was chosen among the most conserved region of dengue virus
genome, the 3’-noncoding region. Based on the different affinity abilities of Fc+ towards
ssDNA and dsDNA, the method was able to discriminate them by a significant 26%
increase in the oxidation voltammetric peak current of Fc+ when dsDNA was
immobilized instead of ssDNA. This result shows that, unlike in other reports, the
oxidation instead of the reduction peak of Fc+ can be successfully used to detect DNA
hybridization. The higher affinity of Fc+ for dsDNA was further demonstrated by a
more pronounced decay of the voltammetric oxidation peak than in the case of ssDNA-
Fc+ interaction, corresponding to a higher kd and to a lower t1/2. Due to the significant
liability of native DNA under storage and operational conditions, the use of short
synthetic oligonucleotides, as in the case of this work, becomes advantageous. The use
of chitosan as an immobilization support and of Fc+ as a non-covalent DNA marker for
hybridization allow to avoid the common drawbacks of covalent binding, namely
complexity, morosity and expensiveness. A reported highlight of using a chitosan film
to immobilize DNA is that a high ionic strength of the ssDNA solution may be
employed to minimize nonspecific DNA adsorption [14]. In theory, the method may be
10
successfully used to specifically detect each one of the four dengue serotypes by
appropriate choice of four serotype-specific oligonucleotide sequences among the viral
genome; this may be one of our working headlines in the near future. Being aware of
the still early stages of biosensors research and production for clinical purposes, the
method here proposed may be a significant contribution for future diagnosis of dengue
and other infectious pathogens envisaging rapidity, simplicity, low-cost and in-the-field
detection with small, portable devices.
Acknowledgements
We acknowledge the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal,
(through co-financing of Programa Operacional Ciência e Inovação – 2010, POCI 2010,
and Fundo Social Europeu, FSE) for supporting this work with a PhD grant (ref.:
SFRH/BD/6186/2001) to Fernando Teles, and to Financiadora de Estudos e Projetos
(FINEP), Brazil, for partial support on the infrastructure. We also acknowledge Prof.
Marcelo Navarro, from the Department of Fundamental Chemistry (DQF) of UFPE, for
having gently lend us the glassy carbon electrode, as well as to Dr. Madalena Areias,
also of DQF, and to Dr. Rosa Dutra, of our group, for helpful suggestions.
11
Fig. 1
-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5-4.0
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
Cur
rent
/ 1e
-6 A
Potential / V
Fig. 2
NH3+ NH3
+ NH3+
PO4-- PO4
-- PO4--
: : :
i DNA h DNA
GCE Chi
Fc FcFc
12
0,9
1,1
1,3
1,5
0 20 40 60 80 100 120
t / s
ln I p
Fig. 3
13
Fig. 1. Scheme of the molecular mechanisms underlying electrochemical DNA
detection with ferrocene. After chemical modification of the glassy carbon electrode
(GCE) surface with chitosan (Chi), the free amino groups (NH3+) of chitosan monomers
electrostatically bind the outer phosphate groups (PO4-) of a single-stranded DNA
(iDNA) which, by this way, becomes immobilized on the surface of the electrode.
Afterwards, a second, complimentary DNA chain (hDNA) hybridizes with the former
and the ferrocene indicator (Fc) binds double-stranded DNA through its major grooves
or electrostatic interactions.
Fig. 2. Cyclic voltammograms of 0.4 mM FcPF6 in 0.01 M TE buffer pH=8.0 at bare
(dotted line), ssDNA-modified (dashed line) and dsDNA-modified (solid line) glassy
carbon electrode, scanned between -0.1 V and 0.5 V (vs. Ag/AgCl), at 50 mV s-1.
Fig. 3. Linearized time-dependence of oxidation peak currents (Ip) of ferrocene in the
ssDNA-modified (▲) and in the dsDNA-modified (■) glassy carbon electrode.
14
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85
4. CONCLUSÕES
• A emergência da dengue a nível mundial como problema de Saúde Pública,
principalmente da sua forma mais grave (hemorrágica), justifica o incremento
não só da disponibilização de meios e recursos humanos, mas também de
pesquisas fundamentais visando combater a doença, erradicando-a e / ou
minimizando os seus efeitos.
• Até que uma vacina efetivamente segura, validada e multivalente seja produzida,
o diagnóstico assume importância crucial no combate à dengue.
• As restrições significativas de aplicabilidade e eficiência dos métodos
convencionais atuais de diagnóstico da dengue tornam premente o
desenvolvimento e produção em larga-escala de pequenos aparelhos portáteis
para diagnóstico descentralizado, combinando rapidez, baixo custo, alta
sensibilidade e especificidade (sorotipagem) e simplicidade operacional.
• O biossensor eletroquímico desenvolvido neste trabalho, através do pico de
corrente de oxidação do ferroceno em voltametria cíclica, foi capaz de detectar
claramente o oligonucleotídeo-alvo, na gama de mg/mL (submicromolar), por
hibridização com a sonda complementar imobilizada no eletrodo de carbono
vítreo previamente modificado com quitosana, obtendo-se um pico de corrente
de oxidação 26% superior ao de um ensaio análogo sem a cadeia-alvo.
• A obtenção dos valores kd = 4.2.10-3 s-1 e t1/2 = 150 s para o eletrodo modificado
com dsDNA, em comparação com os valores 1.9.10-3 s-1 e 353 s
(respectivamente) para o eletrodo modificado com ssDNA, é uma confirmação
experimental da maior afinidade do ferroceno para cadeias duplas do que para
cadeias simples de DNA.
• O revestimento da superfície do eletrodo de carbono vítreo com um filme
oligomérico de quitosana permitiu uma ligação forte e estável do
86
oligonucleotídeo unifilamentar, por simples interação eletrostática dos grupos
NH3+ da quitosana com os grupos PO4
- da cadeia oligonucleotídica.
• Ao contrário do que acontece na generalidade de outros formatos para detecção
eletroquímica de DNA através de indicadores eletroativos de hibridização, os
resultados aqui apresentados foram obtidos mediante adição do indicador
diretamente à solução de medição voltamétrica; isto permite simplificar o
processo global de detecção, pois assim se eliminam as etapas prévias de ligação
do indicador à superfície do eletrodo e de secagem da mesma, antes da
voltametria.
• Ainda que a detecção de DNA em quantidades muito pequenas exija
normalmente a utilização de eletrodos comerciais padronizados de alta-
fidelidade, a presente aplicação demonstrou a possibilidade de se utilizar
também um simples eletrodo manufaturado de carbono vítreo para a
determinação de oligonucleotídeos na gama de submicromolar.
• Ao contrário da redução do ferroceno (Fc+ → Fc), utilizada correntemente, o
sistema de detecção desenvolvido mostrou que a sua oxidação (Fc+ → Fc2+)
também pode ser utilizada para discriminar satisfatoriamente uma cadeia dupla
de uma cadeia simples de DNA.
• A versatilidade da técnica de detecção eletroquímica de hibridização de ácidos
nucléicos manifesta-se na possibilidade de, não só detectar o vírus da dengue,
como também identificar o sorotipo infectante, para tal bastando, em princípio,
substituir a seqüência oligonucleotídica genérica do vírus por seqüências
específicas de cada sorotipo, e hibridizá-las com seqüências complementares.
87
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6. ANEXOS
INSTRUCTIONS TO AUTHORS ANALYTICA CHIMICA ACTA
An international journal devoted to all branches of analytical chemistry
(1) Submission of manuscripts It is a condition of publication that all manuscripts must be written in clear and grammatical English and be submitted to the Analytica Chimica Acta Web site at http://ees.elsevier.com/aca. Authors are requested to transmit the text and art of the manuscript in electronic form to this address. Each manuscript must be accompanied by a cover letter, preferably on headed paper, that explains the analytical novelty of the research, the key findings of the research and their significance to real sample matrices. If you are unable to provide an electronic version, please contact the editorial office prior to submission at e-mail: aca@elsevier.com; tele-phone: +353 61 709635; or fax: +353 61 709111. Authors are encouraged to identify four persons who are qualified to serve as reviewers. Authors are requested not to suggest reviewers with whom they have a personal or professional relationship, especially if that relationship would prevent the reviewer from having an unbiased opinion of the work of the authors. A working e-mail address for each reviewer is essential for rapid review in the event that reviewer is selected from those that are identified by the authors. You may also select reviewers you do not want to review your manu-script, but please state your reason for doing so. Manuscripts are accepted for review with the understanding that the same work has not been published (except as an abstract, or as part of a lecture, review, or academic thesis), that it is not under consideration for publication elsewhere, and that its submission for publication has been ap-proved by all of the authors and by the institution where the work was carried out; further, that any person cited as a source of personal communica-tions has approved such citation. Upon acceptance of an article, authors will be asked to transfer copyright (for more information on copyright, see http://authors.elsevier.com). This transfer will ensure the widest possible dissemina-tion of information. A letter will be sent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript. A form facilitating transfer of copy-right will be provided after acceptance. If material from other copyrighted works is included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit the source(s) in the
article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases: contact Elsevier Global Rights Department, P.O. Box 800, Oxford OX5 1DX, UK; phone: (+44) 1865 843830, fax: (+44) 1865 853333, e-mail: permissions@elsevier.com. (2) Types of contributions Analytica Chimica Acta publishes original papers, and reviews dealing with every aspect of modern analytical chemistry. Reviews are normally written by invitation of the editors, who welcome sugges-tions for subjects. Topics should be broad enough to appeal to a wide audience. Suggestions should be accompanied by a statement saying why the topic should be on interest to the readership of the journal and a proposed table of contents. Note: Analytica Chimica Acta does not distinguish between papers submitted individually or via a symposium. Consequently symposium papers are subject to the same stringent refereeing procedures as other papers. (3) Manuscript preparation The language of the journal is English. Authors are given every latitude, consistent with clarity and brevity, in the style and form of their papers. Title and initial layout. All manuscripts should be headed by a concise but informative title fol-lowed by the names of the authors and the address of the laboratory where the work was carried out. The author to whom correspondence should be addressed must be indicated by an asterisk. Abstract. All papers, reviews, and Letter articles begin with an Abstract (50-250 words) which should comprise a factual account of the contents of the paper, with emphasis on new information. The abstract should be followed by 4-6 keywords. Experimental. The experimental methods should be described after the introductory material. De-tailed experimental descriptions should be re-stricted to one section of the paper. Sufficient detail should be given to allow any experienced worker to implement the procedures described. Procedural steps should not be numbered. Results and Discussion. These may be treated together or separately. Conclusions. This should include key findings of the research, quantitative analytical perform-ance figures (if appropriate) and their significance to real sample matrices.
id9299972 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com http://www.broadgun.com
Acknowledgements. These should be kept as short as possible. References. The references should be collected at the end of the paper, numbered in the order of their appearance in the text (not alphabetically), and typed on a separate page. Titles of papers should not be given, but all authors should be named. References given in tables should be numbered according to the position of the table in the text. Every reference listed must be cited in the text. Reference numbers in the text are set in square brackets on the line. In the list of references, the following forms should be adopted: [1] R.D. Lowe, R.D. Snook, Anal. Chim. Acta, 250 (1991) 95. [2] H. Grosjean, C. Houssier, in: C.W. Gehrke, K.C.T. Kuo (Eds.), Chromatography and Modifi-cation of Nucleosides, Part A (Journal of Chroma-tography Library, Vol. 45A), Elsevier, Amster-dam, 1990, p. A255. Tables. All tables should be numbered with Arabic numerals and have brief descriptive head-ings; they should be typed on separate pages. The layout should be given serious thought. Column headings should be brief, but should include the units in parentheses, where relevant. Footnotes to tables are denoted by superscript a, b, c... The following usage is recommended: e.g., if molar absorptivities are listed, the heading should be (104 l mol-1 cm-1) so that a number 2.32 in the column signifies 23 200. Alphanumeric computer output is usually unsuitable for reproduction and should therefore be retyped and presented as tables; capitals can be used to simulate computer output if such simulation is essential for illustra-tion. Computer programs. Algorithms should be described clearly and concisely by means of a suitable algorithmic notation, although a standard high-level programming language may also be used. Complete program listings are not normally admissible. Flow charts should be avoided in favour of a textual or tabulated description of the program or data flow. Statements on the portability of the software described to other computer sys-tems, as well as on its availability to interested readers, should be given. Figures. Figures should be suitable for direct reproduction and as rich in contrast as possible. Attention should be given to line thickness, letter-ing (which should be kept to a minimum), and spacing on axes of graphs, to ensure suitability for reduction in size on printing. Axes of a graph should be clearly labelled, along the axes, outside the graph itself. All figures should be numbered with Arabic numerals, and require descriptive legends which should be typed on a separate page of paper. Simple straight-line graphs are not acceptable,
because they can readily be described in the text by means of an equation or a sentence. Claims of linearity should be supported by regression data that include slope, intercept, standard deviations of the slope and intercept, standard error, and the number of data points; correlation coefficients are optional. Figures that are subdivided into subfigures should have uniform designation with lowercase letters. For instance: 3a and 3b. Photographs should be as rich in contrast as possi-ble. Line diagrams are generally preferred to photographs of equipment. Colour illustrations in print are reproduced at the author's expense. However, if together with your accepted article, you submit usable color figures, then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these figures will appear in color on the Web (e.g., Science Direct and other sites) regardless of whether these illustrations are reproduced in color in the printed version. For color reproduction in print, you will receive information regarding the costs from Elsevier after receipt of your accepted article. For further information on the preparation of electronic artwork, please see http://authors.elsevier.com/artwork. [Please note: Because of technical complications that can arise in converting color figures to "gray scale" (for the printed version should you not opt for color in print), please submit in addition usable black-and-white files corresponding to all the color illustrations.] Nomenclature, abbreviations, and symbols. Please use L for litres. Always leave a space between units and use superscripts rather than /. For instance: use mg mL-1 and not mg/ml. Do not use ppm or ppb to denote solid/liquid concentra-tions. Do not use abbreviations in the title or keywords. Define abbreviations that are not standard in this field at their first occurrence in both the abstract and the main text. Ensure consistency of abbrevia-tions throughout the remainder of the manuscript. In all other cases, the recommendations of the International Union of Pure and Applied Chemis-try (IUPAC) should be followed, and attention should be given to the recommendations of the Analytical Chemistry Division in the journal Pure and Applied Chemistry (see also IUPAC Compen-dium of Analytical Nomenclature, Definitive Rules, 1987). (4) Procedure after acceptance A set of proofs will be sent to the corresponding author to be carefully checked for errors. Correc-tions must be restricted to instances in which the proof is at variance with the manuscript. We shall be obliged to make a charge for all `extra' correc-tions at a rate in accordance with their cost to us.
To ensure fastest possible publication, proofs are sent to authors by e-mail, and corrections must be returned to the publisher also by e-mail. If correc-tions are not returned, the article will be passed for publication with in-house corrections only. Au-thors of Letters will not receive proofs; proofing will be done in-house in order to speed up publica-tion. (5) Author benefits There are no page charges. The corresponding author, at no cost will be provided with a PDF file of the article via e-mail or, alternatively, 25 free paper offprints. The PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use. (6) Further information Desk editorial address for 'after-acceptance' corre-spondence Elsevier Ireland, Elsevier House, Brookvale Plaza, East Park, Shannon, Co Clare. Tel: +353 (61) 709600; Fax: +353 (61) 709100. E-mail: aca@elsevier.com
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