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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
VICTOR LEÃO HITZSCHKY MADEIRA
Criopreservação do sêmen canino com um diluidor à base
de água de coco na forma de pó (ACP - 106®): efeito do
tempo de equilíbrio e da taxa de descongelação
FORTALEZA, CEARÁ
Dezembro, 2007
ii
VICTOR LEÃO HITZSCHKY MADEIRA
Criopreservação do sêmen canino com um diluidor à base
de água de coco na forma de pó (ACP - 106®): efeito do
tempo de equilíbrio e da taxa de descongelação
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial
para a obtenção do grau de mestre em
Ciências Veterinárias
Área de Concentração: Reprodução e
Sanidade Animal
Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Daniel
Machado da Silva
Co-orientador: Dr. Airton Alencar de
Araújo
FORTALEZA, CEARÁ
Dezembro, 2007
iii
Universidade Estadual do Ceará
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Título do Trabalho: Criopreservação do sêmen canino com um diluidor à base de água de
coco na forma de pó (ACP - 106®): efeito do tempo de equilíbrio e da taxa de descongelação
Autora: Victor Leão Hitzschky Madeira
Defesa em: 20/ 12 / 2007 Conceito obtido: ________
Nota obtida: ___________
Banca Examinadora
______________________________________
Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva
Universidade Estadual do Ceará
Orientadora
______________________________________
Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo
Universidade Estadual do Ceará
Co-Orientador
______________________________________
Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Silva
Universidade Federal Rural do Semi-Árido
Examinador
iv
DEDICATÓRIA
Dedico a minha namorada Cynthia Levi
Baratta pelo apoio incondicional durante as
minhas atividades do mestrado e em todos os
outros momentos desde que tive a sorte de tê-la
novamente ao meu lado.
v
HOMENAGEM
Aos meus pais, Germano Hitzschky Madeira e
Maria Ângela Leão Hitzschky Madeira, por me
reservarem credibilidade e incentivo, nunca
pondo barreiras frente ao meu crescimento
intelectual.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo privilégio de sempre ter tido condições de enfrentar os desafios e
conseguir crescer a cada dia, pois a mim nunca faltaram saúde, alimento, moradia e o amor de
meus familiares.
Aos meus pais pelo amor incondicional e pelo esforço constante de oferecer aos
filhos o que tem de melhor.
Aos meus irmãos, Daniel Leão e Germano Leão, pela amizade e companheirismo.
A minha namorada Cynthia Levi Baratta por todo o bem que tem me feito, sempre
presente na minha vida, seja me ajudando nas madrugadas estressantes do experimento ou nas
madrugadas sorridentes escutando Chico Buarque ao lado das minhas cadelas Alcione e Iara e
da minha gata Rainha.
À minha orientadora, Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva, pela paciência,
pelos ensinamentos e por acreditar em mim, sempre dando oportunidade de me tornar um
profissional e uma pessoa melhor. Jamais esquecerei sua inestimável colaboração na minha
formação profissional e pessoal.
Ao Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo, pela importantíssima ajuda na análise
estatísca dos resultados e ao Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Silva que sempre foi muito
prestativo.
A todos os que fazem o Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias.
Ao Laboratórios de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino por permitir o uso de
equipamentos necessários para que fosse realizado a análise do sêmen auxiliada por
computador.
vii
À ACP Biotecnologia na pessoa da Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro
pelo fornecimento do diluente ACP® 106, objeto de estudo deste trabalho.
A Funcap, pelo apoio financeiro indispensável ao desenvolvimento das atividades
relacionadas ao mestrado.
A todos os colegas do laboratório de reprodução de carnívoros domésticos por
tudo que me ensinaram e pela excelente convivência.
Aos estagiários do laboratório de reprodução de carnívoros domésticos Ricardo
Parente Jucá, Ângela Cristina de Oliveira e Áurea Helena Rocha Lima pela solicitude durante
a execução dos experimentos.
A companheira de trabalho e amiga Claudia da Cunha Barbosa que sempre esteve
disposta a me ajudar e com certeza foi uma pessoa fundamental para realização dos meus
experimentos e dessa dissertação.
À minha grande amiga Iracelma Julião de Arruda por sua amizade e por sempre
está do meu lado quando preciso.
Ao colega doutorando Daniel Couto Uchoa e ao handler profissional Oiran Filho
pela concessão dos animais para a realização dos experimentos.
A todos os animais que fizeram parte do experiemento, pois eles são sem dúvida
alguma as figuras mais importantes de toda essa dissertação.
As minhas cadelas Alcione e Iara e a minha gata Rainha pelo amor desinteressado
e pela maravilhosa companhia em todos os momentos.
Um agradecimento especial ao meu inesquecível cão Lambão in memorian
responsável pelo rumo que optei traçar na minha vida, pois há dez anos atrás lambão precisou
fazer uma ultra-sonografia com a Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva e desde então resolvi
que faria parte do laboratório de reprodução de carnívoros domésticos.
viii
A todos os animais agradeço e dedico!
ix
RESUMO
Devido ao crescente interesse de criadores de cães em resguardar o potencial genético daqueles animais de alto valor zootécnico e afetivo, vários pesquisadores têm se dedicado ao estudo de técnicas que viabilizem a conservação de sêmen por longos períodos sem comprometer, no entanto, a sua capacidade de fertilização.Dessa forma, esse este trabalho foi dividido em dois experimentos que tiveram como objetivo geral aperfeiçoar o protocolo de congelação do sêmen canino utilizando-se um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®) e mais especificamente, no 1° experimento testou-se diferentes taxas de descongelação e, no 2° verificou-se o efeito do tempo de equilíbrio a 4°C após a glicerolização.Para tanto, 20 ejaculados de 15 cães foram processados, sendo 10 para cada experimento. A fração espermática foi diluída em ACP-106® contendo 20% de gema de ovo e submetida ao resfriamento a 15°C/40min e 4°C/30 min. Posteriormente, o ACP-106® acrescido de gema de ovo e glicerol foi adicionado ao sêmen diluído (glicerolização). No experimento 1, a primeira alíquota foi descongelada a 37°C/1min, a segunda a 75°C/8s e a terceira a 55°C/5s. No experimento 2, após a glicerolização, a primeira alíquota não foi equilibrada(G0h), a segunda o foi por 1h (G1h) e a terceira por 2h(G2h) para só então serem congelados. Foram avaliados os seguintes parâmetros: volume, concentração, motilidade, vigor, pH, morfologia, integridade acrossomal e teste hipoosmótico e no caso do experimento 2 foi realizado a CASA.Pela análise dos resultados do sêmen a fresco, observou-se que em ambos os experimentos os parâmetros avaliados apresentavam-se dentro da normalidade para a espécie canina. Com relação ao experimento 1 a motilidade pós-descongelação demonstrou uma diferença entres as três taxas de descongelação, sendo que a taxa de descongelação de 55°C/5s apresentou os melhores resultados por até 30min após a descongelação. Com relação ao vigor as taxas de descongelação 55°C/5s e 37°C/60s foram as que apresentaram os melhores resultados. No tocante as alterações morfológicas, acrossomas intactos, membranas funcionais e pH não houve diferenças entre os tratamentos. Para o experimento 2, após a descongelação, a motilidade total e progressiva e espermatozóides com velocidade média de G2h foram superiores ao G0h, enquanto que o G1h não diferiu nem de G0h, nem de G2h. Na VAP médio e espermatozóides com velocidade rápida, o G2h foi superior ao G0h com 30min após a descongelação. O VAP rápido, bem como as alterações morfológicas, acrossomas intactos e pH não diferiram entre os grupos. Na termoresistência, houve uma queda a partir dos 30min para a maioria dos parâmetros. No teste hipoosmótico, o G2h foi melhor que o G0h e G1h não diferiu de nenhum dos dois. Em vista disso conclui-se que a melhor taxa de descongelação é a de 55°C/5s e que para a congelação do sêmen canino, utilizando-se ACP-106®, deve-se incluir um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C Palavras-chave: sêmen, cão, criopreservação, tempo de equilíbrio, descongelação, ACP-106®.
x
ABSTRACT
Due to the increasing interest of dog raisers to guard the genetic potential of animals with high breeding and emotional values, several researchers have been dedicated to develop techniques which enables the semen conservation for long periods, without compromising its fertilization capacity. The present study was divided in two experiments, aiming to improve the canine semen freezing protocol, using an extender powder coconut water diluter (ACP-106®). The first experiment tested different thawing rates and the second one verified the effect of equilibration times at 4° C after glycerol addition. Being thus, twenty ejaculates from fifteen dogs were processed (ten of each experiment). The sperm rich fraction was extended in ACP-106® with 20% egg yolk, and frozen at 15°C/40min and 4°C/30 min. Then, the extender with glycerol was added. In Experiment 1, the first rate was thawed at 37°C/1min, the second at 75°C/8s and the third at 55°C/5s. In Experiment 2, after the addition of glycerol, the first rate was immediately frozen (G0h) while the second (G1h) and the third (G2h) ones were balanced for 1h and 2h, respectively, before the cryopreservation process. The parameter volume, concentration, motility, vigor, pH, morphology, acrossomic integrity and hyposmotic test were evaluated. In Experiment 2, CASA was also used. To analyze the results regarding to fresh semen, it was observed that, in both experiments, the evaluated parameter were inside the normality values limits to the canine species. In the Experiment 1, the three thawing rates motility presented differences, being the 55°C/5s rate the one which presented better results until 30min after thawing. Regarding to vigor, the thawing rates 55°C/5s and 37°C/60s presented the best results. There were no differences between groups for the parameters morphologic alterations, intact acrosome, functional membranes and pH. In Experiment 2, after thawing, the total and progressive motility and sperm with an average speed of G2h were higher than G0h, while G1h did not differ neither from G0h nor G2h. The average VAP and sperm with fast speed, the G2h was superior to G0h 30min after thawing. The fast VAP, as well as the morphological alterations, acrossomic integrity and pH did not differ between groups. In thermoresistance test, there was a fall starting at 30min for most parameters. In the hyposmotic test, G2h was better than G0h and G1h did not differ from any of the other two groups. In summary, the better thawing rate was at 5°C/5s. For canine semen freezing, using ACP-106 ®, balance period of 2h after glycerol addition at 4ºC must be included. Keywords: semen, dog, cryopreservation , tempo de equilíbrio, , equilibration time, thawing, ACP-106®.
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
% : Porcentagem
µm/s : Micrômeros por segundo
< : Menor
> : Maior
± : Mais ou menos
≤ : Menor ou igual
≥ : Maior ou igual
°C : Graus Celsius
µm : Micrômeros
ACP - 106® : Diluente à base de água de coco em pó formulado para a espécie canina
ACP®
ALH
: Água de coco em pó
: Amplitude do deslocamento lateral da cabeça
ANOVA : Análise de variância
BCF
BHT
BSA
BSP
: Freqüência de batimento da cauda
: Hidroxitolueno butirado
: Albumina sérica bovina
: Proteínas obrigatórias dos lipídios
CAPES : Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CASA : Análise de sêmen auxiliada por computador
CLONE : Cryogenics Laboratory of New England
cm : Centímetro
CNPq
DMSO
: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
: Dimetilsulfoxido
FAVET : Faculdade de Veterinária
FUNCAP : Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
g
h
IA
HOST
: Gramas
: Horas
: Inseminação artificial
: Teste hiposmótico
L : Litro
xii
LDL : Lipoproteína de baixa densidade
LRC
min
: Laboratório de Reprodução de Carnívoros
: Minutos
mL : Mililitros
mOsmol : Miliosmol
MP : Motilidade progressiva
MT : Motilidade total
Ph
s
: Potencial hidrogeniônico
: Segundos
SCA
SMI
SQA
: Sperm Class Analyser
: Indice de motilidade espermática
: Sperm Quality Analizer
sptz : Espermatozóide
sptz/mL
STR
TES
TTR
: Espermatozóides por mililitro
: Retilinearidade
: N-tris-metil2ácido sulfônico aminometano
: Teste de termo resistência
TRIS : Tris-hidroximetil-aminometano
UECE : Universidade Estadual do Ceará
v/v : Volume a volume
VAP : Velocidade média da trajetória
VCL : Velocidade curvilinear
VSL : Velocidade linear
µL : Microlitro
xiii
LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Página
Figura 1. Porcentagem média ± DP de células com acrossoma intacto do sêmen a fresco e descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.
38
Figura 2. Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada do sêmen a fresco e descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.
39
Figura 3. Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.
39
CAPÍTULO 2
Figura 1. Porcentagem média ± DP de células com acrossoma normal do sêmen a fresco e descongelado a diferentes tempo de equilíbrio ( 0h / 1h / 2h)
58
Figura 2. Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h, 2h).
59
Figura 3. Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada de amostras do sêmen a fresco e descongelado a diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h, 2h).
59
xiv
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Página
Tabela 1. Média ± desvio padrão do pH, volume, da concentração, motilidade, vigor, morfologia e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n = 10 ejaculados).
35
Tabela 2. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação em três diferentes taxas de descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.
36
Tabela 3. Média ± desvio padrão do vigor espermático entre três diferentes taxas de descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.
37
Tabela 4. Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e secundárias da cabeça, peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em relação ao sêmen fresco e aos tratamentos 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.
38
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Média ± desvio padrão da concentração, motilidade, vigor, espermatozóides normais, alterações morfológicas e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n = 10 ejaculados).
54
Tabela 2. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.
55
Tabela 3. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.
55
Tabela 4. Média ± desvio padrão da % de SPTZ com velocidade rápida pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação
56
Tabela 5. Média ± desvio padrão da % de SPTZ com velocidade média pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação
56
Tabela 6. Média ± desvio padrão da VAP dos SPTZ com velocidade rápida pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0,
57
xv
30, 60, 90, 120min após a descongelação
Tabela 7. Média ± desvio da VAP dos SPTZ com velocidade média pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação
57
Tabela 8. Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e secundárias da cabeça. Peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em ralação ao sêmen fresco e aos tratamentos 0h, 1h e 2h.
58
xvi
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................................................ ix
ABSTRACT.................................................................................................................... x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS............................................................... xi
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................... xiii
LISTA DE TABELAS.................................................................................................... xiv
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................................... 3
2.1. Criopreservação do sêmen............................................................................... 3
2.2. Métodos de avaliação seminal......................................................................... 5
2.2.1 Motilidade e vigor................................................................................ 5
2.2.2 Morfologia espermática....................................................................... 6
2.2.3 Integridade acrossomal........................................................................ 7
2.2.4. Teste hipoosmótico............................................................................. 8
2.2.5 Teste de termoresistência..................................................................... 9
2.2.6 Sistema de análise seminal auxiliada por computador....................... 10
2.3. O diluente água de coco.................................................................................. 14
2.4. A gema de ovo................................................................................................ 16
2.5. O glicerol........................................................................................................ 18
2.6. Tempo de equilíbrio........................................................................................ 21
2.7. Taxa de descongelação.................................................................................... 22
3. JUSTIFICATIVA....................................................................................................... 25
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS...................................................................................... 26
5. OBJETIVOS................................................................................................................ 27
5.1. Objetivo Geral................................................................................................. 27
5.2. Objetivos Específicos...................................................................................... 27
6. CAPÍTULO 1. Efeito da taxa de descongelação sobre o sêmen canino
criopreservado em um diluidor à base água de coco em pó (ACP-106®)......................
28
7. CAPÍTULO 2. Efeito do tempo de equilíbrio sobre a qualidade do sêmen canino
diluído em ACP - 106® e criopreservado a – 196°C.......................................................
46
8. CONCLUSÕES........................................................................................................... 67
9. PERSPECTIVAS........................................................................................................ 68
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 69
xvii
11. ANEXOS................................................................................................................... 89
1
1. INTRODUÇÃO
O processo de conservação de sêmen ocasiona danos espermáticos, tais como:
redução da motilidade e do vigor, aumento das alterações morfológicas, entre outros que
implicam na redução da qualidade do sêmen preservado. A fim de minimizar esses danos,
foram identificadas substâncias de vital importância na tecnologia do sêmen designados de
diluidores (RODRIGUES, 1997).
Alguns pesquisadores têm tentado desenvolver diluidores alternativos que sejam
atóxicos, isotônicos, tenham atividade tamponante, sejam de baixo custo, práticos e eficientes.
Já há alguns anos, têm sido observados bons resultados na criopreservação do sêmen canino
utilizando-se, diluidores à base de água de coco in natura (CARDOSO et al., 2003). No
entanto, o uso desses diluidores apresenta desvantagens, como a baixa disponibilidade dos
frutos com características ideais para a sua fabricação e a impossibilidade de conservação por
longo período da água de coco em sua forma in natura. Ademais, a constituição bioquímica
de um fruto costuma ser bastante diferente dos demais, o que pode diretamente influenciar a
criopreservação da água de coco. Diante dessa problemática, novas pesquisas foram
conduzidas no intuito de se desenvolver a água de coco sob a forma de pó (ACP®). A forma
em pó apresenta os mesmos constituintes bioquímicos da forma in natura, porém é
padronizada e mais fácil de ser conservada, o que facilita sua comercialização para regiões
onde o fruto não existe.
Resultados iniciais comparando a água de coco na forma in natura e em pó
mostraram que ambas são similarmente eficientes na criopreservação de sêmen canino
(CARDOSO et al., 2004). Entretanto, esses resultados podem ainda ser melhorados, haja vista
que o protocolo de conservação no uso do diluidor ACP® precisa ainda ser aprimorado.
Diversos fatores podem interferir no sucesso da congelação de sêmen. Dentre
estes, destaca-se o tempo de equilíbrio. Segundo WATSON (1979), o tempo de equilíbrio
seria importante, tanto para permitir a entrada do glicerol na célula espermática, como para
permitir que as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram em
maior grau. Para a congelação do sêmen canino com o diluidor ACP®, os poucos trabalhos
acerca do assunto não fazem uso de um tempo de equilíbrio e preconizam a exposição do
sêmen aos vapores de nitrogênio, imediatamente após a glicerolização. Desse modo, é
2
possível que a alteração do protocolo, através da inclusão de um tempo de equilíbrio após a
glicerolização possa incrementar os resultados pós-descongelação.
Outra fase crítica da criopreservação de espermatzóides é a metodologia aplicada
na descongelação, pois sabe-se que essa fase é responsável por vários danos às células.
Atualmente, existem vários protocolos preconizando diferentes temperaturas de
descongelação para o sêmen canino, as quais variam desde 37ºC por um minuto (SILVA et
al., 1998) a 98ºC por 6,5 segundos (NOTHLING et al., 2007). Convencionalmente, o
protocolo de congelação de sêmen canino com o ACP® preconiza a descongelação a 37ºC
(CARDOSO et al., 2004) por 1 minuto. Porém, não existem informações acerca da aplicação
de outras temperaturas de descongelação no uso deste diluidor para o sêmen de cães.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Criopreservação do sêmen
A criopreservação do sêmen é uma biotecnologia de extrema utilidade para
criadores de cães. Dentre as principais vantagens dessa biotécnica pode-se destacar o fato de
que é possível armazenar o material genético de animais de alto valor zootécnico por um
período ilimitado, transmitindo as características desses animais por várias gerações mesmo
após a morte do animal. Além disso, a inseminação artificial (IA) com sêmen congelado
elimina os riscos de transmissão de algumas doenças sexuais, evita o estresse do animal com
o transporte e permite o aproveitamento de machos velhos ou cães que apresentam doenças
adquiridas que não estejam aptos a realizar a monta natural (STOCKNER, 1995).
ROWSON em 1954 foi quem primeiro obteve sucesso na criopreservação do
sêmen de cães, contudo o relato de nascimento de filhotes da espécie canina utilizando sêmen
congelado só foi notificado quinze anos mais tarde (SEAGER, 1969). No Brasil, a primeira
notificação de sucesso em inseminação artificial (IA) com sêmen canino congelado foi
realizada a pouco mais de 20 anos, tendo sido obtida uma ninhada de seis cães normais da
raça Boxer (VASKE et al., 1981).
A -196°C (temperatura do nitrogênio líquido) não existe água na forma líquida, de
tal forma que o ambiente celular é altamente viscoso e a difusão é insignificante, sendo assim
reações químicas não podem ocorrer (MAZUR, 1984). Diante disso, a criopreservação de
células vivas se fundamenta no fato de que, teoricamente, após o resfriamento e permanência
a temperaturas extremamente baixas, estas células entram em um estado de quiescência,
reduzindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição nos gastos energéticos e na
produção de catabólitos tóxicos, contribuindo para a preservação celular e, dessa forma,
podem ser mantidas viáveis por longos períodos, de modo que após a descongelação
voltariam a desenvolver suas atividades normais (BATEMAN, 2001).
Infelizmente, ainda existem muitos fatores que influenciam na sobrevivência e
funcionalidade dos espermatozóides criopreservados. A maioria das alterações causadas pelo
estresse térmico se inicia na membrana espermática (JASKO, 1994; HOLT, 2000). A
alteração da temperatura, assim como alterações de osmolaridade, pressão ou pH podem
4
determinar mudanças na estrutura e organização da bicamada de fosfolipídios (GENNIS,
1989). A redução de temperatura de 37ºC a valores próximos de 4-5ºC pode levar ao rearranjo
inadequado de alguns fosfolipídios da membrana plasmática. Com este rearranjo, as
propriedades básicas da membrana biológica, como permeabilidade seletiva e difusão lateral
de proteínas não são mantidas, alterando a funcionalidade da membrana em questão
(WATSON, 1981; GENNIS, 1989; PARKS E GRAHAM, 1992; AMANN E GRAHAM,
1993; JASKO, 1994; WATSON, 1995; HOLT, 2000; WATSON, 2000). Segundo a revisão
de WATSON (2000), existem ainda alguns elementos do citoesqueleto espermático sensíveis
a alterações de temperatura, como é o caso dos filamentos de actina. O mesmo autor relatou
que a despolimerização da F-actina é uma das etapas necessárias para permitir a aproximação
da membrana plasmática e da membrana acrossomal externa, promovendo a exocitose
acrossomal e que, talvez, esta possa ser uma das explicações para a fusão desorganizada das
membranas após o resfriamento e a criopreservação dos espermatozóides.
Com o declínio constante da temperatura, as células estarão expostas à temperatura
de congelação (abaixo de 0ºC), e com isto, as células espermáticas serão expostas a alterações
de osmolaridade do meio que as circunda. A água presente no meio extracelular encontra-se
sob a forma de solução e com a congelação de parte desta água, a saturação de solutos
aumenta, tornando hipertônico o meio externo. Neste momento, para que um equilíbrio
osmótico seja atingido, ocorre um efluxo de água da célula a ser congelada para o meio
externo. Esta tentativa da célula em equilibrar o meio que a circunda pode levá-la a sofrer um
efeito deletério devido a grande desidratação e a exposição a um meio extremamente
saturado. Este efeito é chamado de Efeito de Solução e é considerado um dos pontos críticos
no processo de congelação das células espermáticas (MAZUR et al, 1972; WATSON, 1981;
WATSON, 1995; HOLT, 2000).
No que diz respeito à metodologia de congelação observa-se que existe uma ampla
variedade de protocolos. Em todas as metodologias busca-se minimizar o dano causado ao
espermatozóide pelo processamento, visando recuperar um máximo possível de
espermatozóides viáveis (STROM et al., 1997). O método de criopreservação de sêmen
canino mais usual é aquele descrito por ANDERSEN (1975). Neste método, foi realizada a
diluição do sêmen a 37ºC em Tris acrescido de gema de ovo e glicerol. Em seguida, foi
procedido um período de equilíbrio de três horas, seguido do envase em palhetas plásticas e a
exposição aos vapores de nitrogênio para só então mergulhar as palhetas em nitrogênio
5
líquido. Segundo HAMMERSTEDT et al. (1990) o processo de criopreservação do sêmen
ocorre em 5 fases : 1) diluição e resfriamento; 2) adição do crioprotetor; 3) congelação em
nitrogênio líquido; 4) armazenamento e 5) descongelação. Para esse pesquisador os métodos
para cada uma destas etapas devem ser desenvolvidos de acordo com a espécie, porque cada
etapa impacta de forma decisiva no sucesso da criopreservação.
2.2. Métodos de avaliação seminal
2.2.1. Motilidade e vigor
A motilidade espermática é definida como sendo a porcentagem de
espermatozóides móveis. Atualmente a maioria dos pesquisadores ainda utiliza a motilidade
como principal parâmetro para a avaliação da qualidade seminal. NOTHLINGH et al. (1997)
observaram que a taxa de gestação em cadelas inseminadas com sêmen congelado estaria
relacionada principalmente com o número de espermatozóides móveis após a descongelação,
contudo o sêmen que apresenta uma boa motilidade após a congelação pode apresentar
espermatozóides incapazes de realizar a fecundação em função de danos acrossomais
(PURSEL et al., 1972). NOTHLINGH et al. (1997) complementam que, além da qualidade
seminal, a detecção do momento ideal para a realização da inseminação é de fundamental
importância para o sucesso da inseminação artificial com o uso de sêmen congelado-
descongelado.
Este parâmetro deve ser avaliado depositando-se uma gota do sêmen entre lâmina
e lamínulas previamente aquecidas a 37°C ( SANTOS & VANNUCCHI, 1997). A amostra é
então avaliada em microscópio, no aumento de 100 ou 400x e, de forma subjetiva, será
avaliada a porcentagem de espermatozóides móveis. Uma amostra de sêmen normal deve
possuir motilidade superior a 70% e, no caso do sêmen congelado-descongelado,
CONCANNON & BATTISTA (1989) sugerem, para a espécie canina, uma motilidade acima
de 50% como ideal e, acima de 30% como aceitável para se proceder uma inseminação
artificial.
Outro parâmetro importante para avaliação da qualidade espermática e que deve
ser avaliado conjuntamente à motilidade é o vigor. Este parâmetro é definido como sendo a
velocidade de progressão do espermatozóide onde é atribuído uma nota que varia de 0 a 5
6
(DOBRINSKY et al., 1993). A presença de vigor 0 indica que o espermatozóide está imóvel,
e o vigor 5 indica que o espermatozóide apresenta um movimento flechante e retilíneo. Cães
normais devem apresentar vigor espermático superior a três (progressão moderada pra frente)
(DOBRINSKY et al., 1993).
2.2.2. Morfologia espermática
Um parâmetro de fundamental importância para avaliação da qualidade
espermática é a análise da morfologia das células, uma vez que, espermatozóides com
alterações morfológicas comprometem de forma significativa a fertilidade de machos tanto da
espécie canina como de outras espécies animais (OETTLÉ, 1993). Alguns estudos
correlacionam porcentagem de defeitos espermáticos e infertilidade no cão sendo reconhecido
que 80% ou mais dos espermatozóides no ejaculado devem ser livres de alterações estruturais
(ROOT E JHONSTON, 1994). OETTLÉ (1993) relatou que, na espécie canina, à medida que
se aumenta o percentual de espermatozóides anormais, a fertilidade é reduzida, sendo
observado que, quando a proporção de espermatozóides morfologicamente normais estava
abaixo de 60%, a fertilidade foi adversamente afetada.
Para a análise das alterações morfológicas existem dois principais métodos de
classificação. Um deles divide as alterações morfológicas em primárias e secundárias
(JOHNSTON et al., 2001). Segundo SEAGER (1986) as alterações morfológicas primárias
são aquelas relacionadas com problemas oriundos da espermatogênese, já as secundárias estão
relacionadas a problemas oriundos da maturação espermática no epidídimo ou durante as
fases de manipulação do sêmen, como colheita, diluição, resfriamento, congelação,
descongelação ou ainda após febre, trauma, processo infeccioso e administração de
glicocorticóides. O outro método de análise das alterações morfológicas classifica os
espermatozóides como apresentando defeitos maiores ou menores (OETTLÉ, 1993). Os
defeitos maiores são aqueles que comprometem gravemente a fertilidade, enquanto que os
menores são considerados defeitos de menor gravidade (OETTLÉ & SOLEY, 1988). Tanto
um método quanto o outro podem analisar as alterações de acordo com a sua localização, ou
seja, cabeça, peça intermediária e cauda (SEAGER, 1986; OETTLÉ, 1993).
Para a visualização da morfologia espermática existem vários métodos
disponíveis. Um deles é a realização de esfregaços de sêmen fixados com glutaraldeído ou
7
tampão salina formolizada para manter as características celulares e permitir uma observação
futura sendo então examinados por microscopia de contraste de fase (CBRA, 1998). A
morfologia também pode ser avaliada microscopicamente, após o uso de corantes Wright,
Rosa de Bengala, Diff-Quik, Spermac_ (PURSWELl et al., 1992; OETTLÉ & SOLEY, 1985;
STRÖM et al., 1997), Giemsa (CARDOSO et al., 2003), Hematoxilina-eosina (SILVA et al.,
2003) e eosina-nigrosina (PEÑA, 2000).
2.2.3. Integridade Acrossomal
De nada adianta uma amostra de sêmen que apresente uma porcentagem alta de
espermatozóides morfologicamente normais e excelentes motilidade e vigor se os acrossomas
encontram-se com algum tipo de alteração que comprometa sua funcionalidade, pois para a
ocorrência da fecundação é indispensável que esta estrutura seja capaz de realizar a reação
acrossômica.
O acrossoma é uma vesícula contendo várias enzimas hidrolíticas, incluindo pró-
acrosina, hialuronidase, esterases e hidrolases ácidas, envolvidas no processo de fecundação
(GARNER & HAFEZ, 1995), desempenhando um papel crucial na função espermática
(CARDOSO et al., 2005).
O armazenamento do sêmen a baixas temperaturas acarreta variadas alterações
nas membranas dos espermatozóides, principalmente no acrossoma. Por esse motivo a
observação da integridade do acrossoma é fundamental quando se faz necessária a
conservação do sêmen. Em sêmen de coelho foi encontrado correlação significativa entre
integridade acrossomal e os resultados de fertilização, mas a correlação não foi significativa
entre fertilização e motilidade espermática (HELLEMANN, 1976; WEITZE, 1977). No cão
foi encontrada relação entre motilidade espermática e integridade acrossomal no sêmen fresco
não diluído, o que não foi observado em amostras de sêmen diluído e congelado
(OETTLE,1986). PACE et al. (1981), estudando sêmen bovino, observaram correlação
positiva entre fertilidade e atividade da acrosina e foi observada em sêmen canino fresco,
diluído e congelado a correlação positiva entre fertilidade e integridade acrossomal
(FROMAN et al., 1984).
8
2.2.4. Teste hipoosmótico (HOST)
O HOST baseia-se na observação de que um espermatozóide, com uma membrana
celular íntegra, se colocado em solução hipoosmótica, permite a passagem da água pela
membrana celular até o restabelecimento do equilíbrio osmótico entre os fluidos extra e
intracelulares (SANTOS et al., 2001). Com o influxo da água para o interior da célula, há um
aumento do volume celular (edema), com posterior enrolamento da cauda (JEYENDRAN et
al., 1984).
VON KOLLIKER (1856) apud PINTO & KOZINK (2007), estudando a fisiologia
do sêmen de diversas espécies de mamíferos, relatou primeiramente que os epermatózoides
expostos à água tornam-se imóveis e edemaciados, um fenômeno que poderia ser invertido
colocando os espermatozóides imóveis em soluções capazes de repor a isotonicidade
(soluções salinas, plasma seminal ou soro). DREVIUS (1963) relatou que as caudas de
espermatozóides de touros enrolavam quando estes eram expostos a soluções hipotônicas, um
fenômeno documentado também para o sêmen de coelho e do ser humano (DREVIUS &
ERIKSSON, 1966). Segundo estes autores, o aumento no volume sofrido pelo
espermatozóide exposto a condições hipoosmóticas ocorre com um mínimo de aumento na
sua área superficial. Assim, após a expansão da membrana plasmática da sua cauda, os
filamentos axiais flexíveis iniciam um processo de enrolamento, conferindo uma aparência
mais esférica a célula espermática.
Até então não era atribuída nenhuma aplicabilidade do HOST para indicar a
capacidade funcional da membrana dos espermatozóides e isso só foi feito posteriormente por
JEYENDRAN et al., (1984). Nesse trabalho, o grau de resposta do espermatozóide quando
em um meio hiposmótico foi correlacionado com a habilidade da célula de penetrar oócitos de
hamsters. Em um estudo subseqüente, concliu-se que a resposta do espermatozóide a um meio
hiposmótico era um indicativo da capacidade de fertilização in vitro em seres humanos (VAN
DER VEM et al., 1986).
ENGLAND & PLUMMER (1993) foram quem primeiro realizaram o HOST em
cães e relataram o edemaciamento dos espermatozóides caninos em meio hiposmótico. Esses
pesquisadores concluíram que o HOST era um método apropriado para avaliar a integridade
da membrana podendo dessa forma ser incorporado em análises rotineiras do sêmen, contudo
demonstraram não existir correlação entre a porcentagem de espermatozóides edemaciados
9
com outros parâmetros, como motilidade, morfologia e porcentagem entre vivos e mortos. Por
outro lado recentemente PINTO & KOZINK (2007) concluíram que o HOST resultou em
uma correlação significativa com a motilidade e viabilidade do sêmen fresco e congelado-
descongelado. INAMASSU et al., (1999) demonstraram que existe correlação entre a turgidez
espermática e a morfologia espermática em resposta ao HOST.
JEYENDRAN et al. (1984), ao descreverem a utilização da técnica para avaliação
do espermatozóide humano, testaram soluções com osmolaridades que variaram de 50 a 300
mOsmol, obtendo os melhores índices de reação espermática ao teste ao utilizarem soluções a
150 mOsmol/L, ou menos. Os mesmos autores também testaram diferentes solutos (citrato de
sódio, sucrose, melitose, frutose e cloreto de sódio) e associações entre eles, e verificaram que
a taxa de reação espermática variava de acordo com a solução usada, dentro da mesma faixa
de osmolaridade. Esses pesquisadores obtiveram os melhores resultados com a utilização da
associação entre citrato de sódio (50%) e frutose (50%) a 150 mOsmol/L, incubada por 30
minutos a 37°C, razão por que escolheram esse protocolo como padrão para todos os outros
experimentos a serem realizados futuramente. Quando o edemaciamento do sêmen canino foi
avaliado pelo teste hipoosmótico, recomendou-se a incubação do sêmen em meio
hipoosmótico por 30-60 minutos (ENGLAND & PLUMMER, 1993; KUMI-DIAKA, 1993;
KUMI-DIAKA & BADTRAM, 1994; RODRIGUEZ-GIL-GIL et al., 1994), contudo em um
estudo mais recente, PINTO & KOZINK (2007), observaram que tanto faz incubar o sêmen
em meio hipoosmótico por 1min ou por 60min . INAMASSU et al., (1999), recomendaram
como protocolo pra realização do teste a mistura de 0,1 mL do sêmen em 0,9 mL da solução
hipoosmótica (150 mOsmol). HISHINUMA & SEKINE, 2003 utilizaram água destilada como
uma solução hipoosmótica e concluiram que essa solução seria adequada para realização do
teste.
2.2.5. Teste de termoresistência (TTR)
O teste de termoresistência (TTR) foi proposto por DIMITROPOULOS (1967),
para a avaliação do potencial de fertilidade do sêmen congelado de bovinos, sendo adaptado
posteriormente para outras espécies. Esse teste consiste na incubação, em banho-maria, de
uma amostra de sêmen descongelado, a uma temperatura e por um tempo pré-determinado, de
acordo com a espécie animal.
10
Geralmente a motilidade espermática e o vigor espermático são as variáveis
analisadas durante a execução do teste (BITTENCOURT, 2006), mas caso seja possível a
realização de análise computadorizada, outros parâmetros também podem ser avaliados.
O TTR obteve grande aceitação, pois submete o sêmen a condições de
temperatura semelhantes à que fica exposto no trato genital de fêmeas em estro,
demonstrando e testando a capacidade de resistência do sêmen pós-inseminação
(BITTENCOURT, 2006) e segundo DIMITROPOULOS (1967), esse teste apresentou uma
correlação positiva e altamente significativa com a fertilidade a campo em bovinos.
No tocante a realização desse teste na espécie canina, STRÖM et al. (1997)
relataram que a termorresistência pós-descongelação pode ser mais baixa para o
espermatozóide canino, do que para outras espécies. Além disso, observaram que o
espermatozóide canino mesmo com uma baixa termorresistência não tem, necessariamente,
um baixo potencial fertilizante, visto que o sêmen congelado, com o método CLONE,
apresentou uma baixa termorresistência e mostrou índices de fertilidade de 59,3% e 86,4%,
após inseminação vaginal e intra-uterina, respectivamente (GOVETTE et al., 1996). Por todos
esses motivos, OLAR (1984) sugere que a avaliação da motilidade imediatamente após a
descongelação pode ser mais importante do que a sobrevivência espermática após um longo
período de incubação.
De acordo com os resultados obtidos por esses pesquisadores percebe-se que é
duvidoso relacionar o TTR com a fertilidade do sêmen canino. O argumento de que esse teste
mimetiza o trato genital das fêmeas não é de todo verdade, visto que a única variável em
comum é a temperatura. Sendo assim é bem provável que o ambiente do trato genital da
fêmea seja incomparavelmente mais adequado para sobrevivência dos espermatozóides. Em
vista disso, fazem-se necessários mais estudos para que se possa saber até que ponto se avalia
com segurança a fertilidade do sêmen por meio desse teste.
2.2.6 Sistema de analise seminal auxiliada por computador (CASA)
Até recentemente, a microscopia óptica tem sido usada rotineiramente para avaliar
os parâmetros principais do sêmen do cão, sendo esta uma avaliação subjetiva baseada na
avaliação dos parâmetros motilidade, vigor, concentração espermática e anormalidades
11
morfológicas. Porém, este método clássico, apresenta limitações como a subjetividade e a
variabilidade (OETTLE et al., 1993, IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a), além de ser
influenciada pela temperatura e pelas habilidades do avaliador, levando a uma elevada
variabilidade entre os laboratórios e os observadores ( IGUER-OUADA & VERSTEGEN et
al., 2001b). A qualidade da avaliação depende da qualidade do microscópio, da experiência
do observador e da técnica de fixação e coloração utilizada para análise de morfologia (PEÑA
& LINDE-FORSBERG et al.,1999; PEÑA et al., 1999 ).Uma fonte adicional da variação do
laboratório é o número relativamente baixo dos espermatozóides analisados com estas
técnicas convencionais (PEÑA et al., 1998).
As variações relatadas na estimação da motilidade espermática (MORTIMER et
al., 1986) e dos parâmetros morfológicos (BAKER et al., 1987; KRUGER et al., 1995) do
mesmo ejaculado avaliado por observadores diferentes implicam uma necessidade absoluta
para métodos objetivos e padronizados, para as finalidades clínicas e das pesquisas
reprodutivas (IGUER-OUADA & VERSTEGEN , 2001b; SMITH & ENGLAND, 2001 ).
Isto conduziu ao desenvolvimento de diversos dispositivos de medição semi-computarizado
(IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a, ENGLAND & ALLEN, 1990; RIJSSELAERE et
al., 2002) e computarizado (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b; RIJSSELAERE et
al., 2003, 2004; SMITH & ENGLAND, 2001) para a avaliação da qualidade do sêmen
canino.
A análise seminal auxiliada por computador (CASA) foi primeiramente proposta
por DOTT & FOSTER há 20 anos e é usada atualmente em diversos centros andrológicos
humanos e veterinários. Sua primeira descrição para a análise seminal do cão foi relatada por
GÜNZEL-APEL et al., (1993) e atualmente tem sido utilizada por diversos pesquisadores
(RIJSSELAERE et al., 2003, SCHÄFER-SOMI & AURICH, 2006; ROTA et al., 2006;
SILVA, 2005).
AMANN & KATZ (2004) definiram a análise de sêmen assistida por computador
(CASA) como um sistema automatizado que visualiza, digitaliza e analisa imagens sucessivas
dos espermatozóides, fornecendo informação acurada e precisa que se baseia na avaliação
individual do espermatozóide, calculando, de forma rápida, diferentes parâmetros seminais,
tais como a motilidade total, motilidade progressiva, linearidade e vários parâmetros de
velocidade como: a velocidade curvilinear (VCL) que é a velocidade da trajetória real do
12
espermatozóide, velocidade média da trajetória (VAP) , que é a velocidade média da trajetória
do espermatozóide, velocidade linear (VSL), que é a velocidade em função da linha reta
estabelecida entre o primeiro e último ponto da trajetória do espermatozóide (RIJSSELAERE
et al., 2003; IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001) (figura 1), amplitude do deslocamento
lateral da cabeça (ALH) definida como o deslocamento médio da cabeça do espermatozóide
em sua trajetória real em relação à trajetória média ou linear, freqüência de batimento cruzado
(BCF) definida como freqüência que a cabeça do espermatozóide atravessa a trajetória média.
e retilinearidade (STR) definida como a relação percentual entre VSL e VAP.
Além destas avaliações, o CASA realiza a subdivisão das populações
espermáticas de acordo com a categoria de seus movimentos, em rápidos, médios, lentos e
espermatozóides estáticos (RIJSSELAERE et al., 2007), e ainda permite a avaliação da
morfologia e concentração espermática (RIJSSELAERE et al., 2005).
Durante a última década, diversos sistemas comerciais do CASA (
videomicrografia computadorizada CellSoft, analisador do movimento das células de
Strömberg-Mika, Hobson Sperm Tracker, e Hamilton-Thorne-Thorne), baseados
predominantemente na avaliação individual do espermatozóide, foram validados para o uso
nos cães (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a ,2001b,. SMITH & ENGLAND, 2001,
GÜNZEL-APEL, 1993, RIJSSELAERE et al., 2003). Diversos estudos encontraram
correlações elevadas entre a motilidade, a motilidade progressiva e a concentração calculada
13
com auxilio do computador e a avaliação microscópica óptica convencional (GÜNZEL-
APEL, 1993, RIJSSELAERE et al., 2003 IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b). Os
problemas principais destes dispositivos de medição computarizados são os custos de
investimento elevados e a necessidade de padronização e validação do sistema antes que todo
o uso prático esteja possível (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b, RIJSSELAERE et
al., 2003, SMITH & ENGLAND, 2001). No entanto, há disponível um equipamento com um
preço mais acessível, o analisador de qualidade espermática (Sperm Quality Analyzer-SQA,
United Medical Systems Inc., Santa Ana, CA, USA), que já foi validado para a avaliação do
sêmen canino criopreservado (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a, 2001b). Esse
equipamento registra variações na densidade óptica, convertendo essa informação, por
cálculos matemáticos, em um índice de motilidade espermática (SMI). Tal procedimento
mostrou uma boa repetibilidade de resultados em amostras seminais de boa e ótima qualidade,
observando altas correlações entre vários parâmetros seminais (IGUER-OUADA &
VERSTEGEN, 2001).
Em cães, as alterações significativas das características da motilidade medidas por
sistemas de CASA foram descritas devido à diluição da amostra do sêmen (RIJSSELAERE et
al., 2003, SMITH & ENGLAND, 2001), do diluente usado (RIJSSELAERE et al., 2003,
SMITH & ENGLAND, 2001), da temperatura da análise (SMITH & ENGLAND, 2001) e da
câmara de contagem (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b). Uma vez que estes
sistemas foram padronizados, um grau elevado de repetibilidade pode ser conseguido com
coeficientes de variação inter- e intra ensaios <12% para maioria dos parâmetros (IGUER-
OUADA & VERSTEGEN, 2001b ; SMITH & ENGLAND, 2001).
RIJSSELAERE et al (2003) avaliando o emprego da análise computadorizada
para sêmen de cães afirmaram que sem a atenção aos ajustes técnicos, sobreduto da
padronização e do processamento do sêmen, os sistemas do CASA podem fornecer dados
enganadores ou errôneos. Entretanto, uma vez que o sistema é padronizado para espécie,
podem oferecer uma análise rápida e objetiva de um grande número de espermatozóides, e
podem gerar uma caracterização muito detalhada da dinâmica espermática. Além disso, este
dispositivo melhora significativamente a exatidão e a precisão de métodos subjetivos
existentes da análise do sêmen do cão e faz a comparação entre laboratórios possível.
14
SILVA (2005), verificou uma relação significativa entre padrões de motilidade
avaliados pelo CASA: VAP, VSL e freqüência de batimento cruzado (BCF), com interações
in vitro entre espermatozóides caninos congelados/descongelados e oócitos homólogos,
evidenciando assim a utilização do CASA como uma ferramenta auxiliar para avaliação
espermática canina.
2.3. O diluente água de coco
Há cerca de duas décadas, a água de coco começou a freqüentar laboratórios de
pesquisadores brasileiros interessados no potencial do produto como meio de conservação
celular. Aos poucos, percebeu-se que o produto, muito mais que uma bebida saborosa e
nutritiva, oferece uma variada possibilidade de utilização nas áreas da medicina, da
veterinária, da biologia, entre outras (GALIZA, 2007).
A água proveniente do fruto do coqueiro Cocos nucifera L. (membro da família
Palmae) é uma solução estéril, ácida que corresponde a aproximadamente 25% do peso do
fruto, possuindo um volume de aproximadamente 400 ml e sua composição básica apresenta
93% de água, 5% de açúcares, além de proteínas, vitaminas, sais minerais, fatores de
crescimento (fitormônios) e um baixo teor fosfolipídeo (LAGUNA, 1996). Com composição
química semelhante à das bebidas isotônicas, é considerada como um repositor de sais
podendo ser utilizada na forma de soro oral ou intravenoso, em casos de cólera, problemas
intestinais e estomacais (ANZALDO et al., 1985., MACIEL et al., 1992). O produto sofre
mudanças na sua composição durante o desenvolvimento do fruto. Além do grau de
maturação, outros fatores como variedade, região e época do ano também têm influência
sobre as suas características físico-químicas (JAYALEKSHMY et al., 1984., MACIEL et al.,
1992)
Dentre os componentes da água de coco têm-se os açúcares que, no início da
maturação, apresentam-se na forma de açúcares redutores (glicose e frutose), cujas
concentrações alcançam níveis máximos de 5%, próximo ao 6° e 7° mês, período em que a
quantidade de água também é maior. Com a maturação, a concentração de açúcares redutores
diminui em até 1%, porém são formados açúcares não-redutores (sacarose), sendo, ao final da
maturação, o teor de açúcares totais de, aproximadamente, 2% (CAMPOS et al., 1996,
JAYALEKSHMY et al., 1984 apud MAGALHÃES et al., 2005).
15
A água de coco contém ainda outros compostos que mostram atividades
semelhantes àquelas das citocininas e que são derivados das purinas (difeniluréia), possuindo
uma ação benéfica na motilidade espermática de espécies como caprinos ovinos e caninos
(NUNES & SALGUEIRO, 1999, UCHOA, 2002). O isolamento da citocinina na água de
coco foi realizado por LETHAM (1974 apud NUNES & COMBARNOUS, 1995). Depois de
várias pesquisas, verificou-se que a auxina principal era o ácido 3-indol-acético (LETHAM,
1974 apud NUNES &COMBARNOUS, 1995).
A água de coco in natura proveniente de frutos com idade de seis meses
(variedade verde da praia) apresenta uma osmolaridade em torno de 500 mOsmol/L e um pH
de 4,5 a 5,0 (NUNES & COMBARNOUS, 1995). Para uma perfeita compatibilização da água
de coco in natura como diluente para o sêmen canino, deve ser feita uma correção da
osmolaridade para 300-310 mOsmol/L e do pH para 6,2 a 6,6 (SILVA, 1999). Para tal
correção, após filtrar a água de coco, adiciona-se água destilada e uma solução de citrato de
sódio a 5% (NUNES, 1995).
A solução citada anteriormente já foi utilizada com eficiência na congelação de
sêmen canino (CARDOSO et al., 2003b). Testando-se alguns outros protocolos, observaram-
se melhores resultados (aproximadamente 50% de espermatozóides móveis) utilizando a
solução citada anteriormente contendo 20% de gema de ovo e 6% de glicerol.
Mesmo com os avanços do processamento da água de coco na forma líquida, a
mesma, depois de acondicionada e armazenada não pára seu metabolismo. CAMPOS et al.
1996 observaram a presença das enzimas polifenoloxidase e peroxidase na água de coco
verde. Estas enzimas apresentam o máximo de atividade em pH 6,0 e 5,5 e a temperatura de
25°C e 35°C, respectivamente. Sabe-se que estas enzimas podem estar relacionadas com as
alterações organolépticas que ocorrem após a extração da água do fruto e que catalisam
reações que estão associadas à deterioração de diversos nutrientes (GALEAZZI, 1984). Isso
levou o pesquisador José Ferreira Nunes durante as décadas de 80 e 90 à elaboração de um
produto genuinamente nordestino à base de água de coco em pó (ACP®).
A grande vantagem da água de coco em pó deve-se ao fato de que uma vez
processada, não modifica sua composição até sua utilização, garantindo um “padrão”
confiável (GALIZA, 2007)
16
Tal produto foi registrado como ACP ® (ACP Biotecnologia ®, Fortaleza - Ceará,
Brasil). A água de coco em pó, após reconstituição, foi testada para a refrigeração do sêmen
de eqüinos (SAMPAIO-NETO et al., 2002), diluição para IA em caprinos (SALGUEIRO et
al., 2002), refrigeração do sêmen de cães (MADEIRA et al, 2004), congelação do sêmen de
cães (CARDOSO et al, 2005) mostrando bons resultados.
2.4. A gema de ovo
A gema de ovo tem sido utilizada para aumentar a habilidade de fertilização do
espermatozóide quando presente nos diluidores para o armazenamento do sêmen na
temperatura ambiente (DUNN et al., 1950; SHANNON & CURSON, 1983) e parece prevenir
danos às células espermáticas durante o resfriamento e congelação (PHILLIPS & LARDY,
1940; DE LEEUW et al., 1993). Entretanto, o mecanismo pelo qual esta proteção é fornecida
ao espermatozóide permanece desconhecida. É especulado que a fração lipoprotéica de baixa
densidade (LDL) contida na gema de ovo associa-se com a membrana do espermatozóide e
promova a proteção ao espermatozóide estabilizando a membrana, contudo alguns autores
questionam a estabilidade da associação de LDL com a membrana do espermatozóide
(WATSON, 1975; FOULKES, 1977; MACDONALD & FOULKES, 1981). Uma segunda
hipótese sugere que os fosfolipídios presentes nas LDL protegem os espermatozóides por
formar uma película protetora na superfície do espermatozóide (QUINN et al., 1980) ou por
substituição dos fosfolipideos da membrana dos espermatozóides que são perdidos ou
danificados durante o processo de criopreservação (FOULKES et al., 1980; GRAHAM &
FOOTE, 1987). Essa película protetora é formada por esferas de lipoproteínas que contem
lipídios neutros de tamanho variável, rodeado de uma capa de lipoproteína composta
principalmente de glicoproteínas e fosfolipídios, cujos grupos hidrófobos se orientam para o
interior e os grupos hidrófilos para a superfície (EVANS et al., 1973). Um estudo recente
mostrou que a fosfatidilcolina da gema de ovo associa-se com a membrana do espermatozóide
e protege o sêmen do garanhão tão eficientemente quanto a gema de ovo; entretanto, aqueles
fosfolipídios não são incorporados na membrana espermática (RICKER et al., 2006). Uma
terceira hipótese sugere que as LDLs competem com os peptídeos catiônicos do plasma
seminal prejudicial à membrana do espermatozóide e assim protegem os espermatozóides.
(VISHWANATH et al.,1992). Recentemente BERGERON & MANJUNATH (2006)
descobriram que uma família de proteínas obrigatórias dos lipídeos (proteínas de BSP)
presente no plasma seminal do touro interage com a LDL e que esta interação parece ter
17
efeitos significativos na preservação da integridade do espermatozóide (MANJUNATH et al.,
2002; BERGERON et al., 2004). Segundo FOULKES (1977), a gema de ovo previne também
a liberação da enzima hialuronidase pela célula espermática.
Para a preservação do sêmen canino, uma variedade de concentrações de gema de
ovo tem sido utilizada. Visto que a mesma também tem uma capacidade de tampão, sua
quantidade no meio varia de acordo com a capacidade tamponante dos outros componentes do
diluente (FARSTAD, 1996). As amostras de gema de ovo comumente utilizadas na
congelação de sêmen canino são em média 15 – 30% do volume total. Esta variação na
concentração é baseada nos resultados obtidos por VAN DEMARK et al., (1957), onde o
percentual de espermatozóides móveis após congelação e descongelação foi similar entre
estas concentrações. SILVA et al., (2000) constataram uma superioridade do diluidor à base
de Tris contendo 20% de gema de ovo em relação a concentração de 10% de gema de ovo
quanto aos parâmetros de vigor, alterações espermáticas totais e secundárias. DAVIES (1982)
obteve melhores taxas de sobrevivência pós-descongelação incluindo 20% de gema de ovo,
frente a 5% (v/v), no entanto, não encontrou diferenças significativas na motilidade pós-
descongelação quando comparou taxas de 10 e de 20% (v/v), se bem que, nos resultados
absolutos a motilidade pós-descongelação foi superior quando utilizava 20%. LOPES-NETO
et al., (2006) testaram diferentes concentrações de gema de ovo (5%, 10% e 20%) acrescidas
ao diluidor a base de água de coco em pó e não obtiveram diferenças em relação aos
parâmetros observados. Nesse contexto, as maiorias dos autores utilizam concentrações de
gema em torno de 20% no diluente (FARSTAD & ANDERSEN-BERG, 1989; LINDE-
FORSBERG & FORSBERG, 1989; SILVA, 2001; MARTINS, 2005).
A gema de ovo, sendo um produto de origem animal, representa um risco
potencial de contaminação do sêmen e sua composição não é uniforme. Conseqüentemente,
está aumentando o interesse de diluidores livres de produtos da origem animal para
armazenagem do sêmen (MANJUNATH et al., 2002; BERGERON et al., 2004). Por essas
razões, pesquisas visando sua substituição por outros lipídios sintéticos e purificados foram
conduzidas e observaram que os análogos do hidroxitolueno butilado (BHT) são interessantes
substitutos para a gema, por também protegerem a membrana plasmática da injúria do choque
térmico (FARSTAD, 1996). Estudos recentes mostraram ser possível a purificação das LDL,
permitindo sua utilização em substituição à gema de ovo integral (MOUSSA et al., 2002).
VARELA JR. et al. (2004) avaliaram o efeito de diferentes concentrações de LDL purificada
18
adicionada ao diluente Tris para a refrigeração do sêmen do cão a 5ºC e observaram que
concentrações entre 6 e 10% de LDL são tão eficientes quanto o uso de 20% de gema de ovo
integral. Entretanto, a literatura ainda é escassa de informações quanto ao uso das LDL na
tecnologia de sêmen de cães.
Além de sua ação em proteger a membrana espermática, a gema de ovo é também
conhecida por servir como uma fonte protéica para o diluente (SANTOS, 2004).
2.5. O glicerol
Para a criopreservação dos espermatozóides faz-se necessário a adição de
substâncias que protejam estas células contra os danos oriundos da congelação. Muitos são os
compostos de ação crioprotetora, os quais são tradicionalmente classificados como tendo ação
intra ou extracelular. Dentro do grupo de ação intracelular, se incluem os álcoois, etanol,
etilenoglicol, glicerol, metanol e polietilenoglicol (DE LEEUW et al., 1993) e também as
amidas, incluindo a acetamida, formamida, lactamida e bem como o dimetilsulfoxido
(DMSO) (JEYENDRAN & GRAHAM, 1980; ASHWOOD – SMITH, 1987; MEDEIROS et
al., 2002). Já no grupo de ação extracelular se incluem açúcares, lipoproteínas da gema do
ovo e proteínas do leite (AMANN & PICKETT, 1987) e polivinil-pirrolidona (ENGLAND,
1993).
POLGE et al., (1949), demonstraram a eficácia do glicerol como crioprotetor
universal e desde então essa substância vem sendo amplamente utilizada. PARKS &
GRAHAM (1992) sugeriram que o glicerol penetra a célula através da difusão passiva,
permanecendo tanto na membrana quanto no citoplasma. GRAHAM (1996) verificou que a
difusão do glicerol é de 30 a 60 vezes mais lenta que a da água. A primeira conseqüência da
adição do glicerol em um meio isotônico é uma alteração de volume celular devido a uma
rápida saída de água intracelular (enrugamento celular), seguido por um lento retorno ao
volume original à medida que o crioprotetor penetra na célula (HAMMERSTED &
GRAHAM, 1990; PEÑA, 1997). O modo pelo qual o glicerol atua não se encontra totalmente
elucidado. Acredita-se que a ação protetora deste crioprotetor é atribuída a suas propriedades
coligativas e ligantes com a água, diminuindo o ponto de congelação da solução, o qual é
determinado como a temperatura onde ocorre a formação dos primeiros cristais de gelo.
Numa solução contendo glicerol, no momento em que ocorrer a congelação restará mais água
19
descongelada do que numa solução sem glicerol, havendo com isso, um aumento do volume
dos canais de solvente não congelado e uma menor concentração de sais nesses canais
(KEITH, 1998) o que reduz com isso os danos do efeito de solução (PEÑA, 1997; HOLT,
2000).
Apesar de imprescindíveis para a sobrevivência dos espermatozóides no processo
de congelação, o glicerol apresenta efeitos tóxicos para estas células (HOLT, 2000a). Por
promover a remoção da água intracelular o glicerol acarreta o encolhimento celular e o
influxo de íons, no entanto, a descongelação proporciona o efeito inverso, consequentemente,
há o influxo de água podendo ocasionar a ruptura da membrana (HOLT, 2000b). O
espermatozóide dos mamíferos comporta-se como um osmômetro linear, ocorrendo morte
celular caso haja intumescimento ou encolhimento do mesmo quando submetido a níveis
superiores da tolerância osmótica espécie específica. As lesões da membrana plasmática
podem também estar relacionadas de maneira secundária ao rápido movimento da água
através desta (BALL & VO, 2001). Sua toxicidade pode resultar também na inibição da
atividade enzimática (FAHY, 1986), na desnaturação de proteínas e as alterações das
interações da actina (FAHY, 1990) e originar danos acrossomais (HOLT, 2000). Segundo
HAMMERSTEDT & GRAHAM (1992) o glicerol induz a mudanças nos eventos
citoplasmáticos por aumentar a viscosidade ao penetrar a célula espermática, causando
alterações na polimerização da tubulina, na associação dos microtúbulos, no balanço
bioenergético, além de atuar diretamente de modo prejudicial na membrana plasmática, no
glicocálix e nas proteínas de superfície celular. A fusogenicidade da membrana e o padrão de
respostas induzidas por sinais extracelulares podem ser alterados devido a estas mudanças
causadas pela inclusão do glicerol à membrana espermática, podendo este fato contribuir para
a diminuição da sobrevivência espermática posterior ao processo de
congelação/descongelação e acelerar a capacitação espermática (WATSON, 1995).
No intuito de se conseguir o máximo efeito crioprotetor com o mínimo de efeitos
tóxicos, vários pesquisadores vêm testando diferentes concentrações de glicerol no diluidor a
fim de determinar a concentração ideal. Segundo ENGLAND (1992) a concentração de
glicerol para a congelação do sêmen de cão varia de 4 a 11%. Para OLAR et al., (1989) e
ROTA et al., (1998) os melhores resultados foram obtidos com concentrações variando entre
2 e 8% no volume de sêmen diluído. PEÑA et al., (1998) compararam concentrações de 2, 4,
6 e 8% de glicerol para congelação do sêmen canino, e concluíram que a glicerolização na
20
proporção de 8% proporcionou os melhores índices de motilidade, viabilidade e morfologia
espermática na pós-descongelação. SILVA et al., (2002d) testaram as concentrações de 4, 6 e
8% de glicerol para a congelação do sêmen canino e verificaram que a morfologia
espermática era melhor preservada, quando utilizada a concentração de 6%. SANTOS et al.,
(2003) compararam as concentrações de 4, 6, 8 e 10% de glicerol e concluíram que a
crioproteção do glicerol, na concentração de 8% em associação ao diluente a base de Tris-
gema preservou melhor as características morfofisiológicas do espermatozóide canino.
CARDOSO et al (2003a) testaram as concentrações de 4,6 e 8% de glicerol no diluidor a base
de água de coco não observando diferenças em relação aos parâmetros avaliados.
O efeito da temperatura de adição de glicerol tem sido investigado em estudos de
criopreservação do sêmen canino. Os agentes crioprotetores penetrantes, particularmente o
glicerol, protegem a célula da crioinjúria durante a fase de cristalização que ocorre entre -6° e
-10°C. Dessa forma, não pareceria ser lógico adicionar o glicerol a temperaturas superiores a
30°C (COLAS, 1975). No entanto, ANDERSEN (1975) realizou a adição de um diluente
glicerolizado ao sêmen a 37°C e obteve bons resultados após inseminação artificial. Já PEÑA
et al., (1998) não encontraram diferenças entre a adição de glicerol ao sêmen a 37° ou a 4°C.
FONTBONNE & BADINAND (1993b) não verificaram diferenças na qualidade do sêmen
canino após a descongelação entre a adição do glicerol à temperatura ambiente (25°C) e a
5°C. Em um estudo mais recente JUCÁ et al., (2007) também não observaram diferenças
entre a glicerolização a temperatura ambiente em relação a 4°C utilizando um diluidor a base
água de coco em pó. Diante disso pode-se concluir que não há problema em promover a
glicerolização a temperatura ambiente.
No que diz respeito à forma de adição do glicerol (simples ou fracionada),
FONTBONNE & BADINAND (1993b) não verificaram diferenças na qualidade do sêmen
canino após a descongelação. SILVA et al., (2003) compararam a adição única e fracionada
do glicerol ao sêmen, na temperatura de 4ºC e não observaram diferenças entre as mesmas.
Da mesma forma LIMA et al., (2007) ao comparar as duas formas de glicerolização em um
diluidor à base de água e coco em pó também não encontraram diferenças.
21
2.6. Tempo de equilíbrio
O tempo de equilíbrio é considerado o tempo total em que os espermatozóides são
mantidos em contato com o glicerol e todos os demais componentes do diluidor, previamente
à congelação (BITTENCOURT et al., 2006). Durante esse período, ocorre o equilíbrio
osmótico entre o meio intracelular espermático e extracelular, formado por todos os
componentes osmoticamente ativos presentes no meio diluidor (SALAMON & MAXWELL,
2000). WATSON (1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a entrada
do glicerol como se acreditava anteriormente, mas também permite que as membranas
espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram.
Outro ponto importante atribuído ao tempo de equilíbrio é que a permanência do
sêmen a uma baixa temperatura permite uma melhor adaptabilidade dos espermatozóides a
essa temperatura, reduzindo com isso, o efeito negativo do choque térmico já que as
alterações físicas e químicas na membrana celular causadas pelo resfriamento podem ser
irreversíveis (SANTOS et al., 2003). ENGLAND (1992) sugeriu que o sêmen de várias
espécies animais necessita de uma pausa de algumas horas antes da congelação para que
desenvolva uma máxima resistência aos efeitos da congelação e concluiu, ainda, que o tempo
de equilíbrio pode ser extremamente variável de acordo com o protocolo de
congelação/descongelação e, ainda, de acordo com a espécie em questão. Segundo OETTLÉ
(1986), um apropriado período de equilíbrio, assim como adequadas taxas de diluição e
resfriamento celular, são fatores fundamentais para a prevenção do surgimento de alterações
espermáticas durante o processo de criopreservação espermática.
Tempos distintos de resfriamento e equilíbrio, variando de 45 minutos a 5 h,
foram relatados para cães (FARSTAD & ANDERSEN BERG, 1989; FERGUSON et al.,
1989; FONTBONNE & BADINMD, 1993; NOTHLING et al., 1995; SILVA et al., 1996).
OLAR et al., (1989) constataram que a melhor motilidade pós descongelação foi alcançada
com o sêmen de cão refrigerado de 37°C a 5°C por 1 h e equilibrado a 5°C por 1 h ou
resfriado por 2h e equilibrado a 5°C por mais 2h usando o diluidor Tris-gema contendo 3-4%
de glicerol. ENGLAND (1992) encontrou que um tempo de equilíbrio de 4 h a 5°C resultou
em melhor motilidade pós descongelação e porcentagem de espermatozóides vivos quando
comparada a tempos de equilíbrio de 2 e 6h usando o diluidor Tris/Tes-gema de ovo com
6,5% de glicerol. ROTA (1997) obteve bons resultados equilibrando o sêmen canino a 4ºC
22
durante 60 minutos, sendo que a temperatura de 4ºC era atingida após 45 minutos de
resfriamento. SANTOS et al., (2003) observou que os melhores resultados de motilidade,
vigor, retenção acrossômica e termoresistência foram obtidos com 1 h de equilíbrio a 4°C e
concluiu que a estabilização do sêmen com o meio diluidor é de fundamental importância
para manter a integridade da membrana do espermatozóide durante o processo de congelação.
Por outro lado, HAY (1996) observou que após resfriamento rápido para O°C durante 40 min,
com equilíbrio maior que 2 horas, houve uma diminuição na motilidade espermática e na
porcentagem de espermatozóides com acrossomas intactos.
Como pode ser constatado, ainda existem algumas divergências entres os
pesquisadores quanto ao melhor tempo de equilíbrio para o sêmen de cães.
Consequentemente, faz-se necessário mais estudos a fim de elucidar algumas dúvidas que
ainda restam sobre esse assunto.
2.7. Taxa de descongelação
Um ponto de extrema importância para a melhoria dos resultados na
criopreservação do sêmen é a metodologia empregada na descongelação. Investigações
recentes tem levado a hipótese de que os espermatozóides criopreservados são danificados
principalmente durante a descongelação (HOLT et al.,1992; GAO et a.l, 1992; CURRY &
WATSON, 1994; HOLT & NORTH, 1994; ROTA et al.,1998) e, isso estaria relacionado às
mudanças das condições hipertônicas durante a congelação para condições isosmóticas
durante a descongelação. Segundo HOLT (2000b), pelo fato do crioprotetor promover a
remoção da água intracelular, ele provoca o encolhimento celular e o influxo de íons. No
entanto, a descongelação proporciona o efeito inverso, consequentemente, há o influxo de
água podendo ocasionar a ruptura da membrana. Outro problema crítico da descongelação é a
formação de cristais de gelo intracelulares (na maioria das vezes pequenos) que apresentam
uma tendência a se agregarem para formação de cristais de gelo maiores (recristalização)
(FAHY, 1986). As células devem então ser descongeladas de uma maneira capaz de prevenir
a recristalização e as conseqüentes alterações de membrana e impedir o influxo exagerado de
água que poderia causar alteração nas acomodações das membranas celulares.
Existem várias taxas de descongelação, as quais podem ser classificadas como
rápidas ou lentas. Nas taxas de descongelação rápidas, usam-se temperaturas mais elevadas e,
23
de forma inversa, as taxas de descongelação lenta usam temperaturas medianas. Uma taxa de
descongelação excessivamente lenta pode resultar em recristalização dos cristais de gelo
intracelular resultando em uma redução na sobrevivência celular. Por outro lado, uma
descongelação excessivamente rápida não permite que o crioprotetor penetrante saia
suficientemente rápido quebrando assim o equilíbrio osmótico e causando inchaço do
espermatozóide devido ao influxo de água (GRIFFTHS et al., 1979).
Por razões práticas, o sêmen canino diluído em TRIS é frequentemente
descongelado a 37ºC, embora vários pesquisadores tenham encontrado que a descongelação a
taxas maiores melhore a viabilidade dos espermatozóides (DAVES,1982; ENGLAND, 1992;
ROTA et al.,1998 apud PEÑA & LINDE-FORSBERG, 2000). IVANOVA-KICHEVA et al.,
(1995), comparando os processos de descongelação a 37°C por 8s e 55 °C por 5s, observaram
que a motilidade espermática, termoresistência, morfologia espermática e reservas energéticas
foram mais bem preservadas a 55 °C, segundo esses autores, ao descongelar o sêmen em
temperaturas mais altas, os efeitos destrutivos dos processos osmóticos nas estruturas dos
espermatozóides são reduzidos. Além disso, o aumento rápido da temperatura de - 196°C a
55°C por 5s impede provavelmente a cristalização intracelular. Por outro lado SILVA et al.,
(1998) sugerem que a temperatura de 37ºC por 60s promove uma menor porcentagem de
alterações morfológicas espermáticas do que a de 50ºC por 30s. BADINAND et al., (1993)
descongelaram amostras de sêmen a 37°C por 45 segundos e consideraram este método
moderado mais seguro e argumentou que o tempo de permanência em temperaturas altas é
sempre crítico e de influência letal sobre a viabilidade dos espermatozóide. Já MINTER &
DeLIBERTO (2005), em um estudo com sêmen de coiote, ao comparar a taxa de
descongelação de 37° por 120s com 60° por 30s e 70° por 8s, concluiu que o sêmen
descongelado a 37°C ou 60°C resultou em uma maior motilidade e viabilidade pós
descongelamento com menos anormalidades morfológicas e acrossomais.
Outros pesquisadores defendem o uso de taxas de descongelação a temperaturas
mais elevadas. NOTHLING & SHUTTLEWORTH (2005) relacionaram o tamanho da palheta
com a taxa de descongelação e observaram que as amostras congeladas em palhetas de 0,5ml
e descongeladas a 70°C por 8s foram as que apresentaram os melhores resultados. PEÑA &
LINDE-FORSBERG (2000) observaram que todos os parâmetros avaliados foram
significativamente melhores quando os espermatozóides foram descongelados a 70ºC por 8 s
quando comparados com 37ºC por 15s. CHIRINÉA (2004) e MARTINS (2005) utilizaram
24
um método de descongelação a 75ºC por 8s para o sêmen de cães e obtiveram excelente
qualidade espermática pós-descongelação. Para PEÑA & LINDE – FORSBERG (2000)
existem evidencias que mudanças na fluidez da membrana espermática ocorrem durante o
resfriamento, congelação e descongelação, e que algumas dessas mudanças são irreversíveis,
provocando um aumento da permeabilidade da membrana, permitindo um influxo de cálcio
descontrolado. Esse influxo de cálcio poderia ocasionar hiperatividade das células. Nesse
estudo desenvolvido por PEÑA & LINDE – FORSBERG (2000) foram testadas duas taxas de
descongelação (37ºC/15s e 70ºC/8s) sendo que a taxa de descongelação de 37ºC/15s
proporcionou uma maior entrada de cálcio intracelular. O autor acredita que isso se deve ao
fato de que as membranas espermáticas expostas a variações de temperaturas sofrem uma
reorganização da membrana lipidica e/ou modificação de proteínas e que essas mudanças são
mais severas com taxas de descongelação mais lentas.
O fato é que existem muitas controvérsias quanto ao melhor protocolo de
descongelação, de modo que, se fazem necessários mais estudos nesse sentido.
25
3. JUSTIFICATIVA
O primeiro sucesso na criopreservação do sêmen de cães foi obtido por ROWSON
em 1954, contudo o nascimento de filhotes da espécie canina utilizando sêmen congelado só
foi relatado quinze anos mais tarde (SEAGER, 1969). Estudos sucessivos foram realizados
promovendo a evolução desta biotécnica e, atualmente ela representa uma ferramenta
importante no manejo reprodutivo de cães de alto valor zootécnico, de modo que a
inseminação artificial das cadelas com sêmen congelado-descongelado é oferecida como um
serviço clínico rotineiro por muitos veterinários, inclusive muitos criadores anunciam em sites
a disponibilidade do envio de sêmen congelado com teste de congelabilidade aprovado para o
uso em cadelas. Apesar de todos esses avanços, a inseminação artificial com sêmen
congelado-descongelado costuma resultar em taxas de gestação e tamanho das ninhadas
menores quando comparado ao uso do sêmen fresco (LINDE-FORSBERG & FORSBERG,
1993). Nesse sentido, inúmeros pesquisadores têm buscado estabelecer um padrão de
resfriamento, congelação e descongelação ideal, associado a um diluidor que seja eficiente, de
fácil preparo e de baixo custo.
Desse modo, justifica-se a utilização do diluidor à base de água de coco para a
congelação do sêmen de cães, haja vista a abundância de matéria prima para o mesmo na
região nordeste do Brasil. Entretanto, existem ainda poucos trabalhos acerca desse assunto,
sendo necessário um aprimoramento do protocolo de uso do diluidor ACP®. Assim, é possível
que sejam obtidos resultados superiores aos atualmente descritos na literatura através do
emprego de uma adequada taxa de descongelação e de um tempo de equilíbrio ideal para a
congelação do sêmen de cães. A verificação dessas variáveis será um passo importante
visando o aperfeiçoamento do ACP® como diluidor para o sêmen de cães, no sentido de uma
futura aplicação comercial e uso em larga escala.
26
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
• O tempo de equilíbrio de 1h a uma temperatura de 4°C após a glicerolização
favorecerá a obtenção de melhores resultados.
• A descongelação do sêmen por meio de temperaturas mais altas e por um curto
período melhorará a qualidade espermática pós-descongelação.
27
5. OBJETIVOS
5.1. Objetivo Geral
� Avaliar a eficiência de um diluidor à base de água de coco na forma de pó (ACP-
106®) na qualidade do sêmen canino após congelação.
5.2. Objetivos Específicos
� Avaliar o efeito de protocolos preconizando a administração de um tempo de
equilíbrio a 4°C após a glicerolização, bem como a ausência desse tempo de
equilíbrio, sobre a qualidade do espermatozóide canino após descongelação.
� Testar diferentes taxas de descongelação para o sêmen canino.
28
6. CAPÍTULO 1
Artigo 1
Efeito da taxa de descongelação sobre o sêmen canino criopreservado em um diluidor à
base água de coco em pó (ACP-106®)
Victor Leão Hitzschky Madeira, Cynthia Levi Baratta Monteiro, Claudia da Cunha Barbosa,
Ricardo Parente Jucá, Ângela Cristina de Oliveira, Daniel Couto Uchoa, Lúcia Daniel
Machado da Silva
Artigo submetido em 22 de novembro de 2007 ao periódico “Ciência Animal Brasileira”,
classificada como QUALIS A nacional.
29
Efeito da taxa de descongelação sobre o sêmen canino criopreservado em um diluidor à
base água de coco em pó (ACP-106®)
Effect of different thawing rates on canine semen cryopreserved using a powdered coconut
water extender (ACP-106®)
RESUMO
Sabe-se que a temperatura, bem como a velocidade de descongelação do sêmen pode
afetar a qualidade do mesmo. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi testar diferentes taxas
de descongelação para o sêmen canino diluído em ACP-106® e criopreservado. Para tanto,
foram coletados 10 ejaculados oriundos de oito cães. A fração espermática foi avaliada quanto
ao volume, concentração, motilidade, vigor, pH, morfologia, integridade acrossomal e teste
hipoosmótico. O sêmen foi diluído em ACP-106®, contendo 20% de gema de ovo e 6% de
glicerol, e congelado em palhetas de 0,25 ml. Depois de uma semana, a primeira palheta foi
descongelada a uma temperatura de 37°C/1 min, a segunda a 55°C/5 s e a terceira a 75°C/8 s
e foram reavaliados os parâmetros seminais. Os tratamentos apresentaram resultados
semelhantes para quase todos os parâmetros avaliados com exceção da motilidade
espermática, que foi melhor preservada na descongelação a 55°C/5s por até 30min, seguida da
taxa de 37°C/60s e por último a taxa de 75°C/8s. Conclui-se que a melhor taxa de
descongelação para o sêmen de cães utilizando como diluidor o ACP-106® é 55°C/5s já que a
mesma foi quem proporcionou uma melhor motilidade por até 30min após a descongelação.
Palavras-chaves: criopreservação, descongelação, sêmen, cão, ACP-106®.
ABSTRACT
It is known that temperature and thawing velocity can affect sperm quality during
freeze-thawing procedures. Thus, the aim of this research was to compare different thawing
rates for canine semen extended in ACP®-106 extender and cryopreserved. Ten ejaculates
were collected from eight dogs and sperm rich fraction was evaluated regarding to volume,
concentration, motility, vigor, pH, morphology, acrosomal integrity and hyposmotic swelling
test. Then, semen was extended in ACP®-106 with 20% egg yolk and 6% glycerol, and frozen
in 0.25 mL straws. After one week, one straw was thawed at 37°C/1 min, another one at
30
55°C/5 s and a third one at 75°C/8 and seminal characteristics were reevaluated. Similar
results were observed for all the groups, except for sperm motility which was better preserved
by using 55°C/5s for up 30min than by 37°C/60s and 75°C/8s. From these results, it is
concluded that canine semen extended in ACP® -106 is better thawed by using 55°C/5s.
Key Words: cryopreservation, thawing, semen, dog, ACP-106®
INTRODUÇÃO
Atualmente o interesse por parte dos criadores de cães em usufruir dos benefícios das
biotecnologias aplicadas à reprodução tem aumentado consideravelmente. No caso particular
da criopreservação do sêmen, podem ser destacadas como principais vantagens dessa
biotecnologia o fato de que é possível armazenar o material genético de animais de alto valor
zootécnico por um período ilimitado, transmitindo as características desses animais por várias
gerações mesmo após a morte do animal (STOCKNER, 1995). Apesar dessas vantagens,
permanecem muitos pontos não identificados que aparentemente influenciam na
sobrevivência e funcionalidade dos espermatozóides criopreservados, o que resulta em taxas
de gestação altamente variáveis e geralmente mais baixas do que aquelas obtidas com sêmen
fresco (LINDE-FORSBERG & FORSBERG, 1993).
A fim de melhorar esses resultados, vários pesquisadores vêm somando esforços no
intuito de aperfeiçoar os protocolos de congelação do sêmen canino. Um exemplo disso é o
desenvolvimento de diluidores alternativos que sejam atóxicos, isotônicos, tenham atividade
tamponante, sejam de baixo custo, práticos e eficientes. O diluidor à base de água de coco tem
em sua composição básica açúcares, proteínas, vitaminas, sais minerais, fatores de
crescimento (fitormônios) e um baixo teor de fosfolipídeo (LAGUNA, 1996). A sua
formulação em pó (ACP_106®) foi testada para a refrigeração de sêmen eqüino (SAMPAIO-
NETO et al., 2002), diluição para inseminação artificial em caprinos (SALGUEIRO et al.,
2002), refrigeração (MADEIRA et al., 2003) e congelação de sêmen canino (CARDOSO et
al., 2005), apresentando bons resultados.
Outro ponto de extrema importância para a melhoria dos resultados na congelação do
sêmen é a metodologia empregada na descongelação. Investigações recentes têm levado à
hipótese de que os espermatozóides criopreservados são danificados, principalmente durante a
descongelação (GAO et al., 1992; HOLT et al.,1992; CURRY & WATSON, 1994; HOLT &
NORTH, 1994; ROTA et al.,1998). Por razões práticas, o sêmen canino é freqüentemente
31
descongelado a 37ºC/1-3 minutos, embora vários pesquisadores tenham encontrado que a
descongelação a taxas maiores melhore a viabilidade dos espermatozóides (DAVIES, 1982;
ENGLAND & ALLEN, 1992; ROTA et al.,1998). IVANOVA-KICHEVA et al. (1995),
comparando os processos de descongelação a 37°C por 8s e 55°C por 5s, observaram que a
motilidade espermática, termorresitência, morfologia espermática e reservas energéticas
foram melhor preservadas a 55°C. Por outro lado SILVA et al. (1998) sugerem que a
temperatura de 37°C por 60s promove uma menor porcentagem de alterações morfológicas
espermáticas do que a de 50°C por 30s. NÖTHLING & SHUTTLEWORTH (2005)
relacionaram o tamanho da palheta com a taxa de descongelação e observaram que as
amostras congeladas em palhetas de 0,5 ml e descongeladas a 70°C por 8s foram as que
apresentaram os melhores resultados. PEÑA & LINDE-FORSBERG (2000) observaram que
todos os parâmetros avaliados foram significativamente melhores quando os espermatozóides
foram descongelados a 70ºC por 8 s quando comparados com 37ºC por 15s. NÖTHLING et
al. (2007) constataram que a descongelação do sêmen a 98°C não traz benefícios, quando
comparado à descongelação a 70°C. MINTER & DeLIBERTO (2005) ao compararem a taxa
de descongelação de 37° por 120s com 60°C por 30s e 70°C por 8s concluíram que o sêmen
descongelado a 37°C ou 60°C resultou em uma maior motilidade e viabilidade pós-
descongelação com menos anormalidades morfológicas e acrossomais. Além disso,
CHIRINÉA (2004) e MARTINS (2005) utilizaram um método de descongelação a 75ºC por
8s para o sêmen de cães e obtiveram excelente qualidade espermática pós-descongelação.
Diante do exposto percebe-se que ainda existem muitas variações no que diz respeito à
melhor taxa de descongelação, além disso, nenhum trabalho propôs a melhor taxa de
descongelação quando se usa ACP-106® como diluidor. Sendo assim, o objetivo deste
trabalho foi avaliar o efeito de diferentes taxas de descongelação sobre a qualidade do sêmen
canino criopreservado com um diluidor à base de água de coco na forma de pó (ACP-106®).
MATERIAL E MÉTODOS
Local de Execução
O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução de Carnívoros do
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará,
localizado na cidade de Fortaleza.
32
Animais experimentais
Foram utilizados oito cães, oriundos de canis particulares, sendo dois da raça Boxer,
um da raça Labrador, um da raça Rottweiler, um da raça Cane Corso, um da raça Bullmastif,
um da raça American Pit Bull Terrier e um da raça Whippet com idades entre 2 e 9 anos. Os
cães, mantidos em canis individuais, receberam alimentação à base de ração comercial
peletizada uma vez por dia e tiveram acesso à água ad libitum.
Coleta do sêmen
O sêmen foi coletado por meio da técnica de manipulação digital do bulbo peniano
(CHRISTIANSEN, 1988) com o auxílio de um funil de plástico e tubos de vidro graduados.
Como no cão a ejaculação ocorre de forma fracionada (FELDMAN & NELSON, 1996), fez-
se a separação do sêmen em suas três frações distintas, sendo a primeira e a terceira de origem
prostática; e a segunda, denominada fração espermática, de origem testicular e rica em
espermatozóides retida para fins de avaliação e posterior criopreservação. No total, foram
coletados e processados 10 ejaculados.
Avaliação do sêmen
A segunda fração do sêmen coletado foi avaliada macro e microscopicamente. As
avaliações macroscópicas incluíram: cor, volume e pH. Já as microscópicas incluíram:
motilidade (porcentagem de espermatozóides móveis), vigor (qualidade da motilidade) que foi
avaliado em uma escala variando de 0 (sem movimento) a 5 (movimento retilíneo
progressivo), concentração e morfologia espermáticas, bem como e integridade acrossomal
(PLATZ & SEAGER, 1977).
Os parâmetros macroscópicos (cor, volume e pH) foram avaliados no sêmen a fresco
(fração espermática), sendo o pH também avaliado após a descongelação. A morfologia
espermática e integridade do acrossoma foram avaliadas no sêmen a fresco e
congelado/descongelado.
33
As avaliações de motilidade e vigor foram realizadas com o auxílio da microscopia
óptica (M.O.), no aumento de 100x. A concentração espermática foi verificada utilizando-se a
câmara de Neubauer (CARDOSO et al., 1997).
Para a avaliação da morfologia e integridade acrossomal, foram realizados esfregaços
de sêmen, os quais foram corados com Rosa de Bengala e, posteriormente, avaliados
utilizando-se um microscópio óptico (1000x), fazendo-se a contagem de 200 células
espermáticas. No tocante à morfologia, os espermatozóides foram classificados como normais
ou apresentando alterações morfológicas primárias ou secundárias e separadas de acordo com
a sua localização (cabeça, peça intermediária e cauda - BURKE, 1986). O acrossoma foi
classificado como normal ou danificado.
Teste hipoosmótico
O teste hipoosmótico (HOS) foi realizado após a coleta e imediatamente, após a
descongelação do sêmen, tendo como função avaliar a integridade funcional da membrana
espermática (SPITTALER & TYLER, 1985). Para isso 0,01 mL de sêmen foi diluído em 0,09
mL de água destilada e mantido em banho-maria a 38ºC. Após 45 minutos, os
espermatozóides de cada alíquota foram colocados em uma lâmina e avaliados em
microscópio óptico. Foram contadas 200 células em aumento de 400x, sendo os
espermatozóides que apresentavam sua cauda enrolada considerados como apresentando
membrana espermática funcional.
Teste de termorresistência
O teste de termorresistência foi realizado após a descongelação do sêmen, sendo este
mantido em banho-maria a 38ºC. A motilidade e o vigor espermático foram avaliados
imediatamente após a descongelação e aos 30, 60, 90 e 120 minutos.
Preparo do diluidor
Foi utilizado um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®) que foi preparado
de acordo com a orientação do fabricante. O diluidor continha 20% de gema de ovo e 6% de
glicerol (concentração final no diluidor).
34
Processamento do sêmen
O volume total de diluidor foi dividido em duas partes (A e B). A parte “A” contendo
apenas o ACP-106® acrescido de gema de ovo e a Parte “B”, similar a anterior, mas contendo
12% de glicerol.
O sêmen foi diluído inicialmente com metade do volume de diluidor necessário para a
concentração final de 200 x 106 espermatozóides/mL. Nesta etapa, foi utilizada somente a
parte A do diluidor. Após esta diluição inicial em temperatura ambiente (aproximadamente
27°C), as amostras foram armazenadas em tubos de vidro e estes colocados em um recipiente
com água e acondicionados em caixa térmica com gelo reciclável (15°C) por 40 minutos.
Após este período, o sêmen foi transferido para um refrigerador até atingir 4°C (30 minutos) e
posteriormente, a parte B foi adicionada ao sêmen. O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25
mL, estas foram dispostas horizontalmente em rampa de congelação a uma altura de 5 cm do
nível de nitrogênio líquido por cinco minutos e, finalmente, armazenadas em nitrogênio
líquido. Após uma semana, as amostras foram descongeladas em banho-maria, sendo a
primeira palheta descongelada a 37°C/60s, a segunda a 55°/5s e a terceira a 75°C por 8s e
avaliadas microscopicamente (CARDOSO et al., 2003).
Análise estatística
As características macroscópicas do sêmen fresco foram avaliadas de forma subjetiva,
exceto o volume da fração espermática que, juntamente com as características microscópicas,
foram avaliadas pela estatística descritiva e expressas na forma de média e desvio padrão. A
análise dos dados foi realizada pelo programa Systat 7.0 (SPSS Inc. 1997). Os dados
percentuais sofreram transformação angular arcoseno. Para verificar as diferenças estatísticas
entre os tratamentos com relação à motilidade, vigor, morfologia, integridade acrossomal e
porcentagem de caudas enroladas, utilizou-se ANOVA-GLM (General Linear Model) e nos
casos em que houve diferenças estatísticas as médias foram comparadas pelo teste de Tukey
para se verificar onde ocorreram as diferenças. Para todas as análises utilizou-se P < 0,05.
RESULTADOS
No tocante ao sêmen a fresco, observou-se que todos os ejaculados apresentaram-se de
cor branco opalescente e viscosidade leitosa e que os demais parâmetros (macro e
microscópicos) encontravam-se dentro da normalidade (Tabela 1).
35
A motilidade espermática do sêmen descongelado a 55°C/5s (58,50 ± 14,92%) foi
melhor do que no descongelado a 37°C/60s (46,00 ± 11,74%) que por sua vez foi melhor do
que no descongelado a 75°C/8s (19,60 ± 29,31%) nos tempos 0 e 30 min (P < 0,05 – Tabela
2). A partir de 60 minutos, não houve mais diferença entre a motilidade nas três taxas de
descongelação testadas (P > 0,05 - Tabela 2). Quando se compara a motilidade dentro de
cada taxa de descongelação ao longo do tempo, observa-se que nas taxas de 37°C/60s e
55°C/5s, a motilidade no tempo 0 min foi superior a todos os outros tempos, e no tempo de 30
min foi superior aos tempos de 60, 90 e 120min (P < 0,05) e a partir dos 60 min não houve
mais diferenças (P > 0,05). Para a taxa de 75°C/8s, a motilidade não diferiu em momento
algum (P > 0,05 - Tabela 2).
Tabela 1. Média ± desvio padrão do pH, volume, da concentração, motilidade, vigor,
morfologia e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n = 10 ejaculados).
Parâmetros avaliados Média ± D.P.
Volume da fração espermática (µl) 785,00 ± 380,83
pH 6,40 ± 0,46
Concentração espermática (nº sptz X 106/mL) 1374,00 ± 744,80
Motilidade (%) 99,00 ± 2,11
Vigor (0 – 5) 5,00 ± 0,00
Espermatozóides normais (%) 87,90 ± 11, 24
Alterações morfológicas de cabeça
Primárias (%) 0,90 ± 1,10
Secundárias (%) 1,70 ± 3,74
Alterações morfológicas de peça intermediária
Primárias (%) 0,20 ± 0,63
Secundárias (%) 2,40 ± 5,21
Alterações morfológicas de cauda
Primárias (%) 0,10 ± 0,32
Secundárias (%) 6,70 ± 3,65
Acrossomas intactos (%) 91,30 ± 4,92
Com relação ao vigor espermático do sêmen descongelado, este não diferiu nas taxas
de 37°C/60s e 55°C/5s em todos os tempos avaliados, mas ambos apresentaram resultados
melhores que o tratamento 75°C/8s nos tempos 0 e 30 minutos (P < 0,05). No que diz respeito
36
à comparação dos tratamentos entre os tempos, o vigor se manteve inalterado até 30 minutos.
A partir de 60 minutos, houve uma redução significativa no vigor que se manteve estável até
120 minutos (Tabela 3).
Para as características morfológicas dos espermatozóides, não houve diferenças entre
as alterações primárias de cabeça, peça intermediária e de cauda e secundárias de peça
intermediária entre nenhum dos tratamentos e igualmente em relação ao sêmen fresco (P >
0,05). Já com relação às alterações secundárias de cabeça e cauda foram observadas algumas
diferenças. No caso das alterações secundárias de cabeça, os tratamentos 37°C/60s e 75°C/8s
foram semelhantes entre si ((P > 0,05), e apresentaram um aumento nas alterações
morfológicas quando comparados ao sêmen fresco (P < 0,05), enquanto que o tratamento
55°C/5s não diferiu nem do sêmen a fresco, nem dos demais tratamentos (P > 0,05). Com
relação às alterações secundárias de cauda todos os tratamentos foram semelhantes entre si e
apresentaram mais alterações que o sêmen fresco (Tabela 4).
Tabela 2. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação em três
diferentes taxas de descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60,
90, 120min após a descongelação.
TAXA DE MOTILIDADE
DESCON-
GELAÇÃO 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min
37°C/60 seg 46,00 ± 11,74bA 14, 50 ± 11,41bB 2,10 ± 4,79aC 0,60 ± 1,58aC 0,10 ± 0,32aC
55°C/5 seg 58,50 ± 14,92aA 36,50 ± 17,80aB 8,80 ± 13,14aC 2,50 ± 6,35aC 1,50 ± 3,37aC
75°C/8 seg 19,60 ± 29,31cA 6,20 ± 13,41cA 4,00 ± 12,65aA 1,00 ± 3,16aA 0,50 ± 1,58aA
a,b,c Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre linhas. A,B,C Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre colunas.
P < 0,05
Nesse estudo observou-se que não houve diferenças com relação à porcentagem de
acrossomas intactos entre os tratamentos, mas ambos apresentaram uma porcentagem menor
de acrossomas intactos em relação ao sêmen fresco (Figura 1).
37
Tabela 3. Média ± desvio padrão do vigor espermático entre três diferentes taxas de
descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a
descongelação.
TAXA DE VIGOR
DESCON-
GELAÇÃO 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min
37°C/60 seg 3,40 ± 0,46aA 2,60 ± 1,02aA 0,60 ± 1,05aB 0,40 ± 0,88aB 0,20 ± 0,63aB
55°C/5 seg 3,80 ± 0,35aA 3,40 ± 0,57aA 1,30 ± 1,32aB 0,45 ± 1,12aB 0,40 ± 0,97aB
75°C/8 seg 1,60 ± 1,88bA 0,85 ± 1,41bA 0,20 ± 0,63aB 0,20 ± 0,63aB 0,10 ± 0,32aB
a,b Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre linhas. A,B Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre colunas.
P < 0,05
Houve uma redução significativa no percentual de células com caudas enroladas em
todos os tratamentos com relação ao sêmen fresco, não diferindo entre os tratamentos após a
descongelação (figura 2).
Não houve alteração do pH nas taxas de 37°C/60s e 55°C/5s (P > 0,05), no entanto,
houve uma redução do pH da taxa de 75°C/8s em relação ao sêmen fresco (P < 0,05) (figura
3).
38
Tabela 4. Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e secundárias da
cabeça, peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em relação ao
sêmen fresco e aos tratamentos 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.
ALTERAÇÕES GRUPOS
% Fresco 37°C/60 s 55°C/5 s 75°C/8 s
Cabeça
Primária 1,70 ± 3,74a 1,10 ± 2,23a 0,80 ± 0,79a 1,60 ± 3,37a
Secundária 0,90 ± 1,10a 3,10 ± 2,47b 1,20 ± 0,63ab 3,70 ± 4,37b
Peça
intermediária
Primária 0,20 ± 0,63a 0,60 ± 0,70a 0,10 ± 0,32a 0,40 ± 0,52a
Secundária 2,40 ± 5,21a 4,70 ± 7,10a 2,30 ± 3,20a 5,60 ± 6,27a
Cauda
Primária 0,10 ± 0,32a 0,00 ± 0,00a 0,00 ± 0,00a 0,00 ± 0,00a
Secundária 6,70 ± 3,65a 21,90 ± 13,67b 20,20 ± 12,41b 18,20 ± 13,89b
Total de
normais 88,00 ± 11,00a 68,60 ± 20,00b 75,40 ± 13,87b 70,50 ± 20,29b
a,b Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre colunas.
P < 0,05
0
20
40
60
80
100
120
TAXA DE DESCONGELAÇÃO
AC
RO
S.I
NT
AC
TO
S
fresco
T 37º C / 60 seg
T 55º C / 5 seg
T 75º C / 8 seg
Figura 1. Porcentagem média ± DP de células com acrossoma intacto do sêmen a fresco e
descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s. P < 0,05.
a
b b b
39
0
20
40
60
80
100
120
TAXA DE DESCO NGELAÇÃO
% E
NR
OL
AD
A fresco
T 37º C / 60 seg
T 55º C / 5 seg
T 75º C / 8 seg
Figura 2. Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada do sêmen a fresco e
descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s. P < 0,05.
5,6
5,7
5,8
5,9
6
6,1
6,2
6,3
6,4
6,5
6,6
TAXA DE DESCONGELAÇÃO
pH
FRESCO
T 37º C / 60 seg
T 55º C / 5 seg
T 75º C / 8 seg
Figura 3. Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a 37°C/60s,
55°C/5s e 75°C/8s. P < 0,05.
DISCUSSÃO
De acordo com a análise dos resultados do sêmen a fresco, observou-se que as
amostras estavam aptas a participarem do experimento, visto que todos os parâmetros
avaliados apresentavam-se dentro da normalidade para a espécie canina, conforme descrito
por CHRISTIANSEN (1988).
Com relação à motilidade pós-descongelação, esse estudo demonstrou que existe uma
diferença significativa entres as três taxas de descongelação, sendo que a taxa de
descongelação de 55°C/5s apresentou os melhores resultados por até 30min após a
descongelação, seguida pela taxa de descongelação de 37°C/60s e, por último, o tratamento
75°C/8s. Resultado semelhante foi obtido por IVANOVA-KICHEVA et al. (1995) em que
b b b
a
a
ab ab b
40
esses autores obtiveram uma melhor motilidade quando descongelaram o sêmen de cães a
55°C/5s em comparação com a taxa de 37°C/8s. Segundo IVANOVA-KICHEVA et al.
(1995), descongelar o sêmen em temperaturas mais altas reduz os efeitos destrutivos dos
processos osmóticos nas estruturas dos espermatozóides, além disso, o aumento rápido da
temperatura de - 196°C a 55°C por 5s impede a recristalização intracelular. Isso foi o que
provavelmente favoreceu o tratamento 55°C/5s em relação ao tratamento37°C/60s. Embora
tenha havido uma superioridade da motilidade do tratamento 55°C/5s em relação ao
37°C/60s, percebe-se que ambos os tratamentos apresentaram uma motilidade dentro da faixa
aceitável para a realização de inseminações artificiais, levando-se em consideração os dados
de CONCANNON & BATTISTA (1989), que sugerem, para a espécie canina, a motilidade
pós-descongelação acima de 50% como ideal e, acima de 30% como aceitável.
NÖTHLING & SHUTTLLEWORTH (2005) relacionaram o tamanho da palheta com
a taxa de descongelação e observaram que as amostras congeladas em palhetas de 0,5 ml e
descongeladas a 70°C por 8s foram as que apresentaram os melhores resultados. PEÑA &
LINDE-FORSBERG (2000) observaram que todos os parâmetros avaliados foram
significativamente melhores quando os espermatozóides foram descongelados a 70ºC por 8 s
quando comparados com 37ºC por 15s. CHIRINÉA (2004) e MARTINS (2005) utilizaram
um método de descongelação a 75ºC por 8s para o sêmen de cães e obtiveram excelente
qualidade espermática pós-descongelação. Percebe-se que todos esses pesquisadores
conseguiram bons resultados na descongelação do sêmen a altas temperaturas e todos eles
atribuem a esses bons resultados a mesma justificativa de IVANOVA-KICHEVA et al.
(1995), contudo nesses experimentos diferentemente do nosso, o sêmen foi envasado em
palhetas de 0,5 ml. Diante disso é possível que a influência letal das altas temperaturas sobre a
viabilidade dos espermatozóide seja maior sobre palhetas de 0,25 ml em relação a palhetas de
0,5 ml, pois o conteúdo da palheta de 0,25 ml descongelaria mais rapidamente que o conteúdo
da palheta de 0,5 ml e sendo assim o sêmen descongelado da palheta de 0,25 ml permaneceria
por mais tempo a uma temperatura elevada. Diante do exposto acreditamos que o resultado
obtido na descongelação a 75°C/8s poderia ser melhorado caso fosse usado uma palheta de
0,5ml ou então diminuído o tempo de exposição à temperatura de 75°C.
Com relação ao vigor espermático, não houve diferença entre as taxas de
descongelação 55°C/5s e 37°C/60s e novamente a pior taxa de descongelação foi a de 75°C/8s
sendo a provável causa para isso o efeito deletério da alta temperatura.
No tocante as alterações morfológicas, acrossomas intactos e caudas enroladas não
houve diferenças entre os tratamentos, sendo observado um maior percentual de alterações
41
totais e secundárias da cabeça e cauda em relação ao sêmen fresco e uma diminuição de
acrossomas intactos e caudas enroladas em relação ao sêmen fresco. Esses resultados já são
esperados em função dos danos celulares provocados pelo processo de congelação e
descongelação do sêmen.
Com relação ao pH constatou-se que ação tamponante do diluidor foi extremamente
eficaz, já que foi capaz de manter o pH dentro da normalidade ao longo de todo experimento
(CHRISTHIANSEN 1988).
CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos sugere-se que a melhor a taxa de descongelação
para o sêmen de cães utilizando como diluidor o ACP-106® é 55°C/5 s já que a mesma foi
quem proporcionou uma melhor motilidade por até 30min após a descongelação
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à CAPES, ao CNPq e à FUNCAP pelo apoio financeiro;
aos proprietários dos cães, em particular ao Daniel Couto Uchoa, por disponibilizar os
animais para o estudo e ao Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo pela colaboração nas análises
estatísticas.
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7. CAPÍTULO 2
Artigo 2
Efeito do tempo de equilíbrio sobre a qualidade do sêmen canino diluído em ACP - 106®
e criopreservado a – 196°C
Victor Leão Hitzschky Madeira, Cynthia Levi Baratta Monteiro, Claudia da Cunha Barbosa,
Lúcia Daniel Machado da Silva
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Efeito do tempo de equilíbrio sobre a qualidade do sêmen canino diluído em ACP - 106®
e criopreservado a – 196°C
Victor Leão Hitzschky Madeira, Cynthia Levi Baratta Monteiro, Claudia da Cunha Barbosa,
Lúcia Daniel Machado da Silva
Laboratório de Reprodução de Carnívoros – Faculdade de Veterinária – Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias, UECE, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi
CEP: 60740-903, Fortaleza, CE, Brasil
Fone: (85) 3101-9859; Fax: (85)3101-9840
RESUMO
Objetivou-se verificar o efeito do tempo de equilíbrio a 4°C após a glicerolização
na congelação do sêmen canino utilizando-se um diluidor à base de água de coco em pó
(ACP-106®). O sêmen diluído em ACP-106® com 20% de gema de ovo foi refrigerado e
acrescido do diluidor com glicerol. Após a glicerolização, a primeira alíquota foi
imediatamente congelada (G0h), a segunda foi equilibrada por 1h a 4°C (G1h) e a terceira por
2h (G2h) para então serem criopreservadas. Posteriormente a descongelação, a motilidade
total e progressiva e espermatozóides com velocidade média de G2h foram superiores ao G0h,
enquanto que o G1h não diferiu nem de G0h, nem de G2h. Na VAP média e espermatozóides
com velocidade rápida, o G2h foi superior ao G0h com 30min após a descongelação. O VAP
rápido, bem como as alterações morfológicas, acrossomas intactos e pH não diferiram entre os
grupos. Na termoresistência, houve uma queda a partir dos 30min para a maioria dos
parâmetros. No teste hipoosmótico, o G2h foi melhor que o G0h e G1h não diferiu de nenhum
dos dois. Conclui-se que para a congelação do sêmen canino, utilizando-se ACP-106®, deve-
se incluir um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C.
Palavras-chave: sêmen; cão; congelação; tempo de equilíbrio; ACP-106®.
ABSTRACT
The objective was to verify the effect of equilibration times at 4ºC after glycerol addition in
freezing canine semen using a extender powder coconut water (ACP-106®). The diluted
semen in ACP-106® with 20% from egg yolk was chilled and added the extender with
48
glycerol. After glycerol addition, the first sample was immediately frozen (G0h), the second
was balanced for 1h at 4ºC (G1h) and the third for 2h (G2h) to then be cryopreserved. After
thawing, the total and progressive motility and sperm with an average speed of G2h were
higher than G0h, while G1h did not differ from G0h or G2h. The average VAP and sperm
with fast speed, the G2h was superior to G0h 30min after thawing. The fast VAP, as well as
the morphological alterations, acrosomal integrity and pH were similar for all groups. In
thermoresistance test, there was a fall starting at 30min for most parameters. In the
hypoosmotic test, G2h was better than the G0h and G1h did not differ from each other group.
It follows that for the freezing of canine semen, using ACP-106 ®, one must include a time of
balance of 2h after glycerol addition at 4ºC.
Keywords: semen; dog; cryopreservation; equilibration time; ACP-106®
INTRODUÇÃO
Um passo importante para a obtenção de melhores resultados na criopreeservação
de sêmen é o uso de diluidores que, associados a um crioprotetor, possam fornecer aos
espermatozóides as condições necessárias para que se obtenha uma boa qualidade espermática
pós-descongelação. Na busca de um diluidor que ofereça essas condições, foi elaborado um
produto à base de água de coco em pó (ACP®). Este diluidor foi testado para a refrigeração de
sêmen eqüino (SAMPAIO-NETO et al., 2002), diluição para inseminação artificial em
caprinos (SALGUEIRO et al., 2002), refrigeração (MADEIRA et al., 2003) e congelação de
sêmen canino (CARDOSO et al., 2005), apresentando bons resultados.
Para que o diluidor e o crioprotetor ofereçam o máximo de benefícios aos
espermatozóides, alguns pesquisadores acreditam que é necessária a realização de um tempo
de equilíbrio antes da congelação, possibilitando com isso que os espermatozóides
permaneçam em contato com o crioprotetor e todos os demais componentes do diluidor
(BITTENCOURT et al., 2006) o que permitirá o equilíbrio osmótico entre o meio intracelular
espermático e extracelular, formado por todos os componentes osmoticamente ativos
presentes no meio diluidor (SALAMON & MAXWELL, 2000), além de também permitir que
as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram (WATSON,
1979).
Tempos distintos de resfriamento e equilíbrio, variando de 45 minutos a 5 h,
foram relatados para cães (FARSTAD & ANDERSEN BERG, 1989; FERGUSON et al.,
49
1989; FONTBONNE & BADINMD, 1993; NOTHLING et al., 1995; SILVA et al., 1996).
OLAR et al. (1989) constataram que a melhor motilidade pós-descongelação foi alcançada
com o sêmen de cão refrigerado de 37°C a 5°C por 1 h e equilibrado a 5°C por 1 h ou
resfriado por 2h e equilibrado a 5°C por mais 2h usando o diluidor Tris-gema contendo 3-4%
de glicerol. ENGLAND (1992) encontrou que um tempo de equilíbrio de 4 h a 5°C resultou
em melhor motilidade pós-descongelação e maior porcentagem de espermatozóides vivos
quando comparada a tempos de equilíbrio de 2 e 6h usando o diluidor Tris/Tes-gema de ovo
com 6,5% de glicerol. ROTA (1997) obteve bons resultados equilibrando o sêmen canino a
4ºC durante 60 minutos, sendo que a temperatura de 4ºC era atingida após 45 minutos de
resfriamento. SANTOS et al., (2003) observaram que os melhores resultados de motilidade,
vigor, retenção acrossômica e termorresistência foram obtidos com 1 h de equilíbrio a 4°C e
concluíram que a estabilização do sêmen com o meio diluidor é de fundamental importância
para manter a integridade da membrana do espermatozóide durante o processo de congelação.
Por outro lado, HAY (1996) observou que após resfriamento rápido para 0°C durante 40 min
com equilíbrio maior que 2 horas, houve uma diminuição na motilidade espermática e na
porcentagem de espermatozóides com acrossomas intactos.
Como pode ser constatado, ainda existem algumas divergências entre os
pesquisadores quanto ao melhor tempo de equilíbrio para o sêmen de cães, conseqüentemente
fazem-se necessários mais estudos a fim de definir o melhor protocolo de congelação para o
sêmen canino. Em vista disso, esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da
administração de um tempo de equilíbrio a 4°C após a glicerolização sobre a qualidade do
espermatozóide canino diluído em ACP-106 ®, após a descongelação.
MATERIAL E MÉTODOS
Local de Execução
O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução de Carnívoros do
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará,
localizado na cidade de Fortaleza.
Animais experimentais
Foram utilizados sete cães, oriundos de canis particulares, sendo dois da raça
Boxer, três da raça Rottweiler, um da raça American Pit Bull Terrier e um da raça Sharpei
50
com idades entre 2 e 9 anos. Os cães, mantidos em canis individuais, receberam alimentação à
base de ração comercial peletizada uma vez por dia e tiveram acesso à água ad libitum.
Coleta do sêmen
O sêmen foi coletado por meio da técnica de manipulação digital
(CHRISTIANSEN, 1988) com o auxílio de um funil de plástico e tubos de vidro graduados.
Como no cão a ejaculação ocorre de forma fracionada (FELDMAN & NELSON, 1996), fez-
se a separação do sêmen em suas três frações distintas, sendo a primeira e a terceira de origem
prostática; e a segunda, denominada fração espermática, de origem testicular e rica em
espermatozóides retida para fins de avaliação e posterior criopreservação. No total, foram
coletados e processados 10 ejaculados.
Avaliação do sêmen fresco
A segunda fração do sêmen coletado foi avaliada macro e microscopicamente. As
avaliações macroscópicas incluíram: cor, volume e pH aferido por meio de fitas indicadoras
(pH-Fix 0-14, Macherey-Nagel®). Já as microscópicas incluíram: motilidade (porcentagem de
espermatozóides móveis), vigor (qualidade da motilidade) que foi avaliado em uma escala
variando de 0 (sem movimento) a 5 (movimento retilíneo progressivo), concentração e
morfologia espermáticas, bem como a integridade acrossomal (PLATZ & SEAGER, 1977).
As avaliações de motilidade e vigor foram realizadas com o auxílio da
microscopia óptica (M.O.), no aumento de 100x. A concentração espermática foi verificada
utilizando-se a câmara de Neubauer (CARDOSO et al., 1997).
Para a avaliação da morfologia e integridade acrossomal, foram realizados
esfregaços de sêmen, os quais foram corados com Rosa de Bengala e, posteriormente,
avaliados utilizando-se um microscópio óptico (1000x), fazendo-se a contagem de 200 células
espermáticas. No tocante à morfologia, os espermatozóides foram classificados como normais
ou apresentando alterações morfológicas primárias ou secundárias e separadas de acordo com
a sua localização (cabeça, peça intermediária e cauda - BURKE, 1986). O acrossoma foi
classificado como normal ou danificado.
Avaliação do sêmen descongelado
Uma semana após a congelação foi realizada a descongelação em banho-maria a
uma temperatura de 55°C por 5 segundos sendo o sêmen transferido em seguida para um tubo
Eppendorf® presente em outro banho-maria a uma temperatura de 37°C. Feito isso, foi
51
mensurado o pH, realizados esfregaços de sêmen, os quais foram corados com Rosa de
Bengala para a avaliação da morfologia espermática e integridade acrossomal conforme foi
descrito para o sêmen fresco e utilizou-se o sistema de análise de sêmen auxiliada por
computador (CASA). O CASA foi utilizado também durante o teste de termorresistência nos
tempos 30, 60, 90 e 120 minutos após a descongelação a fim de se avaliar a longevidade
espermática (SILVA et al., 2003).
No tocante ao CASA, avaliaram-se os parâmetros de motilidade total (MT, %),
motilidade progressiva (MP, %), espermatozóides com velocidade rápida (%),
espermatozóides com velocidade média (%), velocidade média da trajetória (VAP, µm/s) de
sub-populações de espermatozóides com velocidade média (VAP 55 a 95 µm/s) e rápida
(VAP > 95 µm/s). Essas avaliações foram executadas com um microscópio de contraste de
fases acoplado a uma vídeo-câmara adaptada ao sistema Sperm Class Analyser® (SCA,
Microptic S.L., versão 3.2.0).
Para a realização do CASA, a amostra de sêmen descongelada foi re-diluída em
uma solução de citrato de sódio-glicose (2,37 g citrato de sódio, 0,80 g glicose, 100 mL água
destilada) na proporção de 10 µl de sêmen para 50 µl da solução de citrato de sódio-glicose a
fim de se atingir uma concentração de 20 a 50x106 de sptz/mL. Feito isso, cinco µl da amostra
re-diluída foi colocada em uma Câmara de Makler® (Sel-Medical Instruments), previamente
aquecida a 37ºC e finalmente realizada a avaliação.
Teste hipoosmótico
O teste hipoosmótico (HOS) foi realizado após a coleta, e imediatamente após a
descongelação do sêmen, tendo como função avaliar a integridade funcional da membrana
espermática (SPITTALER & TYLER, 1985). Para isso 0,01 mL de sêmen foi diluído em 0,09
mL de água destilada e mantido em banho-maria a 38ºC. Após 45 minutos, os
espermatozóides de cada alíquota foram colocados em uma lâmina e avaliados em
microscópio óptico. Foram contadas 200 células em aumento de 400x, sendo os
espermatozóides que apresentavam sua cauda enrolada considerados como apresentando
membrana espermática funcional.
52
Preparo do diluidor
Foi utilizado um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®) que foi
preparado de acordo com a orientação do fabricante. O diluidor continha 20% de gema de ovo
e 6% de glicerol (concentração final no diluidor).
Processamento do sêmen
O volume total de diluidor foi dividido em duas partes (A e B). A parte “A”
contendo apenas o ACP-106® acrescido de gema de ovo e a Parte “B”, similar a anterior, mas
contendo 12% de glicerol.
O sêmen foi diluído inicialmente com metade do volume de diluidor necessário
para a concentração final de 200 x 106 espermatozóides/mL. Nesta etapa, foi utilizada
somente a parte A do diluidor. Após esta diluição inicial em temperatura ambiente
(aproximadamente 27°C), as amostras foram armazenadas em tubos de vidro e estes
colocados em um recipiente com água e acondicionados em caixa térmica com gelo reciclável
(15°C) por 40 minutos. Após este período, o sêmen foi transferido para um refrigerador até
atingir 4°C (30 minutos). Feito isso o volume da parte B foi dividido por três e cada terço foi
adicionado ao sêmen com um intervalo de cinco minutos (glicerolização fracionada). Ao
término da glicerolização o sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 mL e estas foram
dispostas horizontalmente em rampa de congelação a uma altura de 5 cm do nível de
nitrogênio líquido por cinco minutos e armazenadas em nitrogênio líquido, sendo que na
primeira amostra a ser congelada esse procedimento foi realizado logo após a glicerolização
(G0h), na segunda amostra esse procedimento foi realizado uma hora após a glicerolização
(G1h) e na terceira amostra esse procedimento foi realizado duas horas após a glicerolização
(G2h).
Análise estatística
Os dados relativos ao volume e características microscópicas da fração
espermática foram submetidos aos testes de Shapiro-Wilk e Bartlett para verificação da
normalidade da distribuição e homocedasticidade, respectivamente. Nos casos em que não foi
observada homogeneidade de variância entre os tratamentos, foi feita transformação
logarítmica dos dados. Confirmado o atendimento das exigências para realização da análise de
variância, esta foi executada por meio do PROC GLM do programa SAS (1999) e as médias
foram comparadas através dos testes t de Student (CV>15%) ou Student-Newman-Keuls
(SNK, CV<15%) considerando-se o nível de significância de 5%. Nos casos em que persistiu
53
a condição de heterocedasticidade, mesmo após a transformação dos dados, foi aplicado o
teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Os resultados foram apresentados com média ±
desvio padrão.
RESULTADOS
De acordo com os resultados obtidos para o sêmen fresco, constatou-se que todos
os ejaculados apresentaram cor branco opalescente e viscosidade leitosa. Os demais
parâmetros avaliados (macro e microscópicos) referentes ao sêmen fresco encontram-se na
Tabela 1.
No que diz respeito à analise seminal auxiliada por computador (CASA), os
resultados demonstraram que na avaliação dos parâmetros motilidade total, motilidade
progressiva e percentual de espermatozóides com velocidade média realizada logo após a
descongelação houve uma superioridade do sêmen que foi equilibrado por 2h em relação ao
sêmen que não sofreu um tempo de equilíbrio, enquanto que o sêmen equilibrado por 1h não
diferiu nem de G0h, nem de G2h. Com 30min após a descongelação na avaliação desses
mesmos parâmetros, o G1h e o G2h foram superiores ao G0h. No caso da motilidade total
essa superioridade se estendeu por até 60min e no caso do percentual de espermatozóides com
velocidade média apenas o G2h foi superior ao G0h com 60 min após a descongelação
(Tabela 2, Tabela 3, Tabela 5). Para os parâmetros % de espermatozóides com velocidade
rápida e VAP médio, o G2h mostrou superioridade em relação ao G0h com 30 min após a
descongelação (Tabela 4, Tabela 7). O único parâmetro em que os grupos não diferiram foi o
VAP rápido (Tabela 6).
No tocante aos resultados da avaliação morfológica, observou-se que não houve
diferenças entre os grupos em relação à porcentagem de alterações morfológicas primárias da
cabeça, peça intermediária e cauda. No que diz respeito às alterações morfológicas
secundárias, a única diferença obtida foi na comparação dos grupos G0h, G1h e G2h com o
sêmen fresco em relação às alterações da cauda (Tabela 8). Na comparação entre o número
de espermatozóides normais e na porcentagem de acrossomas intactos, os grupos G0h, G1h e
G2h foram semelhantes entre si e inferiores ao sêmen fresco (Tabela 8, Figura 1).
Na avaliação do pH, não foram observadas diferenças entre os grupos e com
relação aos resultados da porcentagem de espermatozóides com membrana funcional
observou-se que os grupos G0h, G1h e G2h apresentaram uma menor porcentagem de
54
espermatozóides com membrana funcional em relação ao sêmen fresco e na comparação
entres os grupos G0h, G1h e G2h, observou-se que o G0h apresentou menos espermatozóides
com membrana funcional em relação ao grupo G2h (Figura 2, Figura 3).
Tabela 1: Média ± desvio padrão da concentração, motilidade, vigor, espermatozóides
normais, alterações morfológicas e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n=10 ejaculados).
Parâmetros avaliados Média ± D.P.
Volume da fração espermática (µl) 796,00 ± 379,87
pH 6,15 ± 0,24
Concentração espermática (nº sptz X 106/mL) 1473,00 ± 735,80
Motilidade (%) 99,00 ± 3,05
Vigor (0 – 5) 5,00 ± 0,00
Espermatozóides normais (%) 91,80 ± 5,16
Alterações morfológicas de cabeça
Primárias (%) 2,00 ± 2,36
Secundárias (%) 0,90 ± 1,10
Alterações morfológicas de peça intermediária
Primárias (%) 0,10 ± 0,32
Secundárias (%) 0,40 ± 0,70
Alterações morfológicas de cauda
Primárias (%) 0,00 ± 0,00
Secundárias (%) 4,80 ± 3,49
Acrossomas intactos (%) 95,80 ± 2,30
55
Tabela 2: Média ± desvio padrão da motilidade espermática total pós-descongelação em três
diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a
descongelação.
Termorresistência
(minutos)
MT / tempo de equilíbrio (horas)
0 1 2
0 19,5 ± 14,21 bA 33,27 ± 19,21abA 39,29 ± 19,82aA
30 5,47 ± 4,25bB 13,50 ± 8,57aB 19,49 ± 12,82aB
60 1,62 ± 2,12bC 7,40 ± 7,11aC 11.02 ± 12,08aC
90 1, 07 ± 3,28aC 2,19 ± 3,45aD 5,97 ± 8,72aCD
120 0,50 ± 1,58aC 0,47 ± 1,38aD 2,20 ± 5,29aD ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.
p < 0,05
Tabela 3: Média ± desvio padrão da motilidade espermática progressiva pós-descongelação
em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a
descongelação.
Termorresistência
(minutos)
MP / tempo de equilíbrio (horas)
0 1 2
0 12,81 ± 10,48bA 21,80 ± 15,17abA 26,59 ± 17,47aA
30 2,61 ± 2,34bB 5,99 ± 4,46aB 10,66 ± 7,79aB
60 0,90 ± 1,28aC 2,92 ± 3,01aC 5,14 ± 7,93aBC
90 0,61 ± 1,93aD 1,17 ± 1,84aD 3,17 ± 5,05aC
120 0,14 ± 0,44aD 0,24 ± 0,76aD 1,13 ± 2,57aC
ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.
p < 0,05
56
Tabela 4: Média ± desvio padrão da percentagem de espermatozóides com velocidade rápida
pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60,
90, 120min após a descongelação.
Termorresistência
(minutos)
% espermatozóides rápidos / tempo de equilíbrio (horas)
0 1 2
0 9,16 ± 10,58aA 16,59 ± 13,28aA 18,30 ± 15,53aA
30 1,33 ± 1,67bB 3,32 ± 2,78abB 6,03 ± 5,25aB
60 0,35 ± 0,73aC 1,13 ± 1,62aC 2,40 ± 3,75aC
90 0,18 ± 0,57aC 0,45 ± 1,14aCD 2,04 ± 3,47aC
120 0,02 ± 0,06aC 0,00 ± 0,00aD 0,36 ± 0,87aC ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.
p < 0,05
Tabela 5: Média ± desvio padrão da percentagem de espermatozóides com velocidade média
pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60,
90, 120min após a descongelação
Termorresistência
(minutos)
% espermatozóides médios / tempo de equilíbrio (horas)
0 1 2
0 4,50 ± 3,38bA 6,70 ± 4,61abA 11,24 ± 9,83aA
30 1,45 ± 1,25bB 3,17 ± 2,16aB 5,64 ± 4,55aA
60 0,57 ± 0,71bC 2,06 ± 1,83abB 3,38 ± 5,28aB
90 0,43 ± 1,36aC 0,71 ± 1,15aC 1,23 ± 1,82aB
120 0,17 ± 0,54aC 0,28 ± 0,88aC 0,82 ± 1,85aB
ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.
p < 0,05
57
Tabela 6: Média ± desvio padrão da VAP dos espermatozóides rápidos espermática pós-
descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90,
120min após a descongelação.
Termorresistência
(minutos)
VAP rápidos / tempo de equilíbrio (horas)
0 1 2
0 120,30 ± 8,24aA 120,03 ± 7,40aA 117,89 ± 6,64aA
30 83,89 ± 32,19aB 103,41± 17,82aB 105,76 ± 25,67aA
60 31,50 ± 41,80aC 52,68 ± 55,06aC 62,34 ± 59,32aB
90 14,41 ± 40,76aC 24,02 ± 47,85aCD 40,07 ± 52,66aB
120 4,14 ± 11,70aC 0,00 ± 0,00aD 22,53 ± 44,75aB ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.
p < 0,05
Tabela 7: Média ± desvio da VAP dos espermatozóides com velocidade média pós-
descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90,
120min após a descongelação.
Termorresistência
(minutos)
VAP médios / tempo de equilíbrio (horas)
0 1 2
0 73,25 ± 12,14aA 75,38 ± 10,82aA 79,03 ± 2,88aA
30 57,17 ± 21,73bAB 67,03 ± 11,98abAB 76,10 ± 6,51aA
60 34,40 ± 39,33aB 59,18 ± 24,84aB 47,29 ± 34,05aB
90 7,53 ± 23,81aC 23,12 ± 34,49aC 27,54 ± 36,80aB
120 6,69 ± 21,16aC 7,78 ± 24,60aC 15,20 ± 32,09aB ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.
p < 0,05
58
Tabela 8: Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e secundárias da
cabeça. Peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em ralação ao
sêmen fresco e aos tratamentos 0h, 1h e 2h.
Grupos Alterações
(%) Fresco 0h 1h 2h
Cabeça
Primária 2,00 ± 2,36a 2,16 ± 2,91a 1,60 ± 1,95a 1,10 ± 0,99a
Secundária 0,90 ± 1,10a 0,90 ± 1,90a 0,50 ± 0,80a 0,90 ± 1,59a
Peça
intermediária
Primária 0,10 ± 0,32a 0,00 ± 0,00a 0,20 ± 0,42a 0,20 ± 0,42a
Secundária 0,40 ± 0,70a 0,40 ± 0,52a 0,80 ± 1,32a 0,30 ± 0,67a
Cauda
Primária 0,00 ± 0,00a 0,10 ± 0,32a 0,00 ± 0,00a 0,20 ± 0,63a
Secundária 4,80 ± 3,49a 20,99 ± 13,14b 19,20 ± 9,37b 21,40 ± 11,50b
Normais 91,80 ± 5,16a 75,00 ± 12,79b 77,10 ± 10,04b 75,90 ± 13,08b a,bLetras minúsculas diferentes indicam diferença entre colunas.
P < 0,05
0
20
40
60
80
100
120
TRATAMENTOS
AC
RO
SS. I
NT
AC
TO
S
fresco
0h
1h
2h
Figura 1: Porcentagem média ± DP de células com acrossoma normal do sêmen a fresco e
descongelado em diferentes tempo de equilíbrio (0h, 1h e 2h). a,bLetras minúsculas diferentes indicam diferença entre colunas
a b
b
b
b
59
5,4
5,6
5,8
6
6,2
6,4
6,6
TRATAMENTOS
pH
fresco
0h
1h
2h
Figura 2: Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a diferentes
tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h).
P > 0,05
0
20
40
60
80
100
120
TRATAMENTO S
% E
NR
OL
AD
AS fresco
0h
1h
2h
Figura 3: Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada de amostras do sêmen a
fresco e descongelado a diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h). a,bLetras minúsculas diferentes indicam diferença entre colunas
DISCUSSÃO
De acordo com os resultados obtidos para o sêmen fresco, pode-se observar que
os parâmetros avaliados encontravam-se dentro da normalidade para a espécie canina
(CHRISTIANSEN, 1988) e que, portanto todos os animais utilizados estavam aptos a
participarem desse experimento.
b c bc
a
60
No que diz respeito aos parâmetros avaliados pelo CASA, os resultados revelam a
importância do tempo de equilíbrio ao se congelar o sêmen de cães quando se usa ACP-106®
como diluidor. SALAMON & MAXWELL (2000) relataram a importância desse tempo de
equilíbrio para a qualidade do sêmen canino pós-descongelação, pois segundo esses autores
durante esse período, ocorre o equilíbrio osmótico entre o meio intracelular espermático e
extracelular, formado por todos os componentes osmoticamente ativos presentes no meio
diluidor. WATSON (1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a entrada
do glicerol como se acreditava anteriormente, mas também permite que as membranas
espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram. Outro ponto importante
atribuído ao tempo de equilíbrio é que a permanência do sêmen a uma baixa temperatura
permite uma melhor adaptabilidade dos espermatozóides a essa temperatura, reduzindo com
isso, o efeito negativo do choque térmico já que as alterações físico-químicas na membrana
celular causadas pelo resfriamento podem ser irreversíveis (SANTOS et al., 2003).
A motilidade espermática é o principal parâmetro microscópico avaliado no sêmen
descongelado, (ENGLAND, 1993). Nesse experimento, os dados referentes à motilidade total
logo após a descongelação, mostraram que o sêmen submetido a um tempo de equilíbrio de 1
e 2 horas apresentaram uma média aceitável para uma posterior inseminação artificial, visto
que no caso do sêmen congelado-dscongelado, CONCANNON & BATTISTA (1989)
sugerem, para a espécie canina, uma motilidade acima de 50% como ideal e, acima de 30%
como aceitável. O G0h foi quem mostrou os piores resultados de motilidade, contudo o
resultado desse grupo foi semelhante ao obtido por CARDOSO (2005), que utilizando o
mesmo diluidor (ACP-106® acrescido de 20% de gema de ovo) e o mesmo protocolo de
congelação do G0h obteve uma motilidade total de 23% e uma motilidade progressiva de
18%. CARDOSO (2005) foi quem primeiro analisou os dados do sêmen canino descongelado
diluído em ACP-106® utilizando o CASA e nesse trabalho foi comparado os resultados da
análise computadorizada com os da análise subjetiva havendo uma superioridade significativa
dos resultados obtidos pela análise subjetiva. Atribuímos esse resultado ao fato de que é
requerida uma re-diluição para o CASA devido à alta concentração do sêmen após a
descongelação e sabe-se que essa re-diluição do sêmen pode causar mudanças no parâmetro
motilidade e integridade de membrana (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a; SMITH &
ENGLAND, 2001; RIJSSELAERE et al., 2003). Outro ponto importante é que segundo
SCHÄFER-SOMI & AURICH (2007), o aumento na concentração espermática melhora
significativamente a velocidade espermática, a linearidade e a motilidade. Esses autores
recomendam uma concentração de 100×106 sptz/mL para uma adequada análise. Nesse estudo
61
também foi percebido esse efeito da concentração, mas mesmo assim, uma concentração
variando de 20 a 50x106 de sptz/mL foi estabelecida previamente, baseando-se na informação
de que as colisões individuais múltiplas das células condensadas nas concentrações elevadas
podem interferir na motilidade progressiva (VANTMAN et al. 1988; RIJSSELAERE et al.
2002, 2003; HOFLACK et al. 2005). Como existe esse impasse quanto à melhor concentração
a ser utilizada para uma adequada avaliação do CASA, sugerem-se mais estudos sobre esse
assunto.
No tocante ao teste de termorresistência, pôde-se perceber uma queda significativa
a partir dos 30min para a maioria dos parâmetros avaliados, contudo esse resultado não foi
preocupante, visto que a termorresistência pós-descongelação é baixa para o espermatozóide
canino e, além disso, o espermatozóide canino mesmo com uma baixa termorresistência não
tem, necessariamente, um baixo potencial fertilizante (STRÖM et al., 1997).
Com relação às alterações morfológicas, acrossomas intactos e teste hipoosmótico
os resultados obtidos já eram esperados em função dos danos celulares provocados pelo
processo de congelação e descongelação do sêmen (WATSON, 1995). Na comparação entre
os grupos dos resultados do teste hipoosmótico, o G0h apresentou menos espermatozóides
com membrana funcional em relação ao grupo G2h e isso indica que o tempo de equilíbrio
promoveu um efeito benéfico sobre a preservação da funcionalidade da membrana.
Com relação ao pH constatou-se que ação tamponante do diluidor foi extremamente
eficaz, já que foi capaz de manter o pH dentro da normalidade ao longo de todo experimento
(CHRISTHIANSEN 1988).
CONCLUSÃO
Após a análise dos dados podemos concluir que no processo de congelação do
sêmen de cães deve-se incluir um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à CAPES, ao CNPq e à FUNCAP pelo apoio financeiro;
aos proprietários dos cães, em particular ao Daniel Couto Uchoa, por disponibilizar os
animais para o estudo; ao Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo pela colaboração nas análises
62
estatísticas e ao Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino pela disponibilização de uso do
CASA
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67
8. CONCLUSÕES
1. A partir dos resultados obtidos sugere-se que a melhor a taxa de descongelação para o
sêmen de cães utilizando como diluidor o ACP-106® seja 55°C/5s já que a mesma foi quem
proporcionou uma melhor motilidade por até 30min após a descongelação.
2. Após a análise dos dados podemos concluir que no processo de congelação do sêmen de
cães deve-se incluir um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C.
68
9. PERSPECTIVAS
Após a conclusão desse trabalho foi possível demonstrar a eficiência do diluidor a
base de água de coco em pó na congelação do sêmen de cães. Além disso, aprimorou-se a
técnica de congelação até então utilizada para esse diluidor, pois foi mostrada a importância
da inclusão de um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C e de uma taxa de
descongelação de 55°C por 5 segundos. Com esse aperfeiçoamento no protocolo de uso do
diluidor ACP®-106 foi dado um passo importante visando à aplicação comercial e uso em
larga escala.
69
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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11. ANEXOS
Anexo A. Composição do corante Rosa de Bengala para avaliação da morfologia
espermática.
20 mL de água destilada
0,58 g de citrato de sódio
0,8 mL de formaldeído
0,3 g de Rosa de Bengala
OBS.: Após a mistura dos três primeiros componentes, a solução é homogeneizada e
acrescenta-se o Rosa de Bengala.
Anexo B. Diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®) para criopreservação de
sêmen canino.
4,25 g ACP-106®
50 mL água destilada
OBS.: pH 7,07 e osmoraridade de 298 mOsmol.
Anexo C. Composição do meio de re-diluição (solução de citrato de glicose) para avaliação
no CASA
100 mL de água destilada
0,08 g de glicose
2,37 g de citrato de sódio
OBS.: pH 7,5 e osmolaridade de 300 mOsm.
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