começando a decifrar

Começando a decifrar...

O fenômeno de restrição-modificação

K B

Cepa K OK

Cepa B OK

Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação.

Arber, 1962Nathans & Smith, 1962

Enzimas de restrição

Clivagem de restrição

Sítio de Restrição

Nomenclatura das enzimas de restrição

EcoRI Escherichia coliBamHI Bacillus amyloliquefaciens RHBglII Bacillus globigiiPvuII Proteus vulgarisHindIII Haemophilus influenzae RdHinfI Haemophilus influenzae RfSau3A Staphylococcus aureusAluI Arthrobacter luteusTaqI Thermus aquaticusHaeIII Haemophilus aegyptiusNotI Nocardia otitidis-caviarum

Fracionamento de DNA

Mapa de Restrição

Utilização do Mapa

Detectar mutações

Comparação de Mapas

Fracionamento de DNA

Como reconhecer o fragmento de interesse?

Complementariedade

Hibridação

Calor ou pH = desnaturação

Reassociação

Temperatura e força iônica

Sonda

Marcação da sonda

Estringência

Reação de Hibridação e Lavagem:• especificidade da sonda• tamanho da sonda• temperatura (T’m)• força iônica

Especificidade : identidade de seqüência

Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo

Temperatura: T’m - 25oC

Força iônica: NaCl

Southern blot

Resultado

Hibridação in situ

Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro

Em azul claro os núcleos corados com DAPI

Southern blot

Animação

Southern.exe

O que fazer com o fragmento?

Clonagem de DNA

A clonagem permite a eternizar o fragmento

Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser

produzido por um procarioto.

Vetores de clonagem

1. Replicação autônoma2. Marcas de seleção3. Sítio para clonagem

O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem?

Sítio de clonagem

O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas.Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.

Plasmídio recombinante

Transformação

Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção, contenção,multiplicação

Hospedeira transformada

Clonagem molecular

Outro vetor?

Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb.YACs - fragmentos maiores ainda.

Biblioteca Genômica

Genoteca

Varredura de biblioteca

Seqüenciamento de DNA

Princípios

Reação em cadeia de polimerização

1. Replicação

PCR

2. Amplificação

PCR - ANIMAÇÃO

Pcr.exe

Um momento, por favor, estou carregando o programa.