célula e cultura celular

Célula e Cultura Celular

Carlos Roberto Jorge Soarescrsoares@ipen.br

CURSO TNM-5783-2020

Biomateriais – Propriedades e Avaliação

25set2020

O que é célula?

VIDA!

100 trilhões (mais de 1014) células

+ 200 células ≠

1 a 100 micrometros

1 ng de massa típica

As células são as unidades estruturais e funcionais dos organismos vivos

Retículo endoplasmático liso

O que é célula?

DNA

DNA

ácido desoxirribonucleico

Modelo da dupla hélice

proposto por Watson e

Crick em 1953

GenesSeqüência de bases rigorosamente definida

presente na dupla hélice de uma molécula de

DNA capaz de codificar um polipeptídeo.

CaracterísticasCapaz de duplicar-se.

Capaz de gerar um polipeptídeo, por intermédio

de uma molécula de RNA.

2% do DNA

Cromossomos

Organização

cromossômicahttp://www.bio.miami.edu/dana/250/25002_2.html

As células-tronco retiradas do tecido do cordão são chamadas de MESENQUIMAIS

Zigoto

Diferenciação

Aquisição do fenótipo característico

é limitada pela proliferação celular

Pode ser induzida por:

Aumento da concentração celular

Aumento da interação cél-cél / cél-matriz

Fatores de diferenciação

Desdiferenciação:

perda irreversível das propriedades

especializadas das células

Deadaptação:

as propriedades podem ser re-induzidas

com a criação da condição correta.

BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS

Expressão Gênica

Mecanismos de Regulação Gênica

1. Metilação no DNA 2. Modificação de Histonas 3. RNA não codificantes (microRNA)

Fontes

PROLIFERAÇÃO CELULAR

Ciclo Celular

4 fases:

Mitose

G1 (GAP 1)

S (Síntese do DNA)

G2 ( GAP 2)

Pontos de restrição“Checkpoints”

Proteínas de controle do ciclo celular

Cultura de Células

FONTES

Início: Harrison, 1907 / Carrel, 1912

Por ~ 50 anos => utilização de fragmentos não

desagregados

Segunda metade do Séc. XX => cultura de células Dispersas

“Tissue Culture” x “Cell Culture”

Termo Genérico

INTRODUÇÃO

Objetivo:

Desenvolver um método para estudar o comportamento de células

animais livres da influência das variações sistêmicas

Ex.: stress do experimento, homeostase normal

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animal de sangue frio => rã (1907)

animais de sangue quente => interesse médico

embrião (ovo de galinha) - diversidades de células

roedores – linhagem celular contínua

tumores humanos ex.: Hela (1952)

recentemente => células de insetos (pestes/biotecnologia)

células de peixe (“fish farming”/poluição)

L-Cell => Fibroblasto subcultâneo de camundongo (1943)

COS => Célula de rim de macaco (1951)

Hela => Célula epitelial do cervix humano (1952)

CHO-K1 => Células de ovário de hamster chinês (1958)

W138 => Fibroblastos embrionários de pulmão humano (1961)

BHK21 =>”Baby hamster Kidney fibroblastos” (1962)

HEK293 => “human embryonic kidney cell” (1970)

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Per.C6 =˃ “from human retinoblast cells” (1985)

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2019

400000

Tipos de CC Tipos de CC

Tipos de CC

(3D)

Tipos de Cultura Celular

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Meios - “serum-free seletive media”

antibióticos

equipamentos (de ar limpo)

linhagens celulares

substituição de experimentos com animal

Aumento da sensibilidade

mais rápido

Fusão de células

Técnicas de recombinação gênica

Aumento das áreas de interesse

Fatores que contribuíram para o desenvolvimento

da Cultura Celular

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Vantagens da Cultura Celular

Aspectos Físicos-químicosControle do pH, temperatura,

osmolaridade, gases dissolvidos

Condições fisiológicas Controle de hormônio e

Concentração de nutrientes

Micro-ambienteRegulação da matriz, interação

célula-célula e difusão gasosa

Homogeneidade da

linhagem celular

Capacidade seletiva do

meio e clonagem

Caracterização Citologia e imuno-coloração

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Preservação Pode ser armazenada em

nitrogênio líquido

Origem, histórico, pureza

podem ser registrados

Fácil quantificação

Volumes reduzidos, acesso

direto e menores custo

Possibilidade de definir dose,

concentração e tempo

Microtitulação e robótica

Citotoxicidade e screening de

fármacos, cosméticos, etc.

Validação

Replicatas e variabilidade

Economia de reagentes

Controle de concentração

e tempo

mecanização

Redução do uso

de animalBTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS

Limitações da Cultura Celular

Manualidade, contaminação química

ou microbial, contaminação cruzada

Local de trabalho, incubação,

controle do pH, acondicionamento e

descartes de material com risco biológico

Capital para equipamentos e material de

consumo: meio, soro, plásticos

habilidade

Controle

ambiental

Quantidade

e custo

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desdiferenciação

Expressão de marcadores

Histologia, citologia, microambiente

Instabilidade fenotípica

Identificação da célula

Instabilidade genética Heterogeneidade, variabilidade

BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS

Tipos de CC

Tipos de CC

(3D)

Tipos de Cultura Celular

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Evolução da Linhagem Celular

Evolução da Linhagem Celular

Cultura Primária:

O primeiro de uma série

de processos seletivos

Linhagem celular

Linhagem celular contínua:

Reflexo da variação genética

deleção/mutação p53

> telomerase)

aneuplóide

Transformação:

Uma alteração permanente

no fenótipo da célula

espontânea ou induzida

Imortalização

Aberações no controle do crescimento

malignidade

Ex.: Fibroblasto humano

Euploide - ~50 gerações

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Imortalização: Freqüentemente perde a habilidade de diferenciar

Ex.: 3T3; BHK21-C13 não causam tumoração

Aberações no controle do crescimento

Malignidade = potencial de tumoração: a célula desenvolve a

capacidade de gerar tumores evasivos se

implantada in vivo

TransformaçãoUma alteração permanente

no fenótipo da célula

Espontânea ou induzida

Instabilidade Genética => é maior na CC

Transfecção/transformação (bactérias)

Maior propagação

Mutantes não são eliminados

→

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INSTALAÇÕES

E

EQUIPAMENTOS BÁSICOS

•

Planejamento de um Laboratório de CC

Palavra Chave: ASSEPSIA

Considerações:

Nova construção x Converter uma área já existente

• Onde ficaram: passagem de ar/gás; fluxo

Facilidades: sala de lavagem

esterilização

transporte de material

•

Limitações estruturais•

Largura das portas; altura•

• Normas: Biossegurança

GMP

Piso / teto / paredes

Escadas

Tráfego: pessoas/carrinho

Janelas: vedação/insufilm

Espaço entre equipamentos

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Questões Gerais

Quantas Pessoas? Quanto tempo? Tipo de cultura?•

no de Fluxos

manipulação de biorreatores

dissecção de tecidos animais

Sugestão: 12 Fluxos / 50 pessoas

2 Fluxos / 8-10 pessoas

• Qual espaço Físico?

O Lab. CC tem de acomodar 6 principais funções:

Manipulação estéril

Incubação

Preparação

Lavagem

Esterilização

armazenamento

BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS

BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS

Equipamentos Básicos

Fluxo Laminar

Incubadora com CO2

Tanque criogênico

Microscópio Invertido

Centrífuga

Sistema Purificador de água

Autoclave

Freezer - 80

Manipulação de Células

Sub-cultura

Sub-cultura → passagem/transferência

Cultura primária → Sub-cultura → linhagem Celular → cepa celular

Finita (20 – 80 gerações)

Contínua

Número de passagem número de gerações

Designação da linhagem celular:

NHB 2 – 2/3

LT 156

NCI

Banco de células: ATCC – American Type Culture Collection

T47D = HTB-133

MCF-7 = HTB-22

Normal Human Brain

derivada da mesma fonte

clone

Número de gerações (para célula finita)

Lung Tumor

Número da Biopsia

laboratório: Nacional Cancer Institute

HEK 293

Human Embrionic Kidney

293° experimento de Frank Graham’s (1970, Holanda)

Quando deve ser feita a sub-cultura ?

Densidade da cultura: logo após atingir confluência

(obs.: se deixar mais de 24 horas = recuperação mais lenta)

Exaustão do meio = queda do pH

Tempo desde a última sub-cultura (7 dias)

Troca 3 –4 dias

Outros procedimentos requeridos: Aumentar estoque

Mudança de frasco ou meio

Frequente troca de meio

Perfusão contínua

Células pouco conhecidas:

Início das passagens = usar razão 2 ou 4

Concentração Celular na Sub-cultura:

Regra Geral: 1.104 – 5.104 células / mL

Culturas mais frágeis:

endotélio, primeiras passagens do epitélio

Aconselha-se 1.10 5 células / mL

Subcultura da Cultura em Suspensão:

Critérios similares aos da cultura em monocamada

Concentração Celular NÃO maior que 1.106 células / mL

Contagem de células

Congelamento / Descongelamento

Razões para congelar as células:

1. Instabilidade gênica

2. Senescência

3. Transformação

4. Instabilidade fenotípica devido a seleção e dediferenciação

5. Contaminação por microorganismos

6. Contaminação cruzada

7. Falha na Incubação

8. Poupar tempo e material na manutenção de linhagens que não

serão usadas imediatamente

9. Necessidade de distribuição/transporte

Estágios de Criopreservação

Pescoço largo

Pescoço estreito

Vapor

N2 líquido

Tipos de Criofreezeres:

1oC/min → -70 oC → N2 líq (-196oC)

2 min máx

DMSO → 5-10%

Glicerol →10-15%

CUIDADOS:

Descongelamento

Manipulação Rápida

Explosão

DMSO (luvas x pele)

Protetor de Face

ASSEPSIA

Técnicas assépticas: combinação de procedimentos com objetivo de reduzir a probabilidade de contaminação

Manutenção da esterilidade bom senso, experiência

Tipos de contaminação: bactéria, micoplasma, levedura, fungo

Fontes de contaminação: operador, atmosfera, superfícies, soluções, equipamentos, fonte de aquisição das células

Minimização da contaminação:

1) checar a cultura regularmente a olho nú ou ao microscópio;

2) manter a cultura sem antibiótico por determinado período;

3) checar reagentes quanto à esterilidade (fabricante);

4) não compartilhar frascos de reagentes de uso;

5) estabelecer seu próprio método de trabalho “estéril”.

Ambiente de trabalho: calmo; portas e janelas fechadas; acesso restrito; isolado de culturas microbiológicas e de

animais; equipamentos relacionados; atividades não estéreis em outro local.

Superfície de trabalho: limpa e arrumada

Importante: Muito Treino e álcool 70%!!!BTC 5737-CULTURA DE CÉLULAS

Classificação dos OGMs quanto ao grupo de risco:

→ grupo 1: provavelmente não provocam doenças no homem ou nos animais;

→ grupo 2: germes patogênicos capazes de causar doenças em seres humanos

ou animais. Geralmente não apresentam um perigo sério, medidas profiláticas

são conhecidas, risco de propagação limitado;

→ grupo 3: germes patogênicos que costumam provocar doenças graves em

seres humanos ou animais. Propagação via hospedeiro infectado, medidas

profiláticas e de tratamento bem estabelecidas;

→ grupo 4: agentes infecciosos patogênicos que geralmente causam doenças

graves em seres humanos ou animais. Transmissão direta ou indireta,

geralmente não se conhece tratamento eficaz e as medidas profiláticas não são

bem estabelecidas.

Nível de Biossegurança (NB): nível de contenção necessário para permitir o

trabalho com OGM de forma segura, com risco mínimo para o operador e para o

ambiente.

Aplicações da CC

Aplicações Gerais

Biotecnologia

Proteínas Recombinantes

Glicosilação

=>Retornar células

corrigidas ao paciente

Implante de células =>

Doença de Parkinson

Insulina

Musculatura esquelética

Células do próprio indivíduo x célula de feto

Terapia Gênica

Transfectar genes normais

em células deficientes

Terapia Celular

Bioensaios

Cultivo celular 3D

Homem em um Chip

Medicina individualizada

https://www.youtube.com/watch?v=1ya8-bjRHVs&feature=youtu.be

Bioimpressão 3D: Desafios e Aplicações (Dra Janaina Dernowsek, Bioedtech)

Bioimpressão 3D

Células troncos com Pluripotência induzidas IPS’s

Medicina regenerativa

Questões éticas

Obrigado!!!