cincinnati children's hospital medical center universidade de brasília brasília - 2005...

Cincinnati Children's Hospital Medical Center Universidade de Brasília

Brasília - 2005

Atresia das vias biliares extra-hepáticas:Expressão gênica em um modelo experimental

Autora:Elisa de Carvalho

Orientador:Luiz Alberto Simeoni

Co-orientador:Jorge A. Bezerra

I - Introdução

AVBEH: principal indicação de transplante hepático

AVBEH: 50% dos transplantes hepáticos pediátricos

BALISTRERI, W. F. et al. Biliary atresia: current concepts and research directions. Summary of a symposium. Hepatology 23, 1682-1692 (1996).

Nenhuma outra patologia, nem na idade adulta, é responsável por essa monta de indicação para o transplante.

AVBEH: principal indicação de transplante hepático

Hipertensão portalCirrose biliar

Varizes esofagogástricasHiperesplenismo

AsciteInsuficiência hepática

Síndrome hepatopulmonarSíndrome heparorrenal

Colestase

Complicações da portoentorostomiaComplicações da

doença Colangite

Progressão da hepatopatia?

Terapêutica: portoenterostomia

Evolução pós-portoenterostomia

Diagnóstico tardio

?Etiopatogênese

Injúria durante o desenvolvimento dos ductos biliares (primeiro trimestre)

Defeitos na morfogênese: Genes da lateralidade INV CFC1 ZIC3 Má-formação da placa ductal JAG 1 HNF-6 HNF-1β HLA

Artéria hepática Canal pancreatobiliar

AVBEH (embrionária)

(perinatal)

Reovírus Rotavírus Citomegalovírus

Resposta TH1 Células T CD8+

Células NK Macrófagos

Ácidos biliares tóxicos

Desenvolvimento do fígado e vias biliares

Predisposição genética

Fatores ambientais (infecção viral)

Disfunção imune no neonato

Fatores anatômicos Toxicidade

Auto-imunidade

Embrionária

Perinatal

Etiopatogênese

Histologia das vias biliares

Obstrução progressiva

das VBEH

Modelo animal: AVBEH

Camundongos Balb/c

Rotavírus rhesus do grupo A

PHILLIPS, P. A. et al. Chronic obstructive jaundice induced by Reovirus type 3 in weanling mice. Pathology 1, 193-203 (1969).

SCHMELING, D. J. et al. Experimental obliterative cholangitis. A model for the study of biliary atresia. Ann. Surg. 213, 350-355 (1991).

RIEPENHOFF-TALTY, M. et al. Group A rotaviruses produce extrahepatic biliary obstruction in orally inoculated newborn mice. Pediatr. Res. 33, 394-399 (1993).

PETERSEN, C. et al.

New aspects in a murine model for extrahepatic biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 32, 1190-1195 (1997).

Camundongos Balb/c

Indução: AVBEH

Carga viral

Idade do animal

Via de inoculação

106 PFU/mL

< 12 horas

Intraperitoneal

Modelo animal: bem estabelecido, como

adequado para pesquisas experimentais relacionadas

à atresia.

Camundongos Balb/c

Inflamação e fibrose obliterante

Fator inicial:

Infecção

Expressão gênica

As modificações da expressão gênica comandam os processos biológicos que influenciam a evolução da doença após o a lesão inicial.

Hipótese do estudo

Genoma

Ativação ou desativação reacional de genes

Reprogramação da função celular(Estimulação ou inibição de processos biológicos)

Inoculação de RRV

Fibrose progressiva com obliteração das VBEH

II - Objetivos

Analisar o transcriptoma (expressão gênica) das vias biliares extra-hepáticas, em modelo experimental de AVBEH, nas diferentes fases da

evolução dessa doença.

Objetivo geral

Identificar os genes ativados e os desativados, nos camundongos infectados pelo RRV, em relação ao grupo controle, nos diferentes

estágios da obstrução biliar.

Avaliar os processos biológicos que se correlacionam ao desenvolvimento da atresia das vias biliares extra-hepáticas.

Identificar e analisar as vias moleculares que regulam o dano celular e a obliteração das vias biliares extra-hepáticas.

Objetivos específicos

III - Métodos

Estudo experimental, randomizado e controlado.

Desenho do estudo

Injeção intraperitoneal: 20 μL de soro fisiológico 0,9%, primeiras 24 horas de vida.

114 camundongos Balb/c: menores que 24 horas de vida filhos de mães negativas para o RRV

injeção intraperitoneal: 1,5 x 106 UFF de Rotavírus rhesus do grupo A (20 μL) primeiras 24 horas de vida

Grupo A (modelo animal de AVBEH): 63 camundongos

Grupo B (grupo controle): 51 camundongos

Excluídos: animais do grupo A que não desenvolveram AVBEH.

03 amostras RNA: Microarranjos

03 amostras RNA: RT PCR

03 amostrasHistologia: VB

102 Camundongos Balb/c (< 24 horas de vida)

Inoculação intraperitoneal com RRV

Inoculação intraperitoneal com SF 0,9%

Grupo A: 51 camundongos(modelo animal de AVBEH)

Grupo B: 51 camundongos(grupo controle)

Clínica: peso, icterícia, colúria e acolia fecal Laboratorial: bilirrubinúria

Anestesia: Microdissecção e ressecção das vias biliares

Retirada de dois fragmentos hepáticos

Animais sacrificados com:

03 dias de vida: subgrupos A1 e B1

07 dias de vida subgrupos: A2 e B2

14 dias de vida subgrupos: A3 e B3

Amostra 01

Dias 7 e 14

RT PCR: teste de maior acurácia para determinação da expressão gênica.

GeneChip: permite a avaliação do transcriptoma (perfil de “funcionamento” de todos os genes em um momento específico -

níveis de mRNAs dos genes expressos) em um único ensaio.

Avaliação da expressão gênica

Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip®

Reação em cadeia da polimerase em tempo real

Novas tecnologias

Várias seqüências de nucleotídeos (representando todo o genoma) são depositadas em uma superfície de vidro (o chip) e

cada oligonucleotídeo configura uma sonda para um gene específico.

LipídeosCarboidratos

Proteínas

Homogeneização e lise celular (TRIzol)

Fase da separação (fenol/clorofórmio)

Precipitação (isopropanol)

Extração: RNA das vias biliares

TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA

Qualidade do RNA

Local de origem do sinal de fluorescência e a intensidade deste identifica o gene em questão e seu

nível de expressão.

Unidade de expressão: pixel

Quantificação do sinal de fluorescência: sistema GeneChip®

Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring

Avaliação conjunta dos resultados de todas as amostras.

Comparação entre os grupos experimental e controle.

Avaliação estatística.

Classificação dos genes em funções biológicas (Gene Ontology).

Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos

NormalizaçãoGrupo experimental X Grupo controle(Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)

GeneSpring

O valor da expressão dos genes no GeneSpring é um valor relativo (ou normalizado) em relação ao controle.

Primeira etapa:Média de todos os sinais da expressão gênica.Este valor é dividido por cada um dos sinais individualmente. Objetivo: evitar valores extremos.

Segunda etapa:As amostras do grupo controle foram usadas como valor basal. A intensidade do sinal de cada gene no grupo experimental foi dividida pelo valor do mesmo gene no grupo controle, o que foi realizado separadamente para os dias 3, 7 e 14.

Seleção dos genes(Anova p < 0,01)

Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controleGenesativados ou desativados < 2x em relação ao controle

GeneSpring

Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixelsem pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo

(Diagrama de Venn)

GeneSpring

Reclassificação dos genes(PubMed, GeneCard, UniGene, Gene, GeneBank)

Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixelsem pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo

(Diagrama de Venn)

Seleção dos processos biológicos (Anova p < 0,05)

GeneSpring

Validação dos resultados do GeneChip

Reação em cadeia da polimerase em tempo real

RT PCR: Quantificação do número de cópias

Sinal de fluorescência: SYBR Green

Curva de amplificação da RT PCR com várias amostras

Curva de amplificação da RT PCR e definição do CT

Quantidade de cópias inicial da amostra

Região da linha de base

Número de ciclos

Amostra: sem DNA

Linha que delimita o nível de detecção do

sinal de fluorescência

ThresholdAmostra

Platô

Cálculo da expressão gênica

Gene padrão: 18S. Animais do grupo experimental e do controle.

Expressão de um gene

Expressão do gene no grupo experimental Expressão do gene no grupo controle

Quantidade de cópias do gene-alvoQuantidade de cópias do gene padrão

Variação da expressão

Expressão da citoqueratina-7 (Krt2-7):

Fígado e árvore biliar extra-hepática

Especificidade dos microarrranjos:

árvore biliar extra-hepática

Validação: RT PCR

IV - Resultados

Outros estudos: 67% a 86%Petersen C et al., 1997; Czech-schmidt G et al., 2001;

Shivakumar P et al., 2004

AVBEH: 51 camundongos (81%)

63 camundongos

Incidência de AVBEH: animais infectados por RRV

Evolução da infecção pelo RRV

Icterícia

Colúria

Acolia fecal

Ausência:

Quadro diarréico

Humanos: diarréia importante (O'ryan M. et al., 2005)

Animais mais velhos: ausência de icterícia (Feng N. et al., 1994)

AVBEH: quadro clínico

RRV: tropismo pelos colangiócitos

Brevidade cronológica

Camundongos

Não persiste com o crescimento e o amadurecimento do animal

RRV: tropismo único pelas células do epitélio biliar neonatal

(Shivakumar et al., 2004)

De modo similar em humanos:

Atresia é observada apenas em lactentes nos primeiros três meses de vida, não se desenvolvendo em crianças maiores ou em adultos.

BALISTRERI, W. F. Neonatal cholestasis. J. Pediatr. 106, 171-184

(1985).

BEZERRA, J. A. & BALISTRERI, W. F. Cholestatic syndromes of infancy and childhood. Semin.

Gastrointest. Dis. 12, 54-65 (2001).

Imaturidade temporária: relacionada à idade precoce

Pode desempenhar um papel importante na história natural dessa doença.

Aspecto macroscópico das vias biliares extra-hepáticas

Vesícula biliar distendida . Vesícula biliar pequena e contraída.

Vias biliares de aspecto normal. Vias biliares estreitas e fibrosadas.

Grupo experimental

Grupo controle

Avaliação histológica das vias biliares

Barra preta: 100 μm

Dia 3 Dia 7 Dia 14

Dia 14Dia 3 Dia 7

Peso médio dos camundongos

Peso médio dos camundongos relacionado aos dias seguidos à inoculação com SF0,9% ou RRV, com p < 0,01 dos dias 7 a 14.

SF 0,9%

* * * * * * * *

Fenótipo da AVBEH em crianças

Modelo animal:

Sinais clínicos

Aspectos macroscópicos

Histologia

Evolução

Hipodesenvolvimento:

Redução da ingesta alimentar

Esteatorréia

Grupo experimental

Dia 3 Dia 7 Dia 14

Grupo controle

Avaliação histológica do fígado

Dia 3 Dia 7 Dia 14

RRV (vias biliares e tecido hepático):

identificado nos animais sacrificados com 7 dias

RRV (vias biliares e tecido hepático):

Não foi isolado naqueles sacrificados com 14 dias.

Papel do vírus

Efeito citopático direto do vírus

Potencial papel dos processos imunes na evolução da doença.

SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental

biliary atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004).

MACK, C. L. et al. Armed CD4+ Th1 effector cells and activated macrophages participate in bile duct injury in murine

biliary atresia. Clin. Immunol. 115, 200-209 (2005).

Infiltrado linfocitário periductular

Predomínio: linfócitos TH1 e CTLs. SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary

atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004).

Transcriptoma das vias biliares

849 genes

Transcriptoma das vias biliares(45.101 genes transcritos)

Anova p < 0.01Genes ativados ou desativados < 2x ou > 2x

Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels

Seleção dos processos biológicosAnova p < 0,05

3SF 3RRV 7SF 7RRV 14SF 14RRV

Árvore genética: GeneSpring

359 genes

Dia 3:ImunidadeEnzimas

Proteínas estruturaisTransporte

Transcrição e tradução

Proteínas estruturaisApoptose

Transdução de sinais

Proteínas estruturaisTranscrição e traduçãoTransdução de sinais

498 genes

Ativados:310 genes

Reclassificação funcional dos genes(PubMed, UniGene, Gene, GeneCard, GeneBank)

Dia 3 Dia 7 Dia 14

Dia 3 Dia 7 Dia 14 Genes ativados

Transdução de sinalApoptose

Transcrição e traduçãoTransporte

Proteína estruturalEnzima

Imunidade

Imunidade: três etapas da pesquisa.

Maior número de genes ativados: processos imunes no dia 7.

Classificação funcional dos genes ativados nos dias 3, 7 e 14.

Imunidade

Imunidade adquirida

Fase precoce da lesão biliar (dia 3)

Imunidade inata

Células fagocitárias (neutrófilos e macrófagos)

Frações do complemento

Ativação macrofágica

Ativação da cascata de complemento

TAP2, TAPBP PSMB8

Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+

TAP2, TAPBP PSMB8

H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10

TAP2, TAPBP PSMB8

H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10

Imunidade celular

Etapas da imunidade adquirida

Ativação dos linfócitos

Dias após a exposição ao antígeno

Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT

i) Processamento e apresentação do antígeno

ii) Aumento da expressão do MHC da classe I

iii) Fatores reguladores dos interferons

iv) Estimulação dos linfócitos T

Imunidade adquirida: dia 3

Imunidade celularImunidade humoral

BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in children with biliary atresia. Lancet 360, 1653-1659 (2002).

Imunidade

Imunidade inata: complemento

C1Qα, C1Qβ

C3αR1

C1R – Dia 3

FcγRIIIA (CD16)

Célula NK

ativada

FcγRIII (CD16)

Citotoxicidade mediada por anticorpos

Ac liga-se ao antígeno na superfície do patógeno

Receptores Fc (NK) reconhecem os Ac

Sinalização para célula NK matar a célula-alvo

A célula alvo morre por apoptose

Catepsinas

Biossíntese do MHC da classe II

H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1

Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+

BROOME, U. et al. Different expression of HLA-DR and ICAM-1 in livers from patients with biliary atresia and Byler's disease. J. Hepatol. 26, 857-862 (1997).

FENG, J. et al. The aberrant expression of HLA-DR in intrahepatic bile ducts in patients with biliary atresia: an immunohistochemistry and immune electron microscopy study. J. Pediatr. Surg. 39, 1658-1662 (2004).

KOBAYASHI, H. et al. Hepatic overexpression of MHC class II antigens and macrophage-associated antigens (CD68) in patients with biliary atresia of poor prognosis. J. Pediatr. Surg. 32, 590-593 (1997).

Expressão anômala do MHC da classe II nos ductos biliares: lesão progressiva

TCRB-V13

Sinapse imunológica

Redistribuição dos receptores

e seus ligantes

Receptores das células T e seus ligantes

Reconhecimento do antígeno

e seus ligantes

Reconhecimento do antígeno TCRB-V13

Moléculas de adesão intercelular

DILLON, P. W. et al. Differential expression of the major

histocompatibility antigens and ICAM-1 on bile duct epithelial

cells in biliary atresia. Tohoku J. Exp. Med. 181, 33-40 (1997).

DAVENPORT, M. et al. Immunohistochemistry of the liver

and biliary tree in extrahepatic biliary atresia. J. Pediatr. Surg.

36, 1017-1025 (2001).

Moléculas de adesão: papel significativo na

reação inflamatória na atresia biliar, por

ocasionarem atração, retenção e ativação

dos leucócitos circulantes.

Determina a atividade de sinalização das cinases da família Src.

e seus ligantes

TCRB-V13

Outro evento de sinalização intracelular é a fosforilação das tirosinas, por tirosinas

cinases da família Src.

e seus ligantes

TCRB-V13

Componentes essenciais:

sinapse imunológica

Fundamental:ativação dos

mecanismos de sinalização intracelular na ativação da célula T

Regulam a produção de

citocinas.

Desenvolvimento das subpopulações das células T

Subpopulações: TH1 e TH2

Ativação das células T

Estágio inicial: diferenciação da

célula T

Polarização: citocina

Etapas do desenvolvimento

dos linfócitos.

Principal citocina:célula T naive.

Crescimento e diferenciação das células T.

Proliferação e a expansão clonal

das células T naive

A proporção relativa dessas subpopulações é o principal determinante das funções protetoras e das conseqüências patológicas da resposta imune.

Pergunta: predomínio TH1 ou TH2?

TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes

(D) Aumenta da expressão das moléculas do MHC das classes I e II.

Ações biológicas do interferon gama

(B) Nas células B, promove a troca do isótopo para anticorpos opsonizantes e fixadores de complemento.

(A) Ativação de macrófagos, que passam a apresentar maior atividade microbicida.

(C) Promove a diferenciação das células T CD4+ naive para a subpopulação TH1 e inibe a proliferação das células TH2.

TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes

Citocina: estabelece a presença de atividade das células TH1.

Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT

CXCL10, TGTP, CXCL9, LY6C, IGTP, IFI1, IIGP1, SAMHD1, AIF1 e genes do MHC das classes I e II

Aciona a transcrição dos genes induzidos pelos interferons.

Ativação temporal dos indutores do interferon em fases precoces da lesão biliar, seguida da expressão de uma rede molecular dirigida pelo interferon gama, que

conhecidamente polariza os linfócitos em um perfil pró-inflamatório TH1.

Fatores reguladores do interferon

(IRF7 e IRF9)

Interferon gama

Genes induzidos pelo Ifnγ

Via molecular com genes correlacionados

BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in children with biliary atresia. Lancet 360, 1653-1659 (2002).

Aumento do interferon gama e do osteopontin, sinalizando a resposta TH1, bem como a desativação dos genes relacionados às imunoglobulinas.

SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004).

Camundongos knock out para essa citocina importância do interferon gama no desenvolvimento da obstrução biliar.

Modelo animal

Crianças MACK, C. L. et al. Biliary atresia is associated with CD4+ TH1 cell-mediated portal tract inflammation. Pediatr. Res. 56, 79-87 (2004).

Perfil de citocinas característico da presença de linfócitos TH1, a saber: IL-2, interferon gama, TNFα e IL-12.

MACK, C. L. et al. Armed CD4+ TH1 effector cells and activated macrophages participate in bile duct injury in murine biliary atresia. Clin. Immunol. 115, 200-209 (2005).

Aumento da produção do interferon gama pelos linfócitos TH1 e elevação do TNF-α produzido pelos macrófagos.

Papel do interferon gama na obstrução das vias biliares

Transcriptoma: dia 7

TNFRSF1β, TNFαIP2

Mediador da resposta inflamatória

Fagócitos mononucleares ativados, células T estimuladas por antígenos,

células NK e mastócitos.

Enzima

Catepsinas

Biossíntese do MHC da classe II

Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+

CTSC, CTSS

Processamento do antígeno

Expressão coordenada de genes co-relacionados

Apoptose

Papel: CTLs

Mediadores da apoptose: exocitose de grânulos

Lise das células-alvo

Mediadores da apoptose: mediada por FasL-Fas

Expressão do FasL no epitélio dos ductos biliares pode participar da lesão progressiva dos ductos biliares intra-hepáticos após a portoenterostomia.

LIU, C. et al. Expression of fas ligand on bile ductule epithelium in biliary atresia--a poor prognostic factor. J. Pediatr. Surg. 35, 1591-1596 (2000).

Histologia das VBEH X transcriptoma biliar

Imunidade

Dia 14

Silenciamento: diminuição dos processos imunes no dia 14

HAMP1 Maior ativação gênica

Diminuem a disponibilidade de ferro e, por isso, além de agirem como fatores de defesa, também podem ser responsáveis pela

anemia da inflamação ou doença.

Desativação: Recrutamento de linfócitos

CCL21A

Ativação: Metabolismo do ferro

Dia 14

Silenciamento de genes

Transdução de sinais relacionados à imunidade

Fatores de transcrição das células T

MAP2K5

Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T

Inibição química desse fator: preveniu a obstrução biliar secundária ao RRV.

FENG, J. et al. Rotavirus-induced murine biliary atresia is mediated by nuclear factor-kappaB. J. Pediatr. Surg. 40, 630-636 (2005).

NF-κB regula a expressão de muito genes relacionados à resposta inflamatória/imune.

Sinergismo com o STAT1: sinalização da resposta aos interferons.

Desativação das vias responsáveis:

Produção do AP-1

Ativação do NFAT

Via molecular coordenada por genes co-relacionados:

Proteínas estruturais

Matriz extracelularDia 7: FBN2, ADAMTS5, COL4A5, COL14A1, PCOLCE, SPARCL1, FGFR1, GSN, MFAP2, OGNDia 14: COL4A5, COL16A1, FBLN1, FMOD, FLRT3

Exclusão de segmentos atrésicos durante a ressecção da árvore biliar extra-hepática.

Desativados

Alta expressão: “morfogênese, fibrinogênese e remodelamento da matriz extracelular”.

CHEN, L. et al. Altered expression of genes involved in hepatic morphogenesis and fibrogenesis are identified by cDNA microarray analysis in biliary atresia. Hepatology 38, 567-576 (2003).

CHOE, B. H. et al. The pattern of differentially expressed genes in biliary atresia. J. Korean Med. Sci. 18, 392-396 (2003).

Pequena quantidade de células viáveis nas fases tardias da obstrução biliar.

Microscópio de captura a laser de alta resolução.

Validação dos resultados dos microarranjos pela RT PCR

Curva standard: expressão gênica

Curva standard do gene Irf9

RT PCR: curva de dissociação

Curva de amplificação do gene Stat1, das 18 amostras

Resultados do RT PCR

Etapa Gene Descrição Variação*

Dia 3 IRF7 Interferon regulatory factor 7 45,2

Dia 3 IRF9Interferon dependent positive acting transcription factor 3 gamma 7,0

Dia 7 IGTP Interferon gamma induced GTPase 35,3

Dia 7STAT1

Signal transducer and activator of transcription 1

Dia 7 CXCL10 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 63,5

Dia 7 CXCL9 Chemokine (C-X-C motif) ligand 9 57,4

Dia 7 IFNG Interferon gamma 69,1

Genes escolhidos para validação dos resultados dos microarranjos:

IRF7, IRF9, IFNG, IGTP, STAT1, CXCL9 e CXCL10

VariaçãoIRF7

(Dia 3)IRF9

(Dia 3)IFNG

(Dia 7)IGTP

(Dia 7)STAT1(Dia 7)

CXCL9(Dia 7)

CXCL10(Dia 7)

GeneChip 13 4.1 3.9 12.2 12.5 24.7 36.8

RT PCR 45.2 7.0 69.1 35.3 12.7 57.4 63.5

Quantificação da expressão gênica nos microrarranjos e na RT PCR

Diferença no grau de ativação:

A RT PCR apresenta maior acurácia e sensibilidade em relação aos microarranjos de oligonucleotídeos, tendo também maior reprodutibilidade.

DING, C. & CANTOR, C. R. Quantitative analysis of nucleic acids--the last few years of progress. J. Biochem. Mol. Biol. 37, 1-10 (2004).

Validam os obtidos nos microarranjos (GeneChip®)

Polarização para a resposta imune adquirida TH1.

Resultados da RT PCR

Confirmam a existência do circuito inflamatório associado ao interferon gama.

Especificidade dos microarrranjos

Fígado Vias biliares

*Citoqueratina-7 (KRT2-7): filamento presente nos colangiócitos

Em resumo...

Alvos de intervenção terapêutica?

Histologia das VBEH X transcriptoma biliar

Lesão e na obstrução das vias biliares

Papel do sistema imune Interferon gama, TH1

Moléculas: sinapse imunológica

Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe II

Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe I

Aumento da expressão do MHC da classe I

Aumento da expressão do MHC da classe II

Fase precoce

Fase tardia

Ativação da cascata do complemento

Apoptose

Novos achados

Citotoxicidade mediada por anticorpos

VI - Conclusões

O transcriptoma da árvore biliar demonstrou a presença predominante de um processo pró-inflamatório, neste modelo experimental da atresia de

vias biliares extra-hepáticas, com ativação reacional de genes em períodos específicos da progressão do processo obliterativo.

Notavelmente, os animais portadores de AVBEH apresentaram ativação do interferon gama e a expressão seqüêncial de uma rede hierárquica de

genes relacionados à essa citocina, o que reflete um predomínio da resposta TH1.

A definição dos papéis de cada componente desse circuito inflamatório deve contribuir para a elucidação dos mecanismos etiopatogênicos da

AVBEH e para o advento de novas opções terapêuticas que influenciem na evolução da doença, no prognóstico do paciente e na necessidade do

transplante hepático.

Coletivamente, esses genes formam uma seleção transcricional altamente importante para a direção de estudos futuros, que possam explorar como

genes individuais ou grupo de genes relacionados entre si podem regular o início da lesão biliar, bem como a progressão para obliteração das vias

biliares.

A ativação de outros processos biológicos relacionados à apoptose, à cascata de complemento, à ADCC e aos fatores epigenéticos demonstra a presença dessas vias metabólicas durante o desenvolvimento da doença.

Elisa de Carvalho

Cong Liu

Pranavkumar Shivakumar

Gregg Sabla

Bruce Aronow

Jorge A. Bezerra

Autores

Se consegui enxergar mais longe

é porque estava apoiado sobre os ombros de gigantes.

Isaac Newton, Matemático Inglês.Obrigada!

USP18: imunidade inata. SLFN4: crescimento e desenvolvimento das células T. OASL2, OAS1G e OAS2: atividade antiviral, induzida pelos interferons. GBP1, GBP2 e GBP3: proteína ligadora de GTP com atividade GTPase, induzida pelo interferon gama durante ativação macrofágica. GZMA: apoptose. PSMB8, PSMB9 e PSMB10: processamento de antígeno para o MHC da classe I. SAMHD1: induzida pelo interferon, proteína de ligação ao GTP. CTSS e CTSC: proteólise, processamento do antígeno e geração de peptídeo para o MHC da classe II. CYBB, CYP1B1, CYBA, NCF1 e NCF2: complexo NADPH oxidase (fagocitose). PLA2G7: ativa os neutrófilos polimorfonucleares e aumenta a permeabilidade vascular. Atua na inflamação e na anafilaxia. Produzido por plaquetas, leucócitos e células endoteliais. HCK: membro da família Src da tirosina cinase, exerce papel na resposta imune inata e na sinalização para ativação do STAT 5. PTPRC (CD45R): pertence à família dos receptores da tirosina fosfatase, que desempenha papel na sinalização dos receptores dos linfócitos B e T. LYZS: tem função bacteriolítica, em tecidos e fluidos corporais. PTPN18: fosforilação de aminoácidos. Desfosforila a autofosforilada tirosina cinase.

Processos imunes – Enzimas – Dia 7

Papel da colestase: lesão histológica hepática

Ácidos biliares hidrofóbicos

Apoptose primária de hepatócitosPALMEIRA, C. M. & ROLO, A. P. Mitochondrially-mediated toxicity of bile acids.

Toxicology 203, 1-15 (2004).

Institutional Animal Care and Use Committee of Cincinnati Children’s Hospital Research Foundation.

Avaliação do comitê de ética médica

Transporte

Transportadores de membrana (ATP8A1 e LAPTM4A)

Transportadores nucleares (XPO7 e NUTF2)

Metabolismo (STARD4)

Imunidade (TAP2)

Transporte de ânions (SLC4A2)

Transporte de cátions (ATP6V1B2)

Transporte de colesterol (APOB)

Transporte de aminoácidos (SLC1A4)

Ativados

Desativados

Controle da transcrição e da tradução

Dia 14

Fatores de transcrição: TCF21, MEIS1, PBX1, ZF, CEBPG, ZBTB20, JUN

Splicing do RNA: SFRS7

Tradução e síntese protéica: EIF4A2, SERPINH1

Desativados

LipídeosCarboidratos

Proteínas

Homogeneização e lise celular (TRIzol)

Fase da separação (fenol/clorofórmio)

Precipitação (isopropanol)

Extração: RNA das vias biliares

TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA

2,5 μg de RNATampãoDNase I

PrimersNucleotídeos

Mistura: anelamentoRNase OUTTM

SuperScriptTM(transcriptase reversa)

TampãoAgentes redutores

Destruição do DNA

Desativa a DNase

AnelamentoDesfaz estruturas secundárias: RNA

Formação do cDNADestruição do RNA

Temperatura ambiente (15 min)

EDTA 25mM – 65°C (10 min)

70°C (10 min) - 4°C (1 min)

42°C (50 min) - 17°C (15 min) - 4°C (1 min)

Obtenção do cDNA de fita dupla

SupserScriptTM Reverse Transcriptase (Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA)

RT PCR: Curva padrão

Amostra padrão (conhecida) Coeficiente de correlação: 1.000 Amostra em estudo (concentração desconhecida)

RT PCR: Curva de dissociação

Agilent 2100 Bioanalyzer

Qualidade do RNA

Controle da quantidade e da qualidade do RNA

Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer:Concentração do RNA (A260 x 4): > 2,5 μg

Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer:Pureza (260/280 nm): razão > 1,6

Enzima

Carboidratos (glicogênio): PYGB

Lipídios: LIP1

Transcrição: ATF5

HRMT1L2 (transcrição do STAT1)

Chaperona: PDIA3

Ciclo da ubiquitina: USP1 e USP7

OAS1G e OASL2

Enzima 2’-5’ oligoadenilato sintetase: marcador da atividade dos interferons

Degradação do RNA viral

Processos imunes

Expressão gênica

Metabolismo

Enzima

Membro da família Src

Ativação do STAT5

Receptores do interferon I e ativação da via GAS

Enzima

Dia 14

Demonstrado previamente em análise de expressão de genes em fígado de camundongos adultos submetidos à obstrução crônica dos ductos biliares

extra-hepáticos.

CAMPBELL, K. M. et al. Transcriptional reprogramming in murine liver defines the physiologic consequences of biliary obstruction. J. Hepatol. 40, 14-23 (2004).

Ativado: GSTA2

Resposta da colestase crônica ou do estresse oxidativo persistente em estágios avançados da obstrução ao fluxo biliar.

Proteínas estruturais

Expressão diminuída ou ausente do gene VIL nas crianças portadoras de doenças hepáticas colestáticas progressivas.

PHILLIPS, M. J. et al. Abnormalities in villin gene expression and canalicular microvillus structure in progressive cholestatic liver disease of childhood. Lancet 362, 1112-1119 (2003).

Proteína do citoesqueleto, necessária para a manutenção e a integridade das microvilosidades do bordo estriado das células epiteliais canaliculares, nas quais os transportadores de membrana da secreção biliar estão localizados.

SVIL (dia 14)

Desativados

VIL2 (dia 3)

Dia 14

Receptores do interferon I e ativação da via GAS

STAT1: sinalização do interferons

ARHGDIB: sinalização mediada pela proteína Rho, crucial para a ativação da LFA1

CSF2Rβ1: estimula a produção de leucócitos

CEBPβ: ativa a transcrição de genes da fase aguda e participa nos mecanismos que controlam a transcrição dos genes induzidos pelo interferon

Vias moleculares relacionadas à imunidade

Controle da transcrição e da tradução

Replicação e no reparo do DNA: RBBP4, MCM3, RAD23B, TDG

Controle do ciclo celular: NDN

Expressão gênica: Controle transcricional: FUS, ATF4, ATF5, MEF2A, DHX9, TBX2, MTA2, NDN, TCERG1, PFTF1, SMARCE1. Controle pós-transcricional - splicing do RNA: RNPC2; - tradução: PUM2, NOL5, EIF4EBP2, EIF4A1; - ubiquinização de proteínas: TRIM30, MKRN1.

Processos imunes: HRMT1L2: controla a transcrição do STAT1 IRF7e IRF-9: fator regulador de interferons BACH2: controla a transcrição da AP-1 em células neurais e linfócitos

Ativados

Desativação das histonas (HIST1H1E, HIST2H2BE, HIST1H3A)Metilação do DNA (DNMT3A, CTCF).

O papel dos fatores epigenéticos na patogênese da atresia: pacientes portadores da forma embrionária. Estrutura da cromatina: SMARCA-1, HDAC3 e RYBP

ZHANG, D. Y. et al. Coordinate expression of regulatory genes differentiates embryonic and perinatal forms of biliary atresia. Hepatology 39, 954-962 (2004).

Desativados: fenômenos epigenéticos

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