botulismo - diagnóstico laboratorial. procedimentos de coleta e técnicas para detecção da toxina...

BOTULISMOBOTULISMO- Diagnóstico Laboratorial. Procedimentos - Diagnóstico Laboratorial. Procedimentos de Coleta e Técnicas para Detecção da de Coleta e Técnicas para Detecção da Toxina em Pacientes e Alimentos -Toxina em Pacientes e Alimentos -

Miyoko Jakabi

Instituto Adolfo Lutz - SES/SP

INTRODUÇÃO

BOTULISMO: doença que se manifesta pela ação de uma potente toxina produzida pelo Clostridium botulinum

Descrito pela primeira vez em 1879, por Ermengen, na Bélgica

Botulismo - “botulus”: salsicha

BOTULISMO

Botulismo alimentar: ingestão de alimentos contaminados com a toxina pré-formada

Botulismo Ferimento: causado pela multiplicação do microrganismo com produção de toxina em feridas contaminadas

Botulismo infantil:produção endógena de toxina pela germinação de esporos do C. botulinum no intestino (< 1 ano)

C. botulinum - características

Bacilos retos ou ligeiramente curvos, Gram-positivos, imóveis, anaeróbios,0,5-2,0 m de largura e 1,6-22,0 m

de comprimento, esporos ovais e subterminais

C. botulinum

7 tipos de C. botulinum: A, B, C, D, E, F e G diferentes antigenicamente

A, B, E e raramente F: humanosC e D: pássaros e bovinosG (1970): não confirmado como

causador de doença - (Argentina)

Esporos

Esporos

C. botulinum

Toxina botulínica: proteína de 150 kdacadeia pesada de 100 kda e cadeia leve

de 50 kda ligadas por pontes de sulfeto

Toxina C2: 1 cadeia de 55 kda e 1 cadeia de 105 kda não são ligados covalentemente

Síntese da toxina

Presente em pequena quantidade na fase logarítmica

liberada durante a autólisebacteriófagos: tipos C e Dplasmídeos

Ação da toxina botulínica

Neurotoxinaresistente ao ácido estomacalabsorvida intacta pelo trato

gastrointestinal e entra na corrente sangüínea

se liga as células nervosas via gangliosídeos

Cont.

1- ligação da cadeia leve aos receptores na membrana

2- Internalização da toxina ativa3- translocação da toxina p/ o interior

da célula (pinocitose)4- fase lítica - bloqueio da liberação da

acetilcolina

Ação da toxina

O neurotransmissor envia impulsos elétricos p/contrair o músculo

terminações nervosas secretam a acetilcolina responsável pela contração muscular

pacientes com botulismo: neurotoxina liga-se aos terminais nervosos inibindo a liberação da acetilcolina, o músculo não contrai, ocorrendo a paralisia

C. botulinum no ambienteLargamente distribuído no ambientetrato intestinal de animais, pássaros e

peixescadáveres de animais silvestres e

pássaros contém > quantidadetipos A, B e F: terrestrestipo E: ambientes aquáticostipo A: oeste dos EUA; tipo B leste dos EUA e Europa; tipo G: restrito a Argentina

Alimentos associados com botulismo

Alimentos enlatados ou envasados em vidros

industrializados: subprocessamento ou contaminação pós-processo

conservas caseiras: subprocessamento e acidez

Alimento Infantil

Mel: fonte significativa de C. botulinum

Cereal de arroz e xarope de milho: números baixos de esporos

Botulismo

Diagnóstico laboratorial

Presença da toxina circulante, lavado gástrico ou conteúdo intestinal na fase inicial da doença

Análise do alimento epidemiologicamente implicado

Método: Bioensaio

Sorocentrifugação refrigerada Inoculação em 2 camundongos de

20-25g (0,5ml por animal) -IP

BIOENSAIO

Extração da toxina de alimentos, lavado gástrico e fezes

solução de gel fosfato (1:1 p/v, homogeneização, manutenção por uma noite, geladeira)

Centrífuga refrigerada (4ºC/ 2.500 a 3.000 rpm/20 min.)

Tratamento do sobrenadante

Separado em 2 porções: tratada térmicamente: água ebulição/10 min. tripsinizada: acertar o pH p/ 6,2; para cada

1,8 ml do sobrenadante, acrescente 0,2 ml de sol. Tripsina; incubar a 37ºC/1h

OBS: toxina botulínica é termolábil se na amostra está presente só a pré toxina, é

necessária a tripsinização para liberar a parte tóxica

Triagem da presença de toxina por bioensaio

Selecionar no mínimo 8 camundongos (20-25g)

2 animais: inoculados com porção fervida já resfriada

2 animais: inoculados com porção tripsinizada

2 animais: inoculados c/ a porção extraída, não tratada termicamente e não tripsinizada

2 animais são controle do ensaio

Sintomatologia - camundongos

OBS constantemente por 6 hapós este período, os animais são

observados a cada 6 h, até um período máximo de 72h

sintomas: respiração difícil, e elaborada, acinturamento tipo “cintura de vespa”, por paralisia do diafragma em contração

morte

Confirmação da toxina botulínica

Os animais inoculados com a porção fervida não morrerem

os animais inoculados com a porção tripsinizada morrerem

animais controle não morreremOBS: Os animais inoculados com a porção

não tratada podem ou não morrer. Caso morram, significa que a toxina ativa estava presente. Caso não morram, significa que a pré toxina estava presente.

Identificação da toxina

Misturar amostra positiva com anti-soros monovalentes (A,B,E e F) e polivalentes

Inocular em camundongosos animais inoculados, deverão

apresentar os sintomas de botulismo, exceto aqueles que foram inoculados com a antitoxina que foi capaz de inativação

Interpretação

Os animais que não apresentarem sintomas permitem a identificação do tipo presente

Interpretação

Se os camundongos não forem protegidos por 1 dos monovalentes:

1- pode ter muita toxina no alimento2- pode ter mais de 2 tipos de toxinas3- mortes podem ser devidas a outras

causasSe ambos os sobrenadantes, aquecido e

não aquecido, forem letais, as mortes provavelmente não são devidas a toxina botulínica

Aplicação da toxina botulínica

Tratamento de espasmos musculares de vários tipos: estrabismos, dores musculares de faces e pescoço

limitação da terapia: injeção deve ser repetida

Botox

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