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BIOLOGIA MOLECULAR

Prof. Dr. José Luis da C. SilvaProf. Dr. José Luis da C. Silva

A Biologia Molecular é o estudo da Biologia em nível molecular, com

especial foco no estudo da estrutura e função do material genético e

seus produtos de expressão, as proteínas. Mais concretamente, a

Biologia Molecular investiga as interações entre os diversos sistemas

celulares, incluindo a relação entre DNA, RNA e síntese protéica.

Relação com outras ciências biológicas de nível molecular.

BIOLOGIA MOLECULAR

Programa (Ementa)

Visão histórica do gene – 11/06Estrutura e função do DNA e RNA – 11/06Replicação, transcrição e tradução – 11/06Regulação da Expressão gênica – 12/06Tecnologia do DNA recombinante – 12/06

Genômica e Bioinformática – 09/07PCR e Marcadores moleculares – 09/07Aplicações da Biologia molecular – 10/07 (Seminários)Eletroforese em gel – 10/07 (prática)

Evolução do conceito de geneEvolução do conceito de gene

“O conceito de gene não é estático, ele se desenvolveu através de várias fases, desde que Wilhelm Johansen criou o termo em 1909, e

continua evoluindo”

1866 – Mendel definiu como “caráter ou fator unitário” que controlava uma característica fenotípica, tal como a cor das flor em ervilhas.

1900 – Garrod definiu como “um gene mutante-um bloqueio metabólico”

1939 – Beadle e Tatum definiram como “um gene – uma enzima”

1960 – Yanofsky e Brenner redefiniram “um gene – um polipeptídeo”

Refinando o conceito:

“ O gene é uma unidade de informação genética que controla a síntese de um polipeptídeo ou uma molécula de RNA estrutural”

Do gene ao efeito no organismo

Estrutura e função dos ácidos nucléicos

Nucleotídeos

Ribonucleotídeo

Estrutura dos ácidos nucléicos

Estrutura dos ácidos nucléicos

Bases Nitrogenadas

Estrutura dos ácidos nucléicos

Polímero de nucleotídeos

Estrutura 1ária covalente

Fosfato 5’

3’ OH

Estrutura dos ácidos nucléicos

As cadeias polinucleotídicas adotam estruturas em Hélice

Dupla hélice do DNA – Watson e Crick (1953)

Estrutura dos ácidos nucléicos

DNA B é a forma mais estável em condições fisiológicas

Formas de DNAEstrutura dos ácidos nucléicos

Formas A e Z são encontradas

em cristais de DNA. A forma A

é favorecida em soluções mais

concentradas.

A forma Z pode estar

associada com a regulação da

expressão gênica e

recombinação in vivo.

Dogma central da Biologia molecular

A replicação é semiconservativa

Processo semiconservativo:

Durante a replicação, as duas fitas do DNA parenteral são copiados, originando moléculas filhas com somente uma das fitas novas sintetizadas. (Meselson e Stahl, 1958)

Replicação do DNA

O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA.

A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases

Genoma procariótico

O genoma bacteriano circular constitue um único replicon

Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)

DNA-POLIMERASES DNA-polimerase é a enzima que faz a síntese de uma nova fita de DNA.

Possui a capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3’OH de uma região pareada do DNA 5’ → 3’.

Movimento da forquilha de replicação:A partir da origem, a replicação prossegue ao longo da fita de DNA, em uma ou ambas as direções, seqüencialmente até o termino.

Direção da replicaçãoA adição dos nucleotídeos para o crescimento da cadeia é sempre no sentido 5’ → 3’.

Fita contínua (líder)

Fita descontínua

Forquilha de replicação

DNA polimerases de E. coli

PROTEÍNAS NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DA E. coli

Animação replicação

Transcrição A transcrição é realizada por um sistema enzimático que converte a informação genética de um segmento de DNA (gene) em uma fita de RNA complementar à fita molde.

Fita molde (anti-senso) e codificadora (senso)

A transcrição de procariotos e de eucariotos possui três eventos principais:                                        

Iniciação - A RNA polimerase se liga a dupla fita do DNA na região denominada promotor. A iniciação é um passo muito importante na expressão gênica!!!

Elongamento - adição covalente de nucleotídeos a extremidade 3' da cadeia polinucleotídica crescente; isto envolve o desenvolvimento transitório de um curto trecho de DNA fita simples.

Término - Reconhecimento da sequência de término e liberação da RNA polimerase. Embora a transcrição seja realizada pela RNA polimerase, outras enzimas são necessárias para produzir o transcrito, além de outras proteínas. Estes fatores ou se associam diretamente com a RNA polimerase ou auxiliam na formação do aparato transcricional. O termo utilizado para descrever estas proteínas é fatores de Transcrição.

Iniciação: Reconhecimento dos promotoresReconhecimento dos promotores pela subunidade σ70 da RNA polimerase em E. coli. Em condições fisiológicas a RNA pol está provavelmente ligada ao DNA, mas o reconhecimento depende da subunidade sigma.

Extremidade 5’ do gene (Montante)

ATG

Sequências consensoRegiões -35 e -10 (TATA box ou Pribnow box)

Essas sequências são reconhecidas pela subunidade sigma70. Outros promotores apresentam alguma variação nas sequências consenso.

Após a ligação ao promotor e início da síntese, a subunidade sigma é liberada e funciona como um catalisador para outra RNAP ligada à um outro promotor ou ao mesmo promotor.

O reconhecimento do promotor depende de seqüências consensuais.

Um promotor típico possui três componentes, sendo formado pelas seqüências consensuais em –10 e –35 e pelo sítio de início da transcrição.

A comparação com mais de 100 genes de E. coli, chegou-se as seguintes conclusões:

1) O primeiro nucleotídeo a ser transcrito (+1) é geralmente uma purina (A ou G).

2) Duas seqüências são altamente conservada nos genes comparados: uma localizada na região –10, que tem como consenso a seqüência TATAAT (TATA box ou Pribnow box), e outra localizada na região –35, que tem como consenso a seqüência TTGACA,

3) Que as regiões –10 e –35 são separados por 17±1 nucleotídeos (equivale a duas voltas da hélice).

Os fatores sigma de E. coli reconhecem promotores com diferentes seqüências consensuais

Complexo de Iniciação

Complexo fechado

Complexo aberto e iniciação

Liberação do sigma

Complexo aberto – bolha de transcrição

Fase: Alongamento

Após o desligamento da subunidade sigma ocorre uma alteração conformacional na RNAP tornando-a mais esférica e ativa durante o processo de alongamento.

O processo não é contínuo em algumas regiões, principalmente porque ocorre tradução simultânea do mRNA em bactérias. Ocorrem paradas rápidas e retomadas da transcrição.

A processividade é alta e a transcrição tem um índice de erro de 10-5.

Ação da toposiomerases no relaxamento dos supercoil positivo

Fase: Término da transcrição O RNA sintetizado participa ativamente do término de sua síntese, formando estruturas secundárias ou ligando-se a outros fatores.

Em E. coli: Terminação dependente de rho (ρ) Terminação independente de rho (ρ)

Terminação independente de rho (ρ)Este tipo de terminação é responsável pelo término da transcrição de 90% dos genes bacterianos.

Uma sequência na região 3’ do gene, sinaliza o final da síntese do RNA.

É uma sequência repetida de As na fita molde (Us no RNA) que ocasiona uma longa pausa no alongamento da cadeia.

Nessa pausa ocorre o pareamento A:U entre a fita molde e o RNA desestabilizando o híbrido RNA/DNA. Este processo é auxiliado por uma proteína denominada NusA.

15-20 nucleotídeos antes do término rico em As é formado por sequências autocomplematares que formarão grampo de RNA.

Terminação dependente de rho (ρ)

Não existem sequências ricas em As específicas, mas podem haver sequências autocomplementares.

A proteína Rho migra até encontrar a RNA pol parada e sua atividade helicase DNA/RNA dependente de ATP auxilia no desligamento do RNA sintetizado.

Transcrição em Eucariotos RNA - POLIMERASES

RNA - Polimerase I: rRNA

RNA - Polimerase II: mRNA

RNA - Polimerase III: tRNA e outros RNAs nucleares

pequenos

Um gene tipo transcrito pela RNA-polimerase II possui um promotor que se estende a montante a partir do sítio onde a transcrição é iniciada. O promotor contém vários elemento de seqüências curtos (<10pb), aos quais se ligam os fatores de transcrição, espalhados por >200pb. Um reforçador (enhancer),contendo elementos mais compactamente organizados, ao qual também se ligam fatores de transcrição, freqüentemente são alvos para a regulação tecido-específica ou temporal.

Etapas são similares na transcrição,

contudo o processo é muito mais complexo e

regulado

Animação da transcrição

Síntese de proteínas

Código Genético

Tradução - poliribossomos

Animação da tradução