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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CENTRO DE ENGENHARIAS
CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL E SANITÁRIA
Trabalho de Conclusão de Curso
Avaliação da toxicidade ambiental do agrotóxico Glifosato em solo utilizando como bioindicador
minhocas da espécie Eisenia andrei.
Bettina Rodrigues Machado
Pelotas, 2016
BETTINA RODRIGUES MACHADO
Avaliação da toxicidade ambiental do agrotóxico Glifosato em solo utilizando como bioindicador
minhocas da espécie Eisenia andrei.
Trabalho acadêmico apresentado ao Curso de Engenharia Ambiental e Sanitária, da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Engenheiro Ambiental e Sanitarista.
Orientadora: Profª. Drª. Vanessa Sacramento Cerqueira
Pelotas, 2016
Banca examinadora:Profª. Drª. Vanessa Sacramento Cerqueira - Centro de Engenharias/UFPel - OrientadoraProfª. Drª. Adriana Silva Manetti - Centro de Engenharias/UFPelProfª. Drª Cláudia Lemons e Silva - Centro de Engenharias/UFPel
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a minha família em especial a minha mãe e minha
irmã, pela dedicação, preocupação e incentivo.
Aos meus amigos por sempre entenderem o motivo da minha ausência.
Á minha orientadora Vanessa Cerqueira por acreditar no meu potencial e tornar
este trabalho possível.
Ao Professor Darci Gatto por ter cedido os laboratórios da Eng. Industrial
Madeireira para a realização dos ensaios.
Aos colegas e amigos que tive o prazer de conhecer durante a graduação.
A todos que de alguma forma me ajudaram na realização deste trabalho.
OBRIGADA.
RESUMO
MACHADO, Bettina Rodrigues. Avaliação da Toxicidade Ambiental do Agrotóxico Glifosato em Solo Utilizando como Bioindicador Minhocas da Espécie Eisenia andrei. 2016. 63 f. Trabalho de Conclusão de Curso (TCC). Graduação em Engenharia Ambiental e Sanitária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
O aumento populacional e consequentemente da demanda por alimentos tornou o sistema de cultivo agrícola atual baseado na intensa aplicação de produtos químicos visando a máxima produtividade. Dentre os produtos químicos mais utilizados para controle de pragas, doenças e plantas daninhas destaca-se o herbicida Glifosato. Cerca de 90% dos agrotóxicos aplicados por pulverização não atingem seu alvo e muitos desses produtos demonstram persistência no ambiente e se acumulam ao longo das cadeias alimentares, alcançando concentrações altas e tóxicas. O solo é um compartimento susceptível a este tipo de contaminação e o emprego de métodos rápidos, simples e de baixo custo de detecção e avaliação do grau de toxicidade destas substâncias no ambiente se faz de extrema importância. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade ambiental do herbicida Glifosato no solo, utilizando minhocas da espécie Eisenia andrei como bioindicadores. Foi empregado o teste de fuga ou evitamento, conforme a ISO 17512-1 (2007),como indicador de toxicidade ambiental. Este teste consiste em avaliar o comportamento de fuga de minhocas quando expostas ao mesmo tempo a solos contaminados e não contaminados. Os ensaios foram realizados empregando solo natural. Foram avaliadas as concentrações respectivas de 4.000, 6.000, 8.000 e 10.000 mg de glifosato kg
-1de solo. As unidades
experimentais foram mantidas em sala climatizada sob condições controladas de temperatura (20 ± 2°C), luminosidade (600 lux) e fotoperíodo de 12h claro/12h escuro durante 48 horas. O comportamento de fuga ao herbicida glifosato foi observado em todas as concentrações utilizadas no estudo. As concentrações de 8.000 mg.kg-1 e 10.000 mg.kg-1, causaram alterações significativas no comportamento das minhocas Eisenia andrei como ausência de movimentos e aglomeração em pontos específicos. A menor taxa de fuga (76%) ocorreu no ensaio utilizando 4.000 mg.kg-1 e a maior taxa de fuga (92%) foi relativa a concentração de 6.000 mg.kg-1. Os organismos da espécie Eisenia andrei demonstraram sensibilidade ao agrotóxico glifosato, evidenciando sua capacidade de detectar e evitar esta substância química quando presente no solo. O teste de evitamento com minhocas em solo natural se mostrou uma ferramenta eficiente, fornecendo respostas precisas em curto período de tempo, apresentando potencial de utilização no monitoramento ambiental de áreas contaminadas com o agrotóxico glifosato.
Palavras-Chave: Agrotóxico; Bioindicadores; Glifosato; Minhocas Eisenia
andrei; Toxicidade.
ABSTRACT
MACHADO, Bettina Rodrigues. Environmental Evaluation of Toxicity of Glyphosate Pesticide on Soil using as Bioindicator Earthworm of Eisenia
andrei Species. 2016. 63 f. Course Conclusion Paper (TCC). Graduation in Environmental and Sanitary Engineering. Federal University of Pelotas, Pelotas.
The population increase and therefore demand for food changed the traditionalfarming land, converted the actual system of cultive based on massive utilization of pesticides. Among those chemical substances used for control of pests is widely spread the weed killer glyphosate. Around of 90% of pesticides applied by spraying don’t reach their target and this products demonstrated persistence in the environmental and bioaccumulation in the food chains, achieving high and toxics concentrations then, became necessary quick techniques for detection of these substances. The soil compartment is vulnerable of this type of contamination and the employment of simple, easy and cheap techniques are extremely useful. This present study was aimed environmental assessment of glyphosate toxicity on soil, were used as bioindicator earthworm of Eisenia andrei species. Was employed the avoidance test, following ISO 17512-1 (2007), as indicator of environmental toxicity. These test consist in evaluate the avoidance behavior of earthworms when they are exposed at the same time at contaminated soil and control soil. The assays were realized employing natural soil. Were evaluated these concentrations 4.000, 6.000, 8.000 and 10.000 mg glyphosate kg-1 of soil. The experimental units were incubated under (20 ± 2°C) temperature, light (600 lux) and 12h light /12h dark on 48 hours. The avoidance to weed killer glyphosate was observed in all concentrations. The concentration of 8.000 mg.kg-1 and 10.000 mg.kg-1, changed the earthworms Eisenia andrei behavior, were observed absence of movements and agglomeration in specific points. The smallest rate of avoidance occurred on 4.000 mg.kg-1 and the biggest rate of avoidance was observed on concentration of 6.000 mg.kg-1 (92%). The Eisenia andreiindividuals showed ability to detect and avoid the weed killer on soil. The avoidance test with earthworm Eisenia andrei species on natural contaminated soil was considered an efficient tool on the evaluation of contaminated sites with glyphosate weed killer, providing accurate answers in a short period of time in addition to being an easy and cheap method.
Key- Words: Pesticide; Bioindicators; Glyphosate; Earthworm Eisenia andrei;
Toxicity.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 11
1.1 OBJETIVOS........................................................................................................................ 16
1.1.1 Objetivo geral .................................................................................................................. 16
1.1.2 Objetivo específico ......................................................................................................... 16
2. REVISÃO DE LITERATURA...................................................................... 17
2.1 Agrotóxicos ......................................................................................................................... 17
2.2 Glifosato .............................................................................................................................. 18
2.3 Glifosato e a Legislação ................................................................................................... 20
2.4 Mecanismo de ação e interação com o solo ................................................................. 22
2.5 Ensaios de toxicidade ....................................................................................................... 24
2.6 Indicadores de qualidade ambiental ............................................................................... 27
2.7 Utilização da E. andrei como bioindicador..................................................................... 28
3. METODOLOGIA........................................................................................... 31
3.2 Delineamento experimental.............................................................................................. 31
3.2.1 Caracterização do solo .................................................................................................. 32
3.2.2 Organismos-teste ........................................................................................................... 33
3.2.3 Unidade controle positivo .............................................................................................. 33
3.2.4 Preparação das diluições de glifosato ........................................................................ 34
3.2.5 Procedimento experimental: Teste de evitamento .................................................... 34
3.4 Análise de dados ............................................................................................................... 38
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 40
4.1 Validação do teste de evitamento .............................................................. 40
4.2 Testes de toxicidade .................................................................................. 41
5. CONCLUSÃO............................................................................................... 49
REFERÊNCIA ........................................................................................................................... 50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Fórmula estrutural do glifosato.............................................................................. 19
Figura 2- E. andrei.................................................................................................................... 29
Figura 3- Remoção da cobertura vegetal e coleta do solo ................................................ 32
Figura 4- Recipiente utilizado no teste.................................................................................. 35
Figura 5- Ajuste do conteúdo de umidade............................................................................ 35
Figura 6- Divisão do recipiente e colocação do solo teste e controle .............................. 36
Figura 7- Colocação das minhocas na linha formada pela divisória. ............................... 37
Figura 8- Recipiente após a colocação do papel filme....................................................... 37
Figura 9- Local onde o teste permaneceu no período de incubação............................... 38
Figura 10-Distribuição dos organismos nos controles negativo e positivo. .................... 41
Figura 12- Relação entre a dosagem aplicada de glifosato e a taxa de fuga (média dos
tratamentos ± desvio padrão amostral). ............................................................................... 43
Figura 13- Distribuição dos organismos no recipiente (média ± desvio padrão) ........... 45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Classificação toxicicológica dos pesticidas ........................................... 18
Tabela 2 - Ingredientes do agrotóxico glifosato ...................................................... 20
Tabela 3- Relação das doses de glifosato aplicadas no solo teste..................... 32
Tabela 4- Composição granulométrica do solo ...................................................... 33
Tabela 5- Caracterização físico-química do solo ................................................... 33
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AGROFIT – Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários
AMPA – Ácido Aminometilfosfônico
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente
E. andrei – Eisenia andrei
E. fetida – Eisenia fetida
EEC – European Economic Community
FAO – Food and Agriculture Organization
FISPQ – Ficha de Informações de Segurança de Produtos Químicos
ia – Ingrediente ativo
IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
ISO – International Standard Organization
LMR – Limite Máximo de Resíduo
MS – Ministério da Saúde
OECD – Organization for Economic Co-operation and Development
SAT – Solo Artificial Tropical
SINDAG – Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola
U.S EPA – United States Environmental Protection Agency
1. INTRODUÇÃO
O aumento populacional e a crescente demanda por alimentos exigiram
modificações na agricultura tradicional, impulsionando o desenvolvimento de
práticas intensivas na agricultura (CASTRO, 2005). Em meados da década de
1970, o governo instalou o Plano Nacional de Defensivos Agrícolas,
condicionando o crédito rural ao uso obrigatório de agrotóxicos. Rapidamente a
maioria dos produtores rurais passou a só produzir com base nesses produtos
químicos (CARNEIRO et al., 2012), tornando o modelo de produção agrícola
atual dependente da utilização de produtos químicos (SIQUEIRA et al., 1994).
A intensa utilização desses produtos trouxe consigo a preocupação com
a contaminação ambiental, visto que, menos de 10% dos agrotóxicos aplicados
por pulverização atingem seu alvo e que muitos desses produtos demonstram
persistência no ambiente e se acumulam ao longo das cadeias alimentares,
alcançando concentrações altas e tóxicas (ALVES FILHO, 2002; FAY e SILVA,
2004).
Os agrotóxicos, além de proteger as culturas agrícolas das pragas,
doenças e plantas daninhas, podem oferecer riscos à saúde humana e ao
ambiente. O uso frequente de agrotóxicos oferece riscos como a contaminação
dos solos agrícolas, das águas superficiais e subterrâneas, dos alimentos,
apresentando, consequentemente, efeitos negativos em organismos terrestres
e aquáticos e de intoxicação humana pelo consumo de água e alimentos
contaminados, assim como o risco de intoxicação ocupacional de trabalhadores
e produtores rurais (SPADOTTO et al., 2004).
No Brasil, a venda de agrotóxicos aumentou de US$ 2 bilhões para mais
de US$7 bilhões entre 2001 e 2008, alcançando valores recordes de US$ 8,5
bilhões em 2011 (Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa
Agrícola - SINDAG, 2011). Assim, já em 2009, alcançamos a posição de maior
consumidor mundial de agrotóxicos, ultrapassando a marca de 1 milhão de
toneladas, o que equivale a um consumo médio de 5,2 kg de defensivos
agrícolas por habitante ao ano (LONDRES, 2011).
12
Os herbicidas representam (48%) das vendas seguidas pelos inseticidas
(25%) e fungicidas (22%), os quais movimentam 95% do consumo mundial de
agrotóxicos (AGROW, 2007).
Dentre os agrotóxicos utilizados atualmente, destaca-se o glifosato (N-
(fosfonometil) glicina) como o herbicida mais usado em todo o mundo. O
Glifosato é um organofosfato que atua como herbicida de contato. Em diversos
tipos de cultivo, o glifosato costuma ser pulverizado sendo, em geral, absorvido
na planta através de suas folhas e dos caulículos novos. O herbicida é, então,
transportado por toda a planta, agindo nos vários sistemas enzimáticos,
inibindo o metabolismo de aminoácidos. As plantas tratadas com glifosato
morrem lentamente, em poucos dias ou semanas e, devido ao transporte por
todo o sistema, nenhuma parte da planta sobrevive (AMARANTE JUNIOR et
al., 2002). Por não ser seletivo, pode danificar safras importantes mesmo
quando utilizado de acordo com as especificações. Por essa razão, têm sido
desenvolvidas e patenteadas plantas geneticamente modificadas, como soja,
milho e algodão, resistentes ao glifosato (KATZUNG et al., 2012).
A aplicação de Glifosato pode resultar na presença de resíduos tanto na
colheita quanto em animais usados na alimentação humana. No ambiente,
concentrações altas dos compostos (glifosato e seu metabólito, o ácido
aminometilfosfônico (AMPA)) foram encontradas no solo (AMARANTE JUNIOR
et al., 2002).
Segundo Castro (2005), foi possível observar a persistência do Glifosato
e seu metabólito AMPA mesmo após quatro meses de sua aplicação no solo,
embora em baixas concentrações. A ocorrência de Glifosato nas águas
também vem sendo evidenciada em diversos estudos, dentre eles Dutra da
Silva (2003) apontou a presença do herbicida glifosato em águas superficiais
decorridos 30 e 60 dias após a sua aplicação. Amaral (2009) analisou locais
que apresentavam grande exposição ao glifosato e constatou a presença desta
substância em açudes e rios próximos a área agrícola mesmo após cerca de
20 dias após a aplicação do princípio ativo nas culturas.
13
O Brasil possui uma legislação evoluída, exigente e restritiva, que cuida
além da necessidade de comprovação de eficiência agronômica, das garantias
da minimização dos perigos ao ser humano e das ameaças ao meio ambiente
(SPADOTTO et al., 2006). Porém, não existe nenhuma legislação específica
que defina os limites máximos de resíduos de Glifosato e AMPA no solo,
tornando este compartimento susceptível a contaminação ambiental. A Lei
Federal nº. 7.802, de 11 de Julho de 1989, dispõe sobre a pesquisa, a
experimentação, a produção, a embalagem e rotulagem, o transporte, o
armazenamento, a comercialização, a propaganda comercial, a utilização, a
importação, a exportação, o destino final dos resíduos e embalagens, o
registro, a classificação, o controle, a inspeção e a fiscalização de agrotóxicos,
seus componentes e afins. Entretanto, faz-se necessária a avaliação dos riscos
ambientais que cada produto pode apresentar, considerando além da
ecotoxicidade, a exposição dos organismos nos diferentes compartimentos
ambientais (SPADOTTO et al., 2006).
Dentre as formas de se avaliar a contaminação ambiental estão os
métodos analíticos tradicionais, capazes de avaliar agrotóxicos sendo
realizados normalmente por cromatografia em camada delgada (CCD),
cromatografia gasosa (CG) ou cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
(LACORTE e BARCELÓ, 1995; YUN-SUK et al., 1997). Porém, estes métodos
exigem mão de obra especializada e apresentam elevado custo operacional,
tornando inviável o emprego destas técnicas em larga escala em pequenos
laboratórios e/ou para instalações laboratoriais de campo (PERES e
MOREIRA, 2003). Assim, a busca por métodos mais simples, de baixo custo e
de resposta rápida torna-se extremamente necessária. Neste contexto, os
métodos de avaliação ambiental utilizando bioindicadores ou biomarcadores
(Bioensaios), torna-se uma interessante ferramenta, uma vez que podem ser
facilmente reproduzidos em larga escala em pequenos laboratórios não
dispendendo de grandes quantidades de recursos financeiros além de
fornecerem resultados rápidos.
14
No Brasil, não há exigência por parte dos órgãos ambientais do emprego
de testes ecotoxicológicos com organismos de solo para avaliação de
contaminação, que se baseia somente em indicadores químicos (BIANCHI et
al., 2010). Mas, somente a avaliação dos parâmetros químicos não refletem o
comportamento da substância tóxica nos organismos do solo (VAN
STRAALEN, 2002). A utilização de testes ecotoxicológicos para a avaliação de
contaminação de solos é reconhecida internacionalmente como uma
ferramenta complementar à análise química (CROUAU e MOIA, 2006).
Testes agudos e crônicos são tradicionalmente utilizados para avaliar a
toxicidade de contaminantes. Os métodos dos testes frequentemente operam
em diferentes classes de sensibilidade (letal e subletal) utilizando como
parâmetros mortalidade, mudanças de biomassa, taxas de reprodução e
mudanças comportamentais. O parâmetro mortalidade é relativamente sensível
a altas concentrações de poluentes e indica o maior dano provável ao
organismo. Contudo, concentrações subletais de um poluente também podem
ter efeitos ecológicos nas populações, como a diminuição da taxa de
reprodução ou emigração (YOUNG e ULRICH, 2008).
Em específico, o ensaio de comportamento é proposto para testar a
qualidade de solos e a toxicidade de substâncias químicas utilizando o
organismo terrestre Eisenia fetida ou Eisenia andrei (minhoca). Esse ensaio
pode ser aplicado como um método rápido para determinar a biodisponibilidade
de substâncias químicas ou de contaminantes no solo para E. fetida/ andrei,
em que o comportamento de fuga é usado como indicador (KANASHIRO,
2015).
As minhocas se destacam como bioindicadores nos testes
ecotoxicológicos devido ao seu nicho ecológico, isto é, por meio de seus
deslocamentos elas revolvem o solo misturando os horizontes e, pelos seus
hábitos alimentares, influenciam as transformações da matéria orgânica em
decomposição e a ciclagem de nutrientes (PAPINI e ANDREA, 2004), estando
em contato com a substância tóxica a ser avaliada. As minhocas foram
adotadas como organismos padrões para testes ecotoxicológicos pela União
15
Européia (EEC 1984) e Organização para a Cooperação e Desenvolvimento
Econômico (OECD 1984). Além destas, a Organização Internacional de
Padronização (ISO 1993,1998) e a Agência de Proteção Ambiental dos
Estados Unidos (US EPA 1988) produziram guias em relação aos testes de
toxicidade em minhocas. Nestes estudos, as espécies Eisenia fetida/andrei
foram escolhidas pela facilidade de cultivo em laboratório (TOMLIN e MILLER,
1989) e também pelo extenso banco de dados sobre os efeitos de todas as
classes de químicos existentes para essas espécies (EDWARDS e BOHLEN,
1996).
16
1.1 OBJETIVOS
1.1.1 Objetivo geral
Avaliar a toxicidade do herbicida glifosato em solos utilizando como
organismo-teste a minhoca Eisenia andrei.
1.1.2 Objetivo específico
- Avaliar o comportamento dos indivíduos da espécie Eisenia andrei em
diferentes concentrações do herbicida glifosato no solo;
- Determinar a menor concentração capaz de causar o comportamento
de fuga aos indivíduos da espécie Eisenia andrei.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Agrotóxicos
Segundo a Lei Nº 7.802, de 11 de julho de 1989, agrotóxicos e afins são
definidos como produtos e agentes de processos físicos, químicos ou
biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e
beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas,
nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e também de ambientes
urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da
flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos
considerados nocivos ou substâncias e produtos, empregados como
desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento.
São utilizados nas florestas nativas e plantadas, nos ambientes hídricos,
urbanos e industriais e, em larga escala, na agricultura e nas pastagens para a
pecuária, sendo também empregados nas campanhas sanitárias para o
combate a vetores de doenças (PERES e MOREIRA, 2003). Os agrotóxicos
englobam uma vasta gama de substâncias químicas- além de algumas de
origem biológica- que podem ser classificadas de acordo com o tipo de praga
que controlam, com a estrutura química das substâncias ativas e com os
efeitos à saúde humana e ao meio ambiente (AGROFIT, 1998).
O termo agrotóxico, ao invés de defensivo agrícola, passou a ser
utilizado no Brasil a partir da Constituição Federal de 1988, sendo esta
modificação fruto de grande mobilização da sociedade civil organizada. Mais do
que uma simples mudança de terminologia, este termo coloca em evidência a
toxicidade desses produtos para o meio ambiente e para a saúde humana
(BRASIL, 2010). O termo agrotóxico inclui inseticidas (controle de insetos),
fungicidas (controle de fungos), herbicidas (combate às plantas invasoras),
fumigantes (combate às bactérias do solo), algicidas (combate a algas),
avicidas (combate a aves), nematicidas (combate aos nematoides),
moluscicidas (combate aos moluscos), acaricidas (combate aos ácaros), além
de reguladores de crescimento, desfoliantes (combate às folhas indesejadas) e
dissecantes (BAIRD, 2006; FAY e SILVA, 2004).
18
Existem mais de mil formulações diferentes de agrotóxicos, incluindo
inseticidas, herbicidas, fungicidas, nematicidas, fumigantes e outros compostos
orgânicos, além de substâncias usadas como reguladores de crescimento,
desfoliantes e dissecantes (BRAIBANTE e ZAPPE, 2012).
Os herbicidas representam a maior parte do volume total de pesticidas
aplicados na agricultura (ARAÚJO et al., 2008). Dentre os herbicidas, o
Glifosato (N-[fosfonometil] glicina), é um dos mais aplicados em cultivos
agrícolas e atualmente representa 60% do mercado mundial de herbicidas não
seletivos (AMARANTE JUNIOR; DOS SANTOS; BRITO; RIBEIRO, 2002). O
glifosato é a molécula herbicida de maior participação no mercado mundial,
com mais de 150 marcas comerciais sendo comercializado em mais de 119
países, com registro para mais de uma centena de culturas (HARTZLER, 2006;
TONI et al., 2006).
Segundo recomendações da ANVISA, todos os agrotóxicos devem
conter no seu rótulo a devida classificação toxicológica (Tabela 1).
Tabela 1- Classificação toxicicológica dos pesticidas
CLASSE TOXICIDADE COR NO RÓTULO DO
PRODUTO
I Extremamente Tóxico Vermelha
II Altamente Tóxico Amarela
III Medianamente Tóxico Azul
IV Pouco Tóxico Verde
Fonte: ANVISA, 2011
2.2 Glifosato
O glifosato (N-[fosfonometil] glicina), cuja estrutura química está
apresentada na Figura 1, é um ácido orgânico fraco constituído de uma glicina
e metade de fosfometil. A fórmula molecular é C3H8NO5P. O glifosato é
19
usualmente formulado como um sal de ácido de glifosato deprotonado e um
cátion, como isopropilamina ou trimetilsulfonio.
Figura 1- Fórmula estrutural do glifosato
Fonte: ANVISA, 2010.
O glifosato é vendido em concentrações de 48% (m/v) e as doses
aplicadas são em torno de 5 L/ha. No Brasil, esse herbicida é formulado com
diferentes sais, como o sal potássico, sal de isopropilamina e o sal de amônio
(RODRIGUES e ALMEIDA, 2005). É indicado no controle de ervas daninhas
anuais e perenes, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, em culturas de arroz
irrigado, cana-de-açúcar, café, citros, maçã, milho, pastagens, soja (plantio
direto ou indireto), fumo, uva e soqueira em cana-de-açúcar. É indicado, ainda,
para as culturas de ameixa, banana, cacau, nectarina, pêra, pêssego,
seringueira e plantio direto do algodão (AMARANTE JÚNIOR et al., 2002).
De acordo com a classificação toxicológica o glifosato é um herbicida de
classe IV - Pouco tóxico, já quanto ao potencial de periculosidade ambiental, é
considerado um produto perigoso ao meio ambiente.
O glifosato é um herbicida pós-emergente, orgânico e não-seletivo que é
usado tanto em áreas agrícolas como não agrícolas em todo o mundo. É
aplicado em várias culturas com várias formulações comerciais. A principal
formulação é o Roundup® da empresa Monsanto. As taxas de aplicação
recomendadas não excedem 5,8 kg de ingrediente ativo por hectare e são
20
dependentes do tipo de uso. A exposição ambiental pode ocorrer por causa da
deposição devido à deriva e lançamento acidental (WHO, 1994).
Na Tabela 2, estão os ingredientes do glifosato e culturas onde costuma
ser utilizado.
Tabela 2 - Ingredientes do agrotóxico glifosato
Princípio ativo do agrotóxico GLIFOSATO
Fórmula estrutural
Nome químico (IUPAC) N- (fosfonometil) glicina
Fórmula molecular C3 H8 NO5 P
Grupo químico Glicina substituída
Classe Herbicida
Funções orgânicas Ácido Carboxílico, amina
Culturas onde é utilizado Algodão, ameixa, arroz, banana, cacau, café,
cana-de-açúcar, citros, coco, feijão, fumo, maçã,
mamão, milho, nectarina, pastagens, pera,
pêssego, soja, trigo, uva.
Classificação toxicológica IV – Pouco tóxico
Fonte: ANVISA, 2009
2.3 Glifosato e a Legislação
Em âmbito nacional, a Portaria 518 do Ministério da Saúde(MS),
publicada em março de 2004, estabelece em seu Art. 14 uma lista de
substâncias químicas dentre elas, o glifosato, que representam riscos à saúde.
O limite permitido de glifosato em água para fins de abastecimento humano é
de 500 µg/L (LONDRES, 2011). Porém, em 14 de dezembro de 2011, o
21
Ministério da Saúde publicou no Diário Oficial da União a Portaria nº 2.914, de
12 de Dezembro de 2011, que dispõe sobre os procedimentos de controle e de
vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de
potabilidade. Esta portaria revogou e substituiu integralmente a Portaria MS nº
518 de 25 de Março de 2004, entretanto o limite permitido de glifosato em água
para fins de abastecimento humano permaneceu inalterado.
A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (US EPA)
estabelece limite de 700 µg/L de glifosato em água potável como “limite
consultivo de saúde”. Entretanto, a Comunidade Econômica Européia (EEC)
estabelece como “concentração máxima admissível” para pesticidas em água
potável, como substâncias individuais, o limite de 0,1 µg/L, desde que a
concentração total de pesticidas não ultrapasse 0,5 µg/L. No Brasil, a CONAMA
(Conselho Nacional do Meio Ambiente) 357 estabelece os valores máximos de
glifosato em água de acordo com a Classe.
A quantidade máxima de resíduo de determinado pesticida que pode
ser aceita em cada alimento destinado ao consumo humano é chamada de
Limite Máximo de Resíduo (LMR). Estes limites são estabelecidos pelo “Codex
Alimentarius Commission”, um corpo subsidiário da FAO (Food and Agriculture
Organization) e da WHO (1994).
Na legislação brasileira os pesticidas têm seus LMR, ou tolerância, e
intervalo de segurança, ou carência (intervalo entre a aplicação do pesticida e a
colheita), estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA).
A resolução CONAMA Nº 420, de 28 de dezembro de 2009, dispõe
sobre critérios e valores orientadores de qualidade do solo quanto à presença
de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento
ambiental de áreas contaminadas por essas substâncias em decorrência de
atividades antrópicas, porém, não dispõem LMR referentes ao Glifosato e
AMPA.
22
2.4 Mecanismo de ação e interação com o solo
O glifosato é um importante herbicida por apresentar grande capacidade
de translocação na planta (SHANER, 2009). O herbicida Glifosato atua na
planta como um inibidor da enzima 5- enolpiruvilshiquimato-fosfato sintase
(EPSPS). Esta enzima é responsável pela síntese de três aminoácidos
essenciais para as plantas (triptofano, fenilalanina e tirosina). Com a inibição da
biossíntese desses aminoácidos ocorre uma paralisação do crescimento da
planta e morte posterior por deficiência metabólica (BORGES FILHO, 2001).
Apesar dos agrotóxicos serem utilizados apenas com o propósito de
controlar alguns dos fatores que alteram a produtividade, essas substâncias
causam efeitos indesejáveis ao meio ambiente, atuando especificamente na
destruição de espécies não-alvo, na contaminação do solo e de águas
subterrâneas ou superficiais, no desenvolvimento de imunidade contra os
agrotóxicos e na acumulação dessas substâncias na cadeia alimentícia,
repassando-a a vários ecossistemas (RODRIGUES, 2007).
A contaminação no solo por agrotóxicos pode ser realizada de forma
direta ou indireta, sendo as principais fontes de contaminação direta
evidenciadas no ato da aplicação, quando o produto é lançado diretamente no
solo ou quando há vazamentos ou derramamento do equipamento por má
conservação ou uso inadequado. Já a contaminação realizada de forma
indireta pode ocorrer por meio da percolação, processo de arrasto mecânico do
agrotóxico ou outro composto pela água, chegando aos lençóis freáticos; e
também através da volatilização dos compostos aplicados nos cultivos e
formação de poeira do solo contaminado pela pulverização de agrotóxicos, que
podem ser transportados por correntes aéreas e se depositarem no solo e na
água, distantes das áreas onde foram originalmente usados (BARREIRA e
PHILIPPI JÚNIOR, 2002).
O problema da contaminação do solo por agrotóxicos se agrava pelo
fato de que boa parte do que é aplicado em campo é perdido. Estima-se que
90% não atingem o alvo, sendo dissipados para o ambiente e tendo como
23
ponto final reservatórios de água e principalmente, o solo (BETTIOL e GHINI,
2003). As características do solo onde é aplicado o agrotóxico apresenta muita
influência no impacto que este último pode causar ao meio ambiente. Algumas
propriedades presentes no solo, como teores de argila, concentração de óxidos
e matéria orgânica, pH, capacidade de troca de cátions, área superficial
específica, porosidade, teor de umidade e diversidade microbiana presente,
são fatores físico-químicos que interferem na degradação e na retenção de
pesticidas em solos (PRATA et al., 2002).
Quando a molécula de um herbicida chega ao solo, pode sofrer os
processos de degradação e/ou adsorção (MORAES e ROSSI, 2010). Segundo
Locke et al. (2009), a fotodegradação e degradação química não são
significativas na dissipação de glifosato em solos. O glifosato no solo apresenta
alta capacidade de adsorção e devido a isto, muitos são os estudos que tentam
explicar os mecanismos de ligação entre glifosato e solo (TONI et al., 2006). Os
mecanismos mais comuns são a troca de ligantes com os óxidos de ferro e
alumínio e as pontes de hidrogênio formadas entre o glifosato e as substâncias
húmicas presentes no solo (FENG e THOMPSON, 1990). A adsorção reduz a
concentração dos herbicidas na fração solubilizada do solo, removendo parte
de sua ação potencial. O resultado é observado pelo decréscimo da
disponibilidade biológica, na aceleração da velocidade de degradação química
ou, simplesmente, devido ao retardamento do movimento de lixiviação (TONI et
al., 2006).
Dentre os processos biológicos que determinam a persistência dos
herbicidas no solo, a degradação microbiana constitui o de maior importância
(ARAÚJO; MONTEIRO; ABAKERLI; SOUZA, 2003). A principal via de
decomposição do glifosato no ambiente glifosato é através da biodegradação.
O glifosato é rapidamente degradado pelos microrganismos do solo, o seu
principal metabólito é o AMPA. O AMPA é degradado em taxas mais lentas do
que o glifosato. Estudos demonstram que no solo, 79-86% do glifosato é
biodegradado a dióxido de carbono num período de até 6 meses (FRANZ et al.,
1997).
24
Em relação ao ambiente aquático, o glifosato é considerado de baixo
risco devido a sua baixa mobilidade no solo, sendo este fortemente adsorvido
pelas partículas do solo, o que restringe sua lixiviação para águas
subterrâneas. Entretanto, este pode ser carreado ao ambiente aquático através
da erosão do solo (ARAÚJO et al., 2008).
As contaminações das águas superficiais são ocasionadas pelo
escoamento superficial dos agrotóxicos dissolvidos na água da chuva, sendo
estas substâncias levadas às partes mais baixas da topografia, podendo
chegar até os rios, córregos, lagos e açudes. O lançamento dessas
substâncias em cursos d´água é responsável por inúmeros episódios de
mortalidade da fauna aquática, principalmente de peixes (VEIGA et al., 2006).
Já a contaminação do aquífero é decorrente do transporte vertical da
água carreando os contaminantes, podendo atingir as águas subterrâneas
(SPADOTTO et al., 2006). O volume, a intensidade e a frequência das chuvas
tem uma grande influência no transporte e na perda de agrotóxicos por meio do
escoamento superficial e da percolação da água no solo. Dentre os problemas
de contaminação das águas subterrâneas por agrotóxicos destaca-se o fato de
ser utilizada para consumo humano, o que poderá acarretar sérios problemas
de saúde pública.
2.5 Ensaios de toxicidade
Testes de toxicidade são ensaios laboratoriais, realizados sob condições
experimentais específicas e controladas, utilizados para estimar a toxicidade de
substâncias, efluentes industriais e amostras ambientais (águas ou
sedimentos) (COSTA et al., 2008).
Os ensaios de toxicidade podem ser classificados segundo os efeitos
que os organismos venham apresentar durante o tempo de exposição dos
ensaios (NIPPER, 2000; BORRELY, 2001).
- Aguda: única ou múltiplas exposições a uma substância, por qualquer
via, em curto período – aproximadamente 24 horas. As manifestações
25
geralmente ocorrem de forma rápida, surgem de imediato ou no decorrer de
alguns dias, no máximo duas semanas (DUX, 1988).
- Sobreaguda ou Subcrônica: Exposições diárias repetidas a uma
substância, por qualquer via, aparecem em um período de aproximadamente
10% do tempo de vida de exposição do organismo ou alguns meses (DUX,
1988). Denomina-se toxicidade sobreaguda quando ocorre exposição durante
período menor ou igual a um mês. Enquanto que, para períodos entre um e
três meses, classifica-se como toxicidade subcrônica (RUPPENTHAL, 2013).
- Crônica: Os efeitos tóxicos ocorrem após repetidas exposições, por um
longo período de tempo, geralmente durante toda a vida do indivíduo ou
aproximadamente 80% do tempo de sua vida (DUX, 1988).
Segundo a severidade:
- Leve: Os distúrbios produzidos no organismo podem ser rapidamente
reversíveis e desaparecem com o término da exposição (DUX, 1988).
- Moderada: Os distúrbios produzidos no organismo são reversíveis e
não são suficientes para provocar danos físicos sérios ou prejuízos à saúde
(DUX, 1988).
- Severa: Causa mudanças irreversíveis ao organismo humano,
suficientemente severo para produzirem lesões graves ou a morte (DUX,
1988).
Os testes da OECD (Organização Européia de Cooperação e
Desenvolvimento Econômico), da EPA (Agência Americana de Proteção do
Ambiente) e da ISO (Organização Internacional para Padronização) entre
outros, adotaram a espécie E. fetida para os testes de toxicidade aguda desde,
respectivamente 1984, 1991 e 1993, e posteriormente para os testes de
reprodução e rejeição ou evitamento de compostos químicos. No Brasil, o
IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Desenvolvimento dos Recursos
Naturais Renováveis) solicita apenas o teste de toxicidade aguda (ABNT, 2007)
26
e aceita resultados obtidos por meio das metodologias dos testes das
organizações internacionais (ANDRÉA, 2010).
Pode-se definir um veneno como um agente capaz de produzir uma
resposta prejudicial em um sistema biológico. A relação dose-resposta
relaciona as características de exposição a um agente e seu espectro de
efeitos. Os testes de toxicidade não são projetados para demonstrar que um
produto químico é seguro, mas para caracterizar os efeitos tóxicos que um
produto químico é capaz de produzir.
O teste de letalidade aguda é primeiro teste de toxicidade realizado em
um novo produto químico. A DL50 (Dose letal média) e outros efeitos tóxicos
agudos são determinados após uma ou mais vias de administração (uma
sendo a via oral ou a via prevista de exposição) em uma ou mais espécies
animais. Fazem-se a verificação diária dos animais e a catalogação do número
de animais que morrem em um período de 14 dias após uma única dose. Os
testes de toxicidade aguda fornecem uma estimativa quantitativa da toxicidade
aguda (DL50), identificam os órgãos-alvo e outras manifestações clínicas da
intoxicação aguda, identificam diferenças entre espécies e espécies sucetíveis;
estabelecem a reversibilidade da resposta tóxica; e fornecem orientação nas
doses a serem usadas em outros estudos (KLAASSEN e WATKINS, 2012).
Se há uma probabilidade razoável de exposição dérmica ou por inalação
ao material, estudos de toxicidade aguda por via inalatória e dérmica são
realizados. Quando os animais são expostos de forma aguda a substâncias
químicas no ar que respiram ou na água em que vivem (peixes), a
concentração letal 50 (CL50), é geralmente determinada para um tempo de
exposição conhecido, que é a concentração da substância química no ar ou na
água que provoca a morte de 50% dos animais. Estudos de letalidade aguda
são essenciais para caracterizar os efeitos tóxicos dos produtos químicos e
seus perigos para seres humanos. As informações mais significantes derivadas
dos ensaios de letalidade aguda vem de observações clínicas e de exames
post mortem dos animais, e não dos valores específicos da DL50 (KLAASSEN e
WATKINS, 2012).
27
2.6 Indicadores de qualidade ambiental
Distúrbios ocasionados pela ação antrópica no ambiente vem causando
preocupações cada vez maiores, o que leva a busca por indicadores que
apresentem capacidade e sensibilidade para medir e avaliar atributos e
processos que interfiram no equilíbrio dos ecossistemas. Alterações causadas
no ambiente geralmente agridem o solo, a base dos ecossistemas terrestres. O
solo é um sistema dinâmico onde fatores de natureza física, química e bilógica
interagem continuamente. Todos esses fatores, principalmente as
transformações microbianas relacionadas aos ciclos biogeoquímicos e as
diferentes reações químicas, podem ser alteradas de acordo com os tipos de
uso e manejo adotado (BINI, 2009).
O uso de indicadores de qualidade do solo permite monitorar os efeitos
de seu uso e manejo como um corpo vivo, e para tal, esses indicadores devem
ter capacidade e sensibilidade para medir e avaliar atributos e processos do
solo que interfiram na promoção das formas de vida que dele dependem
(DUMANSKI e PIERI, 2000).
Os indicadores biológicos são muito úteis devido à sua especificidade a
certos tipos de impacto já que inúmeras espécies são comprovadamente
sensíveis a um tipo de poluente, mas tolerantes a outros (WASHINGTON,
1984). Assim, índices podem ser criados especificamente para detectar
lançamento de compostos quimicos, considerando as respostas de diversas
espécies da comunidade de macroinvertebrados. Os índices que têm as
comunidades como unidades de estudo são eficientes para o monitoramento
rápido de grandes áreas, apresentando relativo baixo custo (PERES e
MOREIRA, 2003; WATZIN e MCINTOSH, 1999).
Exemplos de organismos que possuem os requisitos para serem
utilizados como possíveis indicadores do nível de poluição são as minhocas,
uma vez que, segundo Paoletti (1999a,b) e Papini (2003), elas são os
organismos que entram em contato direto com as substâncias químicas que
atingem o solo, devido ao seu nicho ecológico. De acordo com esses autores,
28
essas substâncias podem também ser ingeridas juntamente com partículas de
solo, quando esses animais se alimentam, e também ser absorvidas
diretamente através da cutícula destes, quando os poluentes estão dissolvidos
na solução do solo (VAMPRÉ et al., 2010).
2.7 Utilização da E. andrei como bioindicador
Por meio de seus deslocamentos e de ingestão de solo ou serrapilheira
contaminados, as minhocas entram em contato com poluentes que atingem ou
são aplicados no solo e nele podem permanecer adsorvidos nas partículas
minerais, na matéria orgânica e na solução do solo (SPADOTTO et al. 2010).
Elas podem ainda se expor e absorver os contaminantes da solução do solo
por meio de contato direto e passagem pela cutícula (VIJVER et al., 2003;
CASTELLANOS e HERNANDEZ, 2007). A partir desse contato, as minhocas
podem se intoxicar, morrer, ou sobreviver, incorporar e até bioacumular esses
poluentes em seus tecidos (CURRY, 2004).
A determinação das concentrações de poluentes em organismos
bioindicadores é útil porque fornece informações sobre a biodisponibilidade dos
poluentes e o padrão de contaminação (BEEBY 2001; NICHOLSON e LAM,
2005). O potencial bioindicativo de organismos dos níveis tróficos mais baixos
tem sido crescentemente estudado para avaliações dos possíveis perigos
ambientais associados com a transferência e biomagnificação dos poluentes ao
longo das diferentes teias alimentares (VASSEUR e COSSU-LEGUILLE 2006).
Portanto, o nicho ecológico e a importante posição trófica das minhocas, que
se situam nos níveis mais baixos das teias alimentares terrestres, servindo de
alimento para vários animais e como rota de transferência e biomagnificação
de contaminantes ao longo dessas teias, além do conhecimento já acumulado
sobre seus hábitos alimentares e habitats, fazem das minhocas excelentes
bioindicadores de ecotoxicidade de substâncias químicas no solo, pois elas
indicam a bioacumulação potencial ao longo dessas teias (CASTELLANOS e
HERNANDEZ, 2007; NAHMANI et al. 2007; PAOLETTI, 1999).
29
Acredita-se que no mundo existam mais de 8 mil espécies diferentes de
minhocas. No Brasil, são conhecidas entre 240 e 260 espécies, sendo que a
maioria é composta de minhocas nativas (SCHIEDECK et al., 2006).
A E. andrei (Figura 2) apresenta corpo uniformemente avermelhado com
listras pouco aparentes entre os segmentos. Sims e Gerard (1999), informam
que o corpo de um espécime adulto pode variar entre 3 e 6 mm de diâmetro e
entre 60 a 120 mm de comprimento.
Figura 2- E. andrei
Fonte: STEWART, 2016.
Segundo Domínguez (2004), a expectativa de vida desta espécie varia
entre 4-5 anos em cativeiro, mas em condições naturais, pode ser alterada,
devido a um grande número de parasitas e predadores. E. andrei atinge a
maturidade sexual entre 21-28 dias. A cópula ocorre próxima à superfície do
alimento e a postura do primeiro casulo ocorre cerca de 48h após. Cada
indivíduo produz entre 0,35 a 0,5 casulos por dia, sendo o tempo de incubação
até o início da eclosão variável entre 18 e 26 dias. A taxa de viabilidade de
eclosão oscila ao redor de 72% e 82%, sendo o número de descendentes
estimado entre 2,5 e 3,8 por casulo, variando conforme a temperatura
(DOMÍNGUEZ e EDWARDS, 2010).
O nicho ecológico das minhocas as caracteriza como organismos muito
importantes no solo e como bioindicadores ambientais. Suas características,
especialmente das espécies Eisenia fetida Savigny, 1826 e E. andrei Bouché,
1972, as qualificaram para testes de toxicidade para fins de registro de
30
agrotóxicos, junto aos órgãos regulamentadores de diversos países. Além da
relativa facilidade de criação de E. fetida e E. andrei, as condições desses
testes são internacionalmente aceitas e permitem padronização de estudos e
comparações internacionais; informam sobre toxicidade relativa às espécies
endêmicas; permitem avaliações preliminares em relação a intervalos de doses
do poluente para os testes; fornecem estimativas sobre o CENO (concentração
sem efeito observável) para exposição contínua, e ajudam no estabelecimento
de condições para testes de efeitos subletais e sub-crônicos (ANDRÉA, 2010).
Esses estudos são feitos por meio da determinação de doses subletais
sobre biomarcadores – componentes celulares ou bioquímicos, estruturas e
funções de organismos bioindicadores (ANDRÉA et al., 2007 a,b; NICHOLSON
e LAM, 2005; LAM e KUEH, 2008) – e auxiliados pelas análises de solos,
sedimentos e águas, que são os meios onde são encontrados os
bioindicadores (MIGUEL et Al., 1999; GEVAO et al., 2001; FIGUEIREDO-
BARROS et al., 2001).
Dessa forma, as medidas de bioindicadores têm sido usadas para
apontar a probabilidade de um agente estressor (contaminante, alterações das
condições físicas, etc.) causar efeito adverso no ambiente e nas populações.
Essas medidas são também feitas para caracterizar a saúde do ambiente,
indicar o grau de perigo e dar suporte às determinações dos possíveis riscos
ecológicos de mudanças na saúde do ambiente (ANDRÉA, 2008).
3. METODOLOGIA
Para os testes de toxicidade do glifosato no solo e os efeitos na
comunidade biológica do solo, em específico, nas minhocas da espécie E.
andrei, foram utilizados como guias consultivos, os guias propostos pela
Comunidade Econômica Européia (EEC 1984), Agência de Proteção Ambiental
dos Estados Unidos (U.S EPA 1988) e Organização para a Cooperação e
Desenvolvimento Econômico (OECD 1984).
A norma utilizada especificamente na realização do ensaio de fuga foi a
ISO 17512-1 (2007) – Soil quality- Avoidance test for testing the quality of soils
and effects of chemical on behavior. Part 1: Test with earthworms.
3.1 Delineamento experimental
Para avaliação da toxicidade de solos contaminados com o agrotóxico
glifosato foi determinado o comportamento de fuga de minhocas quando
expostas ao mesmo tempo a solos contaminados e não contaminados, de
acordo com o estabelecido na norma ISO 17512-1 (2007). Esta norma fornece
as diretrizes necessárias à realização do ensaio de fuga para avaliar a
qualidade de solos e efeitos de substâncias químicas no comportamento das
minhocas. Este ensaio é normatizado com as espécies de minhocas Eisenia
fetida e Eisenia andrei.
A fim de avaliar a toxicidade de solos contaminados com glifosato foram
idealizados experimentos com diferentes dosagens. Foram montados 4
tratamentos com doses crescentes de glifosato e 2 tratamentos controles
(negativo e positivo), conforme mostrado na Tabela 3. Os ensaios foram
realizados em quintuplicata.
32
Tabela 3- Relação das doses de glifosato aplicadas no solo teste.
Tratamento Dose aplicada (mg/Kg)
Controle negativo 0
Controle positivo (H3BO3) 0
T1 4000
T2 6000
T3 8000
T4 10000
3.1.1 Caracterização do solo
As amostras de solo foram coletadas no Município de Rio Grande/RS
(Figura 3), (Latitude 32º 12’37.3” Sul Longitude 52º 18’60.8’’ Oeste) em área
sem histórico de aplicação de agrotóxico.
Figura 3- Remoção da cobertura vegetal e coleta do solo
O solo foi encaminhado ao Laboratório de Bioprocessos e Biotecnologia
Ambiental da Universidade Federal de Pelotas, onde foi homogeneizado e
peneirado em peneira com 2,00 mm de abertura. Posteriormente, o solo foi
33
desfaunado sob três ciclos de congelamento e descongelamento de 48h/ciclo
(LUZ et al., 2008).
A caracterização do solo expressa nas Tabelas 4 e 5 foi realizada pelo
Departamento de Solos - Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da
Universidade Federal de Pelotas.
Tabela 4- Composição granulométrica do solo
Areia (%) Silte (%) Argila (%)
96,02 1,68 2,3
Tabela 5- Caracterização físico-química do solo
Parâmetros Resultado Método de análise
pH 5,0 pH em água 1:1
Umidade 11 %
Matéria Orgânica 1,52 % Digestão úmida
Argila 4% Densímetro
3.1.2 Organismos-teste
O bioindicador ambiental utilizado nos ensaios foi a minhoca da espécie
Eisenia andrei. Foram utilizadas apenas minhocas adultas cliteladas pesando
entre 300-600 mg.
Ao longo dos ensaios, não foi fornecido nenhum tipo de suplementação
(alimentação) às minhocas.
3.1.3 Unidade controle positivo
Para testar o lote de organismos utilizados nos experimentos, foi
utilizado o ácido bórico (H3BO3), substância tóxica recomendada pela ISO. O
34
ácido bórico é um biocida não seletivo efetivo que atende aos critérios
estabelecidos pela norma ISO 17512-1.
O comportamento de fuga das minhocas deve ser observado na
concentração de 750 mg H3BO3/ kg de solo.
3.1.4 Concentrações de glifosato
As diluições aplicadas em solo foram feitas a partir da formulação
comercial de Glifosato (Roundup original) da Empresa Monsanto.
Para preparar as soluções de glifosato aplicadas às amostras de solo, foi
utilizada a bula do produto e a Ficha de Informações de Segurança de
Produtos Químicos (FISPQ).
Os volumes de solução de glifosato aplicados no teste foram
determinados baseados na quantidade de solo e a concentração requerida em
cada amostra. Foram aplicadas as concentrações de 4.000, 6.000, 8.000 e
10.000 mg.Kg-1.
3.1.5 Procedimento experimental: Teste de evitamento
O teste de evitamento seguiu os procedimentos descritos pela norma
ISO 17512-1 (2007) - Soil quality- Avoidance test for testing the quality of soils
and effects of chemical on behavior.
Os recipientes utilizados foram de plástico, com formato retangular
(dimensões: 19 cm de comprimento, 13,5 de largura e 12 cm de profundidade)
e com capacidade de 2500 mL (Figura 4). Os recipientes por serem
transparentes foram forrados com papel alumínio para evitar efeitos laterais da
luz.
35
Figura 4- Recipiente utilizado no teste
Inicialmente, foi realizado o ajuste do conteúdo de umidade dos solos
utilizando água destilada (Figura 5). O solo foi ajustado a 60% da capacidade
de retenção de água.
Figura 5- Ajuste do conteúdo de umidade
36
Nos solos denominados testes foram aplicadas as concentrações de
glifosato de acordo com o citado na Tabela 3.
Para a montagem das unidades experimentais, foi inicialmente colocado
um divisor de plástico no centro do recipiente e posteriormente foram
colocados de um lado do recipiente o solo controle (solo não contaminado) e
do outro o solo teste (contaminado), conforme mostrado na Figura 6.
Figura 6- Divisão do recipiente e colocação do solo teste e controle
Em seguida, o divisor foi retirado e 10 minhocas todas adultas e
previamente aclimatadas, com clitelo e peso entre 300 - 600mg, foram
colocadas na linha divisória entre os dois substratos (Figura 7). As minhocas,
após a pesagem, foram aclimatadas ao solo durante 24 horas antes do início
do teste.
37
Figura 7- Colocação das minhocas na linha formada pela divisória.
Logo após a colocação dos organismos, os recipientes foram cobertos
por papel filme perfurado manualmente, visando permitir trocas gasosas,
(Figura 8) e distribuídos nas prateleiras de modo que os lados do recipiente
que contém o solo contaminado ficassem sempre na mesma direção (Figura 9).
Figura 8- Recipiente após a colocação do papel filme
38
Figura 9- Local onde o teste permaneceu no período de incubação
As unidades experimentais foram incubadas durante 48 h à temperatura
de 20 ± 2ºC, sob intensidade luminosa constante de 600 lux e fotoperíodo de
12 horas de luz e 12 horas no escuro.
Após 48 horas, o divisor foi novamente introduzido nos recipientes,
separando o solo teste do solo controle, e foi feita a contagem do número de
minhocas em cada um dos lados.
3.2 Análise de dados
Para avaliação dos resultados foi avaliada a porcentagem de minhocas
encontradas em cada compartimento do recipiente e também a taxa de fuga
(taxa de evitamento- avoidance).
A ISO recomenda a equação descrita abaixo para determinar a taxa de
evitamento das minhocas às diferentes concentrações de contaminantes.
39
Equação 1
� = ��−�� �� 100
A = fuga (avoidance), em porcentagem (%);
C = número de minhocas no solo controle;
T= número de minhocas na amostra;
N= número total de minhocas inoculadas (10 em cada recipiente).
De acordo com a ISO 17512-1 (2007), a amostra de solo é considerada
tóxica para os organismos (função de habitat limitado) se, mais de 80% dos
indivíduos estiverem no compartimento controle (ou menos de 20% estiverem
no solo teste), o que corresponde a mais de 60% de evitamento (avoidance)
(Equação 1).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Critérios de validade- Teste de evitamento
Para que o teste de evitamento seja considerado válido, devem ser
atendidos os critérios de validade estabelecidos pela norma ISO 17512-1
(2007). A norma estabelece que devam ser realizados controles negativo e
positivo e que os resultados devem estar dentro da faixa preconizada como
aceitável.
O tratamento controle negativo também chamado de “dual control test”
consiste em utilizar em ambos os lados do recipiente o solo sem contaminação,
permitindo assim observar a distribuição dos organismos no recipiente e inferir
se existem outros fatores que possam estar causando interferência na
distribuição dos organismos além da substância tóxica (RINKE e
WIECHERING, 2001; YEARDLEY et al.,1996). Na presente pesquisa, os solos
foram submetidos a desfaunagem com o intuito de assegurar a existência
somente do organismo desejado.
De acordo com o observado na Figura 10, no tratamento controle
negativo, as minhocas se distribuíram de forma satisfatória visto que
apresentaram distribuição de 60%:40% para cada lado. De acordo com a ISO,
no controle negativo a taxa de minhocas deve estar dentro da faixa 60%:40%.
Neste caso considera-se que não houve a manifestação do comportamento de
fuga, comprovando não haver preferência por parte das minhocas por um dos
lados do recipiente.
A norma ISO também recomenda que seja realizado um tratamento
denominado controle positivo, no qual é utilizado como substância tóxica de
referência, o ácido bórico (H3BO3) na concentração de 750 mg.Kg-1. O ácido
bórico é utilizado como substância referência por ser um quimioesterilizante de
solo com função biocida. Ele é efetivo em concentrações relativamente baixas,
é relativamente estável e persistente, não volatiliza rapidamente e pode ser
facilmente misturado em solos (ISO, 2007).
41
Figura 10-Distribuição dos organismos nos controles negativo e positivo.
O controle positivo tem a finalidade de avaliar o lote de organismos, os
quais devem manifestar o comportamento de fuga quando em contato com a
substância tóxica de referência. De acordo com a norma, quando os solos
contaminados apresentar menos do que 20% do número total de minhocas,
estes são classificados como tendo função habitat limitada. Conforme
mostrado na Figura 10, observa-se que o ensaio controle positivo apresentou-
se dentro dos padrões aceitáveis.
Tendo em vista que os resultados obtidos nos testes controles
permaneceram dentro dos padrões estabelecidos pela norma, o teste foi
validado.
4.2 Testes de toxicidade
Para avaliação da toxicidade de solos contaminados com o agrotóxico
glifosato foi determinado o comportamento de fuga de minhocas quando
expostas ao mesmo tempo a solos contaminados e não contaminados.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Controle negativo Controle positivo
Dis
trib
uíç
ão
do
s o
rga
nis
mo
s (%
)
Controle
Teste
42
O procedimento padrão preconiza a utilização de um solo artificial como
substrato para adição das substâncias tóxicas, a fim de eliminar interferências
externas (SISINNO et al., 2006). Um dos desafios atuais para a avaliação de
áreas contaminadas diz respeito à substituição do substrato artificial pelas
amostras de solo obtidas a campo (SISINNO et al., 2006).
No presente trabalho, foi possível notar que a utilização de solos
naturais ao invés do solo artificial tropical (SAT), recomendado pela ISO, se
mostrou satisfatória visto que, os controles foram validados e os resultados não
se mostraram discrepantes dos estudos relativos ao glifosato já existentes. Os
resultados obtidos foram precisos, não sendo observados resultados com
grandes variações. Em estudos como o realizado por Lima (2006), o qual
buscou a caracterização da atividade de Bom Repouso (MG) e avaliação por
meio de testes toxicológicos com a minhoca E. fetida, este comportamento não
foi verificado, visto que Lima obteve problemas na validação do teste e no teste
de evitamento, apontando como prováveis interferências as diferenças físico-
químicas (pH, matéria orgânica, quantidade de areia, conteúdo de argila,
nutrientes, umidade) nos tipos de solo natural utilizados e entre o solo artificial
tropical. Embora a utilização de SAT distancie os resultados obtidos em
laboratório das situações de contaminação ambiental a campo, talvez neste
caso a utilização do SAT tivesse se mostrado satisfatória, tendo em vista que
as características do solo interferem diretamente no comportamento dos
organismos, contribuindo para a grande variabilidade entre as réplicas nos
resultados.
Em estudos realizados por Cantelli (2011), avaliando a toxicidade aguda
de carbofurano e carbendazim em minhocas utilizando solo natural, mostraram
que a utilização de solo artificial tropical (SAT) modifica de certa forma a
sensibilidade do organismo teste à substância tóxica, logo, deve-se dar
preferência a utilização do solo natural visto que este melhor representa as
condições de contaminação a campo.
43
A Figura 12 mostra a taxa de evitamento obtido nos tratamentos aos
quais foram aplicados o herbicida glifosato nas doses de 4.000, 6.000, 8.000 e
10.000 mg.kg-1.
A partir dos resultados obtidos, observa-se que houve o comportamento
positivo de fuga ao contaminante em todas as doses testadas.
De acordo com a ISO 17512-1, o solo somente pode ser considerado
como tóxico ou de baixa qualidade (função de habitat limitado), quando mais do
que 80% dos organismos são encontrados no solo controle, o que corresponde
a taxa de evitamento maior que 60% (fórmula de evitamento- avoidance).
Todas as concentrações manifestaram função de habitat limitado.
Figura 11- Relação entre a dosagem aplicada de glifosato e a taxa de fuga (média dos tratamentos ± desvio padrão amostral).
Observando a Figura 11, pode-se notar que o comportamento de fuga
não acompanhou o aumento das dosagens aplicadas em solo, tendo a
concentração de 6.000 mg de glifosato/ kg de solo apresentado a maior taxa de
0
20
40
60
80
100
120
4.000 6.000 8.000 10.000
Ev
ita
me
nto
(%
)
Dosagem aplicada (mg kg-1)
Fuga
44
evitamento (92%). As concentrações de 8.000 mg.kg-1 e 10.000 mg.kg-1
apresentaram o mesmo índice de fuga ao contaminante (84%). A concentração
de 4.000 mg.kg-1 foi a dosagem que apresentou o menor valor de evitamento
ao contaminante (76%).
Schiedeck et al (2010) sugere que em situações de intoxicação aguda, a
minhoca pode não conseguir fugir da substância tóxica, induzindo ao erro nos
resultados.
Foi possível notar mudança comportamental nas minhocas quanto
maiores as dosagens de glifosato aplicadas no solo. As minhocas submetidas a
menor concentração (4.000 mg de glifosato/ kg de solo) se mostraram mais
ativas e dispersas no recipiente. Os organismos presentes nas unidades 8.000
mg kg-1 e 10.000 mg kg-1, em sua maioria mostraram ausência ou lentidão nos
movimentos e agrupamento em ponto específico. Este tipo de comportamento
foi relatado por Schiedeck et al (2010) em testes de aceitação de alimento
como sendo comportamento característico de rejeição ao alimento testado.
As minhocas podem absorver os contaminantes da solução do solo por
meio de contato direto e passagem pela cutícula (BUCH, 2010). Assim, podem
se intoxicar, morrer ou sobreviver, incorporar ou até bioacumular esses
poluentes em seus tecidos (CORTET et al., 1999; BURGER, 2006;
VISWANATHAN, 1994), podendo levar a biomagnificação da substância ao
longo da cadeia trófica.
Mesmo quando as moléculas da substância tóxica não afetam
significativamente a sobrevivência das minhocas, podem afetar hábitos e
comportamentos, resultando na redução da população e/ou atividade das
minhocas, o que pode ser influenciado pelo funcionamento do solo (LAL et al.,
2001; LUO et al., 1999; SLIMAK 1997). O estresse causado pela presença do
contaminante faz com que a energia, para crescimento, reprodução e
escavação seja utilizada para garantir a sobrevivência do organismo (GIBBS et
al., 1996; ODUM 1982). Logo se acredita que este tipo de comportamento é
45
característico da espécie quando submetida a condições de estresse como
forma de garantir a sua sobrevivência.
Entretanto, não é possível afirmar a razão pela qual as minhocas não
manifestaram o comportamento de fuga gradativo seguido do aumento da
dosagem de glifosato.
Vale ressaltar que as dosagens utilizadas no estudo estão
intencionalmente bem acima das taxas recomendadas de aplicação no campo
pelo fabricante. As dosagens foram determinadas de modo que simulassem
condições de derramamento acidental do produto.
Em teste preliminar, foi aplicado ao solo o dobro (11, 52 mg ia. ha-1) da
dose máxima (5,46 mg ia.ha-1) recomendada pelo fabricante na bula do
produto, que é para a cultura de taboca (Guadua angustifolia). Neste ensaio, os
organismos não manifestaram comportamento de rejeição ao solo contendo o
glifosato, pelo contrário, observando a Figura 13 é possível notar maior
distribuição no lado contendo 11,52 mg ia. ha-1 (53,33%) se comparado ao
controle (46,67%).
Figura 12- Distribuição dos organismos no recipiente (média ± desvio padrão)
0
10
20
30
40
50
60
70
11,52 mg /ha Controle
Dis
trib
uiç
ão
do
s in
div
ídu
os(
%)
Tratamentos
46
Buch (2010) realizou estudo para analisar a utilização da espécie
Eisenia andrei como bioindicadora de solos contaminados por agrotóxicos. As
concentrações de Glifosato Pica-Pau aplicadas em solo foram 0, 7, 14, 21, 30 e
47 mg ia. de glifosato kg-1 em solo artificial tropical (SAT). Foram considerados
como habitat limitado as concentrações de 30 e 47 mg i.a kg-1.
No presente estudo o dobro da dose recomendada (11,52 mg i.a ha-1)
não demonstrou toxicidade aos organismos, ao contrário do estudo de Buch
que observou toxicidade já nas doses recomendadas de utilização a campo.
O Glifosato Pica-Pau utilizado nos ensaios por Buch apresenta
classificação toxicológica superior ao Roundup original, logo, como esperado
demostrou maior toxicidade aos organismos em doses menores.
Em estudo semelhante ao de Buch, mas, com a utilização da formulação
comercial Roundup, Chini (2014), não observou o comportamento de fuga
necessário para caracterizar o solo como habitat limitado.
Mesmo que em baixas concentrações não sejam notados
comportamentos de fuga à substância tóxica, não se pode concluir que em
situações de exposição prolongada não haja efeitos adversos aos organismos
(ANDRÉA, 2008; BURATINI e BRANDELLI, 2006).
Com base no presente estudo e nos estudos de Kanashiro (2015) e
Chini (2014), podemos concluir que só é possível observar os efeitos de
toxicidade ao glifosato Roundup em solo nos organismos terrestres E. andrei e
E. fetida em altas concentrações.
O produto utilizado no estudo (Roundup original) não contém dados
relativos a ecotoxicidade para minhocas em sua Ficha de informação de
segurança do produto químico (FISPQ). Para este produto há dados
ecotoxicológicos relativos a algas, crustáceos e peixes. Assim, foi tomado
como base para o delineamento experimental, os dados ecotoxicológicos com
minhocas contidos na FISPQ do produto Roundup transorb r, o qual apresenta
valores de CL50, 14 dias > 10.000 mg/kg para Eisenia foetida e Roundup N.A
47
com valores de CL50 de 6964,39 mg/Kg. Os produtos Roundup transorb r e
Roundup N.A foram escolhidos como base por apresentarem composição
química semelhante ao composto utilizado no ensaio.
Foi possível notar a manifestação do comportamento de fuga e
alterações comportamentais em minhocas quando submetidas a concentração
≥ 4.000 mg de glifosato kg-1 de solo, concentração inferior a menor CL50
utilizada como base no teste.
Kanashiro (2015) avaliou a toxicidade ambiental do glifosato em
concentrações de 96 a 10.000 mg.kg-1 e de deltametrina em concentrações de
5 a 1.500 mg.kg-1 no solo através de ensaios de mortalidade, biomassa e
reprodução. As minhocas E. andrei manifestaram o comportamento de
toxicidade aguda (mortalidade) em concentrações iguais e superiores a 6.000
mg de glifosato kg-1. Os ensaios de evitamento não foram realizados no estudo
de Kanashiro, porém, fazendo uma comparação entre os estudos pode-se
notar que as concentrações nas quais houveram manifestações de fuga e
toxicidade aguda foram semelhantes, exceto a concentração de 4.000 mg.kg-1
que se configurou como habitat limitado no teste de evitamento no presente
estudo, enquanto que, a concentração mais próxima avaliada por Kanashiro de
4.500 mg.kg-1 não demonstrou toxicidade aos organismos.
O ensaio de evitamento é o bioensaio que melhor se assemelha as
condições encontradas no ambiente natural, pois, no ambiente as populações
naturais têm a habilidade de fugir do contaminante antes que efeitos letais ou
sub-letais ocorram. Isso demonstra a relevância ecológica de estudos sobre o
comportamento de fuga dos organismos, pois testes onde os mesmos ficam
confinados tornam os resultados distantes da realidade, nos casos em que a
fuga seja provável (LOPES et al.,2004).
O teste de evitamento parte do princípio que as minhocas por terem
quimioreceptores, são capazes de detectar e evitar a presença de substâncias
tóxicas, evitando permanecer no solo que as contém (LIMA, 2010).
48
Dentre as vantagens da utilização do teste de fuga, o período de
duração do teste (48 horas) quando comparado a testes agudos como
mortalidade (14 dias) e reprodução (56 dias) se constituí em um diferencial,
tornando o teste uma ferramenta importante na avaliação de solos
contaminados.
A sensibilidade é outro parâmetro que se destaca quando comparado
aos testes agudos. Relatado por vários autores, os níveis de detecção da
contaminação no solo são menores no teste de fuga.
A utilização do teste de evitamento com minhocas da espécie Eisenia
andrei se mostrou uma ferramenta eficiente na análise de solos contaminados
por glifosato sendo capaz de fornecer informações rápidas que auxiliam na
tomada de decisões.
O organismo teste mostrou altas taxas de fuga a todas as concentrações
aplicadas se mostrando sensível ao contaminante em altas concentrações.
Porém, recomenda-se estudos com concentrações menores que 4.000 mg de
glifosato/kg de solo para que se consiga estabelecer com precisão a mínima
concentração de glifosato que apresenta o comportamento de fuga das
minhocas Eisenia andrei. Também, se faz interessante a ampliação dos
estudos, utilizando outros cenários de contaminação, como exposições
múltiplas e também a utilização de outros testes que auxiliem o entendimento
do efeito a longo prazo nos organismos terrestres como ensaios de
reprodução, biomassa e mortalidade.
5. CONCLUSÃO
Os organismos da espécie Eisenia andrei demonstraram sensibilidade
ao agrotóxico glifosato, evidenciando sua capacidade de detectar e evitar esta
substância química quando presente no solo, deste modo podem ser utilizadas
para auxiliar no monitoramento ambiental de áreas contaminadas.
As minhocas manifestaram o comportamento de fuga nas concentrações
de 4.000, 6.000, 8.000 e 10.000 mg.kg-1, sendo a maior taxa de fuga (92%)
relativa a concentração de 6.000 mg.kg-1.
A menor concentração testada capaz de causar o comportamento de
fuga dos organismos da espécie Eisenia andrei e que atende aos critérios
estabelecidos pela ISO 17512-1 (2007) de habitat limitado foi a concentração
de 4.000 mg.kg-1 de solo.
As concentrações de 8.000 mg kg-1 e 10.000 mg kg-1, causaram
alterações significativas no comportamento das minhocas Eisenia andrei como
ausência de movimentos e aglomeração em pontos específicos.
O teste de evitamento com minhocas da espécie Eisenia andrei em solo
natural contaminado com glifosato se mostrou uma ferramenta eficiente na
avaliação de áreas contaminadas, fornecendo respostas precisas em curto
período de tempo além de ser um método de fácil operação e de baixo custo.
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