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Disciplina de Engenharia de Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

2º Semestre de 2018

Aula 5: Ferramentas Computacionais e

Técnicas para “Engenheirar” Proteínas

Prof. Marcos Túlio de Oliveira marcos.t.oliveira@unesp.br

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Ferramentas Computacionais

Protein Data Bank (PDB)

Transcriptase Reversa do HIV-1

Transcriptase Reversa do HIV-1

Visualização de Estruturas

Visualização de Estruturas

Visualização de Estruturas

Visualização de Estruturas

Visualização de Estruturas

Visualização de Estruturas

Estudo de caso 1 – evolução estrutural

da pol γ

Maquinaria de replicação do DNAmt

Cielsielski et al., 2016. Enzymes 39:255-292.

Variabilidade oligomérica da pol γ

Humanos e camundongo = 1 α / 2 β

Drosophila melanogaster = 1 α / 1 β

Saccharomyces cerevisiae = 1 α / 0 β

Buscas por outras pol γs animais

Buscas por outras pol γs animais

Buscas por outras pol γs animais

Buscas por outras pol γs animais Species Common name Phylum Class Order Accession Number

Pol γ-α

Amphimedon queenslandica sponge Porifera Demospongiae Haplosclerida XM_003389221.1

Trichoplax adhaerens placozoan Placozoa Tricoplacia - XM_002116311.1

Nematostella vectensis starlet sea anemone Cnidaria Anthozoa Actiniaria scaffold_62

Hydra magnipapillata fresh water polyp Cnidaria Hydrazoa Hydroida XP_002166917.2

Crassostrea gigas pacific oyster Mollusca Bivalvia Ostreoida EKC38630.1

Caenorhabditis elegans roundworm Nematoda Chromadorea Rhabditida NM_064191.1

Bursaphelenchus xylophilus pine wood nematode Nematoda Chromadorea Tylenchida scaffold01109

Oscheius tipulae hermaphroditic soil

nematode

Nematoda Chromadorea Rhabditida 959 Nematode Genomes

Dirofilaria immitis heartworm Nematoda Chromadorea Spirurida 959 Nematode Genomes

RNA-seq

Loa loa eye worm Nematoda Chromadorea Spirurida XM_003141747

Daphnia pulex water flea Arthropoda Crustacea Diplostraca EFX73911.1

Pediculus humanus corporis human body louse Arthropoda Insecta Phthiraptera XM_002425672.1

Drosophila melanogaster fruitfly Arthropoda Insecta Diptera NM_057473.3

Drosophila sechellia fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002035723.1

Drosophila yakuba fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002088608.1

Drosophila erecta fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001969538.1

Drosophila simulans fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002079353.1

Drosophila persimilis fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002023169.1

Drosophila pseudoobscura

pseudoobscura

fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001356205.2

Drosophila ananassae fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001962747.1

Drosophila willistoni fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002066715.1

Drosophila grimshawi fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_001988310.1

Drosophila virilis fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002057431.1

Drosophila mojavensis fruitfly Arthropoda Insecta Diptera XM_002004015.1

Aedes aegypti yellow fever mosquito Arthropoda Insecta Diptera XM_001647501.1

Alinhamento de sequências

Alinhamento de sequências

Alinhamento de sequências

Alinhamento de sequências

pol γ-α

Alinhamento de sequências

pol γ-α

Identificação de um novo motivo

Identificação de um novo motivo na

subunidade catalítica

Cadê a subunidade acessória?

Lewis et al. (2015) PLOS Genetics 11: e1004985

Distribuição do domínio de dimerização

na subunidade acessória

Alinhamento + Estrutura

HLH-β3

Distribuição do domínio de dimerização

na subunidade acessória

Modelagem de Estrutura

HLH-β3

Modelagem de Estrutura

HLH-β3

Modelagem de Estrutura

HLH-β3

usa a estrutura de uma proteína (que foi determinada experimentalmente) para

predizer a estrutura de uma proteína homóloga

Modelagem por Homologia

usa a estrutura de uma proteína (que foi determinada experimentalmente) para

predizer a estrutura de uma proteína homóloga

Modelagem por Homologia

Modelagem por Homologia

https://www.bioscience.org/2004/v9/af/1437/fulltext.php?bframe=figures.htm

Resumo: algumas (poucas) ferramentas

Bancos de dados – PDB, NCBI, SwissProt, etc.

Buscas por sequências similares – BLAST e suas

variações

Visualização de estruturas – PyMOL, MolScript,

Jmol, etc.

Alinhamentos de sequências – Clustal, MUSCLE,

T-Cofee, etc.

Modelagem por homologia – I-Tasser, Modeller,

etc.

Estudo de caso 2 – o sítio ativo da Twinkle

Alinhamento de sequências

Estudos fisiológicos e bioquímicos

Modelagem do sítio ativo

Ziebarth et al., 2010. JBC 285:14639-14647.

Resumo: mesmo tipo de ferramentas

Bancos de dados – PDB, NCBI, SwissProt, etc.

Buscas por sequências similares – BLAST e suas

variações

Visualização de estruturas – PyMOL, MolScript,

Jmol, etc.

Alinhamentos de sequências – Clustal, MUSCLE,

T-Cofee, etc.

Modelagem por homologia – I-Tasser, Modeller,

etc.

Estudo de caso 3 – aqueles que não são, mas se parecem,

e aqueles que se parecem, mas não são...

Similaridade Estrutural

Fribourg S , and Conti E EMBO Rep. 2003;4:699-703

Mex67 e TAP – proteínas homólogas

Mtr2 e p15 – nenhuma similaridade de sequência / análogos funcionais

em leveduras em animais

Similaridade Estrutural

Kaguni LS , and Oliveira MT CRBMB. 2016;51:53-64

As primases de bactéria e de bacteriófagos são homólogas, e possuem similaridade

de sequência com o domínio N-terminal da Twinkle mitocondrial de animais

Mas a Twinkle não faz primers durante a replicação do DNAmt animal (no

entanto, ela faz em plantas...)

Kaguni LS , and Oliveira MT CRBMB. 2016;51:53-64

Mas como engenheirar a proteína de interesse?

Como testar a relação estrutura-função?

Análise de Estruturas

Análise de Estruturas

Análise de Estruturas

Análise de Estruturas

E se sua proteína favorita não possui

estrutura já determinada?

Conservação de sequências

pol γ-α

Conservação de sequências

pol γ-α

Conservação de sequências

Clonagem em Vetor de Expressão

Clonagem em Vetor de Expressão

Com o gene da sua proteína clonado em

vetor de expressão…

CDS proteína de interesse

Com o gene da sua proteína clonado em

vetor de expressão…

CDS proteína de interesse

Com o gene da sua proteína clonado em

vetor de expressão…

GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT

CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA

G H E R S R K A D Q S

Com o gene da sua proteína clonado em

vetor de expressão…

GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT

CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA

G H E R S R K A D Q S

Com o gene da sua proteína clonado em

vetor de expressão…

GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT

CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA

G H E R S R K A D Q S

Com o gene da sua proteína clonado em

vetor de expressão…

GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT

CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA

G H E R S R K A D Q S

Codons para Ala:

GCU

GCA

GCG

GCC

Com o gene da sua proteína clonado em

vetor de expressão…

GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT

CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA

G H E R S R K A D Q S

Codons para Ala:

GCU

GCA

GCG

GCC

Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCGCTAAAGCTGACCAGTCT3’

Primer 2: 3’CCAGTACTTTCTAGGCGATTTCGACTGGTCAGA5’

Mutagênese Sítio-Dirigida

PCR

…GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT…

…CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA…

Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCGCTAAAGCTGACCAGTCT3’

3’CCAGTACTTTCTAGGCGATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2

Template

Mutagênese Sítio-Dirigida

PCR

Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT3’

3’CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2

…GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT…

…CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA… GC

CG

CG

GC

Mutagênese Sítio-Dirigida

PCR

Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT3’

3’CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2

…GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT…

…CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA… GC

CG

CG

GC

Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCGCTAAAGCTGACCAGTCT3’

3’CCAGTACTTTCTAGGCGATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2

Mutagênese Sítio-Dirigida

PCR Primer 1

Primer 2

Mutagênese Sítio-Dirigida

PCR

Mutagênese Sítio-Dirigida

PCR

Mutagênese Sítio-Dirigida

PCR

Mutagênese Sítio-Dirigida

…dentro do tubo de PCR no final.

Mutagênese Sítio-Dirigida

…dentro do tubo de PCR no final.

Mutagênese Sítio-Dirigida

Digestão com DpnI

Mutagênese Sítio-Dirigida

Digestão com DpnI

Mutagênese Sítio-Dirigida

Transformação em E. coli

Inóculo em

meio líquido

Minipreparação do

DNA plasmidial

Mutagênese Sítio-Dirigida

Transformação em E. coli

Mutagênese Sítio-Dirigida

Verificação e Testes

Sequencie o fragmento de DNA Expresse a proteína em células de E. coli apropriadas Faça testes de solubilidade e purificação Parta para os experimentos para comparar a proteína mutada com a tipo selvagem (WT)

Mutagênese Sítio-Dirigida

Resumo

Mutagênese Sítio-Dirigida

Resumo

Mutagênese Sítio-Dirigida

Substituições

Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT3’

3’CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2

…GGTCATGAAAGATCC TAAAGCTGACCAGTCT…

…CCAGTACTTTCTAGG ATTTCGACTGGTCAGA… GC

CG

CG

GC

Codons para Ala:

GCU

GCA

GCG

GCC

Mutagênese Sítio-Dirigida

Deleções e Inserções

Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCAAAGCTGACCAGTCT3’

3’CCAGTACTTTCTAGGTTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2

…GGTCATGAAAGATCCAAAGCTGACCAGTCT…

…CCAGTACTTTCTAGGTTTCGACTGGTCAGA… G

C G T

C A

Primer 1: 5’GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT3’

3’CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA5’ :Primer 2

…GGTCATGAAAGATCCCGTAAAGCTGACCAGTCT…

…CCAGTACTTTCTAGGGCATTTCGACTGGTCAGA…

G

C G T

C A

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