aula 01 introdução

Núcleo deBioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais

MÉTODOS ANALÍTICOS EM QUÍMICA ORGÂNICA – II

- CROMATOGRAFIA -

Prof. Dr. Alberto J. Cavalheiro

Instituto de Química de Araraquara – UNESPDepartamento de Química Orgânica

Introdução às principais técnicas cromatográficas

utilizadas na análise qualitativa e/ou quantitativa de

substâncias orgânicas em mistura, com ênfase em

cromatografia líquida (CL).

Objetivo

Metodologia

AULAS

ExpositivasPráticas

AVALIAÇÕES

(P) 2 Provas escritas (individuais) 45%(S) 2 Seminários (dupla) 30%(R) Relatórios das práticas (dupla) 20%(A) Avaliação de aproveitamento das aulas (“individual”) 5%

Média = 0,45P + 0,3S + 0,2R + 0,05AMédia = 0,45P + 0,3S + 0,2R + 0,05A

INTRODUÇÃO À CROMATOGRAFIA

1. Braithwaite, A. Chromatographic Methods, 4ª ed. 1985.

2. Scott, R. P. W. Techiques and practice of chromatography. v. 70, 1995.

3. Miller, J. M. Chromatography, 1988.

4. Poole, C. F. and Poole, S. K. Chromatography today. 1991.

5. Sewell, P. A. Chromatographic separactions, 1987.

6. Collins, H. C. Introdução a métodos cromatográficos. Ed. Unicamp. 7ª ed. 1995.

CLAE

Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. Practical HPLC Method Development. 2a. Ed. John Wiley. 1997.

Bibliografia

Fase Extratora

a + B

A + b

A + B MisturaHeterogêneaF1

F2

MisturaHomogênea(Amostra)

a + b

A + b

a + B

a + b

A + b

a + B

n etapas

[A]F2

[A]F1

KA=

[B]F2

[B]F1

KB=

Princípio Geral

Técnica de análise de substâncias em mistura, que envolve a distribuição

diferencial dessas substâncias em um sistema heterogêneo bifásico.

SISTEMA CROMATOGRÁFICO:

Heterogêneo e bifásico

Fase Móvel (FM) Fase Estacionária (FE) Configuração

gás (CG) sólido ou líquido coluna

líquido (CL) sólido ou líquido coluna/planar

Cromatografia

CC = cromatografia em colunaCCD = cromatografia em camada delgada (planar)

Técnica de análise de substâncias em mistura, que envolve a distribuição

diferencial dessas substâncias em um sistema heterogêneo bifásico.

Cromatografia Analítica:Análise qualitativa e/ou quantitativa de substâncias em mistura.Cromatografia Preparativa: Purificação de substâncias em mistura.

Cromatografia

Fase Extratora

a + B

A + b

A + B MisturaHeterogêneaF1

F2

MisturaHomogênea(Amostra)

a + b

A + b

a + B

a + b

A + b

a + B

n etapas

[A]F2

[A]F1

KA=

[B]F2

[B]F1

KB=

Princípio Geral

Cromatografia

Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.

CC

Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.

Cromatografia

Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.

Cromatografia

Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.

Cromatografia

Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.

Cromatografia

Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.

Cromatografia

Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.

Cromatografia

CC

Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel.

Cromatografia

CromatogramaRegistro gráfico do processo cromatográfico

Resolução (Rs)

21

12 ).(2

ww

trtrRs

+−=

CC

Cromatograma

t0 = momento da aplicação da amostra na colunatm = tempo mortotr = tempo de retençãow = largura do picoh = altura do pico

AMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRA

Rf = d/D1,00

0,00 (ORIGEM)

0,73

0,36

0,08

D d10,0 cm

7,3 cm

3,6 cm

0,8 cm

Rf = fator de retençãoD = distância percorrida pela FMD = distância percorrida pela manchaOrigem = ponto de aplicação da amostra

Cromatografia

Cromatografia em Camada DelgadaCCD ou TLC

Adsorção Absorção Permeação (dissolução)

Líquido/gás sólido

Líquido sólido

+

+

+-

-

Líquido/gás líquido Líquido/gás gel/sólido

INTERAÇÕES INTERMOLECULARESIônicasPonte de Hidrogêniovan der Waals Keeson (dipolo/dipolo)

Debye (dipolo/dipolo induzido) London (dipolo induzido/dipolo induzido)

Mecanismos

Antes 1965 - Colunas de vidro Partículas > 100 µm Fase Normal (silica, alumina, etc.) Amostras pouco polares Fluxo induzido por gravidade Tempo: horas - dias Detecção: off-line (UV, pH, gravimetria, etc)

1965 a 1970 - Partículas 30-50 µm Bombas para impulsionar FM Primeiros detetores on-line: IR, UV.

Depois 1975 - Fase Reversa (C18, C8, C2, etc.) Compatibilidade com amostra biológicas polares Tempo: minutos

Depois 1980- Automação completa

CC - Instrumentação

Micheal S. Tswett (ou Tsvett)Botânico Russo

Pai da cromatografia

1906 - χρωµα γραφια croma grafia

Separação de pigmentos vegetais

Micheal S. Tswett (ou Tsvett)Botânico Russo

Pai da cromatografia

1906 - χρωµα γραφια croma grafia

Separação de pigmentos vegetais

Kuhn, Wintertein e Lederer1931 Reinvenção da técnica

Separação de carotenóides e xantofilas

A. J. P. Martin1944 Cromatografia em papel

Separação substâncias polares, como amino ácidos, carboidratos e pigmentos

PRIMEIRAS APLICAÇÕES:ESTUDO DE METABÓLITOS VEGETAIS

J. Chem. Ed. 1967, 44, 238.

Cromatografia em Coluna Aberta

Algodão

Disco de papel filtro

Empacotamento:- Suspensão- Seco

Análise das frações:- CCD

15 – 30 cm

60–200 µm

Cromatografia

SOLVENTES

BOMBA

INJETOR COLUNA

DETETOR COLETOR

DESCARTE

Cromatografo Líquido

CCD - Instrumentação

SimplicidadeBaixo custo

Suporte sólidoAdsorvente (FE)EspalhadorCubaRevelador

CCD - Instrumentação

Até 31 canais diferentes (190-800 nm)

Cromatograma

t0 = momento da aplicação da amostra na colunatm = tempo mortotr = tempo de retençãow = largura do picoh = altura do pico

� Fluxo (F): vazão da FM, geralmente em mL/min.

� Tempo morto (tm): tempo necessário para eluir uma substância que não interage com a FE.

� Volume morto (Vm): volume de FM necessário para preencher todos os interstícios e poros da FE, ou volume de FM necessário para eluir uma substância que não interage com a FE.

tm = Vm/F

� Tempo de retenção (tR): tempo necessário para eluir uma substância de um determinado sistema cromatográfico.

� Volume de retenção (VR): volume de FM necessário para eluir uma substância de um determinado sistema cromatográfico.

tR = VR/F

DEFINIÇÕES

Nomenclature for Chromatography. Pure & Appl. Chem. 65:819-872 (1993)

)(

)(.2

21

12

ww

trtrRs

+−=

Resolução (Rs)

Indica a qualidade da separação entre duas bandas cromatográficas.

Para resolução completa, Rs > 1,25

Mapa de Resolução

Resolução (Rs)

Fatores envolvidos na resolução cromatográfica:

2

21

2

.54,5ou .16

=

=

w

trN

w

trN

N: Fator de eficiência

Relação entre tempo de permanência do analito no sistema e alargamento da banda cromatográfica.

Quanto mais difícil a separação (a pequeno), maior N necessário.

k’: Fator de capacidade ou de retenção

É a razão da distribuição do analito entre FE/FM

Quanto maior, maior a afinidade do analito pela FE, em relação à FM.

tm

tmtrk

n

nk

FM

FE −== 'ou '

1

2

'

'

k

k=α

α : Fator de seletividade

É a razão entre os fatores de retenção de dois analitos.

Quanto maior, mais fácil a separação.

N: Fator de eficiência (Pratos Teóricos)

Relação entre tempo de permanência do analito no sistema e alargamento da banda cromatográfica.

Quanto mais difícil a separação (a pequeno), maior N necessário.

Ajustar através de:

comprimento da coluna ou placa

tamanho e forma da partícula

fluxo da FM

volume da amostra

quantidade de amostra

2

21

2

.54,5

ou .16

=

=

w

trN

w

trN

Resolução (Rs)

k’: Fator de capacidade ou de retenção

É a razão da distribuição do analito entre FE/FM

Quanto maior k’, maior a afinidade do analito

pela FE, em relação à FM.

Ajustar através de:

força de eluição da FM

polaridade da FE tm

tmtrk

n

nk

FM

FE−== 'ou '

Resolução (Rs)

α : Fator de seletividade

É a razão entre os fatores de retenção de dois analitos.

Quanto maior, mais fácil a separação.

Ajustar através de :

tipo de componente da FM

tipo de FE1

2

'

'

k

k=α

Resolução (Rs)

)1'(

'.

)1(.

42

2

+−=

k

kNRs

αα

EFICIÊNCIA

Depende da configuração do sistema

SELETIVIDADE RETENÇÃO

Dependem das características da FM e FE do sistema

FATORES QUÍMICOS

FATORES FÍSICOS

Resolução (Rs)

0 2 4 6 8 10

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Influ

ênci

a na

Res

oluç

ão

n N

NRs ∝

0 2 4 6 8 10

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

(α -

1/α

)

α

αα 1−∝Rs

0 2 4 6 8 10 12 140,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

K'/(

1+K

')

K'

1'

'

+∝k

kRs

)1'(

'.

)1(.

42

2

+−=

k

kNRs

αα

κ

(RETENÇÃO)

TEMPO

(SELETIVIDADE)

α

N

(EFICIÊNCIA)

Resolução (Rs)

Dificultar o espalhamento da bandaAumentar a área da FEDiminuir volume da FM

↑ N

Diminuir tamanho das partículas (mm)Partículas esféricasAumentar comprimento da coluna (L)Otimizar fluxo da FM Otimizar temperatura

Otimizando a Resolução

1. Eficiência (N) .162

=w

trN

Coluna, tubulação, injetor, detetor ∑ 2= Lh /σ

µµ

CB

Ah ++=A = Difusão de Eddy

B = Difusão molecular na FM

C = Efeitos da transferência de massas

Otimizando a Resolução

1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.

h = N/L

h: altura de um prato teórico

ou

d

LN .4,0

max=

Comprimento grande causa espalhamento e análise longaPartícula muito pequena necessita pressão muito alta

40 − 60 µm

5 µm

DIÂMETRO PARTÍCULA L=15cm L=25 cm

60 − 200 µm (130 µm) ⇒ 460 770

40 - 60 µm (50 µm ) ⇒ 1.200 2.000

20 µm ⇒ 3.000 5.000

10 µm ⇒ 6.000 10.000

5 µm ⇒ 12.000 20.000

3 µm ⇒ 20.000 33.300

1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.

Otimizando a Resolução

Coluna, tubulação, injetor, detetor ∑ 2= Lh /σ

µµ

CB

Ah ++=A = Difusão de Eddy

B = Difusão molecular na FM

C = Efeitos da transferência de massas

1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.

h = N/Lou

Otimizando a Resolução

Coluna, tubulação, injetor, detetor ∑ 2= Lh /σ

µµ

CB

Ah ++=A = Difusão de Eddy

B = Difusão molecular na FM

C = Efeitos da transferência de massas

1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.

h = N/Lou

Otimizando a Resolução

µµ

CB

Ah ++=

Equação de van Demmter

A = Difusão de Eddy

B = Difusão molecular na FM

C = Efeitos da transferência de massas

mt

L=µF

Vt mm =

L

VF m.µ=

1. Eficiência (N)Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica.

Otimizando a Resolução

Otimizando a Resolução

2. Retenção (k’) e Seletividade (α)Fatores que afetam a interação relativa entre analitos e fase estacionária (FE) e fase móvel (FM).

Para otimizar esses fatores, é preciso conhecer as características dessas duas fases e a maneira como os analitos interagem com elas:

FASE ESTACIONÁRIA FASE NORMAL FASE REVERSA

FASE MÓVEL SOLVENTES, características e compatibilidade FORÇA DE ELUIÇÃO

Otimizando a Resolução

2.1 Cromatografia de Fase Normal (FN) FE mais polar que FM.

Interações ANALITO X FE e FM X FM(em ordem decrescente de intensidade):

- Iônica (indesejáveis)- Ponte de Hidrogênio- Van der Waals

Dipolo – dipoloDipolo – dipolo induzido

ADSORVENTES p/ FN (exemplos):-Sílica-Alumina-Poliamida-Fases ligadas polares (CN, NH2, Diol)

Superfície da FE é polar.

Otimizando a Resolução

2.1 Cromatografia de Fase Normal (FN) FE mais polar que FM.

ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente)

APOLAR → POLAR

SOLVENTES MAIS COMUNS:- Hexanos (éter de petróleo pe 60-80o C)- AcoEt ou acetona- Et2O ou MTBE- i-PrOH ou MeOH- CHCl3 ou CH2Cl2 (DCM)

Superfície da FE é polar.

Sílica gel

Si O

OH

O

O H

Si O

CH 3 Si O

CH 3 C H 3

SiO

OH

C H 3

SiO H

CH 3

CH 3

O H

SiH 3

O

H

H

O

H

H

Otimizando a Resolução

Mecanismo de adsorção:-Si-OH: Interações polares por ponte de

hidrogênio, como doador ou aceptor de H.-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou

dipolo/dipolo induzido

Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm

Poro: 60 a 120Å

Partículas

Sílica gel

Si O

OH

O

O H

Si O

CH 3 Si O

CH 3 C H 3

SiO

OH

C H 3

SiO H

CH 3

CH 3

O H

SiH 3

O

H

H

O

H

H

Otimizando a Resolução

Vantagens:• Elevada resistência mecânica• Grande porosidade e área superficial

• Gel duro (intumescimento não varia em função do solvente).

Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm

Poro: 60 a 120Å

Partículas

PAREI AQUI

Sílica gel

Si O

OH

O

O H

Si O

CH 3 Si O

CH 3 C H 3

SiO

OH

C H 3

SiO H

CH 3

CH 3

O H

SiH 3

O

H

H

O

H

H

Otimizando a Resolução

Influência do teor de água da FM sobre a eficiência (H) e retenção (k’).FE: Sílica FM: DCM Amostra: Fenilpropanol

Desvantagens:• Difícil controle da atividade de água• Forte adsorção de substâncias polares• Forte adsorção de substâncias básicas• Limite operacional de pH (2 a 8)• Sítios com energia de adsorção diferentes.

Otimizando a Resolução

AluminaAtividade: capacidade de adsorção em função do teor de água adsorvida

Atividade, segundo escala de Brockmann & Schadder

Ativ.% de água

Alumina Sílica

I - -

II 3 10

III 6 12

IV 10 15

V 15 20

O Al

AlO

ClAlCH3

Cl

CH3

Cl

ÁCIDApH 4,0

O Al

AlO

ONaAlCH3

ONa

CH3

ONa

BÁSICApH 9,0

O Al2+

AlO

AlCH3 O NEUTRApH 7,0

CLAE

CCD

Alumina 1100 C4000 CII ou IIII

Otimizando a Resolução

Alumina

O Al

AlO

ClAlCH3

Cl

CH3

Cl

ÁCIDApH 4,0

O Al

AlO

ONaAlCH3

ONa

CH3

ONa

BÁSICApH 9,0

O Al2+

AlO

AlCH3 O NEUTRApH 7,0

Mecanismo de adsorção:Al3+: campo positivo favorece interação

com moléculas polarizáveis (p. ex. sistemas conjugados)O2-: sítios básicos favorecem a interação

com doadores de H+

Vantagens:• Elevada resistência mecânica• Faixa operacional de pH maior (2 a 12)

• Gel duro (intumescimento não varia em função do solvente).

• Retenção menos pronunciada de substâncias básicas.

Otimizando a Resolução

Alumina

O Al

AlO

ClAlCH3

Cl

CH3

Cl

ÁCIDApH 4,0

O Al

AlO

ONaAlCH3

ONa

CH3

ONa

BÁSICApH 9,0

O Al2+

AlO

AlCH3 O NEUTRApH 7,0

Desvantagens (em relação à Sílica):• Catalisa reações (p. ex. aldólicas)• Partículas irregulares e maiores (↓ N)

• Menor reprodutibilidade

• Retenção pronunciada de substâncias ácidas (p. ex. ác. carboxilicos).

Otimizando a Resolução

Alumina

O Al

AlO

ClAlCH3

Cl

CH3

Cl

ÁCIDApH 4,0

O Al

AlO

ONaAlCH3

ONa

CH3

ONa

BÁSICApH 9,0

O Al2+

AlO

AlCH3 O NEUTRApH 7,0

Aplicações:

• Análises em condições mais básicas que as suportadas por sílica (> 9);

• Poliaromáticos, alcalóides, aminas e vitaminas lipossolúveis.

Otimizando a Resolução

Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm

Poro: 60 a 120Å

Partículas

Fases Ligadas (BPC)

Si O

OH

O

O H

Si O

CH 3 Si O

CH 3 C H 3

SiO

OH

C H 3

SiO H

CH 3

CH 3

O H

SiH 3

O

H

H

O

H

H

Si R

CH3

Cl CH3

+

Sílica

Otimizando a Resolução

Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm

Poro: 60 a 120Å

Partículas

Fases Ligadas (BPC)

Si O

OH

O

O

Si O

CH 3 Si O

CH 3 C H 3

SiO

O

C H 3

SiO H

CH 3

CH 3

O H

SiH 3

Si

R

CH3H3C

Si

R

CH3H3C

SILANOLRESIDUAL

Si O Si

Si O Si

Si O Si

Si O Si

Si O Si N

Si O Si NH2

Si O Si OHOH

ODS, RP-18, C-18

RP-8, C-8

Fenil

CN, Cianopropil

NH2,Propilamino

TMS, C-1

Diol

APOLARES

POLARES

Si CH3

CH3

Cl CH3

+Cloreto de

trimetilsilano

Fase ligada

Otimizando a Resolução

Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm

Poro: 60 a 120Å

Partículas

Fases Ligadas (BPC)

Si O Si

Si O Si

Si O Si

Si O Si

Si O Si N

Si O Si NH2

Si O Si OHOH

ODS, RP-18, C-18

RP-8, C-8

Fenil

CN, Cianopropil

NH2,Propilamino

TMS, C-1

Diol

APOLARES

POLARES

Si O

OH

O

O

Si O

CH 3 Si O

CH 3 C H 3

SiO

O

C H 3

SiO

CH 3

CH 3

O H

SiH 3

Si

R

CH3H3C

Si

R

CH3H3C

Si CH3

CH3

CH3

Fase ligada capeada

Otimizando a Resolução

Fases Ligadas (BPC)

Si O

OH

O

O

Si O

CH 3 Si O

CH 3 C H 3

SiO

O

C H 3

SiO

CH 3

CH 3

O H

SiH 3

Si

R

CH3H3C

Si

R

CH3H3C

Si CH3

CH3

CH3

Fase ligada capeada

Vantagens:Vantagens:

- Equilíbrio mais rápido

- Menor adsorção irreversível

- Água não influi na reprodutibilidade

- Sítios de adsorção mais homogêneos

- Eluição em gradiente facilitada

Esféricas IrregularesDiâmetro: 3 a 200 µm

Poro: 60 a 120Å

Partículas

Fases Ligadas (BPC)

CH3

CH3

CH3

TOLUENO

NAFTALENO

BIFENILA

ACENAFTENO

2,3-DIMETILNAFTALENO

COLUNA 100 x 8 mmFluxo: 2,0 mL/minDetetor UV 254 nm

C18 – 10% carbonoEsférica – 5 µmNão capeada

C18 – 7% carbonoEsférica – 5 µmCapeada

C18 – 10% carbonoIrregular – 10 µmNão capeada

C8 5% carbono

CN2% carbono

Fenil5% carbono

Para amostra APOLAR↓ Polaridade da FE, ↓ retenção dos analitos

FM: ACN/Água 70:30

Otimizando a Resolução

Fases Ligadas Polares - FN

Interações ANALITO X FE e FM X FM(em ordem decrescente de intensidade):

- Iônica (indesejáveis)- Ponte de Hidrogênio- Van der Waals

Dipolo – dipoloDipolo – dipolo induzido

ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente)

APOLAR → POLAR

SOLVENTES MAIS COMUNS:-Hexanos (éter de petróleo pe 60-80o C)- AcoEt ou acetona- Et2O ou MTBE- i-PrOH ou MeOH- CHCl3 ou CH2Cl2 (DCM)

S i O S i N

S i O S iN H 2

S i O S iOH

OH

CN, Cianopropil

NH2, Propilamino

Diol

Fase Ligada Amino (NH2)

AMOSTRA: ESTERÓIDES

O

O

CH3

CH3

OH

1. Desoxicorticosterona

O

O

OH

CH3

CH3

OH

2. Desoxicortisona

O

O

CH3

OH

CH3

OH

3. Corticosterona

O

O

O

OH

CH3

CH3

OH

4. Cortisona

O

O

OH

CH3OH

CH3

OH

5. Hidrocortisona

O

O

O

OHCH3

CH3

OH

6. Prednisona

FM quaternáriaMTBE 40%DCM 15%CHCL3 42%MeOH 3%

COLUNA: Zorbax-NH2 10 µm250 x 4,6 mmFluxo 3,0 mL/minDetetor UV 254 nm

1

2 3

6

4

5

Fase Ligada Amino (NH2)

Aplicação: análise de monossacarídeos – FASE NORMAL

Coluna: Hypersil 5 APS

100 x 3,0 mm

FM: ACN/Água 80:20

Fluxo: 0,5 mL/min

Detector: RI

O

OHOH

OH OH

CH3

O

OHOH

OHOH

O

OH

OH

OHOH

O

OH

OH OH

OH O OH

OH

OHOH

OH

O

OH

OH

OH OH

OH

O

O

O

OHOH

OH OH

OH

OH

OH

OH

O

O

O

OH OH

OHOH

OH

OH

OHOH

O

O

O

OH OH

OHOH

OH OH

OHOH

H

H

1. Raminose 2. Ribose 3. Xilose

4. Arabinose 5. Frutose

6. Glicose 7. Sacarose

8. Maltose 9. Lactose

Aplicação: análise de monossacarídeos – FASE NORMAL

Amostra: suco de frutas (tomate, uva, framboesa, etc)

O

OH

OH

OHOH

1. Xilose

O OH

OH

OHOH

OH

2. Frutose

O

OH

OH

OH OH

OH

3. Glicose

O

O

O

OHOH

OH OH

OH

OH

OH

OH

4. Sacarose

O

O

O

OH OH

OHOH

OH

OH

OHOH

5. Maltose

Coluna: Hypersil 5 APS

100 x 3,0 mm

FM: ACN/Água 80:20

Fluxo: 0,5 mL/min

Detector: RI

Otimizando a Resolução

2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM.

Superfície da FE é apolar.

CH3Si

OSi

OSi

OSi

O

CH3

CH3

OH

CH3

OH

O

CH3

CH3

CH3

CH3

ADSORVENTES p/ FR (exemplos):

Si O Si

Si O Si

Si O Si

Si O Si

ODS, RP-18, C-18

RP-8, C-8

Fenil

TMS, C-1

SOLVENTES MAIS COMUNS:- Água- Acetonitrila (ACN)- MeOH- Tetraidrofurano (THF)

Otimizando a Resolução

2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM.

ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente)

POLAR → APOLAR

Superfície da FE é apolar.

CH3Si

OSi

OSi

OSi

O

CH3

CH3

OH

CH3

OH

O

CH3

CH3

CH3

CH3Interações ANALITO X FE e FM X FM(em ordem decrescente de intensidade):

Van der WaalsDipolo – dipoloDipolo – dipolo induzidoDipolo induzido – dipolo induzido

Interações residuais: pte. H

Vantagens:Vantagens:

- Equilíbrio mais rápido

- Menor adsorção irreversível

- Água não influi na reprodutibilidade

- Sítios de adsorção mais homogêneos

- Eluição em gradiente facilitada

Otimizando a Resolução

2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM.

Coluna Fase Reversa C18:Aplicação quase universal (~ 70% das aplicações na literatura)Permite análise desde substâncias hidrossolúveis e/ou iônicas até substâncias lipofílicas (NARP).

Supressão da Ionização

Coluna: µBONDAPAK C18 30 cm X 3,9 mmFM: Água, com 5% HOAcDetecção: UV 254nmTempo: 30 min.

R-COOH R-COO- + H+ pKa 4-5

Φ-OH Φ-O- + H+ pKa 10-12

OHO

HO

OH

OH

OHO

OH

OH

OHO

OH

OHO

OH OH

O OHO OH

OH

O OH

OH

OH

O OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

1. Ácido gálico

2. Ác. protocatecuico

3. Ác. p-OH-benzóico

6. Ác. salicílico

5. Ác. cafeico 7. Ác. p-coumárico

8. Ác. o-coumárico

9. Ác. ferúlico

10. Ác. cinâmico

O OH

OH

OMe

4. d-CatequinaAmostra: Ácidos Carboxílicos Fenólicos

O

N

CH3

CH3

N

NH

CH3

N

CH3

CH3

CH4

N

N

CH3

CH3

CH3

1 2

3 4

Coluna: Zorbax ODS 5µm, 150 x 0,46 mm FM: ACN/Tampão 30:70 + 0,2% TEA e 0,2% TFATampão Fosfato 25 mM pH 2,5Fluxo: 1,0 mL/min Detector: UV

C18

Aplicação: antidepressivos tricíclicos – FASE REVERSA

C18

Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mmFM: MeOH a 1,0 mL/minDetector: UV (λe: 295 nm)

Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mmFM: MeOH a 1,0 mL/minDetector: UV (λe: 295 nm)

OCH3

CH3

CH3

OHCH3 CH3

CH3

CH3

CH3

3. α-tocoferol (vitamina E)

OCH3

CH3

CH3

OHCH3 CH3

CH3

CH3

2. β-tocoferol

OCH3

CH3

CH3

OHCH3 CH3

CH31. δ-tocoferol

OCH3

CH3

CH3

OCH3 CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

O

4. Vitamina E - acetato

Aplicação: análise de tocoferóis – FASE REVERSA

Coluna: Inertisil 5 Si 150 x 4,6 mmFM: EtOH 0,3% em n-HexanoFluxo: 1,0 mL/minDetector: FLU (λex: 300 nm; λem:330 nm)

Aplicação: análise de tocoferóis em margarina – FASE NORMAL

Sílica gel

OCH3

CH3

CH3

OHCH3 CH3

CH3

CH3

OCH3

CH3

CH3

OHCH3 CH3

CH3

OCH3

CH3

CH3

OHCH3 CH3

CH3

CH3

OCH3

CH3

CH3

OHCH3 CH3

CH3

CH3

CH3

1. α-tocoferol (vitamina E)

2. β-tocoferol

3. γ-tocoferol

4. δ-tocoferol

AMOSTRA

Sol. em Água

Insol. em Água

Iônica ou Ionizável

Não-iônica

PM ≠

Sol. em solv. orgânico

PM ≠

APOLAR*

POLAR**

FASE NORMAL

FASEREVERSA

GPC

Iônica ouIonizável

Não-iônica

GPC

FASEREVERSA

ÍON-PAR ouTROCA IÔNICA

ÍON-PAR ouTROCA IÔNICA

FASEREVERSA

SUPRESSÃO

SUPRESSÃO

FASE NORMAL

Sephadex

C18C8

C18C8CN

SiCNNH2

C18C8

C18C8CN

SiCNNH2

C18C8

Sephadex - LH20

CHAVE PARA ESCOLHA CHAVE PARA ESCOLHA DO ADSORVENTE (FE)DO ADSORVENTE (FE)

* Hexano, CHCl* Hexano, CHCl33

** AcOEt, MeOH** AcOEt, MeOH

♦ Substâncias com grupos funcionais diferentes

Valor de α maior em Sílica do que em C18

Valor de α menos distinto entre fases ligadas FN e FR

♦ Homólogos ou substâncias que diferem no no. de carbonos

Valor de α maior em FR

♦ Isômeros

Valor de α maior em FN

Otimizando a Resolução

2.2 Fase Normal (FN) X Fase Reversa (FR)

Cromatografia em Fase NormalCromatografia em Fase NormalVANTAGENS DESVANTAGENS

1. Permite grandes variações na seletividade atravésda variação da composição da FM.

1. Amostras iônicas são mais facilmente separadaspor RPC.

2. Colunas são muito estáveis em FM não aquosa 2. Controle da força de eluição da FM é mais difícildo que em RPC.

3. Muitas substâncias orgânicas são mais solúveisnos solventes de NPC (vantagem em Crom. Prep.)

3. Menor p. e. dos solventes usados na FM causamformação de bolhas.

4. Pressão necessária é menor devido menorviscosidade dos solventes.

4. Retenção pode variar em função de águaadsorvida pela FE.

5. Útil para análise de amostras que podemdecompor em soluções aquosas.

5. Eluição em gradiente limitada pelo “demixing”da FM e pela adsorção de água.

6. Adsorventes mais baratos. 6. Solventes mais caros. Descarte mais caro.

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MÉTODOS ANALÍTICOS EM QUÍMICA ORGÂNICA – II

- CROMATOGRAFIA -

Prof. Dr. Alberto J. CavalheiroMs. Tamara R. Calvo

Instituto de Química de Araraquara – UNESPDepartamento de Química Orgânica

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O

NO

O

O

O

O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

HH

2

NO

O

O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

3

N

N

N

N

O

O

CH3

CH3

CH3

4

O

N

O O

CH3

CH3

H

CH3

O 5

O

N

OO

OO

CH3

CH3CH3

6

O

N

OHOH

CH3

H

7

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EXPLICAR MELHOR FR E FNAMPLIAR OS TIPOS DE COLUNASEXPLICAR MELHOR MECANISMO DE RETENÇAO NOS VARIOS TIPOS DE FE